Name: 효율적인 방법은 탈분화 지방 세포를 얻는 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 11 s
Description: 배우세요 DFAT 세포를 효율적으로 생성하는 새로운 세포 배양 방법을. 이 개선된 배지는 재생의학 및 조직공학 연구에서 세포 품질을 향상시키고 세포 치료 적용에 활용될 수 있습니다.

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본 연구는 일본과학진흥회(Japan Society for the Promotion of Science, ST261006IP, TM)의 첨단연구기술창업프로그램(START Program)과 문부과학성의 사립대학 전략연구재단 프로그램(Program for the Strategic Research Foundation at Private Universities) (S1411018, TM)의 지원을 받았다.

인간의 피하 지방의 샘플은 성형 외과, 비뇨기과, 소아 외과 및 일본 대학 이타바 병원 (도쿄, 일본)의 정형 외과의 부서에서 수술을받은 환자에서 얻었다. 환자는 동의서를 작성 준, 의학의 일본 대학의 윤리위원회는 연구를 승인했다. 1. 조직 준비 <ol><li> 실험실에 수술실에서 조직 샘플을 가져와. </li><li> (-) 5 ml의 PBS로 세척 된 지방 조직의 1-2 g이어서 50 ㎖ 튜브에서 한번 실온 (RT)에서, 그리고 10cm의 플라스틱 접시에 시료를 배치했다. </li></ol> 2. 콜라게나 소화 <ol><li> (-)를 PBS에서 샘플을 제거 멸균 0.1 % 10ml를 부가 한 다음 (/ w를 V) 조직 샘플을 함유하는 접시 콜라게나 제 용액 (콜라게나 제 II 형). </li><li> 이 구성 퓌레에 도달 할 때까지 약 15 분 동안 수술 용 가위로 조직을 잘게ency. </li><li> 이어서, 0.1 %의 다진 조직 진탕 기에서 교반과 함께 50 ㎖ 튜브에서 30 분 (60 RPM)에서 37 ° C에서 (w / v)의 콜라게나 제 용액을 소화. </li><li> 50 ㎖의 튜브에 100 μm의 필터를 통해 샘플 분해 필터. 다음에, 필터를 통해 2 % FBS로 보충 된 10 ml의 DCM을 (자재 표 참조)를 통과한다. </li></ol> 3. 세포 분리 <ol><li> 실온에서 1 분 동안 100 XG에서 필터링 된 세포를 원심 분리기. </li><li> DCM는 50 ㎖ 튜브에서 2 % FBS로 보충 된이 시점에서, 5 ㎖를 준비한다. </li><li> 다음으로, 1,000 μL 피펫을 사용하여 부동 지방 세포를 작성하고 50 ㎖ 튜브 함유 배지에 세포를 추가합니다. </li><li> 그 후, 세포와 DCM 매체를 섞어 부드럽게 50 ML 튜브를 흔들. </li><li> 그 후, 실온에서 1 분 동안 100 XG에서 튜브를 원심 분리. </li><li> 18 G 바늘 및 20 ㎖ 주사기를 사용하여 튜브의 아래쪽 배지를 버리고. </li><li> 다음으로, DCM의 10 ㎖를 추가수집 된 세포를 2 % FBS와 upplemented. </li><li> 부드럽게 50 ML 튜브를 흔들어 세포와 DCM을 섞는다. </li><li> 실온에서 1 분 동안 100 XG에 튜브를 원심 분리기. </li></ol> 4. 도금 세포 <ol><li> 12.5 cm 플라스크에 20 % FBS와 보충 DCM 또는 DMEM의 41 ML을 추가합니다. </li><li> 다음으로, 200 μL 피펫은 플라스크에 지방 세포의 40 μl를 추가하여. </li><li> 그런 다음, 20 % FBS와 보충 DCM 또는 DMEM으로 술병을 입력합니다. CRITICAL STEP :이 시점에서, 세포는 배지에 걸쳐 확산되도록. 시각적으로 분리 된 세포를 확인하고 나중에 평면을 유지하기 위해 라운드 페트리 접시의 뚜껑에 플라스크를 유지합니다. </li><li> 마지막 인큐베이터 안에 플라스크를 배치하고 7 일 동안 37 ℃, 5 % CO 2 인큐베이터에서 흐트러 떠난다. </li><li> 배양 일주일 후, 플라스크를 반전하고 DFAT 세포를 확인합니다. 이 시점 fibrobl에서부터 10 설명 된대로 다음, DFAT 세포 생성 능력을 평가AST와 같은 세포 (DFAT 세포)는 지방 세포에서 특정 영역에 있습니다. </li><li> DCM 또는 DMEM 5 ㎖의 추가 이전의 세포 배양 배지를 제거한 다음, 플라스크에 20 % FBS가 보충. DFAT 세포 매체를 변경 한 후 다른 주 동안 성장하도록 허용합니다. </li><li> 세포 계수기를 사용하여, 다양한 세포 배양 조건 (DMEM 대 DCM) 하에서 생성 DFAT 세포의 수를 계산. </li></ol>

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</ol>

저자는 공개할 것이 없습니다.

시험관 탈분화에 천장 문화로 알려진 과정을 거쳐 성숙한 지방 세포는 더 원시적 인 표현형으로 되돌아와 증식 능력을 얻을 수 있습니다. 이 세포로 탈분화 지방 (DFAT) 세포라고합니다. DFAT 세포의 multilineage 분화 잠재력을 평가 하였다. 분석 및 유전자 발현 분석 DFAT 세포의 ASC (6)에 비해 매우 균일 한 것으로 확인 유동 세포 계측법. 사실, DFAT 세포의 세포 표면 항원 프로파일의 ASC 6에있는 것과 매우 유사하다. 따라서, DFAT 세포는 중간 엽 줄기 세포와 유사하게 기능 할 수있다. 성공적으로 20 % 송아지 혈청으로 보충 7-8 DMEM F12 세포 배양 배지를 이용 DFAT 세포가 생성되고 다른 그룹. 우리는 10 %의 FBS로 보충 된 세포 배양 용 배지를 사용 DFAT 셀을 제조하려고했지만,이 프로토콜 DFAT 생산 세포의 수는 w보다 상당히 낮았다편 20 ...

세포 치료 및 조직 공학 재생 의학 1-5의 분야에서 뜨거운 주제이다. 이러한 치료 양식은 큰 약속을 보유하지만, 몇 가지 기술적 인 문제는 현재 임상 사용을 방해. 이와 관련하여, IPS 세포의 생성과 모든 조직 공학 요법은 환자의 안전성을 유지하기 위해 외부 유전자 transductions없는 세포를 생산한다. 따라서, 우리는 성공적 DFAT 인간 세포 (6)를 제조하는 첫 번째 그룹이었다. 다른 여러 연구 그룹은 이후 더 우리의 모델의 유용성을 강조, 포유 동물 기원 7-9의 DFAT 세포를 생성하는 우리의 방법을 채택하고있다. 여러 연구의 과정 동안, 우리는 세포 배양 환경의 품질이 셀 매체의 내용을 조정함으로써 수정 될 수 있음을 발견 하였다. 이 발견은 DFAT 셀 생산 성공률의 증가를 이끌고 셀의 품질을 개선하고있다; 모두 중요한 요인효율적으로 향후 임상 시험에 대한 세포를 생성하는 단계를 포함한다. 이와 관련하여, 그리고 DFAT 셀 생성하는 방법 (유사한 매체 세포 재조합 인간 인슐린, 혈청 알부민, L- 글루탐산, 여러 지방산이 포함 매체 및 콜레스테롤 유래 간엽하는 DCM) 개선 DFAT 배지 및 확산 (DCM의 내용에 대한 자세한 정보는 요청시 사용 가능)을 개발했다. 사용 방법이 고품질 DFAT 세포는 지방 세포, 골 세포, 연골 세포 및 세포를 포함한 여러 세포 유형으로 분화하는 능력을 생성 하였다. 요컨대,이 검증 세포 배양 프로토콜 DFAT 셀의 품질을 향상시켜 세포 치료 및 조직 공학의 임상 적용을 향상시키기위한 매우 유용 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>CSTI303-MSC 배지&nbsp;</td><td>CSTI</td><td>87-671</td><td>이 매체는</td></tr><tr><td>PBS(-)</td><td>Wako</td><td>166-23555</td> 텍스트에서 DCM으로 정의됩니다. <td>Mg2+ 및 Ca2+</td></tr><tr><td>DMEM 매체</td>를 포함하지 않습니다. <td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma</td><td>172012</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase type II</td><td>Sigma</td><td>C-6885</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Takasago Medical Industry Co., Ltd</td><td>TKZ-F2194-1</td><td></td></tr><tr><td>셰이커</td><td>TAITEC</td><td>Bioshaker V.BR-36</td><td></td></tr><tr><td>팔콘 셀 스트레이너 100 &mu; m 옐로우</td><td>코닝 생명과학&nbsp;</td><td>DL 352360</td><td></td></tr><tr><td>팔콘 12.5 cm&sup2; 파란색 통풍 나사 캡이 있는 직사각형 경사 목 세포 배양 플라스크</td><td>CORNING LIFE SCIENCES&nbsp;</td><td></td><td></td>353107</tr><tr><td>18 G 바늘</td><td>NIPRO</td><td>02-002</td><td></td></tr><tr><td>20 ml 주사기&nbsp;</td><td>NIPRO</td><td>08-753</td><td></td></tr><tr><td>Z 시리즈 쿨터 카운터</td><td>BECKMAN 쿨터</td><td>383550</td><td></td></tr></tbody></table>

효율적인 방법은 탈분화 지방 세포를 얻는 방법

An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells

조직 공학 및 세포 치료는 임상 적으로 큰 약속을 잡으십시오. 이와 관련하여, 이러한 중간 엽 줄기 세포 (MSC들)와 같은 다 능성 세포가 손상된 장기 기능을 복원하기 위해, 가까운 미래에, 치료 학적으로 이용 될 수있다. 그럼에도 불구하고, 중간 엽 줄기 세포의 증폭과 그 주변의 비 효율성을 분리하는 매우 침습적 등 여러 가지 기술적 인 문제는 현재 이러한 치료 양식의 잠재적 임상 사용을 방해. 여기서, 우리는 탈분화 지방 세포 (DFAT) MSC 유사 세포의 생성을위한 매우 효율적인 방법을 소개한다. 흥미롭게도, DFAT 세포는 지방 세포, 골 세포, 연골 세포 및 세포를 포함한 여러 세포 유형으로 분화 될 수있다. 다른 그룹이 이전 성숙한 지방 조직에서 DFAT 세포를 생성하는 다양한 방법을 제시하였으나, 우리의 방법이보다 효율적으로 DFAT 세포를 생성 할 수있다. 이러한 관점에서, 우리는 보여 DFAT 배지 (DCM)는, 20 % FBS로 보충 된 것을20 % FBS 보충 된 DMEM보다 DFAT 세포를 생성하는데보다 효과적이다. 또한 우리의 세포 배양 방법에 의해 제조 DFAT 세포는 여러 조직 유형으로 재분화 될 수있다. 따라서, 조직의 탈분화의 연구를위한 매우 흥미롭고 유용한 모델이 제시된다.

<html> 이 연구에서, DFAT 세포 생성을위한 방법 및 키트는 (도 1)을 개선 하였다. 우리의 방법은 우리 DCM 및 20 % FBS (도 2a)를 함유하는 DMEM 배지를 모두 사용 DFAT 세포를 생성 할 수있다. 이에 따라 DFAT 세포를 생성하고 DCM DMEM 효율을 비교 하​​였다. 관계없이 지방 세포의 개수 (도 2A와 B)의 DMEM에 비해 이와 관련하여, DCM 세 배 DFAT 세포의 증식을 강화. 10 % FBS (도시되지 않은 데이터)를 사용하여 프로토콜과 비교했을 때 20 % FBS 사용은 세포 성장을 향상시킨다. 우리는 추가로 DCM을 사용하여 제조 DFAT 셀 (도 3)를 지방 세포로 재분화 및 조골 세포로 분화 할 수있는 능력을 갖고 있음을 확인 하였다. 분석법 방법은 이전 연구 <sup...

우리는 DFAT 세포 생성을 위한 조건을 수정했으며 이러한 세포의 생산을 위한 개선된 성장 배지의 사용에 관한 정보를 여기에 제공합니다.

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used ...

이 새로운 세포 배양 방법의 전반적인 목표는 탈분화된 지방 세포를 더 높은 효율로 생성하는 것입니다. 본 방법은 재생 의학 분야에서 연구하는 연구자들이 지방세포, 골세포 및 연골세포 생성에 관여하는 여러 과정에 대한 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 본 세포 배양 프로토콜의 주요 장점은 DEFAT 세포의 품질을 향상시키는 것이므로, 가까운 시일 내에 세포 치료 및 조직 공학의 현재 응용 분야를 개선하는 데 적용될 수 있을 것입니다.수술실에서 환자의 피하 지방 샘플을 실험실로 옮긴 후, 조직의 무게를 측정하고 1~2g의 지방 조직 샘플을 15mL 튜브에 넣습니다. 그다음 5mL의 PBS로 샘플을 세척한 후, 샘플을 10cm 플라스틱 디쉬로 옮깁니다. PBS를 제거합니다.그런 다음 샘플이 들어 있는 디쉬에 멸균된 0.1% w/v collagenase 10 milliliters를 추가합니다. 다음으로, 외과용 가위를 사용하여 조직이 페이스트 상태가 될 때까지 잘게 다집니다. 다져진 조직과 collagenase 용액을 15 milliliter 원심분리 튜브로 옮기고, 60 RPM으로 흔들어주며 37 °C에서 30분 동안 소화시킵니다.소화 과정 후, 소화된 샘플을 100 micron 필터로 걸러 새 15 milliliter 튜브에 담습니다. 그런 다음, 2% FBS가 첨가된 DEFAT 배양액 10 milliliters를 필터에 통과시킵니다. 세포 현탁액에서 지방 세포를 분리하기 위해, 먼저 필터링된 세포를 상온에서 100 times g로 1분 동안 원심분리합니다.원심분리 동안, 15 mL 튜브에 2% FBS가 첨가된 DCM 5 mL를 준비합니다. 그다음, 1000 µL 피펫을 사용하여 원심분리된 튜브 상층에 떠 있는 지방세포를 흡입하여 배지가 들어 있는 15 mL 튜브에 추가합니다. 튜브를 가볍게 흔들어 DCM 배지와 세포를 혼합합니다.그 다음, 상온에서 100 ×g로 1분 동안 튜브를 원심분리합니다. 원심분리 후, 18 gauge 바늘과 20 milliliter 주사기를 사용하여 튜브 바닥의 배지를 제거합니다. 그런 다음 2% FBS가 첨가된 DCM 10 milliliters를 세포에 넣고 튜브를 부드럽게 흔들어 혼합합니다.실온에서 100 ×g로 1분 동안 세포를 다시 원심 분리합니다. 플레이팅을 시작하려면 20% FBS가 보충된 DCM 또는 DMEM 41 mL를 12.5 cm 플라스크에 넣습니다. 그런 다음 200 µL 피펫을 사용하여 지방 세포 40 µL를 취해 플라스크에 추가합니다.그다음 플라스크에 DCM 또는 20% FBS가 보충된 DMEM을 채웁니다. 세포가 배지 전체에 고르게 퍼지도록 하는 것이 중요합니다. 플라스크가 수평을 유지하도록 원형 페트리 접시 뚜껑 위에 올려둡니다.마지막으로, 5% carbon dioxide 및 37 °C로 설정된 인큐베이터에 플라스크를 넣고 7일 동안 그대로 둡니다. 1주일간 배양한 후, 플라스크를 뒤집어 탈분화된 지방 세포가 있는지 확인합니다. 다음으로, 배지를 흡입하여 제거한 후 20% FBS가 보충된 5 mL의 DCM 또는 DMEM을 플라스크에 추가합니다.배지를 교체한 후 DEFAT 세포를 일주일 더 배양합니다. 일주일 후, 세포 계수기를 사용하여 다양한 세포 배양 조건에서 생성된 DEFAT 세포의 수를 측정합니다. 이 이미지는 DMEM에서 14일 동안 배양한 후의 DEFAT 세포 콜로니를 보여줍니다.여기 DCM에서 14일 동안 배양한 후의 DEFAT 세포를 보여줍니다. 각 이미지의 스케일 바는 200 microns를 나타냅니다. 세포 계수기를 사용하여 DEFAT 세포 증식을 정량화하였으며, DEFAT 세포 생성에 있어 DCM과 DMEM의 효율을 비교하였습니다.여기서 보는 바와 같이, DCM을 사용했을 때 세포 증식이 촉진되는 것이 관찰됩니다. 여기서 DCM을 사용하여 생성된 인간 DEFAT 세포를 적절한 유도 배지에서 3주 동안 배양하여 DEFAT 세포의 재분화 및 분화 능력을 평가하였습니다. 이 세포들은 알칼리성 포스파타아제 염색과 Alizarin Red S 염색을 통해 골분화 능력이 양성으로 나타났습니다. 마지막으로, Oil Red O 염색을 통해 지방분화 능력이 확인되었습니다.고품질의 DEFAT 세포를 성공적으로 생성하기 위해서는 콜라게나아제 처리와 지방 세포 분리 과정 모두를 세심하게 수행하는 것이 매우 중요합니다. 이러한 노력을 통해, 검증된 당사의 세포 배양법이 발생 생물학 및 재생 의학 분야의 현재와 미래의 연구 활동을 촉진하는 것을 목표로 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

성숙한 지방세포는 역분화를 통해 줄기세포의 풍부한 공급원을 나타낼 수 있으며, 이는 섬유아세포와 같은 세포의 균질한 집단으로 이어집니다. 콜라겐분해효소 소화는 인간 지방에서 성숙한 지방세포를 분리하는 데 사용됩니다. 우리 프로토콜의 목표는 인간의 성숙한 지방 세포에서 다분화능, 역분화된 지방 세포를 얻는 것입니다.

천장 문화 성숙한 지방 세포의 탈분화를 통해 인간 된 지방 줄기 세포의 생성

지방 조직 혈관 창시자에서 흰색과 베이지색 adipocytes의 차별화는 비만에 대사 개선 위한 잠재력을 맺는 다. 우리는 CD34 + CD31 + 인간의 지방에서 내 피 세포 격리 및 후속 시험관에 확장 및 차별화 흰색과 베이지색 adipocytes에 프로토콜을 설명합니다. 여러 다운스트림 응용 프로그램을 설명 합니다.

절연, 확장, 및 Adipogenic CD34 + CD31 + 인간의 Omental 및 피하 지방 조직에서 내 피 세포의 유도

흰색 adipose 조직 (WAT) 약물 개발 및 대사 연구를 방해, 그것의 현재 기본 문화 모델에 중요 한 결함을 있다. 여기, 선물이 stromal 세포 시트 사이 붙여 와트에 의해 많은 microphysiological 시스템을 생산 하는 프로토콜. 이 구조는 기본 와트 문화에 대 한 안정적이 고 융통성 있는 플랫폼을 제공합니다.

인간 지방 Microphysiologic 플랫폼: 백색 지방 조직에 끼여

이 프로토콜은 형광 활성화 세포 분류 또는 면역자기 비드 분리를 통해 쥐 복강 내 백색 지방 조직(WAT) 저장소에서 지방 형성 및 섬유 염증성 기질 세포 하위 집단을 분리하는 기술적 접근 방식을 설명합니다.

Isolation of Adipogenic and Fibro-Inflammatory Stromal Cell Subpopulations from Murine Intra-Abdominal Adipose Depots

우리는 형광 활성화 세포 분류를 사용하여 마우스 전도성 지방 패드에서 매우 실행 가능한 지방 전구 세포를 분리하는 간단한 방법을 제시한다.

마우스 전형 지방 조직에서 지방 전구의 준비

이 프로토콜은 유도 만능 줄기 세포(iPSC)로부터 순수한 지방세포 집단의 생성을 허용합니다. 레티노산은 iPSC를 지방세포 생성에 사용되는 중간엽 줄기세포(MSC)로 분화시키는 데 사용됩니다. 그런 다음 나일 레드 염색을 기반으로 한 분류 접근법을 사용하여 순수한 지방 세포를 얻습니다.

지방 세포 관련 장애를 연구하기 위해 인간 iPSC를 순수한 지방 세포 집단으로 강력하게 분화

이 프로토콜은 지방전구세포를 얻고 시험관 내에서 지방세포 분화를 달성하기 위해 쥐 지방 조직에서 기질 혈관 분획(SVF)의 반자동 분리를 설명합니다. 콜라게나제 분해를 위해 조직 해리제를 사용하면 실험 변동이 줄어들고 재현성이 높아집니다.

조직 해리기를 사용하여 쥐 백색 지방 조직에서 기질 혈관 분획의 반자동 분리

이 프로토콜은 효소 해리 및 형광 활성화 세포 분류를 통해 가시쥐(Acomys)에서 골격 및 심장 근육 섬유-지방 생성 전구세포(FAP)를 분리하는 방법을 간략하게 설명합니다. 이 프로토콜에서 얻은 FAP는 근섬유아세포 및 지방세포로 효과적으로 확장되고 분화될 수 있습니다.

Fibro-Adipogenic Progenitor Isolation, Expansion, and Differentiation from the Spiny Mouse Model(스파이니 마우스 모델로부터의 섬유-지방형성 전구세포 분리, 확장 및 분화)

여기에서는 자가 지방 조직을 서로 다른 물리화학적 특성과 기능을 가진 다양한 지방 구성 물질로 변환할 수 있는 프로토콜을 제시합니다.

지방을 특수 성분으로 전환하기 위한 혁신적인 지방 조직 분획

여기서는 처리 시간이 &gt;90% 감소하고, 세포 생존율이 높으며, 광범위한 호환성을 특징으로 지방유래 줄기세포와 지방세포를 효율적으로 분리하는 표준 방법을 제시합니다.

돼지 지방 조직에서 지방 유래 줄기세포와 지방세포의 효율적인 분리

배우세요 DFAT 세포를 효율적으로 생성하는 새로운 세포 배양 방법을. 이 개선된 배지는 재생의학 및 조직공학 연구에서 세포 품질을 향상시키고 세포 치료 적용에 활용될 수 있습니다.

효율적인 방법은 탈분화 지방 세포를 얻는 방법

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