미토콘드리아 대사 유학을위한 플랫폼으로 인간 혈소판의 LC-MS 분석
2016년 4월 4일
여기에서 우리는 고립 된 인간의 혈소판 내가 로테를 억제제 복잡한에 대한 응답으로 신진 대사 적응을 연구하는 생체 접근으로 모델을 사용할 수 있습니다 보여줍니다. 이 방법은 액체 크로마토 그래피 질량 분석에 의해 추적 동위 상대적 정량을 채용하고 연구 다양한 디자인을 적용 할 수있다.
이 절차의 전반적인 목표는 생체이물 처리나 질병 상태가 세포 대사를 어떻게 변화시키는지 확인하는 것입니다. 이 방법은 질병 상태나 적용된 독소가 세포 대사에 어떤 영향을 미치는지 밝힐 수 있는 잠재력이 있습니다. 그리고 일단 이것이 알려지면, 우리의 방법은 어떤 종류의 개입이 결함을 수정할 수 있는지 여부를 밝힐 수 있는 능력을 갖게 됩니다.
이 기술의 주요 장점은 형질전환된 세포주에 의존하지 않기 때문에 인간의 건강과 직접적인 관련이 있는 답을 제공할 가능성이 더 높다는 것입니다. 이 절차를 시작하려면 디메틸 설폭사이드에 로테논의 10밀리몰 스톡 용액을 준비합니다. 10 millimolar rotenone stock solution을 연속 희석하여 rotenone 농도가 1 나노 몰에서 100 마이크로 몰 범위의 용액을 얻습니다.
다음으로, 이전에 준비된 농축 Tyrode의 완충 용액 5ml에 각 원액 50마이크로리터를 추가하여 10피코몰에서 1마이크로몰 범위의 로테논 농도를 가진 용액을 준비합니다. 50마이크로리터의 DMSO를 버퍼 용액 샘플 중 하나에 추가하여 차량 제어 장치로 사용합니다. 전혈에서 혈소판을 분리하기 위해 175 x g에서 15분 동안 중단 없이 전혈 검체를 원심분리하십시오.
완료되면 상부 혈소판이 풍부한 혈장층 1ml를 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 혈소판이 풍부한 혈장을 옮길 때 혈소판 펠릿이 림프구에 의해 오염되지 않도록 담황색 코트를 방해하지 않도록 주의하십시오. 혈소판이 풍부한 혈장층을 400 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
그런 다음 초자연을 흡인합니다. 각 조건에 대해 3개 이상의 생물학적 복제를 사용하여 이전에 준비된 각 로테논 용액 1ml에 혈소판 펠릿을 재현탁합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 습도 95%와 이산화탄소 5%로 설정된 방수 재킷 이산화탄소 인큐베이터에서 1시간 동안 재현탁된 혈소판을 배양합니다.
이 시점에서 3000 x g에서 3분 동안 샘플을 원심분리하여 혈소판을 펠릿화합니다. supernatent를 흡인시킨 후 적절한 안정 동위원소 표지된 내부 표준물질을 추가합니다. 그런 다음 750마이크로리터의 얼음처럼 차가운 10% 트리클로로아세트산에 혈소판을 재현탁합니다.
펄스는 각 샘플을 0.5초 펄스로 30회 초음파 처리합니다. 원심분리 후 C18 고체상 추출 컬럼을 진공 매니폴드에 부착합니다. 1ml의 메탄올로 컬럼을 컨디셔닝합니다.
그런 다음 1ml의 이중 증류수로 컬럼을 평형을 이룹니다. 컬럼을 통해 샘플에서 파생된 상층액을 실행합니다. 완료되면 1ml의 물로 컬럼을 세척합니다.
다음으로, 10밀리리터 유리 원심분리 튜브를 진공 매니폴드에 로드하여 용리 분획을 수집합니다. 1ml의 25밀리몰 암모늄 아세테이트와 메탄올로 컬럼을 용리시킵니다. 용출액을 질소 가스로 건조시킨 후 건조된 잔류물을 50마이크로리터의 5%5-설포살리사이클릭산에 재현탁시키고 분석을 위해 샘플을 HPLC 파일로 옮깁니다.
이전에 SH-SY5Y 세포에서 보고된 바와 같이, 로테논에 대한 반응으로 아세일 CoA 티오에스테르의 상대적 수준 변화는 복합체 1의 억제로 인한 것으로 가정됩니다. 구체적으로, 베타-하이드록시부티릴-CoA의 증가와 함께 숙시닐 CoA의 용량 의존적 감소가 있는 반면, 아세틸 CoA 수치는 변하지 않았습니다. 로테논으로 처리된 인간 혈소판 분석은 매우 일관된 결과를 보여주고 고유한 실험 데이터 세트를 제공합니다.
이 관찰은 혈소판에 핵이 없기 때문에 로테논에 대한 반응의 미토콘드리아 의존성을 강조한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 다음과 같은 추가 질문에 답하기 위해 대사 추적과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 이 치료 또는 질병 상태가 기질 활용에 어떤 영향을 미칩니까? 일부 대사 산물의 수치에서 변화를 확인하면 왜 변하는 것일까요?
경로의 어떤 단계가 어떤 방식으로 영향을 받습니까? 이 비디오를 시청한 후에는 전혈에서 혈소판을 분리하고, 제어된 생체 외 챌린지를 수행하고, LCMS 분석을 위해 아실 CoA 티오에스테르를 추출하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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개요
본 연구는 complex I 억제제인 rotenone에 반응하여 나타나는 대사 적응을 조사하기 위한 ex vivo 모델로서 분리된 인간 혈소판의 활용 방법을 보여줍니다. 이 방법은 상대 정량을 위해 동위원소 추적 및 액체 크로마토그래피-질량 분석법을 사용하므로, 다양한 연구 설계에 적용 가능합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 세포 대사
- 약리학
- 인체 건강 관련성
배경
- 제노바이오틱스(xenobiotics)가 세포 대사에 미치는 영향을 이해하는 것은 매우 중요합니다.
- 분리된 인간 혈소판은 형질전환된 세포주에 비해 적절한 모델을 제공합니다.
- 이러한 접근 방식은 대사 결함에 대한 잠재적인 중재 방법을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다.
- 대사 변화를 연구하기 위해 복합체 I 억제제로 로테논(Rotenone)이 사용됩니다.
연구 목적
- 제노바이오틱(xenobiotic) 처리가 세포 대사에 미치는 영향을 결정하기 위해.
- 질병 상태가 대사 과정을 어떻게 변화시키는지 탐구하기 위해.
- 중재법이 대사 결함을 교정할 수 있는 잠재력을 평가하기 위해.
사용된 방법
- 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide) 내 로테논(rotenone) 10 millimolar 스톡 솔루션 준비.
- 다양한 농도를 얻기 위한 로테논 스톡의 계열 희석.
- 대사 분석을 위한 동위원소 추적.
- 정량을 위한 액체 크로마토그래피-질량 분석법.
주요 결과
- 분리된 혈소판은 rotenone에 대한 대사 반응을 효과적으로 모델링합니다.
- 동위원소 추적을 통해 유의미한 대사 적응을 확인할 수 있습니다.
- 액체 크로마토그래피-질량 분석법은 정확한 정량을 제공합니다.
- 이 방법은 다양한 실험 설계에 적용 가능합니다.
결론
- 분리된 인간 혈소판은 대사 연구를 위한 가치 있는 모델입니다.
- 이러한 접근 방식은 질병 메커니즘과 잠재적 치료법에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다.
- 향후 연구에서는 이 방법을 확장하여 다른 대사 경로를 탐색할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
인간 혈소판은 미토콘드리아 대사와 제노바이오틱스(xenobiotic)의 영향을 연구하기 위해 임상적으로 유의미한 비변형 모델을 제공하며, 대사 연구에서 암 세포주가 가진 한계점을 해결합니다. 이 플랫폼은 대사 경로 변화에 대한 재현 가능하고 공여자 특이적인 분석을 가능하게 하여, 초기 발견 단계에서의 타겟 검증 및 기전적 리스크 감소(de-risking)를 지원합니다. 혈액 은행 소싱을 통한 확장성은 기초 발견부터 전임상 및 임상 연구까지의 중개적 연속성을 용이하게 합니다.
바이오 제약 R&D에서의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: rotenone과 같은 복합체 I 억제제에 대한 미토콘드리아 반응을 조사함으로써 치료 가설의 검증을 가능하게 합니다.
- 운영적 가치: 형질전환 세포주에서 나타나는 대사 재프로그래밍으로 인한 혼란 변수를 줄여주는 인간 관련 시스템을 제공합니다.
- 예측적 가치: 당분해 억제 시 지방산 산화 증가와 같은 보상적 대사 변화를 일관되게 검출함으로써 생물학적 위험 감소를 지원합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 과학적 가치: acyl-CoA thioester의 정량적 LC-MS 판독값을 생성하여, 경로 특이적 활성 평가를 위한 상대 정량 및 동위원소 표지를 가능하게 합니다.
- 운영적 가치: 생물학적 반복 시료 전반에 걸쳐 재현 가능한 대사체 프로파일을 제공함으로써, 외인성 물질 스크리닝 캠페인을 위한 분석 표준화를 지원합니다.
- 확장성: 개별 기증자 또는 혈액 은행으로부터의 혈소판 분리를 통해 고함량 스크리닝을 위한 대사 활성 시료의 확장 가능한 생산이 가능합니다.
중개 및 전임상 연구
- 중개적 연속성: ex vivo 혈소판 반응을 in vivo 대사 적응과 연결하여, 바이오마커에 기반한 전임상 검증을 지원합니다.
- 기전적 리스크 감소: 핵이 없는 혈소판의 반응을 통해 관찰된 대사 변화가 미토콘드리아 의존적인지 여부를 명확히 합니다.
- 리스크 조정 기반의 진전: 대사 결함을 되돌리는 중재법의 효능 평가를 가능하게 하여, 리드 최적화 단계에서의 go/no-go 결정에 필요한 정보를 제공합니다.
파이프라인 및 워크플로 통합
이 방법은 표적 검증부터 리드 화합물 발굴, 전임상 평가에 이르는 발견 연속체에 적합하며, 특히 미토콘드리아 표적 화합물 및 대사 조절제에 유용합니다.
- 발견 생물학: 용량 의존적인 rotenone 처리 시 혈소판 반응을 분리함으로써 외생물질이 세포 대사에 미치는 영향에 대한 가설 검증을 지원합니다.
- 스크리닝: LC-MS 분석을 위해 혈소판을 분석 준비 상태로 만들어, 화합물 라이브러리 스크리닝을 위한 재현 가능한 정량적 결과물을 도출합니다.
- 분석학: acetyl-CoA, succinyl-CoA 및 beta-hydroxybutyryl-CoA thioester의 상대 정량을 제공하여 조건별 대사 흐름(metabolic flux)의 비교를 가능하게 합니다.
- 중개 연구: 질환 상태 및 치료적 개입과 관련된 대사 적응을 모델링하여 전임상 연속성을 유지합니다.
- 기업적 재사용: 여러 프로젝트와 치료 영역에 적용 가능한 표준화된 혈소판 분리 및 대사물 추출 워크플로우를 구축합니다.
운영 및 기업적 영향
- 과학적 가치: 암 세포주로 인한 아티팩트를 배제하고 생리학적으로 유의미한 인간 모델을 사용하여 타겟 검증의 예측 신뢰도를 높입니다.
- 운영적 가치: 표준화된 혈소판 분리, ex vivo 챌린지 및 대사물 추출 프로토콜을 통해 재현성을 보장합니다.
- 전략적 가치: 대사적 취약성을 조기에 발견함으로써 예기치 않은 미토콘드리아 독성으로 인한 후기 단계의 탈락을 줄여 자본 효율성을 개선합니다.
- 포트폴리오 영향: 인간 관련 시스템 내 핵심 대사 경로에 미치는 영향을 기반으로 화합물의 위험 조정 우선순위 설정을 지원합니다.
실행 시 고려 사항
- 혈소판 분리, 무균 세포 취급 및 LC-MS/MS 대사체학 분야의 전문 지식이 필요합니다.
- 원심분리 장비, 고상 추출용 진공 매니폴드 및 HPLC-MS 시스템의 사용 가능 여부에 따라 달라집니다.
- 실험실 및 기증자 간의 혈소판 풍부 혈장 준비 및 rotenone 투여량의 표준화가 필요합니다.
- 다양한 제노바이오틱스 및 동위원소 표지 방식에 따른 적응 고려 사항이 포함됩니다.
- ex vivo 상태의 혈소판 생존력과 대사적 무결성을 유지하기 위해 분리 후 즉각적인 처리가 필요하다는 점에 의해 제한됩니다.
