Name: 마이크로 RNA 정량는 DNA 결합 염료 화학, 물방울 디지털 PCR을 사용하여 순환 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: 학습하세요 혈장이나 혈청에서 순환하는 microRNA를 droplet digital PCR로 정량하는 방법을. DNA 결합 염료 화학을 활용하여 높은 감도로 암 바이오마커를 검출하고 조기 진단에 활용할 수 있습니다.

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(-, 15분의 2,010 9,980 5 밀레 N 당. 특별 프로그램 분자 임상 종양)와, 대학 수업의 이탈리아 교육부에서 MF (MFAG 11676)에 암 연구를위한 이탈리아 협회 (AIRC)로부터 MN에 자금을 지원하는 MN에 대한 연구 FIRB 2011 (프로젝트 RBAPIIBYNP).

혈장 또는 혈청에서 마이크로 RNA 분리 참고 : 플라즈마 및 혈청 준비의 miRNA 정량 순환에 중요한 단계이다. 플라즈마 및 혈청 준비를위한 기본 절차는 없습니다. 고려해야 만 중요한 것은 동일한 실험에서 모든 샘플은 동일 흐름을 사용하여 처리 할 수​​ 있어야한다는 것이다. 200 μL의 혈청 또는 혈장에서 시작합니다. 총 RNA를 상업적으로 이용 가능한 키트를 사용하여 혈청 또는 혈장으로부터 분리 될 수있다. 1. (miRNA를 포함) 총 RNA를위한 프로토콜 절연 <ol><li> 얼음에 해동 혈청 / 혈장 샘플. </li><li> 200 μL 혈청 / 플라즈마에 용해 시약 (예., QIAzol)의 1 ML을 추가합니다. </li><li> 텍싱하여 혼합하고 5 분 동안 실온에서 벤치에 균질를 포함하는 튜브를 배치합니다. </li><li> C.에서 합성의 miRNA CEL-은 miR-39-3p의 4.16 nM의 용액 3 μl를 추가 간스. </li><li> 클로로포름 200 μl를 추가합니다. 15 초 동안 적극적으로 튜브를 흔들어. 장소 일2 분 동안 실온에서 벤치에 전자 튜브. </li><li> 4 ° C에서 12,000 XG에 15 분 동안 원심 분리 단계 분리를 구하는 : 위 수성 단계는 RNA가 포함되어 있습니다. </li><li> , 새로운 튜브에 700 μl를 수성 상을 이동하는 흰색 계면 물질의 이동을 피하십시오. </li><li> 100 % 에탄올 1 ML을 추가하고 반전으로 섞는다. </li><li> 피펫은 최대 미니 스핀 컬럼에 시료 700 μL은 2 ㎖의 포집 관에 배치합니다. 15 초 동안 12,000 XG에 뚜껑 원심 분리기를 닫습니다. 흐름 -을 통해 폐기하십시오. </li><li> 나머지 샘플을 사용하여이 단계를 반복합니다. </li><li> 미니 스핀 컬럼에 700 ㎕의 버퍼 RWT 추가 열을 씻어 12,000 XG에 15 초 동안 뚜껑과 원심 분리기를 닫습니다. 흐름 -을 통해 폐기하십시오. </li><li> 미니 스핀 열에 피펫 500 μL 버퍼 RPE. 12,000 rpm에서 15 초 동안 뚜껑과 원심 분리기를 닫습니다. 흐름 -을 통해 폐기하십시오. 다시이 단계를 반복합니다. </li><li> 스핀 열을 건조 2 분 동안 전속력으로 미니 스핀 컬럼을 원심 분리기잔류 에탄올에서 막. </li><li> 컬럼의 막에 새로운 1.5 ml의 수집 관 및 피펫 35 μL의 RNA 분해 효소가없는 물을에 미니​​ 스핀 컬럼을 전송합니다. </li><li> RNA의를 용출 12,000 XG에서 1 분 동안 원심 분리기. </li><li> -80 ° C에서 RNA를 저장합니다. 주 : RNA의 농도를 정확하게 측정 할 수 없기 때문에, 입력 된 금액에 대한 척도로서 고정 볼륨을 사용한다. </li></ol> 2. 마이크로 RNA 역전사 <ol><li> 배 반응 완충액 클레아없는 물 : 역전사 (RT) 시약을 혼합 성분을 해동. 믹스 부드럽게 얼음에 튜브와 장소를 반전. 즉시 사용하기 전에, 냉동고에서 효소 믹스를 제거하고 얼음에 배치합니다. 모든 시약을 스핀. </li><li> 표 1에 설명 된 바와 같이 얼음의 RT 시약 혼합물을 준비한다. 적어도 10 %를 초과하는 조합을 준비한다. </li><li> 피펫으로 반응을 혼합 한 다음 스핀 다운. </li><li> 42 ℃에서 60 분 동안 품어. </li><li> 되돌리기를 열 - 불 활성화95 ℃에서 5 분 자체의 효소. </li><li> 즉시 4 ℃로 냉각. </li><li> -20 ° C에서 cDNA를 저장합니다. </li></ol> 3. cDNA를 희석 <ol><li> 클레아없는 물에서 계획된 ddPCR 반응에 필요한 서식하는 cDNA의 양을 희석. 1:50 1 사이의 cDNA의 반응을 희석 : (500)을 물에 대상 miRNA의 풍부에 따라 다릅니다. -20 ° C에서 희석 된 cDNA를 저장합니다. 희석 된 cDNA는 -20 ° C에서 3 개월 이상 안정한 것으로 판명되었다. </li></ol> 4. 물방울 생성 및 PCR 주 : 액적 생성 한 번에 8 개의 샘플들에 대해 수행되어야한다. 기술 복제로 인해 12,15 .A 아니 템플릿 컨트롤 (NTC) 샘플은 모든 판에서 실행되어야합니다이 기술의 높은 재현성에 각각 다른 ddPCR 조건에 대해, 필요하지 않습니다. <ol><li> 해동 마스터 믹스를 평형 (예., EvaGreen 마스터 믹스) 실온에서, 마이크로 RNA 프라이머 세트와 cDNA를. </li><li> 마스터 믹스 번째 믹스oroughly 튜브를 수회 반전. 모든 시약을 스핀 다운. </li><li> 표 2에 기재된 바와 같이 ddPCR 혼합물을 준비한다. 여러 ddPCR 반응이 수행되는 경우, 작동 ddPCR-용액을 섞어 제조. 10 % 이상 초과 믹스를 준비합니다. </li><li> 조립 후 잘 혼합하고 ddPCR 믹스를 스핀 다운. </li><li> ddPCR 12 μL를 96- 웰 PCR 플레이트 또는 PCR 튜브에 혼입 분배. </li><li> 잘 / 각각의 튜브로 희석 cDNA를 템플릿의 8 μl를 추가합니다. </li><li> 홀더에 방울 생성기 카트리지를 삽입합니다. </li><li> 전송 공기를 피하는 웰의 바닥에 기포 조심하면서 방울 생성기 카트리지의 샘플 웰 (중간 행)에 각각 준비된 샘플 20 μL. </li><li> 방울 생성기 오일의 70 μl를 각 유정 (아랫 줄)을 입력합니다. </li><li> 카트리지 홀더 위에 개스킷 후크 및 방울 생성기 삽입. </li><li> 제조 업체의 홍보에 따른 액적 생성을 시작하기 위해 덮개를 닫습니다otocol. 액적 생성이 완료되면, 뚜껑을 열고 일회용 가스켓을 제거합니다. 카트리지의 상단 우물은 물방울이 포함되어 있습니다. </li><li> 96 웰 PCR 플레이트의 한 칼럼에 팔 상부 웰 (액적)의 내용 피펫 천천히 부드럽게 40 μL. </li><li> 즉시 증발을 방지하기 위해 물방울 전사 후 호일 PCR 플레이트를 밀봉. 액적 리더의 바늘과 호환되는 천 공식 박 플레이트 씰을 사용합니다. </li><li> 플레이트를 밀봉 30 분 이내에 열 사이클링 (PCR)를 시작합니다. </li><li> 표 3에 따른 순환 프로토콜을 수행합니다. </li></ol> 5. 물방울 읽기 <ol><li> 액적 리더의 전원을 켭니다. </li><li> 액적 리더에 열 자전거 타는 사람에서 접시를 이동합니다. </li><li> 판 홀더의베이스로 후 PCR 방울을 함유하는 96 웰 PCR 플레이트를 놓는다. </li><li> PCR을 접시에 판 홀더의 상부를 놓습니다. 단단히 모두 분리 탭을 눌러아래 홀더에 PCR 플레이트를 고정합니다. </li><li> 시스템 PC에서 소프트웨어를 시작합니다. <ol><li> 실험 (절대 정량)를 정의하는 설정을 클릭 한 다음 방울​​ 독서를 시작하려면 실행을 클릭합니다. </li><li> 액적 판독이 완료되면, 열기를 클릭하여 데이터를 분석하는 버튼 &quot;분석&quot;. </li><li> 양의 물방울 (올가미 도구) (그림 1B)를 선택하는 분석 소프트웨어에서 2D 진폭 플롯을 사용합니다. </li><li> 긍정적이고 총 방울의 수를 확인하기 위해 이벤트 탭을 사용합니다. 18,000의 총 - 21,000 방울은 일반적으로 probeless ddPCR 달성된다. </li><li> 양의 물방울이 선택되면, 농도 탭에서 수출 .CSV 옵션을 사용하여 miRNA의 농도 값을 내보낼 수 있습니다. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Arroyo, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Argonaute2+complexes+carry+a+population+of+circulating+microRNAs+independent+of+vesicles+in+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Argonaute2 complexes carry a population of circulating microRNAs independent of vesicles in human plasma.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5003-5008 (2011).</li>
<li>Skog, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+microvesicles+transport+RNA+and+proteins+that+promote+tumour+growth+and+provide+diagnostic+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers.</a> Nat Cell Biol. 10, 1470-1476 (2008).</li>
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</ol>

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순환의 miRNAs는 매우 낮은 농도에서 혈액 내 존재하는 혈장 및 혈청 샘플에서 추출 할 수있는 RNA의 양이 적다. 이 때문에, 그것들은 마이크로 어레이 및 RNA 서열 분석과 같은 다른 기술을 정량화하기 어렵다. 또한, 데이터의 정규화 계약 일반화 부족 혈중 내인성 &quot;참조&quot;의 miRNAs의 존재가있다. 이러한 맥락에서, 혈청 또는 혈장해도 매우 낮은 1 ㎖ 당 miRNA의 매수를 카운트 할 수있는 액적 디지털 PCR과 같은 중요한 기술은 매우 매력적이다. 우리는-역의 사본을 만듭니다 때문에 시간을 절약하고, 가장 중요한, RNA 소재 하나의 반응에있는 모든 순환의 miRNAs를 보편적 인 cDNA를 시스템에이 기술을 쌍. 우리의 접근에서, 특이도는 다른 솔루션에 비해 16 miRNA의 정량화 매우 잘 수행 LNA 프라이머의 사용에 고유하다. 작은 물방울디지털 PCR은 표적 유전자의 농도를 산출 절대 허용하는 종점 분석법이다. 정량 P...

MicroRNAs(miRNAs)는 활성 방출 또는 괴사 및 세포사멸 과정의 결과로 잠재적으로 유기체의 모든 세포에 의해 혈액 순환으로 방출됩니다. cell-free miRNA는 혈류에서 자유롭고 안정적인 분자로 검출되거나, 지단백질과 연결되거나, 엑소좀과 미세소포체 내부에 둘러싸여 있습니다 1-3. 이들은 세포 대 세포 전달자(cell-to-cell communer)4로 기능하는 것으로 여겨지며, 암, 심장 질환 또는 자가면역 질환이 있을 때 그 양이 변한다 5-7. 정확하고 재현 가능한 정량화는 질병 바이오마커로 평가하기 위한 기초입니다. 그러나, 이미 다른 곳에서 기술된 몇 가지 이유로 인해 8,9, 혈청 또는 혈장, 그리고 다른 체액에서 miRNA를 정량화하는 것은 매우 어려울 수 있다 10,11. 우리는 최근 miRNA 특이적 LNA 프라이머 및 DNA 결합 염료 방울 디지털 PCR(ddPCR) 기술을 기반으로 순환 miRNA의 절대 정량화를 위한 방법을 개발했습니다 12. 이 방법론은 miRNA 유방암 바이오마커 13,14의 검증에 적용되었습니다. 
나노리터 크기의 액적 내에서 역전사된 각 miRNA 분자를 분할한 후, 각 샘플에서 각 miRNA의 복제 수를 계수할 수 있으며, 기본적으로 녹색 및 양성 형광 방울의 수를 계산합니다. PCR 반응이 발생하자마자 정량적 RT-PCR(RT-qPCR)에서와 같이 표준 곡선을 설정하거나 목표량 계산에서 PCR 효율성을 고려할 필요 없이 양성 계수가 달성됩니다. 또한 ddPCR은 순환 miRNA 정량화에서 RT-qPCR보다 더 민감하고 정확한 것으로 입증되었습니다 15. 이 기사에서는 이 방법론의 자세한 프로토콜을 제시하고, 가장 관련성이 높은 단계에 대해 논의하며, 특히 혈청 및 혈장 임상 샘플을 고려합니다.

<table><tbody><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>Columns는 miRNA를 포함한 총 RNA, 혈청/플라즈마에서 추출,</td></tr><tr><td>100 nmole RNA oligo Cel-miR-39-3p</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>맞춤형</td><td>시퀀스: UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG</td></tr><tr><td>Universal cDNA 합성 키트 II, 8-64 rxns</td><td>Exiqon</td><td>203301</td><td>키트, microRNA 역전사</td></tr><tr><td>MicroRNA LNA PCR 프라이머 세트&nbsp;</td><td>Exiqon</td><td>204000-206xxx 및 2100000-21xxxxx</td> 액적 내부 <td>miRNA 증폭용 프라이머</td></tr><tr><td>QX200 액적 발생기</td><td>BioRad</td><td>186-4002</td><td>액적 판독에 사용되는 기기</td></tr><tr><td>QX200 액적 판독기</td><td>BioRad</td><td>186-4003</td><td>액적 생성에 사용되는 기기</td></tr><tr><td>QuantaSoft 소프트웨어</td><td>BioRad</td><td>186-3007</td><td>데이터 수집 및 분석</td></tr><tr>용 소프트웨어<td>PX1 PCR 플레이트 씰러</td><td>BioRad</td><td>181-4000</td><td>플레이트 씰러</td></tr><tr><td>DG8 액적 발생기 카트리지 및 개스킷</td><td>BioRad</td><td>186-4008</td><td>샘플과 오일을 혼합하여 액적을 생성하는 데 사용되는 카트리지</td></tr><tr><td>QX200 ddPCR EvaGreen 슈퍼믹스</td><td>BioRad</td><td>186-4033/36</td><td>PCR 슈퍼믹스</td></tr><tr><td>QX200 액적 발생기 오일 EvaGreen 염료</td><td>BioRad</td><td>186-4005</td><td>액적 생성용 오일</td></tr></tbody></table>

마이크로 rna 정량는 dna 결합 염료 화학, 물방울 디지털 pcr을 사용하여 순환

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

마이크로 RNA (miRNA가) (무 세포들)은 순환 혈류로 세포로부터 방출된다. 순환 특정 마이크로 RNA의 양은 질병 상태에 연결된 질병 표지자로서 사용될 수있는 잠재력을 가지고있다. 디지털 PCR 기술 염료 계 화학 제를 사용하여 액적 마이크로 RNA 정량화를 순환 민감하고 정확한 방법이 최근 개발되고있다. 구체적으로, 핵산 (LNA)을 그 고유의 miRNA의 절대 정량을 얻을 수있다 호환 액적 디지털 PCR 시스템에서 녹색 형광 DNA 결합 염료 miRNA에 특이 적 프라이머를 사용하여 잠김 기반. 여기, 우리는이 기술을 수행하는 플라즈마 및 혈청 등의 생물학적 유체에서 miRNA의 양을 평가하는 방법을 설명, 가능하고 효과적이다.

혈장 또는 혈청 1 ㎖ 당 특정의 miRNAs의 절대량 디지털 PCR 기술을 녹색 형광 DNA 결합 염료를 사용하여 액적으로 결정될 수있다. (1)가 최종 miRNA의 농도를 결정하는 포지티브 방울 선택의 과정을 제시 도면 (그 사본 / μL ) 분석 소프트웨어에 의해 계산 된 증폭 반응이다. 혈액의 각 miRNA의 양은 다른 것들보다 일부의 miRNA 종 더 풍부되고, 매우 상이하다. ddPCR 반응의 1:50 희석 된 cDNA를 사용하여이 양 및 음 적의 적절한 수를 얻을 수있다. 양 액적 포화 (예., 남아있는 네거티브 방울)의 경우의 cDNA 샘플의 추가 희석이 필요할 수있다. 모든 LNA 프라이머 세트는 방울 디지털 PCR 시스템에서 제대로 작동하도록 최적화되어야한다. 은 m...

염료 기반 화학 및 액적 디지털 PCR 기술을 사용한 cell-free microRNA 정량화를 위한 민감하고 정확한 방법에 대해 설명합니다.

마이크로 RNA 정량는 DNA 결합 염료 화학, 물방울 디지털 PCR을 사용하여 순환

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

이 절차의 전반적인 목표는 드롭렛 디지털 PCR(droplet digital PCR) 기술을 사용하여 혈장 또는 혈청과 같은 생체 시료 내의 순환 microRNA를 정량화하는 것입니다. 이 방법은 바이오마커 분야의 의문에 답하는 데 도움을 줄 수 있으며, 암의 진단 및 예후 바이오마커를 식별함으로써 활용 가능합니다.이 기술의 주요 장점은 높은 민감도에 있습니다. 이 방법은 내인성 대조 유전자가 필요 없이 함량이 적은 microRNA 또한 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 초기 단계의 암 환자를 식별할 가능성이 있기 때문에 암 진단 분야로 그 활용 범위가 확대될 수 있습니다.또한 신경계 또는 심혈관 질환과 같은 다른 질병에도 적용될 수 있습니다. 일반적으로, 열 사이클링 단계 이전에 액적의 파손을 방지하기 위해 액적 조작에 주의를 기울여야 합니다. 따라서 부주의한 조작이나 너무 빠른 피펫팅으로 인해 액적이 파괴될 수 있으므로, 액적 생성 과정을 시각적으로 시연하는 것이 매우 중요합니다.혈장 또는 혈청 microRNA를 분리하는 것으로 이 절차를 시작하십시오. 그런 다음 동봉된 문서에 설명된 대로 역전사 및 희석을 수행하십시오. EvaGreen 마스터 믹스 microRNA 프라이머 세트와 cDNA를 냉동고에서 꺼내 실온에서 해동하십시오.해동 후, 마스터 믹스 튜브를 여러 번 뒤집어 섞어줍니다. 그런 다음 모든 시약을 원심 분리하여 가라앉힙니다. 동봉된 문서의 지침에 따라 droplet digital 또는 ddPCR 믹스 작업 용액을 준비합니다.각 조건별 템플릿 미포함 대조군(no-template control)을 포함하여 최대 8개 샘플에 충분한 양과 10%의 여유분을 준비합니다. 혼합이 완료되면 ddPCR 믹스를 충분히 섞고 원심분리합니다. 본 기술의 높은 재현성 덕분에 기술적 반복 실험(technical replicates)은 필요하지 않습니다. 원심분리 후, 96-well PCR 플레이트의 각 웰에 ddPCR 믹스 12 µL를 분주합니다.희석된 cDNA 템플릿 8 µL를 각 웰에 추가합니다. 그런 다음 드롭렛 생성기 카트리지를 카트리지 홀더에 삽입합니다. 드롭렛 생성기 카트리지의 중간 열에 준비된 각 샘플 20 µL를 조심스럽게 옮깁니다.웰 바닥에 기포가 생기지 않도록 주의하십시오. 하단 열의 각 오일 웰에 70 µL의 액적 생성기 오일을 채웁니다. 카트리지 홀더에 가스켓을 겁니다.드롭렛 생성기에 삽입하고 덮개를 닫아 드롭렛 생성을 시작합니다. 드롭렛 생성이 완료되면 덮개를 열고 드롭렛 생성기에서 카트리지를 꺼낸 뒤 일회용 가스켓을 제거합니다. 카트리지의 상단 웰에 드롭렛이 포함되어 있습니다.8개의 상단 웰에서 각각 40 µL를 96-웰 PCR 플레이트의 단일 열로 천천히 그리고 부드럽게 옮깁니다. 증발을 방지하기 위해 즉시 호일로 플레이트를 밀봉합니다. 플레이트를 밀봉한 후 30분 이내에 동봉된 문서의 표 3에 기술된 PCR 프로토콜을 사용하여 열 사이클링을 시작합니다.드롭렛 리더의 전원을 켭니다. 그런 다음 플레이트를 써멀 사이클러에서 드롭렛 리더로 옮깁니다. PCR 후 드롭렛이 포함된 96-웰 PCR 플레이트를 드롭렛 리더 내 플레이트 홀더 바닥에 놓습니다.플레이트 홀더의 상단을 PCR 플레이트 위에 놓습니다. 양쪽의 릴리스 탭을 세게 눌러 PCR 플레이트를 홀더에 고정합니다. 시스템 PC에서 QuantaLife 소프트웨어를 실행합니다. Setup을 클릭하고 샘플, 표적 유전자 및 분석에 관한 정보가 포함된 템플릿 데이터 파일을 엽니다.왼쪽 탐색 바에서 실행(Run)을 선택하십시오. 실행 옵션(Run Options) 창이 나타납니다. 염료 세트(Dye Set) 메뉴에서 EVA를 선택하고 확인(OK)을 클릭하여 드롭렛 판독을 시작하십시오.분석 소프트웨어에서 run이 완료되면 2D Amplitude 플롯을 사용하여 양성 droplet을 선택하십시오. 양성 droplet을 선택하려면 왼쪽 탐색 모음의 올가미(lasso) 도구를 사용하십시오. 그런 다음, Events 탭을 클릭하여 양성 droplet 및 전체 droplet의 수를 확인하십시오.프로브 없는 ddPCR에서는 일반적으로 총 18,000개의 액적(droplet)이 생성됩니다. 그런 다음 농도(Concentration) 탭을 클릭하여 최종 시료의 농도를 시각화하십시오. 마지막으로 내보내기(Export) 기능을 사용하십시오.microRNA 농도 값을 내보내기 위한 CSV 파일입니다. mRNA miR-181a-5p를 두 개의 혈장 샘플인 S1과 S2에서 58°C 및 60°C의 어닐링 온도에서 0.5 µL 및 1 µL의 프라이머 농도를 사용하여 정량화했습니다. 이 그림은 각 조건에 따른 증폭 반응의 µL당 microRNA 복제 수를 나타냅니다.각 샘플에 대해 PCR 양성 액적은 파란색으로, 음성 액적은 검은색으로 표시됩니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 대조군 샘플은 예상대로 양성 액적이 나타나지 않았습니다. 0.5 µL 또는 1 µL의 프라이머를 사용하여 60 °C에서 PCR을 수행한 결과, 양성 액적과 음성 액적이 더 명확하게 분리되었습니다.이 그림에서 오차 막대는 포아송 95% 신뢰 구간을 나타냅니다. 그리고 여기에서 파란색으로 표시된 양성 액적의 수를 초록색으로 표시된 전체 액적의 수와 비교하였습니다. 종합하면, 이러한 데이터는 드롭렛 디지털 PCR을 사용하여 생체 시료 1µL당 microRNA의 절대적 복제수를 결정할 수 있음을 입증합니다.이 영상을 시청하고 나면 droplet digital PCR을 이용한 mRNA 정량 분석 수행 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 기술을 숙달하면 96개의 샘플을 단 몇 시간 만에 분석할 수 있으며, 이는 임상 환경에 최적화된 결과 도출 속도입니다. 이러한 발전 이후, 이 기술은 microRNA 및 기타 핵산을 질병 바이오마커로 탐색하는 액체 생검 분야의 길을 열어주었습니다.

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생명공학

여기 샘플 제한된 양의 작업 특히, microRNA (miRNA) 표현 수준에 대해 비용과 시간 효율 높은 처리량 검사 도구로 microfluidic 플랫폼와 함께 최적화된 멀티 플렉스 반전 transcriptase 정량 PCR (qRT - PCR) 프로토콜을 설명합니다.

높은 처리량 MicroRNA의 프로파일 : 최적 멀티 플렉스 플루 동적 ArrayTM의 IFCs에 Nanoliter의 규모 qRT - PCR

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액적 디지털 중합효소 연쇄 반응: 희귀 종양 돌연변이 검출을 위한 나노액적 PCR 반응을 생성하는 방법

이 비디오에서는 두 개의 서로 다른 유전자 마커를 동시에 검출하는 데 유용한 기존 PCR 기술을 변형한 ddPCR(duplex digital PCR) 기술을 보여줍니다. 단일 PCR 반응은 독립적으로 증폭되는 나노리터 크기의 유화 액적으로 분할되며, 액적 분획에서 서로 다른 색상의 형광 증폭 신호를 검출하는 것은 표적 염기서열의 초기 농도를 계산하는 데 사용됩니다.

이중 유전자 마커의 동시 정량을 위한 Duplex Digital PCR

MicroRNA(miRNA)는 널리 보존된 조절 분자 부류입니다. 여기에서는 두 가지 강력한 ligation 단계와 high-throughput sequencing에 의존하는 miRNA 클로닝 방법에 대해 설명합니다. 당사의 방법은 miRNA의 정확한 게놈 전체 정량을 가능하게 합니다.

높은 처리량 시퀀싱에 의한 마이크로 RNA 정량을위한 작은 RNA 분자의 고효율 내고

순환 마이크로 RNA는 최근 각종 암 및 기타 질환에 대한 유망한 새로운 바이오 마커로 등장했다. 이 문서의 목적은 세 가지 다른 프로브 기반의 실시간 PCR 플랫폼 및 정량화 및 마이크로 RNA 순환의 풍요 로움을 결정하는 데 사용할 수있는 방법을 논의하는 것입니다.

프로브 기반의 실시간 PCR은 마이크로 RNA의 정량 측정을위한 접근 방법

우리는 단순화된 (아날로그) 판독으로 핵산을 정량화하기 위한 종말점 디지털 분석을 설명합니다. 당사는 특수 기기가 아닌 표준 qPCR 기계를 사용하여 액적 기반 디지털 분석의 벌크 형광을 측정하고 현미경 검사로 결과를 확인합니다.

디지털 핵산 정량 분석​​ 실험의 단순 대량 판독

이 보고서 또는 사전 증폭 없이 양적 실시간 반전 녹음 방송 PCR를 사용 하 여 플라즈마 miRNA의 절대 레벨을 측정 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜 플라즈마 miRNAs의 수량의 더 나은 이해를 제공 하 고 다른 연구 나 실험실에서 해당 데이터의 질적 평가 허용 한다.

Cynomolgus 원숭이, 양적 실시간 반전 녹음 방송 PCR를 사용 하 여 플라즈마 예측에 관한 레벨의 절대 정량화

순환 microRNAs는 심혈 관 질환 및 급성 심근 경색에 대 한 생체로 약속을 보여주었다. 이 연구에서 우리는 미르 추출, 반전 녹음 방송 및 심혈 관 질환 환자의 혈 청에서 miRNAs의 절대 정량화에 대 한 디지털 PCR 프로토콜을 설명합니다.

급성 심근 경색 및 심혈 관 질환 MicroRNAs 순환 측정을 위한 디지털 PCR

여기에서, 우리는 환자 생물학적 유체 (biofluids)에 존재하는 순환 DNA에 있는 종양 체세포 돌연변이를 검출하는 프로토콜을 제시합니다. 우리의 액적 디지털 중합효소 연쇄 반응 (dPCR) 기지를 둔 방법은 종양 돌연변이 allelic 주파수 (MAF)의 정량화를 가능하게 하고, 종양 반응의 진단 그리고 시간적 감시에 최소침습 적인 보충을 촉진하.

환자 생체 유체에서 종양 관련 순환 DNA의 검출 및 모니터링

여기에서는 단일 세포에서 절대 미토콘드리아(mt)DNA 복제 수와 mtDNA 결실 이형질 수준을 측정하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

디지털 액적 중합효소 연쇄반응을 이용한 단세포 미토콘드리아 DNA 복제 수 및 이형질 측정

이 프로토콜은 발산 프라이머를 사용하여 세포에서 원형 RNA(circRNA) 수준을 정밀하게 정량하기 위한 디지털 액적 PCR(dd-PCR)의 자세한 방법을 설명합니다.

디지털 액적 PCR을 사용한 원형 RNA의 정량화

학습하세요 혈장이나 혈청에서 순환하는 microRNA를 droplet digital PCR로 정량하는 방법을. DNA 결합 염료 화학을 활용하여 높은 감도로 암 바이오마커를 검출하고 조기 진단에 활용할 수 있습니다.

마이크로 RNA 정량는 DNA 결합 염료 화학, 물방울 디지털 PCR을 사용하여 순환

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