간단하고 효율적인 접근 방법은 돌연변이 백시 니아 바이러스 벡터를 구축하기

이 실험의 전반적인 목표는 CRISPR-Cas9 기술을 사용하여 돌연변이 백시니아 바이러스 발생 효율성을 향상시키는 것입니다. 이 방법은 생물학 연구 및 의학 연구, 특히 유전자 치료 및 백신 접종을 위한 새로운 백시니아 바이러스 벡터를 생성하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법을 사용한 바이러스 시연은 양성 플라크를 식별하고 포착하기 어렵기 때문에 매우 중요합니다.

이 기술의 가장 큰 장점은 돌연변이를 백시니아 바이러스로 만드는 효율성을 극적으로 향상시킨다는 것입니다. 가을걷이한 CV-1 세포로 시작해서, 100에 그들의 농도를 조정하십시오, 밀리리터 당 000의 세포. 그런 다음 transfection을 위해 2ml의 현탁액을 6웰 플레이트의 각 well에 파종합니다.

다음 날, 0.5 나노그램의 gRNA-N2 플라스미드와 0.5 나노그램의 pSTCas9 플라스미드로 세포를 transfection합니다. 그런 다음 24시간 동안 배양합니다. 24시간 후에 매체를 교체하십시오.

다음으로 VVL15 바이러스를 준비합니다. DMEM으로 백본 VVL15 바이러스를 밀리리터당 200, 000 PFU로 희석합니다. 그런 다음 형질주입된 CV-1 세포의 각 웰에 희석된 바이러스 100마이크로리터를 추가합니다.

2시간 후, HR 발현을 위해 셔틀 donor 벡터 1마이크로그램으로 세포를 transfection하고 24시간 동안 세포를 배양합니다. 다음 날, 세포 스크레이퍼를 사용하여 형질주입된 CV-1 세포를 분리합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 cryovial에 수집하고 나중에 사용할 수 있도록 섭씨 영하 80도에서 보관합니다.

변형된 VV를 정제하는 첫 번째 라운드를 시작하려면 웰당 300, 000개의 변형되지 않은 CV-1 세포가 있는 15개의 6웰 플레이트를 파종합니다. 다음날, 형질 주입된 CV-1 세포의 동결된 현탁액을 섭씨 37도에서 3분 동안 해동한 다음 30초 동안 현탁액을 격렬하게 와류로 용해하여 세포를 용해합니다. 그런 다음 1마이크로리터의 용해물을 3밀리리터의 DMEM으로 희석합니다.

이 희석액을 변형되지 않은 CV-1 세포의 각 플레이트 웰에 반 밀리리터를 첨가합니다. 그런 다음 플레이트를 이틀 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다. 이틀 후, 형광 현미경을 사용하여 RFP 양성 플라크를 식별합니다.

10X 대물렌즈로 발견할 수 있습니다. 식별되면 마커 펜을 사용하여 플레이트 아래의 명판에 정확하게 레이블을 지정합니다. 이제 수확할 각 양성 플라크에 대해 200마이크로리터의 무혈청 DMEM을 포함하는 극저온 여과를 준비합니다.

다음으로, 라벨이 지정된 플라크가 있는 웰의 모든 배지를 흡인하는 것이 중요합니다. 그런 다음 30 마이크로리터를 흡입하도록 설정된 200 마이크로리터 피펫을 사용하여 극저온 여과체에서 10 마이크로리터의 배지를 피펫에 부분적으로 로드한 다음 플라크를 긁어내고 나머지 흡인으로 세포를 끌어냅니다. 이것을 cryovial로 배출하고 이 절차를 두 번 더 반복하여 동일한 RFP 양성 플라크를 표적으로 하여 가능한 한 많은 세포를 수집합니다.

채취물을 섭씨 영하 80도에서 보관하거나, 두 번째 정제를 즉시 수행해야 하는 경우 드라이아이스에서 10분 동안 동결합니다. 변형된 VV를 정제하는 두 번째 라운드는 첫 번째 라운드의 동결 세포를 사용하여 첫 번째 라운드와 동일하게 수행됩니다. 그러나 각 RFP 포지티브 라인에 대해 6개 이상의 RFP 포지티브 플라크를 선택할 수 있습니다.

하나의 양성 플라크에서 형성된 모든 플라크가 RFP 양성이 되어 플라크가 순수함을 나타낼 때까지 선택 과정을 반복하며, 추가로 3-5라운드가 소요될 수 있습니다. 하루 전에 웰당 50만 개의 CV-1 셀이 있는 6개의 벽 플레이트를 준비합니다. 다음 날, 얼어붙은 정제된 플라크를 섭씨 37도에서 3분 동안 해동합니다.

그런 다음 플라크를 30초 동안 격렬하게 소용돌이쳐 용해물을 만듭니다. 세포 파편을 포함한 모든 용해물을 CV-1 세포의 웰에 넣고 플레이트를 3일 동안 배양합니다. 다른 5개의 우물은 사용하지 마십시오.

매일 현미경으로 세포를 검사하십시오. 세포의 절반 이상이 세포병성으로 나타나면 감염된 세포를 수확합니다. 이상적으로는 모든 세포가 세포원성이어야 합니다.

세포 스크레이퍼를 사용하여 배양 배지가 있는 15ml 튜브에 세포를 수집합니다. 그런 다음 300g에서 3분 동안 세포를 펠릿화합니다. 상등액을 버리고 PCR을 사용하여 돌연변이 VV의 변형을 확인하거나 세포 펠릿을 섭씨 음의 80도에서 동결하여 나중에 확인합니다.

설명된 방법은 기존 프로토콜에 비해 재결합 효율을 100배 이상 향상시킵니다. 예를 들어, VV N1LG는 수정 대상이었습니다. 앞서 설명한 바와 같이, Cas9을 발현하는 플라즈마와 N1L 특이적 gRNA를 CV-1 세포에 동시 transfection하여 상동 재조합에 대한 효율성을 향상시켰습니다.

transfection 하루 후, RFP가 CV-1 세포에서 발현되었습니다. 다음으로, CV-1 세포는 상동 재조합에서 전체 용해물로 감염되었습니다. RFP 양성 및 음성 플라크는 모두 CV-1 세포에서 관찰되었습니다.

정제 프로토콜에 따라, 순수한 재조합체를 얻었다. 돌연변이 백시니아 바이러스에 감염된 순수한 플라크에서 유래한 세포 용해물에 감염된 후 모든 플라크는 RFP 신호를 나타냈습니다. PCR을 사용하여 표적 유전자의 결실을 확인했습니다.

변형된 바이러스는 온전한 N1L 대조군과 달리 RFP에 대해서는 긍정적인 신호를 보였고 N1L에 대해서는 신호를 보이지 않았습니다. 모두 비표적 유전자 A52R에 대해 양성이었다. 이 비디오를 시청한 후에는 새로운 백시니아 바이러스 벡터를 빠르게 만드는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 10일 안에 완료할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 생물 의학 분야의 연구자들이 암 및 전염병의 치료 및 예방을 위한 생물학적 제제 개발에서 새로운 바이러스 벡터를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.