Name: 미토콘드리아 대사 유학을위한 플랫폼으로 인간 혈소판의 LC-MS 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 4 s
Description: 학습하세요 인간 혈소판을 이용한 LC-MS 분석으로 미토콘드리아 대사 변화를 연구하는 방법을. 동위원소 추적 기법으로 대사 적응을 정량화하고 질병 메커니즘과 치료 가능성을 탐색합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

우리는 NIH 보조금 P30ES013508 및 T32ES019851의 지원을 인정합니다.

윤리 정책 : 인간의 샘플의 처리에 관한 모든 프로토콜은 대학의 펜실베니아의 인간 연구 윤리위원회의 지침을 따르십시오. 버퍼의 1. 준비 및 100 배 스톡 솔루션 <ol><li> 기본 타이로드의 버퍼 1 L를 준비합니다. 2 ∙ 2 H 2 O, 0.224 g의 KCl, 및 0.095 g의의 MgCl 2. DDH 2 O.과 1 L에 총 볼륨을 조정 8.123 g의 NaCl, 1.428 g의 수 NaHCO3, 0.466 g의 염화칼슘을 결합 필터는 기본 타이로드의 버퍼를 소독. </li><li> 포도당과 팔 미트 산의 100 배 재고 솔루션을 준비합니다. 100 배 포도당 재고 솔루션의 경우, DDH 2 O 1 ㎖에서 100 mg의 포도당 또는 [13 C 6] 글루코스 공수를 용해 100 배 팔미 테이트 솔루션의 경우, 팔 미트 산의 2.56 mg을 에탄올 1 ㎖에서 [13 C 16] -palmitic 산 2.72 mg의 용해. 필터 100X 원액 살균. </li><li> 적절한 농축 타이로드의 버퍼를 준비합니다 <ol&gt; <li> 비 표지 연구의 경우, 1 100 배 포도당 주식 솔루션 ㎖의 기본 타이로드의 버퍼의 98 ml의에 100 배 팔 미트 산 원액 1ml를 추가합니다. </li><li> 포도당 라벨 연구의 경우, 기본 타이로드의 버퍼의 98 ml의 100 배 팔 미트 산 원액 1 100 배 [13 C 6] 글루코스 공수 원액의 mL 및 1 ml에 추가 할 수 있습니다. </li><li> 팔 미트 산 라벨 연구의 경우, 기본 타이로드의 버퍼의 98 ml를 1 ml의 [13 C 16] -palmitic 산 원액 ml의 포도당 원액 100 배의 1을 추가합니다. </li></ol></li><li> 로테 처리를위한 솔루션을 준비 <ol><li> 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)에 로테의 10 mM 스톡 용액을 준비한다. </li><li> 비 표시 용량 - 반응 시험의 경우, 1.4.3를 진행합니다. 단일 용량에서 라벨 연구의 경우, 1.4.5를 진행합니다. </li><li> 1 nM 내지 100 μM까지 로테 농도와 솔루션을 얻기 위해 DMSO에 10 밀리미터 로테 주식의 일련의 희석을 수행합니다. 이들은 100 배 재고 있습니다에스. </li><li> 오후 10시 1 μM까지 로테 농도와 솔루션을 준비 1.3.1에서 기본 타이로드의 버퍼 + 포도당 + 팔 미트 산 5 ml의 각 주식의 50 μl를 추가합니다. 또한, 차량 제어 역할을 DMSO의 50 μl를 추가합니다. 2.1로 진행합니다. </li><li> 10 μM 작업 용액을 얻었다 DMSO에 10 mM의 스톡 용액을 1000 배로 희석. </li><li> 5 ml의 기본 타이로드의 버퍼 + 각이 주식의 50 μl를 추가합니다 [13 C 6] 글루코스 공수 + 팔 미트 산을 1.3.2에서베이스 타이로드의 버퍼 + 포도당 + [(13) C (16)] 1.3.3에서 -palmitic 산. 최종 농도는 100 나노 로테이다. 또한, 차량 제어 역할을하는 각 버퍼에 DMSO의 50 μl를 추가합니다. </li></ol></li></ol> 2. 혈소판 분리 참고 :이 방법은 하나 전혈이나 혈소판 가방에서 유래 혈소판 의무가 있습니다. 여기에 포함 된 예제 데이터를 제조 하였다혈소판 가방에서 파생 된 혈소판을 사용. 바수 등의 알을 참조하시기 바랍니다. (5) 전체 혈액에서 분리 된 혈소판을 사용에 대한 자세한 내용은. <ol><li> 전체 혈액에서 혈소판 분리 참고 : 혈소판의 가방에서 혈소판을 분리하는 경우, 2.2.1를 진행합니다. <ol><li> 없이 브레이크와 15 분 동안 175 x g에서 원심 분리기 전혈. </li><li> 전송 상부 혈소판 풍부 혈장 1 ㎖ (PRP)을 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브 층을 포함한다. </li><li> 5 분 동안 400 × g으로의 PRP를 원심 분리기. </li><li> 기음 뜨는 및 3.1 또는 3.2 단계로 진행합니다. </li></ol></li><li> 혈소판 가방에서 혈소판 분리 <ol><li> 전사 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 혈소판 현탁액 1 ㎖. </li><li> 5 분 동안 400 XG에 현탁액을 원심 분리기. </li><li> 기음 뜨는 및 3.1 단계로 진행합니다. 또는 3.2. </li></ol></li></ol> 3. 실험 수행 <ol><li> 생체이의 효과를 결정하기 위해치료 (예를 들어, 로테) 관심의 대사 산물의 수준에 (예를 들어, 아세틸 -CoA), 3.1.1를 진행합니다. 관심의 하류 대사 산물로 대사 전구 물질의 혼입에 생체이 물 (예., 로테)의 효과를 확인하려면 3.2.1를 진행합니다. <ol><li> 각 조건에 대해 셋 정도의 생물학적 복제를 사용하지 않고, 단계 1.4.4에서 각 솔루션 1 ml의 단계 2.1.4 또는 2.2.3에서 혈소판 펠렛을 재현 탁. </li><li> 95 % 습도, 5 % CO 2, 1 시간 동안 37 ℃로 설정된 물 재킷 CO 2 인큐베이터에 재현 탁 혈소판 부화. 4.1 단계로 진행 참고 : 여기에 우리는 용량 반응 실험에 대해 설명합니다. 대안 적으로, 시간 경과 실험이 수행 될 수는있는 용량은 고정시키고 인큐베이션 길이 대신 변화시켰다. </li></ol></li><li> 관심 하류 대사 산물로의 대사 전구체의 혼입에 생체이 치료의 효과를 결정한다. <ol><li> 유각 조건에 대한 세 가지 생물학적 복제보다 적은 노래하지, 단계 1.4.6에서 표시 타이로드의 버퍼의 각 제제의 1ml의 단계 2.1.4 또는 2.2.3에서 혈소판 펠렛을 재현 탁. </li><li> 95 % 습도, 5 % CO 2, 1 시간 동안 37 ℃로 설정된 물 재킷 CO 2 인큐베이터에 재현 탁 혈소판 부화. 4.1 단계로 진행합니다. </li></ol></li></ol> 4. 담금질 및 CoA를 추출 <ol><li> 3 분 동안 3,000 XG에 원심 분리하여 혈소판 펠렛. </li><li> 기음 뜨는. </li><li> 750 ㎕의 얼음 냉 10 % 트리클로로 아세트산에 재현 탁 혈소판 (W / V). </li><li> 적절한 안정 동위 원소 표지 내부 표준을 추가합니다. 예를 들어, 목표는 샘플을 가로 질러 아실 CoA의 종 수준과 비교 안정 동위체 앞에서 설명한대로 효모에서 얻은 표지 된 CoA 티오 에스테르 (SILEC 기술) (29)의 혼합물 100 μl를 사용하는 것이다. </li><li> 펄스 초음파 처리 각 시료를 0.5 초 펄스 30 번. </li><li> 4 ℃에서 10 분 동안 16,000 XG에 원심 분리기 샘플. </li><li> 진공 매니 폴드 C18 고체상 추출 (SPE)를 부착 기둥. </li><li> 1 ml의 메탄올과 열을 조건입니다. </li><li> 1 ML의 DDH 2 O.로 열 평형 </li><li> 열을 통해 샘플에서 파생 된 상층 액 (이 경우 약 850 μl를) 실행합니다. </li><li> 1 ml의 물에 열을 씻으십시오. </li><li> 진공 매니 폴드에로드 10 ㎖ 유리 원심 관이 용출 분획을 수집한다. </li><li> 메탄올 중 25 mM의 아세트산 암모늄 1 mL로 컬럼을 용출. </li><li> 질소 가스 하에서 건조 용출액. </li><li> 50 μl의 5 % (w / v)의 5 술포 산에서 건조 잔류를 재현 탁하고 HPLC 바이알로 전송합니다. </li></ol> 5. HPLC 설치 <ol><li> HPLC를위한 시스템 제어 소프트웨어를 사용하여 표 1에 나열된 바와 같이, 분석 대상 물질과 열 이용에 최적화 HPLC 조건을 생성하는 방법. 참고 : 열 temperat를이러한 데이터의 생성에 사용 URE 25 ℃로했지만, 특정 파라미터는 악기에서 관심의 화합물에 대해 다를 것이다. 아실 CoA를 정량 들면, LC-MS 분석의 여러 가지 방법이보고되어 있고, 서로 다른 LC 조건 14,19,20 다른 분석 물에 대한 검증. </li><li> HPLC를 적절하게 평형을 허용합니다. 참고 :이 방법의 시작 용매 조건에서 컬럼의 컬럼과 평형을 연결하기 전에 용매의 양 프라이밍을 포함해야한다. 평형 볼륨은 제조업체의 지시에 따라해야하고, 그 결과 유출 물 낭비 전환해야합니다. 참고 : HPLC 설정에 대한 자세한 내용은 바수와 블레어 (5)를 참조하십시오. </li></ol> 6. 질량 분석기 설치 <ol><li> 질량 분석 장치에 대한 제어 소프트웨어를 사용하여 관심 화합물의 이온화 된 형태의 검출을위한 타겟을 만드는 방법. 매개 변수되게됩니다표 2인치 주 : 이들 화합물의 안정 동위체 유사체는 양 또는 음의 모드가 우수한 감도를 제공할지 여부를 결정하고 그 검출을위한 소스 및 광학 조건을 최적화하기 위해 사용되어야한다. 질량 분석계에있어서의 총 검출 시간 연관된 HPLC 방법의 시간 성분에 대응한다. 주 : 앞서 언급 된 바와 같이, 아실 CoA를 분석의 다수의 방법은 양극 (14)과 음극 (15)의 이온화 모드 오히려 삼중 사중 악기 (28)보다 고해상도 질량 분석기 (17)의 사용을 포함하여,보고되었다. </li><li> 깨끗하고, 악기를 교정 분광계로 안정적인 스프레이를 확립하고, 보정 용액이 적절 소스와 제조업체의 지침에 따라 광학에서 발산하는 시간을 허용합니다. </li><li> 질량 분석기 제어 소프트웨어와 모든 샘플에 대한 순서를 설정합니다. 의 inclu이름이나 숫자 식별자를 해제하고 적절한 주입 볼륨과 악기 방법을 나타냅니다. 첫 번째 샘플 전에 빈을 실행하고 이월 또는 매트릭스 효과를 완화하기 위해 필요에 따라 샘플 사이에 다른 공백 및 세척을 실행합니다. 주 : 선택된 분석 &#39;액체 크로마토 그램의 피크의 통합을위한 처리 방법들은이 시퀀스 내에서 설정되거나 후속 적 데이터 처리에 적용 할 수있다. </li><li> 순서를 시작하고 압력 변동 또는 시스템 장애 및 운전 중 신호 강도의 손실을 포함하여 문제를 주기적으로 질량 분석기 및 HPLC 시스템을 모니터링 할 수 있습니다. 주 : 심각한 문제 또는 영구 실행 실패 실행과 퍼지를 중지 요구 및 재 평형화 세척뿐만 아니라 HPLC 시스템 및 질량 분석을 교정 할 수있다. 단말기 설정 및 데이터 처리에 대한 자세한 내용은 바수와 블레어 (5)를 참조하십시오. </li></ol>

<ol><li>Ault, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+utility+of+flow+cytometry+in+the+study+of+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Hematol%22%5BJournal%5D)">The clinical utility of flow cytometry in the study of platelets.</a> Semin. Hematol. 38 (2), 160-168 (2001).</li>
<li>Avila, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+mitochondrial+dysfunction+is+evident+in+type+2+diabetes+in+association+with+modifications+of+mitochondrial+anti-oxidant+stress+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Clin.+Endocrinol.+Diabetes%22%5BJournal%5D)">Platelet mitochondrial dysfunction is evident in type 2 diabetes in association with modifications of mitochondrial anti-oxidant stress proteins.</a> Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 120 (4), 248-251 (2012).</li>
<li>Basu, S. S., Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotenone-mediated+changes+in+intracellular+coenzyme+A+thioester+levels%3A+implications+for+mitochondrial+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Rotenone-mediated changes in intracellular coenzyme A thioester levels: implications for mitochondrial dysfunction.</a> Chem. Res. Toxicol. 24 (10), 1630-1632 (2011).</li>
<li>Basu, S. S., Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SILEC%3A+a+protocol+for+generating+and+using+isotopically+labeled+coenzyme+A+mass+spectrometry+standards%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">SILEC: a protocol for generating and using isotopically labeled coenzyme A mass spectrometry standards.</a> Nat. Protoc. 7 (1), 1-12 (2012).</li>
<li>Basu, S. S., Deutsch, E. C., Schmaier, A. A., Lynch, D. R., Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+platelets+as+a+platform+to+monitor+metabolic+biomarkers+using+stable+isotopes+and+LC-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">Human platelets as a platform to monitor metabolic biomarkers using stable isotopes and LC-MS.</a> Bioanalysis. 5 (24), 3009-3021 (2013).</li>
<li>Berson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+for+experimental+buprenorphine+hepatotoxicity%3A+major+role+of+mitochondrial+dysfunction+versus+metabolic+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms for experimental buprenorphine hepatotoxicity: major role of mitochondrial dysfunction versus metabolic activation.</a> J. Hepatol. 34 (2), 261-269 (2001).</li>
<li>Castell, J. V., Jover, R., Martinez-Jimenez, C. P., Gomez-Lechon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+cell+lines%3A+their+use%2C+scope+and+limitations+in+drug+metabolism+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Opin.+Drug+Metab+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte cell lines: their use, scope and limitations in drug metabolism studies.</a> Expert. Opin. Drug Metab Toxicol. 2 (2), 183-212 (2006).</li>
<li>Ciccimaro, E., Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable-isotope+dilution+LC-MS+for+quantitative+biomarker+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">Stable-isotope dilution LC-MS for quantitative biomarker analysis.</a> Bioanalysis. 2 (2), 311-341 (2010).</li>
<li>Dang, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Links+between+metabolism+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Links between metabolism and cancer.</a> Genes Dev. 26 (9), 877-890 (2012).</li>
<li>Darnell, M., Weidolf, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+of+xenobiotic+carboxylic+acids%3A+focus+on+coenzyme+A+conjugation%2C+reactivity%2C+and+interference+with+lipid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Metabolism of xenobiotic carboxylic acids: focus on coenzyme A conjugation, reactivity, and interference with lipid metabolism.</a> Chem. Res. Toxicol. 26 (8), 1139-1155 (2013).</li>
<li>Des Rosiers, C., Fernandez, C. A., David, F., Brunengraber, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversibility+of+the+mitochondrial+isocitrate+dehydrogenase+reaction+in+the+perfused+rat+liver.+Evidence+from+isotopomer+analysis+of+citric+acid+cycle+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Reversibility of the mitochondrial isocitrate dehydrogenase reaction in the perfused rat liver. Evidence from isotopomer analysis of citric acid cycle intermediates.</a> J. Biol. Chem. 269 (44), 27179-27182 (1994).</li>
<li>Ellis, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+profiling+detects+early+effects+of+environmental+and+lifestyle+exposure+to+cadmium+in+a+human+population%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Med%22%5BJournal%5D)">Metabolic profiling detects early effects of environmental and lifestyle exposure to cadmium in a human population.</a> BMC. Med. 10, 61(2012).</li>
<li>Grevengoed, T. J., Klett, E. L., Coleman, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acyl-CoA+metabolism+and+partitioning%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Acyl-CoA metabolism and partitioning.</a> Annu. Rev. Nutr. 34, 1-30 (2014).</li>
<li>Haynes, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+fatty+acyl-coenzyme+As+in+mammalian+cells+by+liquid+chromatography-electrospray+ionization+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitation of fatty acyl-coenzyme As in mammalian cells by liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry.</a> J. Lipid Res. 49 (5), 1113-1125 (2008).</li>
<li>Ikegawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+cholyl-adenylate+in+rat+liver+microsomes+by+liquid+chromatography%2Felectrospray+ionization-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Characterization of cholyl-adenylate in rat liver microsomes by liquid chromatography/electrospray ionization-mass spectrometry.</a> Anal. Biochem. 266 (1), 125-132 (1999).</li>
<li>Kalghatgi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bactericidal+antibiotics+induce+mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+damage+in+Mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Bactericidal antibiotics induce mitochondrial dysfunction and oxidative damage in Mammalian cells.</a> Sci. Transl. Med. 5 (192), 192ra85(2013).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+Metabolomics+with+Acyl-CoA+Profiling+Reveals+Widespread+Remodeling+in+Response+to+Diet%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">High-Resolution Metabolomics with Acyl-CoA Profiling Reveals Widespread Remodeling in Response to Diet.</a> Mol. Cell Proteomics. 14 (6), 1489-1500 (2015).</li>
<li>Lopez-Gallardo, E., Iceta, R., Iglesias, E., Montoya, J., Ruiz-Pesini, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OXPHOS+toxicogenomics+and+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">OXPHOS toxicogenomics and Parkinson's disease.</a> Mutat. Res. 728 (3), 98-106 (2011).</li>
<li>Magnes, C., Sinner, F. M., Regittnig, W., Pieber, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LC%2FMS%2FMS+method+for+quantitative+determination+of+long-chain+fatty+acyl-CoAs%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">LC/MS/MS method for quantitative determination of long-chain fatty acyl-CoAs.</a> Anal. Chem. 77 (9), 2889-2894 (2005).</li>
<li>Mauriala, T., Herzig, K. H., Heinonen, M., Idziak, J., Auriola, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+long-chain+fatty+acid+acyl-coenzyme+A+compounds+using+liquid+chromatography-electrospray+ionization+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B+Analyt.+Technol.+Biomed.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Determination of long-chain fatty acid acyl-coenzyme A compounds using liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry.</a> J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 808 (2), 263-268 (2004).</li>
<li>Murphy, T. A., Dang, C. V., Young, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotopically+nonstationary+13C+flux+analysis+of+Myc-induced+metabolic+reprogramming+in+B-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Metab+Eng%22%5BJournal%5D)">Isotopically nonstationary 13C flux analysis of Myc-induced metabolic reprogramming in B-cells.</a> Metab Eng. 15, 206-217 (2013).</li>
<li>Paglia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomic+analysis+of+platelets+during+storage%3A+a+comparison+between+apheresis-+and+buffy+coat-derived+platelet+concentrates%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Metabolomic analysis of platelets during storage: a comparison between apheresis- and buffy coat-derived platelet concentrates.</a> Transfusion. 55 (2), 301-313 (2015).</li>
<li>Patti, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+strategies+for+untargeted+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Sep.+Sci%22%5BJournal%5D)">Separation strategies for untargeted metabolomics.</a> J. Sep. Sci. 34 (24), 3460-3469 (2011).</li>
<li>Robishaw, J. D., Neely, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coenzyme+A+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Coenzyme A metabolism.</a> Am. J. Physiol. 248 (1 Pt 1), E1-E9 (1985).</li>
<li>Rodgers, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+platelet+physiology+and+laboratory+evaluation+of+platelet+function%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Obstet.+Gynecol%22%5BJournal%5D)">Overview of platelet physiology and laboratory evaluation of platelet function.</a> Clin. Obstet. Gynecol. 42 (2), 349-359 (1999).</li>
<li>Salles, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+high-throughput+ELISA+assay+for+platelet+function+testing+using+platelet-rich+plasma+or+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb.+Haemost%22%5BJournal%5D)">Development of a high-throughput ELISA assay for platelet function testing using platelet-rich plasma or whole blood.</a> Thromb. Haemost. 104 (2), 392-401 (2010).</li>
<li>Snyder, N. W., Basu, S. S., Worth, A. J., Mesaros, C., Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+of+propionic+acid+to+a+novel+acyl-coenzyme+A+thioester+by+mammalian+cell+lines+and+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Metabolism of propionic acid to a novel acyl-coenzyme A thioester by mammalian cell lines and platelets.</a> J. Lipid Res. 56 (1), 142-150 (2015).</li>
<li>Snyder, N. W., Basu, S. S., Zhou, Z., Worth, A. J., Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+isotope+dilution+liquid+chromatography%2Fmass+spectrometry+analysis+of+cellular+and+tissue+medium-+and+long-chain+acyl-coenzyme+A+thioesters%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Stable isotope dilution liquid chromatography/mass spectrometry analysis of cellular and tissue medium- and long-chain acyl-coenzyme A thioesters.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 28 (16), 1840-1848 (2014).</li>
<li>Snyder, N. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+stable+isotope-labeled+acyl-coenzyme+A+thioesters+by+yeast+stable+isotope+labeling+by+essential+nutrients+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Production of stable isotope-labeled acyl-coenzyme A thioesters by yeast stable isotope labeling by essential nutrients in cell culture.</a> Anal. Biochem. 474, 59-65 (2015).</li>
<li>Wallace, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+diseases+in+man+and+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial diseases in man and mouse.</a> Science. 283 (5407), 1482-1488 (1999).</li>
<li>Wojtovich, A. P., Brookes, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+II+inhibitor+atpenin+A5+protects+against+cardiac+ischemia-reperfusion+injury+via+activation+of+mitochondrial+KATP+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Res.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">The complex II inhibitor atpenin A5 protects against cardiac ischemia-reperfusion injury via activation of mitochondrial KATP channels.</a> Basic Res. Cardiol. 104 (2), 121-129 (2009).</li>
<li>Worth, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+isotopes+and+LC-MS+for+monitoring+metabolic+disturbances+in+Friedreich%27s+ataxia+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">Stable isotopes and LC-MS for monitoring metabolic disturbances in Friedreich's ataxia platelets.</a> Bioanalysis. 7 (15), 1843-1855 (2015).</li>
<li>Worth, A. J., Basu, S. S., Snyder, N. W., Mesaros, C., Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+neuronal+cell+mitochondrial+complex+I+with+rotenone+increases+lipid+beta-oxidation%2C+supporting+acetyl-coenzyme+A+levels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Inhibition of neuronal cell mitochondrial complex I with rotenone increases lipid beta-oxidation, supporting acetyl-coenzyme A levels.</a> J. Biol. Chem. 289 (39), 26895-26903 (2014).</li>
<li>Zhou, L., Schmaier, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+aggregation+testing+in+platelet-rich+plasma%3A+description+of+procedures+with+the+aim+to+develop+standards+in+the+field%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Platelet aggregation testing in platelet-rich plasma: description of procedures with the aim to develop standards in the field.</a> Am. J. Clin. Pathol. 123 (2), 172-183 (2005).</li>
</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언합니다.

여기에서 우리는 교란 미토콘드리아 대사 연구를위한 플랫폼으로 고립 된 혈소판의 유틸리티를 보여 주었다. 특히, 우리는 로테으로 복잡한 I 억제에 대한 응답으로 신진 대사 적응을 특징으로하고있다. 본 연구는 인간의 혈소판에 세포 라인에서 로테 논에 의해 복잡한 I 억제의 역할 이전에보고 된 연구 결과를 확장했다. 중요한 것은,이 또한 억제 로테 혈소판 석시 닐 -CoA를 형성 혈소판 βHB 닐 -CoA의 증가를 자극하고 아세틸 -CoA의 혈소판 수준에 영향을 미치지 않는 것이 판명되었다. 큰 관심이 유형의 분석의 유효성 및 재현성을 보장하기 위해주의해야한다. 혈소판은 전혈로부터 분리 될 경우 림프구 오염 및 혈소판 활성화를 방지하기 위해, 전술 한 바와 같이, 상기 분리는 림프구 언 디스 포함 된 버피 코트를 떠나는 전념 특별한주의와 정확하게 진행해야turbed. 용량 반응 곡선은 의미가하기 위해서는, 연속 희석은 각 단계에서...

역기능 미토콘드리아 대사는 신경 변성, 암, 심혈관 질환 (30)을 포함하여 다양한 질환에 연루되어왔다. 따라서, 많은 노력이 질병의 발병에 기여하는 대사 결함을 특성화에 배치되었습니다. 액체 크로마토 그래피 - 탠덤 질량 분석 (LC-MS / MS)는 복잡한 생물학적 매트릭스에서 분석의 정량화를위한 ​​황금 표준으로 간주되며 종종 대사 연구 8 사용된다. 종종 인간의 질병과 관련이 접근하고 잘 정의 된 모델을 달성 생물 의학 연구의 경우입니다 그러나, 도전이다. 많은 연구는 세포 대사 7,9에 생체 이물질 또는 유전 적 이상의 영향을 프로빙을위한 세포 모델을 변형 사용한다. 혼란을 도입 할 수 암 세포에서 발생하는 대사 재 프로그래밍 (21) 요인 때문에 적합하지 않습니다. 이러한 문제는 circumve 될 수 있습니다대사 분석에 충분한 미생물을 얻는 것은 어려울 수 있지만, 일차 전지 모델 nted. 또한, 문화에 사용되는 항생제의 많은 양의 영향은 잠재적으로 혼란 미토콘드리아 연구 (16)과 같이 강조하고있다. 인간 혈소판 대사 연구 5,22,27,32 충분한 미토콘드리아 콘텐츠 일차 전지 모델을 이용할 수있는 기회를 제공. 혈액 공여자 개별 또는 혈액 은행에서 대량 흡입되므로 외부 요인 용이하게 제어 할 수있는 모델을 제공 내지 제 혈소판 쉽게 얻을 수있다. 둘째, 그들의 작은 크기 혈소판 용이에도 최소한 갖춘 실험실 5 최소 준비 작업과 다른 혈액 성분으로부터 분리 될 수있다. 참고로, 혈소판 핵을 포함하지 않는 때문에, 독립적으로 전사 조절 대사 변화를 연구하는 데 이용 될 수있다. 여기에 우리가 보여아실 - 조효소 A (COA) 티오 상대 정량 이외에 혈소판 격리 시스템은 탄​​소 대사를 검토 할 수있다. 특히, 우리는 중요한 대사 물질 아세틸으로 [(13) C] -label의 설립을 조사하기 위해 안정 동위 원소 (비 방사성) 표지 [13 C 6] 글루코스와 [13 C 16] -palmitate과 신진 대사 라벨의 사용을보고 CoA를 해당 작용 또는 지방산 산화를 통한. 이는 생화학 적 경로 13,24에서 아실 CoA를 종의 광범위한 참여와 같은 로테 3,33 복잡한 I의 억제와 같은 다른 변수를 테스트에이 시스템의 취급 용이성에 강력한 일반화하고, 다양한 플랫폼을 제공합니다. 아래의 프로토콜에서 제공하는 정보에 더하여, 동위 원소 표지하고 상기 LC-MS 기반 분석에 사용되는 방법의 광범위한 설명 바수 블레어 4에서 찾아 볼 수있다.

<table><tbody><tr><td><강>시약</강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨(NaCl)</td><td>시그마-알드리치</td><td>746398</td><td></td></tr><tr><td>중탄산나트륨(NaHCO3)</td><td>시그마-알드리치</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘 이수화물(CaCl2 * H2O)</td><td>시그마-알드리치</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>염화칼륨 (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘 (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208337</td><td></td></tr><tr><td>포도당</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>13C6-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>389374</td><td></td></tr><tr><td>팔미트산</td><td>케이맨</td><td>10006627</td><td></td></tr><tr><td>13C16-Palmitic</td><td>Acid Sigma-Aldrich</td><td>605573</td><td></td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>Trichloro Acetic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6399</td><td></td></tr><tr><td>5-sulfosalicylic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>390275</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitirle</td><td>Fischer Scientific</td><td>A996-4</td><td>(optima)</td></tr><tr><td>물(H2O)</td><td>Fischer Scientific</td><td>W7-4</td><td>(최적)</td></tr><tr><td>포름산</td><td>Fischer Scientific</td><td>85171</td><td>(최적)</td></tr><tr><td>디메틸설폭사이드</td><td>시그마-알드리치</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Fischer Scientific</td><td>04-355-222</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>피셔 Scientific</td><td>A454-4</td><td>(optima)</td></tr><tr><td>암모늄 아세테이트</td><td>Fischer Scientific</td><td>A639-500</td><td></td></tr><tr><td>2 ml Eppendorf Tubes</td><td>BioExpress</td><td>C-3229-1</td><td></td></tr><tr><td>LC 바이알(플라스틱)</td><td>Waters</td><td>186002640</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 유리 원심분리기 튜브</td><td>Kimble Chase</td><td>73785-10</td><td></td></tr><tr><td>오아시스 고체상 외출(SPE) 컬럼</td><td>Waters</td><td>WAT094225</td><td></td></tr><tr><td>Pastuer 피펫</td><td>Fischer Scientific</td><td>13-678-200</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 방수 인큐베이터</td><td>Nuaire</td><td>AutoFlow NU-8500</td><td></td></tr><tr><td>삼중 사중극자 질량 분석기</td><td>Thermo Scientific</td><td>Finnigan TSQ Quantum</td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Thermo Scientific</td><td>Dionex Ultimate 3000</td><td></td></tr><tr><td>출처</td><td>Thermo Scientific</td><td>HESI II</td><td></td></tr><tr><td>HPLC 컬럼</td><td>Phenomenex</td><td>Luna C18</td><td>3 &mu; M 입자 크기, 200mm x 2mm</td></tr></tbody></table>

미토콘드리아 대사 유학을위한 플랫폼으로 인간 혈소판의 lc-ms 분석

LC-MS Analysis of Human Platelets as a Platform for Studying Mitochondrial Metabolism

교란된 미토콘드리아 대사는 다양한 질병에서 원인적인 역할을 하는 것으로 새로운 관심을 받고 있습니다. 대사 경로의 변화를 조사하려면 외부 요인을 잘 제어할 수 있는 모델이 필요하며, 이를 통해 재현 가능하고 의미 있는 결과를 얻을 수 있어야 합니다. 많은 연구에서 이러한 목적을 위해 형질전환된 세포 모델을 사용합니다. 그러나 많은 암 세포주에서 발생하는 대사 재프로그래밍은 혼란스러운 변수를 유발할 수 있습니다. 이러한 이유로 일차 세포가 바람직하지만, 대사 연구를 위한 적절한 바이오매스를 확보하는 것은 어려울 수 있습니다. 여기에서 우리는 인간 혈소판이 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석 분석과 함께 대사 연구를 수행하기 위한 플랫폼으로 활용될 수 있음을 보여줍니다. 이 접근법은 상대적 정량화 및 동위원소 표지에 적합하여 특정 대사 경로의 활성을 조사할 수 있습니다. 개인 기증자 또는 혈액 은행에서 혈소판을 사용할 수 있기 때문에 이 모델 시스템을 임상 연구에 적용할 수 있으며 규모를 확대할 수 있습니다. 여기에서는 분리된 혈소판을 사용하여 복합 I 억제제 로테논에 대한 반응으로 이전에 확인된 보상 대사 변화를 확인합니다. 보다 구체적으로, 해당과정의 감소는 아세틸-CoA 수치를 유지하기 위한 지방산 산화의 증가를 동반합니다. 우리의 결과는 혈소판이 세포 대사에 대한 생체이물(xenobiotics)의 효과를 조사하기 위해 쉽게 접근할 수 있고 의학적으로 관련된 모델로 사용될 수 있음을 보여줍니다.

우리가 노출 로테 논에 결과 이​​전에 설명한 보상 대사 적응의 일반화를 재현 한이 방법의 유용성을 입증합니다. 이 결과는 이전에 세포 배양 모델에서 발견되었으며,이 연구는이 대사 변화도 anuclear과 세포 배양과 같은 실험적 인공물 경향이없는 혈소판 발생하면 테스트하고자 하였다. 그들의 신진 대사 활동을 유지하지만,이 작품은, 인간의 주입을 위해 너무 오래된 것으로 간주되었던 펜 외상 센터, 6 일 된 혈소판을 시행 하였다. 도 1에 도시 된 바와 같이 아이솔레이션 하였다. 총 흐름이 더 이상 환자에게 투여하는 데 유용 혈소판 가용성 96- 웰 플레이트 기반 높은 처리량 임상 견본 또는 실험 조건의 한정된 수로부터 용이하게 확장 될 수있다. (그림 2)의...

여기에서 우리는 고립 된 인간의 혈소판 내가 로테를 억제제 복잡한에 대한 응답으로 신진 대사 적응을 연구하는 생체 접근으로 모델을 사용할 수 있습니다 보여줍니다. 이 방법은 액체 크로마토 그래피 질량 분석에 의해 추적 동위 상대적 정량을 채용하고 연구 다양한 디자인을 적용 할 수있다.

미토콘드리아 대사 유학을위한 플랫폼으로 인간 혈소판의 LC-MS 분석

Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic ...

이 절차의 전반적인 목표는 제노바이오틱(xenobiotic) 처리 또는 질병 상태가 세포 대사를 어떻게 변화시키는지 결정하는 것입니다. 이 방법은 질병 상태나 투여된 독소가 세포 대사에 어떤 영향을 미치는지 밝혀낼 가능성이 있습니다. 그리고 이를 알게 되면, 본 방법은 특정 종류의 중재를 통해 해당 결함을 교정할 수 있는지 여부를 밝혀낼 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 형질전환된 세포주에 의존하지 않으므로 인체 건강과 직접적으로 관련된 결과를 제공할 가능성이 더 높다는 것입니다. 이 절차를 시작하려면 dimethyl sulfoxide에 rotenone 10 millimolar 스톡 용액을 준비하십시오. 10 millimolar rotenone 스톡 용액을 연속 희석하여 rotenone 농도가 1 nanomolar에서 100 micromolar 범위인 용액들을 제조하십시오.다음으로, 미리 준비한 농축 Tyrode's 버퍼 용액 5 mL에 각각의 스톡 용액 50 µL를 추가하여 rotenone 농도가 10 pM에서 1 µM 범위인 용액들을 준비합니다. 대조군(vehicle control)으로 사용하기 위해 버퍼 용액 샘플 중 하나에 DMSO 50 µL를 추가합니다. 전혈에서 혈소판을 분리하려면, 전혈 샘플을 175 x g에서 15분 동안 정지 없이 원심분리합니다.완료되면, 상층의 혈소판 풍부 혈장(platelet-rich plasma) 1 mL를 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 혈소판 풍부 혈장을 옮길 때 버피코트(buffy coat)가 섞이지 않도록 주의하여 혈소판 펠릿이 림프구에 의해 오염되지 않도록 합니다. 혈소판 풍부 혈장 층을 400 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.그 다음, 상층액을 흡입하여 제거합니다. 각 조건당 최소 3개 이상의 생물학적 반복 시료를 사용하여, 혈소판 펠릿을 이전에 준비한 각 rotenone 용액 1 mL에 다시 현탁합니다. 이후, 현탁된 혈소판을 습도 95%, 이산화탄소 5%, 온도 37 °C로 설정된 워터자켓형 이산화탄소 배양기에서 1시간 동안 배양합니다.이 단계에서 샘플을 3000 x g에서 3분 동안 원심분리하여 혈소판을 펠렛화합니다. 상층액을 흡입하여 제거한 후, 적절한 안정 동위원소 표지 내부 표준물질을 첨가합니다. 그다지, 얼음처럼 차가운 10% trichloroacetic acid 750 microliters에 혈소판을 재현탁합니다.각 시료를 0.5초 간격의 펄스로 30회 펄스 초음파 처리합니다. 원심분리 후, C18 고체상 추출 컬럼을 진공 매니폴드에 장착합니다. 메탄올 1 mL로 컬럼을 컨디셔닝합니다.그 다음, 1 mL의 2중 증류수로 컬럼을 평형화합니다. 샘플에서 얻은 상층액을 컬럼에 통과시킵니다. 완료되면 1 mL의 물로 컬럼을 세척합니다.다음으로, 용출 분획을 수집하기 위해 10 milliliter 유리 원심분리관을 진공 매니폴드에 장착합니다. 25 millimolar 아세트산 암모늄과 메탄올 1 milliliter로 컬럼을 용출합니다. 질소 가스 하에서 용출액을 건조시킨 후, 건조된 잔류물을 5% 5-sulfosalicyclic acid 50 microliters에 재현탁하고 분석을 위해 샘플을 HPLC 바이알로 옮깁니다.이전에 SH-SY5Y 세포에서 보고된 바와 같이, rotenone에 반응하여 나타나는 acetyl CoA thioester의 상대적 수준 변화는 complex one의 억제로 인한 결과라는 가설이 세워졌습니다. 구체적으로, acetyl CoA 수준은 변하지 않은 반면, succinyl CoA는 농도 의존적으로 감소하고 동시에 beta-Hydroxybutyryl-CoA는 증가합니다. rotenone으로 처리한 인간 혈소판을 분석한 결과 매우 일관된 결과가 나타났으며, 이는 독특한 실험 데이터 세트를 제공합니다.혈소판에는 핵이 없기 때문에, 이러한 관찰 결과는 로테논(rotenone)에 대한 반응이 미토콘드리아에 의존적이라는 점을 강조한다는 사실에 주목하는 것이 중요합니다. 이 절차 이후에는 다음과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 대사 추적(metabolic tracing)과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다: 이 처리 또는 질병 상태가 기질 이용에 어떤 영향을 미치는가? 일부 대사물질의 수치 변화를 확인했다면, 그 변화의 원인은 무엇인가?경로의 어느 단계가 어떤 방식으로 영향을 받습니까? 이 영상을 시청하고 나면 전혈에서 혈소판을 분리하고, 제어된 ex-vivo 챌린지를 수행하며, LCMS 분석을 위해 acetyl CoA thioester를 추출하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

lc-ms-analysis-human-platelets-as-platform-for-studying-mitochondrial

Research

연구

JoVE Journal

Environment

환경

파킨슨 병을 일으키는 유전자에 변이를 가지고 환자의 섬유 아세포가 쉽게 접근 할 수를...

파킨슨 병 분야에서 Mitochondrial Phenotypes을 모니터링하기위한 기본 인간 섬유 아세포의 사용

혈액 백혈구 및 혈소판은 개인의 생체 에너지 전반적인 건강의 마커로 사용하고 있으므로 병적 과정 및 치료의 효과를 모니터링하기위한 잠재력을 가질 수있다. 여기에서 우리는 미토콘드리아의 기능이 세포의 산화 버스트를 분리하고 측정하는 방법을 설명합니다.

인간 백혈구 및 혈소판의 분리 및 평가를위한 프로토콜 : 생물 에너지와 산화 버스트

이 연구는 미토콘드리아 부피, 미토콘드리아 막 전위, 활성 산소 종 수준, 미토콘드리아 호흡 사슬 조성 및 미토콘드리아 DNA의 변화를 감지하기 위해 두 개의 형광 리포터 또는 항체를 사용한 유세포 분석 및 이중 염색을 기반으로 여러 미토콘드리아 기능 매개 변수를 측정하는 새로운 접근 방식을보고합니다.

인간 유도 만능 줄기 세포와 그 신경 및 신경교 유도체에서 여러 미토콘드리아 파라미터의 유세포 분석

미토콘드리아 네트워크는 매우 복잡하여 분석하기가 매우 어렵습니다. 새로운 MATLAB 툴은 타임랩스 이미지에서 실시간 컨포칼 이미징 미토콘드리아를 분석하지만, 출력 볼륨이 커서 개별 수동 주의가 필요합니다. 이 문제를 해결하기 위해 신속한 파일 분석이 가능한 루틴 최적화가 개발되었습니다.

동형 특이적 레티노산 수용체에 의한 살아있는 신경 미토콘드리아 항상성 조절의 최적화된 자동 분석

이 프로토콜은 소량의 샘플만 사용할 수 있는 경우 호흡기 초복합체를 분석하는 기술을 설명합니다.

Isolation of Mitochondria for Mitochondrial Supercomplex Analysis from Small Tissue and Cell Culture Samples(소조직 및 세포 배양 샘플에서 미토콘드리아 초복합체 분석을 위한 미토콘드리아 분리) 

면역 세포에서 생리학적으로 관련된 기질 농도 하에서 미토콘드리아 생체 에너지학을 연구하는 방법은 제한적입니다. 당사는 고분해능 폐활량 측정법을 사용하여 인간 T 세포, 단핵구 및 말초 단핵 세포의 에너지 수요에 대한 미토콘드리아 막 전위의 반응 변화를 평가하는 상세한 프로토콜을 제공합니다.

인간 면역 세포에서 미토콘드리아 막 전위의 동적 변화를 평가하기 위한 고분해능 폐활량 측정법

혈소판 대사는 특히 출혈 및 혈전성 질환에서 혈소판 과잉 및 저활동의 역할과 관련이 있기 때문에 관심이 있습니다. 혈장에서 혈소판을 분리하는 것은 일부 대사 분석에 필요합니다. 여기에 제시된 것은 세척된 혈소판에서 세포 내 대사 산물을 분리하는 방법입니다.

정량적 대사 플럭스 연구를 위한 세척된 인간 혈소판의 준비

본 프로토콜은 괴사, 세포사멸 및 혈소판 활성화의 중복된 특징을 나타내는 procoagulant 혈소판을 분석하는 데 필요한 포괄적인 절차를 제공합니다.

괴사, 세포사멸 및 혈소판 활성화의 특징을 보이는 Procoagulant Platelets의 포괄적인 분석

우리는 온전한 나무 체관부를 보존하고 관찰을 위해 준비하는 기술을 제공합니다.  우리는 체관부 샌드위치(phloem sandwich)라는 장치를 만들어 절지동물, 미생물 및 체관부 조직에 서식하는 기타 유기체를 도입하고 관찰할 수 있도록 합니다.

나무 조직 내에서 절지 동물과 미생물 군집 유학을위한 기술

이 작품은 선택적으로 바이오 래드 유전자 총을 사용하여 정량, 식물의 세포 내 소기관을 대상으로하기위한 새로운 방법을 설명합니다.

깁슨 조립 및 유전자 총을 사용하여 담배 일시적인 유전자 발현

학습하세요 인간 혈소판을 이용한 LC-MS 분석으로 미토콘드리아 대사 변화를 연구하는 방법을. 동위원소 추적 기법으로 대사 적응을 정량화하고 질병 메커니즘과 치료 가능성을 탐색합니다.

미토콘드리아 대사 유학을위한 플랫폼으로 인간 혈소판의 LC-MS 분석

더 많은 동영상 탐색