종양 개발의 평가를 위해 마이크로 컴퓨터 단층 촬영을 사용하고 후속 치료에 대한 반응의를 폐암의 마우스 모델에서

이 비디오의 전반적인 목표는 폐암 생쥐 모델에서 종양 발생, 치료 반응 및 기타 실험을 평가하기 위해 Micro CT를 사용할 때의 이점을 식별하는 것입니다. 이 방법은 마우스 모델을 사용할 때 종양이 성장하기 시작하는 시기, 성장 속도 및 치료 개입에 대한 반응과 같은 폐암 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술을 통해 연구에서 제외해야 하는 동물을 식별하는 동시에 종양 크기의 실시간 변화를 감지할 수 있습니다.

이 기술은 시간과 노력을 절약하고 연구 그룹당 마우스 수를 현저히 줄입니다. Micro-CT 스캐너에서 컴퓨터 제어 장치에 액세스하고 RMCT2"라는 소프트웨어 패키지를 엽니다.그런 다음 워밍업 사이클을 시작합니다. 다음으로, 마우스용 스캐너 샘플 베드를 플라스틱으로 싸서 준비합니다.

다음으로, 이소플루란을 사용하여 마우스를 마취하고 피부 꼬집음을 사용하여 마우스가 마취되었는지 확인합니다. 피부가 살짝 펴 펴는 것으로 충분합니다. 다음으로, 각막 건조를 방지하기 위해 안과 연고를 바릅니다.

이제 마우스를 등쪽이 위로 향하게 하여 샘플 베드에 놓습니다. 마우스의 머리를 잡고 몸을 아래쪽 다리에서 아래쪽으로 당겨 몸을 대칭으로 펴고 곧게 펴십시오. 그런 다음 마취 가스를 챔버로 보내고 가스 튜브를 동물의 코 옆에 배치하여 지속적인 마취제를 투여합니다.

그런 다음 마우스와 샘플 침대를 플라스틱으로 감싸 마우스를 제자리에 고정합니다. 스캔 중 마우스를 움직이거나 비틀면 흐릿하고 사용할 수 없는 이미지가 생성되므로 마우스가 고정되어 있는지 확인하십시오. 이제 챔버를 닫고 시스템을 90킬로볼트 및 160마이크로암페어로 조정하고 스캔 시간을 4.5분으로 설정합니다.

이미지 범위를 24mm로 설정합니다. 그런 다음 하트비트에 대해 시스템을 동기 모드로 설정합니다. 이제 데이터베이스에 새 이미지에 대한 새 폴더를 만들고 스캔을 시작하십시오.

스캔을 완료한 후 마우스를 빈 케이지로 옮기고 의식을 회복할 때까지 관찰합니다. 마취에서 완전히 회복될 때까지 수용 동료에게 반환하지 마십시오. 이미지 J에서 연속 마이크로 CT 이미지 파일을 엽니다.목에서 복부로 또는 그 반대로 각 마우스의 모든 이미지를 스크롤합니다.

이제 순진한 야생형 쥐의 스캔을 사용하여 흉부의 다양한 부위와 정상적인 해부학적 구조의 밀도를 확인합니다. 희끄무레한 복부 내장과 횡격막까지 스크롤을 올려 가슴을 통해 목까지 영역을 확인합니다. 뼈가 있는 흉곽의 랜드마크, 흉골과 척추, 갈비뼈를 기록해 두십시오.

그런 다음 가슴 앞쪽에 있는 심장과 심장 근처와 종격동에 있는 주요 혈관을 확인합니다. 기관 내강은 목과 가슴 위쪽 높이에 있는 작은 다크서클로, 오른쪽과 왼쪽의 주요 기관지로 나뉜 다음 점점 더 작은 기관지로 계속 분기됩니다. 각 기관지는 두 개 또는 세 개의 혈관과 밀접하게 연관되어 있습니다.

이제 유도되지 않은 DT 마우스의 스캔을 검사하고 이상이 있는지 확인하십시오. 결절 또는 폐기종성 수포와 같은 비정상적인 유도 전 폐 그림자가 있는 마우스는 실험에서 제외합니다. 이 실험에서는 FGF9 유발 종양을 생성할 수 있는 정상적인 폐 스캔을 가진 마우스를 사용합니다.

종양을 유도하려면 차우에 200ppm으로 독시사이클린을 투여합니다. 10주 후, 이 쥐의 폐에 종양 결절이 생겼는지 확인하기 위해 두 번째 Micro-CT 스캔을 수행합니다. 그런 다음 마우스를 두 그룹으로 나눕니다.

FGFR 차단제인 AZD4547를 위관을 통해 한 그룹에 투여합니다. 10주 동안 일주일에 6일 동안 이 작업을 수행합니다. 다른 그룹에게는 위약을 준다.

결절 그림자의 변화를 추적하려면 치료 4-5주 후에 세 번째 스캔을 수행합니다. 나중에 10주간의 전체 치료가 끝나면 네 번째 스캔을 수행합니다. 그런 다음, 서로 다른 시점에서 연속 스캔 이미지 내의 유사한 위치를 비교하여 치료에 대한 반응으로 종양 결절의 동적 변화를 식별합니다.

비정상적인 그림자가 나타나거나 사라지는지 확인합니다. 동일한 해부학적 위치로 올바른 방향을 잡는 것은 결과를 해석하는 데 매우 중요합니다. 흉부 내에서 기관, 기관, 분기점, 좌우 주요 기관지, 대동맥 및 큰 혈관, 횡격막과 같이 쉽게 식별할 수 있는 해부학적 랜드마크를 사용합니다.

몸이 기울어지기 때문에 뼈는 덜 유용한 랜드마크가 됩니다. 쥐를 안락사시킨 후 목과 폐에 접근하여 심장과 흉선을 잘라냅니다. 기관 뒤에 집게를 삽입하여 식도와 분리합니다.

다음으로, G24 캐뉼라를 사용하여 기관을 캐뉼러하고 기관 간 끝 주위에 봉합사를 매듭을 지어 캐뉼라를 고정합니다. 이제 25cm 기둥이 있는 캐뉼러를 통해 얼음처럼 차가운 4% PFA를 사용하여 폐를 팽창시키고 고정합니다. 그런 다음 캐뉼라를 분리하고 기관의 매듭을 조여 PFA 누출을 방지합니다.

이제 후두에 부착된 것을 포함하여 상부 기관을 잘라냅니다. 그리고 봉합사에서 기관을 당기면서 모든 부착물에서 기관과 폐를 절개합니다. 그런 다음 폐와 함께 기관을 제거하십시오.

실온 5%PFA 5ml가 들어 있는 15ml 튜브에 티슈를 넣습니다. 완전한 조직 침투 및 고정을 위해 폐를 밤새 PFA에 두십시오. 그런 다음 평소와 같이 조직을 처리합니다.

이 연구를 위해 8-12주 된 DT 마우스를 사전 스크리닝한 결과, 약 절반이 Micro-CT 스캔에서 폐 이상을 보여 포함하기에 적합하지 않았습니다. 이 연구를 위해 종양 유도를 10주 동안 활성화한 후 치료를 진행했습니다. FGFR 억제제인 AZD4547를 10주 동안 투여한 마우스는 치료 전 스캔에서 볼 수 있는 결절의 크기가 사라지거나 감소하는 것으로 나타났습니다.

반면에, 위약을 투여한 대조군 마우스는 변화가 없거나, 결절 크기가 증가하거나, 새로운 결절이 나타났습니다. 폐의 종말점 조직학적 평가는 Micro-CT 스캔으로 얻은 결과의 정확성을 확인합니다. 실제로 깨끗한 폐를 가지고 있다고 판단된 쥐는 정상적인 폐 조직학을 가지고 있었습니다.

반면, 이상을 보인 마우스는 수포와 결절을 포함한 다양한 조직학적 변화를 보였다. 독시사이클린을 주입한 지 10-12주 후, 모든 동물에서 다양한 크기와 위치를 가진 다발성 선암 결절이 관찰되었습니다. 이후 10-12주간의 FGFR 차단제 치료에서 결절이 점점 더 작아지는 것으로 나타났습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 Micro-CT를 사용하여 마우스 폐의 종양 발달을 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 그리고 다양한 실험 절차에 대한 응답으로 이러한 종양의 변화를 추적합니다. 일단 마우스가 시작되면 마우스당 10분 이내에 스캔을 수행할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 마우스를 깊은 마취 상태로 유지하고 스캔 중 움직임을 최소화하기 위해 샘플 베드에 단단히 감싸는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 개발 후 이 기술은 폐암 및 암 줄기세포 분야의 연구자들이 종양 발생 정도, 진행성 퇴행 및 다양한 실험 설정을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. X-Ray로 작업하는 것은 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오.

표준 기계 작동 절차에서는 이 절차를 수행하는 동안 항상 절차를 수행해야 합니다.