송곳니 X-연결된 근육 영양 실조에 칵테일 안티센스 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 건너 뛰기 멀티 엑손

이 실험의 전반적인 목표는 Duchenne 근이영양증 또는 DMD의 개 모델에서 칵테일 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 AON을 사용하여 다중 엑손 건너뛰기의 효능과 독성을 조사하는 것입니다. 이 방법은 안티센스 올리고뉴클레오티드가 다중 엑손 건너뛰기를 유도하고 대형 동물 모델에서 이영양증 발현을 파괴할 수 있는지 여부와 같은 안티센스 엑손 건너뛰기 요법의 중개 연구에서 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 연구에서 개 모델을 사용하는 주요 이점은 더 큰 동물의 치료 결과를 DMD 환자에게 보다 안정적으로 외삽할 수 있다는 것입니다.

엑손 건너뛰기는 DMD에 대한 매우 유망한 치료법이지만, 선천성 근이영양증 및 사지 거들 근이영양증과 같은 다른 유전 질환에도 적용될 수 있습니다. 시험관 실험의 시연은 연구실장인 Yoshitsugu Aoki 박사가 맡고, 생체 내 실험의 시연은 우리 학과의 박사후 연구원인 Mutsuki Kuraoka 박사가 맡을 것입니다. 텍스트 프로토콜에 따라 AON을 설계한 후, 6-well plates를 사용하여 10%FBS 및 1%pen-strep을 갖는 3ml의 DMEM에서 1-5배 10-3/3의 제곱센티미터 CXMD 근아세포를 시딩합니다.

섭씨 37도에서 60-80%가 합류할 때까지 세포를 배양합니다. 세포가 원하는 합류점에 도달하면 환원된 혈청 배지를 사용하여 양이온성 리포좀 형질주입 시약을 총 부피 100μl로 희석하고 혼합물을 실온에서 30-45분 동안 방치합니다. 그런 다음 감소된 혈청 배지로 AON을 최종 부피 100마이크로리터로 희석합니다.

희석된 transfection 시약과 희석된 AON을 결합하고 실온에서 10-15분 동안 배양합니다. 그 동안, 세포에서 배지를 제거하고 새로운 배지를 사용하여 세포를 세 번 씻으십시오. 다음으로, 형질주입 혼합물에 0.8ml의 배지를 첨가한 다음 전체 용액을 갓 세척한 세포에 첨가합니다.

섭씨 37도에서 3시간 동안 배양합니다. 그런 다음 세포에 분화 배지(DM)를 추가하고 분화가 일어날 때까지 최대 10일 동안 배양합니다. 3일차쯤부터 차별화를 확인합니다.

개 근아세포의 모르폴리노 형질주입을 수행하기 위해 이 비디오의 앞부분에서 설명한 것처럼 CXMD 근아세포를 배양합니다. 칵테일 모르폴리노를 섭씨 65도에서 10분 동안 가열합니다. 그런 다음 펩타이드 전달 시약을 추가하고 모르폴리노를 최종 농도인 3-6마이크로몰로 조정합니다.

다음으로, DM을 사용하여 근아세포의 배지를 교체하고 1개의 마이크로몰의 최종 농도에서 각 웰에 모르폴리노를 첨가합니다. 16-18시간 동안 배양합니다. 그런 다음 RNA 추출을 위해 세포를 수집하려면 세포에 1ml의 구아니디늄 티오시아네이트-페놀-클로로포름을 추가하여 플레이트에서 분리합니다.

실온에서 10분 동안 세포를 배양한 후 세포를 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 각 튜브에 200마이크로리터의 클로로포름을 추가하고 RNA 층, 단백질 층 및 DNA 층의 세 가지 별도 층이 보일 때까지 실온에서 2분 동안 배양합니다. 12, 000 시간 g 및 15 분 동안 4 섭씨 온도에 관에 분리기

그런 다음 상층액의 최상층을 제거하고 500마이크로리터의 이소프로판올이 들어 있는 튜브로 옮깁니다. 상등액을 제거하고 RNA 펠릿을 저장하기 전에 상등액 튜브를 회전시킵니다. 펠릿을 세척하기 위하여 에타놀을 사용하고, 5 분 동안 8의, 000 시간 g 및 4 섭씨 온도에 분리기를 이용하십시오.

15-30마이크로리터의 RNase-free 물을 추가하기 전에 튜브를 15분 동안 뒤집어 잔류 에탄올을 증발시킵니다. 그런 다음 260나노미터에서 UV-Vis 분광법을 사용하여 RNA를 정량화합니다. RT-PCR을 수행하려면 다음 시약을 함께 혼합하고 최종 부피 25마이크로리터에 물을 첨가합니다.

샘플을 thermocycler에 넣고 다음 프로그램을 실행합니다. 실행이 완료되면 제품을 섭씨 4도 또는 섭씨 20도에서 보관하십시오. 근육 주사를 시행하려면 텍스트 프로토콜에 따라 동물을 수술 준비하고 마취한 후 메스를 사용하여 두개골 경골 위로 세로로 약 5cm 길이의 피부를 자르거나 주사 부위를 표시 CT.To 수술 바늘과 수술 실을 사용하여 2cm 간격으로 두 개의 스티치 마커를 만들어 깊은 근막을 꿰매십시오.

보다 정확한 생검을 할 수 있도록 주사 부위를 실로 표시하는 것이 매우 중요합니다. 다음으로, 27게이지 바늘을 사용하여 원하는 농도의 AON을 근육에 주입하고 바늘을 1분 동안 그대로 둡니다. 그런 다음 개복 근육 생검을 수행하려면 외과용 메스를 사용하여 CT 근육에서 약 2cm 길이의 근육 조직 조각을 제거합니다.

근육 근막을 근육 위에 다시 놓고 000 흡수성 실을 사용하여 조직을 닫습니다. 그런 다음 000 나일론 실을 사용하여 피부를 닫습니다. 바늘을 사용하여 부프레노르핀 염산염 1kg당 0.02mg을 근육 주사합니다.

각 AON을 동일한 양으로 함유한 칵테일을 사지 정맥에 주입하려면 텍스트 프로토콜에 따라 동물을 잡고 있는 동안 사지 정맥에 정맥 내주 바늘을 삽입합니다. 주입 펌프 또는 주사기 드라이버를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 20분 동안 분당 2.5밀리리터씩 총 50ml를 주입합니다. 반복적인 주사로 디스트로핀 발현이 축적되므로 매주 또는 격주로 주사를 반복하십시오.

독성을 검사하기 위해 매주 혈액 검사를 수행하려면 바늘을 사용하여 앞다리 또는 뒷다리의 피하 정맥 중 하나에서 3ml의 혈액을 채취합니다. 제조업체의 지침에 따라 다음 평가를 포함합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 추가 분석을 수행합니다.

각 AON의 효과를 비교하기 위해 다양한 2'OMePS 처리 조건으로 Myoblast를 transfection했습니다. 여기에 표시된 겔은 처리 4일 후 수집된 RNA의 RT-PCR 샘플을 나타냅니다. 겔의 더 높은 띠는 프레임 밖의 DMD 산물을 나타내며, 처리되지 않은 Ex8A 및 Ex8B 처리된 근아세포에서 관찰되었습니다.

Ex6A, Ex6B, Ex8A 및 칵테일 처리된 근아세포는 프레임 내 산물을 보여주었습니다. cDNA 염기서열분석을 통해 Exon 6에서 9까지 건너뛴 것을 확인했습니다. 이 그림에서 볼 수 있듯이, 면역세포화학(immunocytochemistry)은 AON을 투여한 개 세포가 처리되지 않은 샘플에 비해 디스트로핀 양성 섬유를 증가시켰다는 것을 밝혔습니다.

다양한 AON 치료 조건의 효능을 비교하기 위해 CXMD 개에게 Ex6A 또는 Ex6A, Ex6B, Ex8A의 칵테일을 다양한 용량으로 주사했습니다. DYS1에 대해 염색된 근육 샘플은 칵테일 처리된 샘플에서 디스트로핀 발현이 증가하고, 디스트로핀 용량에 따라 디스트로핀 양성 섬유가 증가함을 보여줍니다. 전신 주사 후, 칵테일 치료를 받은 CXMD 개는 CT와 심장 근육 샘플 모두에서 NT CXMD 개에 비해 디스트로핀 발현이 증가한 것으로 나타났습니다.

그러나 AON을 처리한 골격근은 치료된 심장근에 비해 디스트로핀의 발현이 훨씬 더 높았습니다. 또한, 치료된 CXMD 개는 NT CXMD 개에 비해 중심 핵 섬유가 현저히 감소하여 조직 병리학이 개선된 것으로 나타났습니다. 일단 마스터되면 시험관 내 및 생체 내 실험이 제대로 수행되면 몇 시간 내에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 개의 건강 상태를 주의 깊게 모니터링하는 것이 중요합니다. 개발 후, 전신 엑손 건너뛰기는 이 분야의 연구자들이 DMD 환자를 대상으로 인간 임상 시험을 시작할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 보고 나면 안티센스 올리고뉴클레오티드가 있는 개를 치료하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.