마이크로 RNA 정량는 DNA 결합 염료 화학, 물방울 디지털 PCR을 사용하여 순환

이 절차의 전반적인 목표는 액적 디지털 PCR 기술을 사용하여 순환하는 microRNA 및 혈장 또는 혈청과 같은 생물학적 유체를 정량화하는 것입니다. 이 방법은 바이오 마켓 분야의 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 진단 및 예후, 바이오마케팅 암을 식별함으로써.

이 기술의 주요 장점은 높은 감도에 있습니다. 또한 양성 참조 유전자를 필요로 하지 않고 덜 풍부한 microRNA를 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법의 함의는 초기 단계의 암을 가진 사람들을 식별할 수 있는 잠재력이 있기 때문에 암 진단으로 확장됩니다.

또한 신경 질환이나 심장 질환과 같은 다른 질병에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 개인은 중단을 피하기 위해 열 순환 단계 전에 비말 조작에 주의를 기울여야 합니다. 따라서 액적 생성에 대한 시각적 시연은 부주의한 조작 또는 너무 빠른 파이펫팅으로 인해 액적이 파괴될 수 있기 때문에 매우 중요합니다.

혈장 또는 혈청 microRNA를 분리하여 이 절차를 시작합니다. 그런 다음 함께 제공된 문서에 설명된 대로 역필사하고 희석합니다. 냉동실에서 EvaGreen 마스터 믹스 microRNA 프라이머 세트와 cDNA를 꺼내 실온에서 해동합니다.

해동된 후 마스터 믹스 튜브를 여러 번 뒤집습니다. 그런 다음 모든 시약을 스핀다운합니다. 함께 제공된 문서의 지침에 따라 액적 디지털 또는 ddPCR 혼합 작업 용액을 준비합니다.

각 조건에 대한 템플릿 없는 대조군과 10%를 초과하여 최대 8개의 샘플에 대해 충분히 준비합니다.조립이 완료되면 ddPCR 혼합물을 철저히 혼합하고 스핀다운합니다. 이 기술의 높은 재현성으로 인해 기술적 복제가 필요하지 않습니다. 스핀 후 12마이크로리터의 ddPCR 혼합물을 96웰 PCR 플레이트의 각 웰에 분배합니다.

각 웰에 8마이크로리터의 희석된 cDNA 템플릿을 추가합니다. 그런 다음 액적 발생 카트리지를 카트리지 홀더에 삽입합니다. 액적 발생기 카트리지의 중간 행으로 준비된 각 샘플을 20마이크로리터로 조심스럽게 옮깁니다.

우물 바닥에 기포가 유입되지 않도록 하십시오. 맨 아래 줄의 각 유정에 70마이크로리터의 액적 생성기 오일을 채웁니다. 카트리지 홀더에 개스킷을 겁니다.

액적 발생기에 삽입하고 뚜껑을 닫으면 액적 생성이 시작됩니다. 액적 생성이 완료되면 뚜껑을 열고 액적 발생기에서 카트리지를 제거하고 일회용 개스킷을 제거합니다. 카트리지의 상단 웰에는 물방울이 포함되어 있습니다.

8개의 상단 웰 각각에서 40마이크로리터를 96웰 PCR 플레이트의 단일 컬럼으로 천천히 부드럽게 이동합니다. 증발을 방지하기 위해 즉시 호일로 플레이트를 밀봉하십시오. 플레이트를 밀봉한 후 30분 이내에 함께 제공된 문서의 표 3에 설명된 PCR 프로토콜을 사용하여 열 순환을 시작합니다.

액적 판독기의 전원을 켭니다. 그런 다음 열 순환기에서 액적 판독기로 플레이트를 이동합니다. post-PCR 액적이 포함된 96웰 PCR 플레이트를 액적 리더의 플레이트 홀더 바닥에 놓습니다.

PCR 플레이트에 플레이트 홀더 상단을 놓습니다. 두 릴리스 탭을 모두 아래로 단단히 눌러 PCR 플레이트를 홀더에 고정합니다. 시스템 PC에서 QuantaLife 소프트웨어를 시작합니다. 설정을 클릭하고 샘플, 표적 유전자 및 분석에 대한 정보가 포함된 템플릿 데이터 파일을 엽니다.

왼쪽 탐색 모음에서 실행을 선택합니다. 실행 옵션 창이 나타납니다. Dye Set 메뉴에서 EVA를 선택하고 OK를 클릭하여 액적 판독을 시작합니다.

실행이 완료되면 해석 소프트웨어에서 2D 진폭 플롯을 사용하여 양수 방울을 선택합니다. 양수 드롭릿을 선택하려면 왼쪽 탐색 모음에서 올가미 도구를 사용합니다. 그런 다음 Events 탭을 클릭하여 양수 및 총 방울의 수를 확인합니다.

18의 총계는, 000의 작은 물방울 보통 probeless ddPCR로 달성된다. 그런 다음 농도 탭을 클릭하여 최종 농도 샘플을 시각화합니다. 마지막으로 내보내기를 사용합니다.

CSV를 사용하여 microRNA 농도 값을 내보냅니다. mRNA miR-181a-5p는 섭씨 58도 및 60도의 어닐링 온도에서 0.5 및 1마이크로리터 프라이머 농도를 사용하여 S1 및 S2의 두 가지 혈장 샘플에서 정량화되었습니다. 이 그림은 각 조건에 대한 증폭 반응에서 마이크로리터당 microRNA의 사본을 나타냅니다.

각 샘플에 대한 PCR 양성 액적은 파란색으로 표시되고 음성 액적은 검은색으로 표시됩니다. 여기에서 볼 수 있듯이 대조군 샘플에는 예상대로 양의 액적이 없습니다. 0.5 또는 1마이크로리터의 프라이머를 사용하여 섭씨 60도에서 PCR을 수행하면 양성 및 음성 방울을 더 잘 분리할 수 있습니다.

이 그림에서 오차 막대는 Poisson 95% 신뢰 구간을 나타냅니다. 그리고 여기서, 파란색으로 표시된 양수 방울의 수는 녹색으로 표시된 총 방울 수와 비교됩니다. 종합하면, 이러한 데이터는 액적 디지털 PCR을 사용하여 생물학적 유체의 마이크로리터당 microRNA의 절대 사본 수를 결정할 수 있음을 보여줍니다.

이 동영상을 시청한 후에는 액적 디지털 PCR을 사용하여 mRNA 정량화를 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 마스터링이 완료되면 단 몇 시간 만에 96개의 샘플을 분석할 수 있으며, 이는 임상 환경을 위한 최적의 결과입니다. 각 개발 후 이 기술은 질병 바이오마커로서 microRNA 및 기타 핵산을 탐색하기 위한 액체 생검 분야로의 길을 열었습니다.