효율적인 방법은 탈분화 지방 세포를 얻는 방법

이 새로운 세포 배양 방법의 전반적인 목표는 더 높은 효율성으로 역분화된 지방 세포를 생성하는 것입니다. 우리의 방법은 재생 의학 분야에서 일하는 연구자들이 지방형성 세포, 골형성 세포 및 연골형성 세포 생성과 관련된 여러 과정에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 세포 배양 프로토콜의 주요 장점은 DEFAT 세포의 품질을 향상시킨다는 것이므로 가까운 장래에 세포 치료 및 조직 공학의 현재 응용 분야를 개선하는 데 적용될 수 있습니다.

수술실에서 환자의 피하 지방 샘플을 실험실로 가져온 후 조직의 무게를 측정하고 1-2g의 지방 조직 샘플을 15ml 튜브에 넣습니다. 그런 다음 5ml의 PBS로 샘플을 세척한 다음 샘플을 10cm 플라스틱 접시에 옮깁니다. PBS를 제거합니다.

그런 다음 샘플이 들어있는 접시에 부피 당 10 밀리리터의 멸균 0.1 % 중량 콜라겐 분해 효소를 첨가하십시오. 다음으로, 수술용 가위를 사용하여 조직이 퓌레의 농도가 될 때까지 다집니다. 다진 조직과 콜라겐분해효소 용액을 15ml 원심분리기 튜브에 옮기고 60RPM으로 흔들면서 섭씨 37도에서 30분 동안 소화합니다.

분해 후 분해된 샘플을 100미크론 필터를 통해 새 15ml 튜브에 넣습니다. 그런 다음 2% FBS가 보충된 10ml의 DEFAT 배양 배지를 필터를 통과시킵니다. 세포 현탁액에서 지방 세포를 분리하기 위해 먼저 여과된 세포를 실온에서 1분 동안 100배 g으로 원심분리합니다.

원심분리하는 동안 15ml 튜브에 2%FBS가 보충된 DCM 5ml를 준비합니다. 다음으로, 1000마이크로리터 피펫을 사용하여 원심분리된 튜브에서 떠다니는 지방 세포를 추출하고 배지가 들어 있는 15ml 튜브에 세포를 추가합니다. 튜브를 부드럽게 흔들어 DCM 배지와 세포를 혼합합니다.

그런 다음 실온에서 1분 동안 100회 g으로 튜브를 원심분리합니다. 원심분리 후 18게이지 바늘과 20밀리리터 주사기를 사용하여 튜브 바닥에 있는 매체를 제거합니다. 그런 다음 2%FBS가 보충된 DCM 10ml를 세포에 넣고 튜브를 부드럽게 흔들어 섞습니다.

실온에서 1분 동안 100배 g으로 세포를 다시 원심분리합니다. 도금을 시작하려면 12.5cm 플라스크에 20%FBS가 보충된 41ml의 DCM 또는 DMEM을 추가합니다. 그런 다음 200마이크로리터 피펫을 사용하여 40마이크로리터의 지방 세포를 추출하고 플라스크에 추가합니다.

그런 다음 플라스크에 20% FBS가 보충된 DCM 또는 DMEM을 채웁니다. 세포가 배지 전체에 퍼져 있는 것이 중요합니다. 둥근 페트리 접시의 뚜껑에 플라스크를 올려 평평하게 유지합니다.

마지막으로 플라스크를 이산화탄소 5%와 섭씨 37도로 설정된 인큐베이터에 넣고 7일 동안 방해받지 않고 그대로 둡니다. 일주일 동안 배양한 후 플라스크를 뒤집어 역분화된 지방 세포가 있는지 확인합니다. 다음으로, 배지를 흡입한 다음 20% FBS가 보충된 5ml의 DCM 또는 DMEM을 플라스크에 추가합니다.

배지를 변경한 후 DEFAT 세포가 일주일 더 성장하도록 합니다. 일주일 후, 세포 계수기를 사용하여 다양한 세포 배양 조건에서 생성된 DEFAT 세포의 수를 계산합니다. 이 이미지는 DMEM에서 14일 동안 배양한 후 DEFAT 세포 콜로니를 보여줍니다.

다음은 DCM에서 14일 동안 배양한 후의 DEFAT 세포입니다. 각각의 경우 축척 막대는 200미크론을 나타냅니다. 세포 계수기를 사용하여 DEFAT 세포 증식을 정량화하고 DEFAT 세포 생성에서 DCM 및 DMEM의 효율성을 비교했습니다.

여기에서 볼 수 있듯이, DCM의 사용으로 향상된 세포 증식이 관찰됩니다. 여기서, DCM을 사용하여 생성된 인간 DEFAT 세포를 적절한 유도 배지에서 3주 동안 배양하여 DEFAT 세포의 재분화 및 분화 능력을 평가했습니다. 세포는 알칼리성 인산가수분해효소(alkaline phosphatase) 염색에 의해 골형성 능력(osteogenic capacity)에 대해 양성이었고, 알리자린 레드 S(Alizarin Red S)로 염색함으로써 골형성 능력(osteogenic capacity)에 대해 양성이었다.

기초적인 콜라겐 분해 효소와 지방 세포 분리를 모두 통해 고품질 DEFAT 세포를 성공적으로 생성하기 위해 최대한 주의를 기울여 수행하는 것이 매우 중요합니다. 이러한 노력을 통해 당사의 검증된 세포 배양 방법은 발달 생물학 및 재생 의학 분야에서 현재와 미래의 연구 노력을 촉진하는 것을 목표로 합니다.