Name: 전임상 환자 유래 종양 소설 안티 - 암 치료의 조사를위한 이종 이식 모델의 개발 및 유지 보수 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: 학습하세요 환자 유래 종양 이종이식 모델을 활용한 신항암 치료제 효능 평가 및 예후 바이오마커 발굴 방법을. 이 기법은 종양 이형성을 유지하여 임상적 관련성이 높은 전임상 연구에 필수적입니다.

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윤리 정책 : 환자 유래 대장 선암 종양 표본이 콜로라도 여러 임상 시험 심사위원회 (08-0439)에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 콜로라도 병원의 대학에서 환자 동의에서 얻었다. 모든 동물의 작업은 콜로라도 덴버 기관 동물 관리 및 사용위원회의 대학에 의해 승인 동물 프로토콜에 따라 수행 하였다 (IACUC, 프로토콜 # 51412 (06) 1E와 96813 (04) 1E). 1. 받기 및 환자 혈액을 준비 <ol><li> 한 수집 -이 구연산 나트륨을 함유하는 혈액 / 세포 분리 튜브에서 혈액 ㎖ (플라즈마, 림프구 및 단핵구 밴드 밀도 구배 유체, 겔 차단 및 적혈구 및 호중구가 포함 된 튜브 상이다). 주의, 혈액이나 조직과 혈액 매개 병원체의 지침을 따르십시오. 참고 : PBMC를 플라즈마를 포함 할 수있다 미래 연구에 사용될 수 있습니다 : 종양 돌연변이와 생식 세포 유전 적 변이를 비교, circula를 분리등 무 세포 DNA (cfDNA) 검사 단백질 마이크로 RNA, 평가 팅 종양 세포. </li><li> RT 없음 브레이크 15 분 동안 2,500 XG에서 혈액 / 세포 분리 튜브를 원심 분리기. </li><li> 말초 혈액 단핵 세포를 (림프구 및 튜브의 단핵구 대역에서 PBMC를)를 수집하고 1.5 ml의 microcentrifuge 관 (일반, 오토 클레이브, DNase의,의 RNase 및 발열 무료)에 넣어 멸균 인산 완충와 튜브의 상단에 기입 식염수 (PBS). <ol><li> RT에서 3 분 동안 2300 × g으로 원심 분리 튜브의 하단의 한 PBMC 펠릿을 형성 하였다. 다음, 조심스럽게 뜨는을 제거합니다. 30 초 동안 3,000 XG에 펠렛 원심 분리기를 씻어 멸균 PBS 1 ML을 추가 한 다음 상층 액을 제거합니다. </li></ol></li><li> 1.5 ml의 멸균 극저온 유리 병에 (튜브의 플라즈마 단계에서) 혈액 / 세포 분리 튜브에서 플라즈마를 수집하는 피펫을 사용하여 (DNase의와의 RNase 무료, 아니 인간의 DNA, 내 독소 무료) 및로 PMBC의의 플라즈마와 펠렛을 넣어 -80 ° C (F)저장 Freezer (냉동실). </li></ol> 2. 받기 및 환자 종양 샘플 준비 <ol><li> 준비 RPMI 또는 DMEM 미디어 1 다음 중 하나 페니실린 - 스트렙토 마이신 및 비 필수 아미노산의 100 (10 %), 1 : 1000 (1 %) Plasmocin, 10 % 불 활성화 태아 소 혈청 (전체 미디어) 및 추가 20-25 종양 표본에 대한 멸균 컬렉션 컵 ml의. </li><li> 얼음에 완전한 미디어를 포함하는 살균 컵에 종양 샘플을 검색하거나 4 ℃에서 보관하십시오. 주 : 종양 샘플, 외과 의사에 의해 제거 병리학 자에 의해 처리하고, 완전한 미디어 무균 수거 컵에 배치되어 과잉 환자 종양 조직의 한 조각이다. 주의, 혈액이나 조직과 혈액 매개 병원체의 지침을 따르십시오. 또한, 이상적으로 다섯 마우스를 주입, 종양은 약 1 ㎤의해야합니다. </li><li> 면역 저하 쥐에 주입 동물 시설에 종양 샘플을 가져와. 주 : 최대한 빨리 종양 샘플을 처리하는 것이 최상이다. <ol><li> 층류 후드에서 종양 컵에서 멸균 플라스틱 가공 접시에 종양 샘플을 놓는다. 젤라틴 단백질 혼합 용액 300 ㎕를 가득 멸균 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 12 약 3 × 3 × 3mm 조각과 배치 - 10로 절단하는 오토 클레이브 - 작은 가위와 집게를 사용합니다. 얼음에 튜브를 유지합니다. </li><li> 우선 순위로 마우스에 종양을 주입하지만, 남아있는 종양이 존재하는 경우, 플래시 냉동 바이알 (FF), 포르말린 고정 파라핀 포함 (FFPE) 컵 및 실행 가능한 종양 병을 수집합니다. </li><li> FF를 들어, 단백질, RNA 또는 DNA 분리와 같은 추가 분석을 위해 멸균 저온 유리 병에서 종양 조직의 작은 조각을 수집합니다. 액체 질소 듀어에 즉시 FF를 배치하고 장기 보관 -80 C의 냉동고 °. </li><li> FFPE 들어 충분한 종양, 위 종양, 적어도 24 시간 동안 포르말린되면 파라핀 블록에 10 ml의 10 % 포르말린 컵 프로세스로 3 작은 조각이됩니다. 참고 : 24 시간을 기반으로우리의 조직학 코어의 제안 11 끕니다. </li><li> 마지막으로, 극저온 튜브에 남아있는 종양을 배치합니다. 미디어를 완료하는 데 10 % 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)를 추가하여 가능한 미디어를 확인합니다. 다음으로, 극저온 튜브에 1 ml에 추가하고 얼음에 저장합니다. 주 : 오랜 시간 동안 얼음에 보관하지 마십시오. <ol><li> 10 종양이 향후 5 생쥐에 주입하는 이상적으로 충분합니다 작은 조각으로 남은 종양을 잘라. 이를 이소 프로필 알코올 냉동 컨테이너 (천천히 한번에 종양 1 °의 C를 정지)에 넣고, -80 ° C에 냉동 투입 될 때까지이어서, 종양이 중 다이되지 않도록 얼음 생존 종양 튜브를 배치 동결 과정. 주 : 장기 저장을 위해 종양을 제거한다 (이 후 - 삼일) 큰 액체 질소 듀어 넣고. 가능한 튜브는 마우스에 주입 추출되지 않는 한 해동 할 수 없습니다 것을 유의하시기 바랍니다. </li></ol></li></ol></li></ol> 삼.환자 유래 종양 이종 이식의 주입 <ol><li> 각 개별 환자 유래의 종양 8 회 오래 된 남성 및 / 또는 여성 무 흉선 누드 마우스 (부족 T 세포) - 오 (6)을 사용합니다. 10 종양의 총 (마우스 당 2 주사) 피하 (SQ)를 주입한다. 주 : 원래 인간 종양 F0로 지정하고 한번 차세대 F1 인 쥐에 주입된다. 또한, 각각의 고유 한 이식편에 대한 멸균 된 집게, 가위, 및 트로 카를 사용합니다. </li><li> 멸균 12 G의 트로 카를로 젤라틴 단백질 혼합 용액에서 종양의로드 조각은 종양이 완전히 투관침에 밀려되어 있는지 확인합니다. <ol><li> (마취의 유지를 위해 3 % 아이소 플루 란 - - 4 %의 산소 및 2 5 %의 초기 속도 아이소 플루 란에서 시작 3) 멸균 층류 후드에있어서, 이소 플루 란 마취 기계에 접속 된 마취 상자에 마우스 5 마리를 올려 숯 필터 (과잉 가스를 흡수). 참고 : 숙련 된 기술자에 전체 절차를 수행 할 수 있어야한다약 5 분 총 (마우스 당 약 30 초)에서 5 쥐의 케이지. 따라서 추가로 열 지원과 눈 윤활은 일반적으로 사용되지 않습니다. 경험이 적은 개인 또는 훈련 기간 동안, 매우 개인이 한 번에 적은 동물의 절차를 수행 및 / 또는 동물이 5 분보다 더 오래 마취 될 경우 절차를 수행하는 동안 온난화 패드 / 아이 윤활을 사용하거나하는 것이 좋습니다. 절차는 우리 대학에서 IACUC 표준을 기반으로합니다. </li></ol></li><li> 마우스가 더 이상 응답 없도록 마우스 발가락을 꼬집어 후 아이소 플루 란 상자에서 마우스를 가져 가라. 옆구리 영역은 멸균 12 G의 트로 카를에 도달 할 때까지 중간 지느러미 목 영역 아래 피하 투관침을 슬라이딩에 종양을 주입하는 깨끗한 필드에 마우스를 놓습니다. <ol><li> 마우스의 측면의 각 측면에 하나의 종양 피하을 제공합니다. 투관침은 종양 원하는 측면 영역에 남아 있음을 보장 인출 될 때 종양 핀치. GE의latinous 단백질 혼합물을 마우스의 신체 온도 경화 및 종양 성장에 도움 SQ 및 결합 조직에 고정하기 위해 약 1 주간 종양을 캡슐화한다. 투관침에 의해 병변 4mm보다 크지 않으며 스테이플 피부에 가까이 할 필요가 없다. 주 : 우리 수의사가 더 클로저가 병변의 매우 작은 크기에 기초하지 필요 결정된 짧은 치료 시간이 기간 동안, 기록없이 감염, 및 동물의 근접 모니터링 (중간 등쪽 넥 영역은 피부에 긴장이나 병변 정리 감소) . </li></ol></li><li> 마우스를 멀리 종양 주사 부위에서 완전히 깨어 분사 멜 록시 캄 2 ㎎ / ㎏ SQ (진통제)을하기 전에. 다음으로, 케이지에 마우스를 놓고 마우스가 깨어 및 이동 될 때까지 모니터링 할 수 있습니다. 참고 : 완전히 깨어 때까지 무인 동물을 회복 두지 마십시오. 멜 록시 캄의 투여 량은 우리 대학에서 IACUC 표준을 기반으로합니다. <ol><li> 다음으로,도 4와 같은 절차를 반복마우스를 나머지 자신의 호흡을 모니터링 할 수 있습니다. 참고 :이 매우 빠른 절차 및 마우스 멜 록시 캄 주입 후 곧 깨어 있습니다,하지만 필요에 따라 아이소 플루 란을 조정하십시오. 마우스 취출 때마다, 아이소 플루 란 거절. 멜 록시 캄은 24 시간 지속되고 트로 카를에서 병변은 완전 일주에 치유 할 것이다. </li></ol></li></ol> 환자 유래 종양 이종 이식 은행 4. 유지 보수 <ol><li> 적어도 일주일에 한 번 쥐의 성장과 건강을 모니터링합니다. 종양의 크기, 종양의 생성, 종양 주입의 날짜 및 마우스의 건강을 추적하는 스프레드 시트 (또는 다른 추적 시스템)를 사용합니다. 참고 : 마우스는 15 원래 체중 %, 낮은 신체 조건 점수 (≥ 2)를 분실 한 경우, 종양 궤양, 종양은 2,000mm 3 또는 전체 종양 3,000mm 3, 웅크 (병약하고, 감기, 혼수 등을 도달했다 .) 임의의 방식에서, 마우스 CO₂ 통해 안락사 또는 경부 전위로 하였다 마취econdary 방법. 종양을 수집하고, 그렇지 않은 생쥐 CO₂ 경부 탈구를 통해 안락사 경우 마취 경추 탈구를 통해 안락사. </li><li> 종양은 위에서 설명한 후 안락사하는 자궁 경부 전위를 수행으로 약 1,500-2,000 mm 3 마취 마우스 인 경우. <ol><li> 마우스가 하트 비트가 없음을 확인합니다. 멸균 가위와 집게와 SQ 종양을 절제. 참고 : 허용 종양은 최대 1 년 성장하고 더 종양이 보이지 않는 경우 다음 두 번째 방법으로 자궁 경부 전위 다음 CO 2를 통해 쥐를 안락사합니다. </li><li> 통로 (5 마우스의 새로운 세트 일명) 다음 세대로 성장하는 종양 가장. 전달 12 종양 또한 상술 한 바와 같이 후 남은 종양을 수집 - 사용 설명서 위 (10)를 수집합니다. 참고 : 다수의 가능한 튜브를 수집하는 초기 세대 (F1 - F8)에서 매우 중요하다; 따라서 여러 가능한 튜브, FF 튜브 및 generat라는 당 1 FFPE를 수집이온. </li><li> 마우스의 새로운 세대는 약 300mm 3의 종양 성장이 때까지 남아있는 쥐를 유지합니다. 나머지 마우스 큰 종양이있는 경우, 전술 한 바와 같이 계속 수집. </li></ol></li><li> 통로 종양에 계속 F15까지 각 단계에서 수집합니다. 이 시점에서, 액체 질소 중 가능한 초기 세대의 가능한 튜브를 타고 얼음에 해동을하게 상술 종양 주입 절차를 따르십시오. 가능한 튜브에서 성장 종양은 세대에서 세대로 전달에 비해 쥐에서 성장하는 데 시간이 더 걸릴 수 있으므로 계획 할 때 염두에 두십시오 있습니다. 특정 PDTX 모델은 더 이상 통과에 필요한 경우 안락사 않고 수많은 가능한 튜브는 장래의 사용을 위해 회수되도록하는 종양을 수집한다. </li></ol> 환자 유래 종양 이종 이식 5. 발달 치료 참고 : F3 세대에서 대부분의 종양이 좋은 성장 속도론은 (더 빠르고 공동 성장이nsistent) 따라서, 약물의 효능 연구를 PDTX로 진행합니다. <ol><li> 원하는 종양이 매우 큰 경우 (1500 - 2,000mm 3), 마우스의 원하는 양으로 확장하는 종양를 수집하기 위해 위의 절차를 따르십시오. <ol><li> 상기 가정에 따라서 처리 군마다 필요한 종양의 수를 결정 시험된다. 주 : 단백질이 젤라틴 혼합액 1 ㎖를 마우스에 주입하기 위해 약 30 피트의 작은 조각 종양 (종양 형태에 의존) 할 수있다. </li></ol></li><li> 주간 종양으로 쥐를 확인 대부분의 종양은 (50 사이에 약 - 300 mm³) 눈에 띄게 작은 경우 종양 부피를 결정하는 캘리퍼스와 함께 종양을 측정한다. 종양의 부피 = [width² (최소 측정) × 길이 (최대 측정)] 0.52을 X. 주 : 단백질이 젤라틴 혼합물 용액을 일주일의 종양 성장이 정확할 것이다 후 후 일주일 동안 주입 된 종양 부분을 둘러싼 다. </li><li> 300 mm³과 - (50) 사이에 종양 볼륨을 사용하여N 좌우 종양 평균. 이어서 서로 약간 번호 내의 그룹과 그룹 당 평균 10 종양 치료 그룹으로 무작위. 다음으로, 그룹으로 마우스를 정렬하고 원하는 치료 연구를 시작한다. </li><li> 약물 (약물에 따라 일정) 두 번 일주일에, 무게 측정 (종양)와 쥐 선량. 연구의 끝에서, 마취 및 자궁 경부 전위를 통해 쥐를 안락사와 실험실에서 미래의 약력 학적 분석을 위해 종양를 수집합니다. 참고 :이 연구는 차량 종양의 크기와 마우스의 상태에 따라 30 일 동안 지속됩니다. </li></ol> PDTX 은행 6. 조직 <ol><li> 연구 및 동물의 적절한 사용의 반복 방지하기 위해 잘 문서화 된 형태를 유지합니다. 참고 :이 성공적으로 PDTX 은행의 핵심입니다. <ol><li> PDTX 은행의 마우스, 처리, 데이터, 병원에서 인간의 환자에서 종양을 추적하기 위해 스프레드 시트를 사용하여 무엇을 수집한다. 주 :이 냉동 액체 질소 dewars 포함뿐만 아니라, 및 FFPE 저장. </li></ol></li></ol>

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</ol>

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PDTX 신약 개발 플랫폼은 신규 화합물의 임상 활동을 예측 신뢰할 수없는 다른 전임상 모델의 단점을 개선 모델을 제공합니다. 중요한 것은,이 모델에서 종양이 생물학적으로 안정, 전이성 잠재력을 보유하고 세대 유사한 약물 반응성을 나타낸다. 이 모델에서, 환자 유래의 종양은 무 흉선 누드 마우스에 주사 계대하고,이어서 치료의 평가에 사용된다. 등 성공적인 PDTX 은행에 대한 몇 가지 중요한 단계가 있습니다 : 1) 응집력 임상 팀 / 동의 환자를 식별하고 우수한 실험실 및 기술 동물과 함께 제거와 종양 조직의 흥행 PDTX 모델과 2) 강력한 연구 그룹에 종양 조직과 PDTX 뱅크의 유지 주입 된 마우스의 상태를 감시하기위한 기술. 우리 PDTX 모델에서 중요한 이점은 투관침 절차 종양을 주입한다. CU의 다른 방법종양 포켓 tting 후 봉합 또는 피부 클립을 사용하는 사람을 위해 소요되는 많은 시간, 더 고통 마우스에 대한 약물 치료 및 봉합이나 상처 클리핑 영역의 모니터링이 필요합니다. 투관침 절차 적은 훈련을 필요로 ...

대장 암 (CRC)는 미국에서 암 사망에 크게 기여. 2015 년, 49,700 사망 1 CRC의 예상 132,700 새로운 사례가 있었다. 국소 질환 환자의 예후가 우수하지만, 고급 질환 환자는 신규 치료법의 개발이 중요한 우선 순위 결정, 불량한 결과를 갖는다. 치료 화학 요법이 질병에 배포 된 새로운 생물학적 제제의 기준에도 불구하고, 전체 생존 만 증분 증가하고있다. 따라서,이 질병에서 종양 성장을 촉진 관련된 드라이버 경로를 이해하는데 상당한 노력이 존재한다. 암 게놈 아틀라스 네트워크는 최근 다수의 주요 CRC의 이상 조절에 관여하고 포함하는 경로 확인했습니다 : WNT를, 포스 3- 키나제 (PI3K), RAS, 변형 성장 인자 β (TGF-β의)와 TP53 2. 함께 조사는 오티 설명과 함께CRC 성장을 강화할 그녀의 경로를 크게이 환자군 3-5 생존을 개선하기위한 새로운 치료법의 개발을 촉발 하였다. 종양 치료제 개발에 활용 전임상 모델은 이러한 신규 한 화합물의 임상 적 활성을 예측하는 과정이 필수적이었다. 다양한 전임상 모델은 신약 개발 과정에서 사용되어왔다. 전임상 트랜스 제닉 동물 모델 및 세포주 크게 때문에 인간 종양의 복잡도를 반영하기 위해 자신의 무능력을, 신규 종양 치료법의 임상 적 활성을 결정하는데 성공적이지 않은 불멸화 것을 고려하면, 환자 유래의 종양 이종 이식 (PDTX) 모델이 확립되었다. 이 모델의 가장 큰 장점은 종양 이질성은 그대로 유지하고 밀접하게 원래 환자 종양 6-9의 분자 특성과 clonality을 반영하는 것입니다. PDTX 모델은 생체 내에서 우수한을 제공전임상 플랫폼은 새로운 에이전트, 약물 내성 경로, 조합 전략, 암 줄기 세포 생물학 (10)을 공부한다. PDTX 공정의 일반적인 개요는도 1에 도시되어있다. 또한, 병원에서 시작 그 초과 종양 조직이 일부 연구에 사용될 수 있도록 환자 동의. 다음으로, 수술로 종양의 조각은 병리학 자에 의해 싫어할하고 연구 인력으로 운반 할 미디어에 넣어. 바로 그 후, 종양의 단면은 작은 조각으로 절단하고, 면역 결핍 마우스의 피하에 이식. 종양 성장 후에는 종양 (10)을 유지하기 위해 다른 세대의 마우스로 계대된다. 전형적으로, F3 생성 후에 종양은 신규 화합물 및 / 또는 조합 치료를 평가 치료 연구로 확장 될 수있다. 활용하여 차세대 서열 (엑솜 서열, RNA 서열과 SNP 어레이) 가능성 예측 바이오 마커 발견하다특정 치료에서 효과를 유도 할 수있다 환자의 선택에 도움 에디션. 1) 단일 에이전트로 또는 조합하여 새로운 치료법의 효능을 평가하고 2) 이전에 임상 시험에 대한 민감도 또는 저항의 예측 바이오 마커를 식별 : PDTX 모델을 사용하는 무엇보다 중요한 목표로합니다. 이 논문에서, 우리는 CRC PDTX 은행의 개시 및 유지 보수 방법론을 제공하고 신약 개발의 발견이 모델의 장점과 한계를 제공합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54393/54393fig1.jpg" /> CRC를 PDTX 모델 프로토콜의 그림 1. 개요. 환자 유래의 종양은 수술받은 즉시 피하 무 흉선 누드 마우스에 주입된다. 종양이 성장하면 그것은 다음 세대로 확장하고 결국 치료 연구에 확장됩니다. 치료 RESPONSE를을 평가하고 예측 바이오 마커는. 환자 선택에 도움을 수 식별 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54393/54393fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>RPMI 또는 DMEM</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 스트렙토 마이신</td><td>코닝</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>비 필수 아미노산</td><td>Corning</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td>해동 -4 &deg; C, 그런 다음 30 &deg에서 60분 동안 활성화합니다. C 수조</td></tr><tr><td>CPT 혈액 튜브</td><td>BD 진공</td> 청소기 <td>362761</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심 분리기 튜브</td><td>Surelock</td><td>A-7002</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr>사이로겐<td>바이알</td><td>Cyroking</td><td>C0732901</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 종양 절단 접시</td><td>Trueline</td><td>TR4001</td><td></td></tr><tr><td>가위</td><td>Roboz</td><td>RS-5881</td><td></td></tr><tr><td>집게</td><td>Roboz</td><td>RS-5135</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel (젤라틴 단백질 혼합물)</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>-20 또는 -80 &deg에 보관하십시오. C, 그런 다음 얼음에서 해동하고 RT</td></tr><tr><td>10 % 포르말린 컵</td>에 두지 마십시오 <td>프로토콜</td><td>032-059</td><td></td></tr><tr><td>액체 질소 듀어 저장</td><td>Thermolyne</td><td>CY50900</td><td></td></tr><tr><td>휴대용 액체 질소 듀어</td><td>Nalgene</td><td>4150-2000</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 설폭 사이드</td><td>Fischer</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>냉동 용기 : Mr</td><td>Frosty Nalgene</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>이소 프로필 알코올</td><td>Decon</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>투관침</td><td>미국</td><td>MP-182</td><td></td></tr><tr><td>마취 기계</td><td>혁신 연구 Patterson 수의학</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마취 상자</td><td>Patterson 수의학</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>수의사 1</td><td>1038005</td><td></td></tr><tr><td>F-Air 캐니스터</td><td>Bickford Omnicon</td><td>80120</td><td></td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td>Vet one</td><td>5182-90C</td><td></td></tr><tr><td>캘리퍼스</td><td>파울러</td><td>54-100-167</td><td></td></tr><tr><td>체중계</td><td>오하우스</td><td>스카우트 프로 SP601</td><td></td></tr></tbody></table>

전임상 환자 유래 종양 소설 안티 - 암 치료의 조사를위한 이종 이식 모델의 개발 및 유지 보수

Development and Maintenance of a Preclinical Patient Derived Tumor Xenograft Model for the Investigation of Novel Anti-Cancer Therapies

환자 유래 종양 이종이식편(PDTX) 모델은 인체 실험에 앞서 항암 약물 개발을 촉진하는 데 필요한 플랫폼을 제공합니다. 인간 종양 조각을 무흉선 누드 마우스(면역 저하, T 세포 결핍)에 피하 주입하여 종양 은행을 만든 다음 환자로부터 이러한 종양을 유지하기 위해 다른 세대의 마우스로 배양합니다. 중요한 것은 원래 종양의 세포 이질성이 이 모델에서 밀접하게 모방되어 약물 효능 연구(단일 제제 및 조합), 바이오마커 분석, 저항성 경로 및 암 줄기세포 생물학의 평가에 임상적으로 보다 관련성이 높은 모델을 제공한다는 것입니다. PDTX 모델의 몇 가지 한계는 마우스에서 1세대 이후 인간 기질이 마우스 기질로 대체된 점, 종양의 피하 주사로 인한 전이에 대한 치료 효과를 조사할 수 없는 점, 면역이 저하된 마우스의 사용으로 인한 면역 요법에 대한 평가 부족 등을 포함합니다. 그러나 이러한 한계에도 불구하고 PDTX 모델은 신약 개발 프로세스에서 강력한 전임상 플랫폼을 제공합니다.

CRC를 PDTX 모델과 TCGA에있는 일반적인 돌연변이의 유사점 우리는 CRC PDTX 은행에서 일반적으로 돌연변이 (KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA, APC, CTNNB1 및 TP53)의 비율은 CRC 환자 집단에서 볼 수있는 돌연변이 주파수를 대표했다 여부를 조사 하였다. 도 2A (TCGA) 및 B (CRC PDTX 뱅크)에 도시 된 바와 같이, 이들 유전자의 돌연변이의 빈도는 TCGA (N = 276 명) 및 CRC PDTX 뱅크 (N = 59 CRC 환자)와 매우 유사 하였다. 23 %의 차이가 관찰되었다 관찰함으로써 가장 큰 차이점은, APC 유전자에 있었다. 이러한 결과는 CRC 환자 집단에서 관찰 된 일반적인 돌연변이가 잘 C...

피하 전임상 모델에서 환자 유래 종양을 활용하여 새로운 치료법, 예측 바이오 마커의 발견 및 약제 내성 경로의 효능을 연구 할 수있는 좋은 방법입니다. 이 모델은 신약 개발 과정에서 임상 시험에 앞서 많은 신규 항암 요법의 운명을 결정하는데 중요하다.

Patient derived tumor xenograft (PDTX) models provide a necessary platform in facilitating anti-cancer drug development prior to human trials. Human tumor ...

본 피하 환자 유래 암종 이종이식(Patient Derived Tumor Xenograft) 절차의 전반적인 목표는 종양에서 새로운 치료법의 효능, 예측 바이오마커 발굴 및 약물 내성 경로를 연구하는 것입니다. 이 방법은 특정 약물이 특정 종양 유형에 대해 활성을 나타내는지에 대한 종양학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 환자 유래 암종 이종이식이 원래 종양의 전형적인 분자적, 유전적 및 조직학적 이질성을 유지하여 모델의 임상적 관련성을 높인다는 점입니다.시연은 저희 실험실의 전문 연구 보조원이자 공인 수의 테크니션인 Stacey Bagby가 진행하겠습니다. sodium citrate가 포함된 혈구 분리관에 1~2 mL의 혈액을 채취한 후, 샘플을 원심분리하고 말초혈액 단핵구(PBMC) 층을 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 튜브의 상단까지 멸균 PBS를 채웁니다.그런 다음, 세포를 다시 원심 분리합니다. 이어서 PMBC 펠렛이 손상되지 않도록 주의하며 1 mL의 PBS로 빠르게 세척합니다. 그 후, 피펫을 사용하여 혈구 수집 튜브에서 혈장을 1.5 mL 멸균 냉동 보관 튜브로 옮기고, 혈장과 PBMC 펠렛을 -80 °C에서 보관합니다.완전 배지가 담긴 멸균 컵에 인간 종양 조직을 옮겨 동물 시설로 운반한 후, 컵을 층류 후드(laminar flow hood) 내에 배치하십시오. 조직을 채취한 직후 가능한 한 빨리, 소량의 회수 배지가 담긴 멸균 플라스틱 절단 접시로 조직을 옮깁니다. 그런 다음, 오토클레이브로 멸균한 소형 가위와 핀셋을 사용하여 조직을 약 3x3x3 mm 크기로 절단하고, 이식 준비를 위해 얼음 위에 둔 300 µL의 젤라틴성 단백질 혼합 용액이 포함된 오토클레이브 멸균 1.5 mL 미세원심분리 튜브에 10~12조각을 넣습니다.급속 냉동 보관을 위해서는 적절한 수의 종양 조각을 새로운 1.5 milliliter 미세 원심분리 튜브로 옮기고 바이알을 액체 질소 도너에 넣습니다. 그 후, -80 °C 냉동고에 보관합니다. 포르말린 고정 및 파라핀 매립을 위해서는 작은 종양 조각 3개를 10 milliliter 10% 포르말린 컵에 넣고 24시간 동안 둡니다.조직을 파라핀 임베딩 블록으로 제작한 후, 남은 조직 조각들을 동결 보관용 튜브(cryogenic tube)로 옮깁니다. 그런 다음, 10% DMSO가 첨가된 완전 배지 1 mL를 조직에 넣고, 이소프로필 알코올 동결 컨테이너로 옮기기 전까지 튜브를 얼음에 박아 보관합니다. 이후 해당 컨테이너를 -80 °C 냉동고에 보관합니다.종양 조직을 주입하려면, 젤라틴성 단백질 혼합 용액에 보관된 종양 조각들을 멸균된 12-gauge 트로카에 장입하되, 각 종양 조각이 트로카 내부로 완전히 삽입되었는지 확인하십시오. 다음으로, 6~8주 된 무흉선 누드 마우스의 발가락 꼬집기 반응이 없는 것을 확인한 후, 마우스를 멸균 라미나 플로우 후드의 깨끗한 작업 영역으로 옮깁니다. F0 종양을 등쪽 목 부위와 마우스의 양측 옆구리에 피하 주사하고, 이어서 종양이 주입된 옆구리 부위 중 한 곳의 원위부에 진통제를 피하 투여하십시오.그 후, 마우스를 다시 케이지에 넣고 완전히 회복될 때까지 관찰합니다. 제노그라프트가 이식된 마우스의 성장과 건강 상태를 최소 일주일에 한 번 확인하며, 종양 크기, 종양 세대, 종양 주입 날짜 및 마우스의 건강 상태를 적절한 추적 시스템에 기록합니다. 종양 크기가 약 1,500에서 2,000 cubic millimeters에 도달하면, 고압증기멸균된 가위와 포셉을 사용하여 종양을 절제하고, 방금 시연한 것과 같이 F1 종양을 다음 세대의 동물 5마리로 계대 이식합니다. 이때 각 종양에 대해 시연된 대로 급속 냉동 포르말린 샘플과 생존 종양 샘플을 주의하여 수집하십시오.F0 종양 그룹의 남은 마우스에서 종양의 크기가 약 1, 500에서 2, 000 cubic millimeters에 도달하면, 앞서 시연한 수집 방법과 동일하게 해당 종양들을 수집하십시오. F15 종양 생성 단계에 도달하면, 액체 질소 저장소에 보관된 가용한 종양 조각 중 가장 초기 세대를 사용하여 다음 시리즈의 종양 주입을 수행하십시오. 원하는 종양이 1, 500에서 2, 000 cubic millimeters 정도로 매우 클 때는, 위의 절차에 따라 종양을 수집하여 원하는 수의 마우스로 확장하십시오.마우스에 약물을 투여하고 주 2회 체중 측정 및 측정을 수행합니다. 각 그룹당 종양 10개가 포함되도록 마우스를 치료 그룹으로 무작위 배정하며, 그룹 내 종양 부피 평균은 100에서 300 cubic millimeters 사이로서 서로 표준편차 범위 내에 있어야 합니다. 그 후, 마우스들을 치료를 위한 적절한 그룹으로 분류합니다.인간 및 마우스 DNA를 대상으로 한 이중 색상 형광 인시튜 하이브리다이제이션(fluorescence in situ hybridization) 결과, F0 종양의 인간 기질 세포가 F1 종양에서는 마우스 기질 세포로 대체되었음이 입증되었습니다. 또한, F0 세대의 모든 인간 유래 간세포 성장 인자(hepatocyte growth factor)는 F1 세대에서 마우스 간세포 성장 인자로 대체된 반면, 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor) 리간드는 F1 세대에서 인간 및 마우스 단백질 모두로 구성되었습니다. 동일한 종양의 서로 다른 세대를 처리하더라도 치료 반응에는 변화가 없었습니다.종양의 내성 또는 민감도는 종양의 세대보다는 종양 계통에 특이적인 것으로 보입니다. 또한, 이러한 공통 변이 유전자들의 변이 빈도는 Cancer Genome Atlas와 대장암 환자 유래 종양 이종이식 뱅크 간에 매우 유사하게 나타났습니다. 이는 대장암 환자군에서 관찰되는 공통 변이들이 대장암 환자 유래 이종이식 모델에 잘 반영되어 있음을 시사합니다.숙달되면 이 기술은 적절히 수행했을 때 1~2시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 암 환자를 식별하고 동의를 구하며, 종양 조직을 제거하고 육안 검사를 수행하기 위해 응집력 있는 임상 팀을 구성하는 것이 중요합니다. 본 절차 이후에는 특정 종양 유형의 환자에 대해 이러한 전략의 생존 가능성에 대한 추가적인 질문에 답하기 위해 단일 제제 또는 병용 제제로서의 항암 화합물 조사와 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.이 기술의 개발 이후, 종양학 분야의 연구자들은 새로운 암 치료제, 종양 이질성, 치료 내성 기전, 암 줄기세포 생물학 및 종양 기질 상호작용을 탐구할 수 있는 길을 열게 되었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 새로운 암 치료제를 평가하기 위한 환자 유래 종양 이종이식 모델을 구축하고 유지하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

인간 다발성 골수종 (MM) 세포는 간엽 세포의 생존과 증식을위한 세포 외 매트릭스 성분의지지 미세 환경을 필요로한다. 우리는 종양의 성장, 침윤 및 혈관 신생에 항암제의 효과를 연구하기 위해 접목 인간 골수종 및 중간 엽 세포와 생체 내 닭 배아 모델을 설립했다.

닭에서 인간의 다발성 골수종 이종 이식 모델의 설립은 종양의 성장, 침략과 혈관 신생을 공부하기

암 세포의 이식은 암 기전과 치료 반응의 확인에 중요한 도구입니다. 현재의 기술은 면역 기능이없는 동물에 달려 있습니다. 여기, 우리는 종양 세포 행동과 생체 내 약물 반응의 장기 분석을위한 면역 능력이있는 배아에 zebrafish 종양 세포를 이식하는 방법을 설명합니다.

종양 세포의 행동과 약물 반응에 대한 장기 연구를 위해 면역 능력이있는 숙주 내로 Zebrafish Pediatric Brain 종양을 이식

여기, 우리는 암에 대 한 신뢰할 수 있는 전 임상 모델을 만드는 생물학 관련 사이트에서 초음파 유도 신경 (NB) 및 Ewing의 육 (ES) 세포의 주입을 활용 (설립 세포 및 종양 환자에서 파생 된 셀) 프로토콜 제시 연구입니다.

초음파의 이용 가이드 생물학 관련 전이성 종양 Xenografts의 설립을 위한 세포 이식 조직 감독

환자 유래 이종이식(PDX) 모델은 흑색종 분자 및 생물학적 특징을 보다 강력하게 회귀하고 기존의 플라스틱 조직 배양 계 세포 에 비해 치료 반응의 더 예측이다. 여기서는 새로운 PDX 모델 의 확립과 기존 PDX 모델의 특성화/실험에 대한 표준 운영 프로토콜에 대해 설명합니다.

흑색종 환자 유래 이종이식 모델

우리는 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 기술합니다 - 번역형 면역 종양학 연구를 위한 기지를 둔 인간화한 이종이식 마우스 모형. 이 프로토콜은 I-O 치료 평가를 위한 유사한 모형을 설치하고 특성화하기 위한 일반적인 지침으로 봉사할 수 있었습니다.

인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 번역 면역 종양학에 대한 인간화 제종이식 모델 (I-O) 연구

현재 프로토콜은 외과 위암 견본에서 환자 파생된 이종이식 (PDX) 모형 및 1 차적인 암 세포주를 설치하는 방법을 기술합니다. 이 방법은 약물 개발 및 암 생물학 연구에 유용한 도구를 제공합니다.

위암 환자 유래 이종이식 모델 및 1차 세포주 구축

여기서 우리는 종양의 게놈 메이크업에 기초하여 선택된 표적 치료의 효능을 시험하기 위한 프로토콜을 제시한다. 프로토콜은 구조적인 DNA 재배열의 확인 그리고 검증, 마우스로 환자의 종양의 이식 및 해당 약에 대한 반응을 시험하는 것을 기술합니다.

구조적 DNA 변경 분석 및 환자 유래 제노이식을 사용하여 암에 있는 표적으로 한 치료 시험

환자 유래 제노이식(PDX) 모델과 이식 가능한 유전자 조작 마우스 모델은 인체 질환을 충실히 재구성하고 기본 및 번역 형 유방암 연구를 위한 선호 모델입니다. 여기서, 종양 생물학을 연구하고 약물 반응을 평가하기 위해 유방 지방 패드로 유방 종양 단편을 정형전으로 이식하는 방법이 설명된다.

유방암을 위한 전임상 모형으로 유방 종양의 정형소 이식

다음 작업에서는 대장암과 췌장암의 대형 바이오뱅크 설립에 필요한 연속적인 단계를 설명합니다.

살아있는 바이오 뱅크의 창조 및 유지 보수 - 우리가 그것을 하는 방법

PDX 모델이 중개 종양학 분야에서 빠르게 표준이 되고 있기 때문에 현재 프로토콜은 역형성 갑상선 암종(ATC) 및 두경부 편평 세포 암종(HNSCC)의 환자 유래 이종이식(PDX) 모델을 설정하고 특성화합니다.

역형성 갑상선 암종 및 두경부 편평 세포 암종의 환자 유래 이종 이식 모델의 확립 및 특성화

여기에서는 신선한 흑색종 조직에서 분리된 세포 현탁액을 배양하여 흑색종 환자 유래 오가노이드를 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 이러한 오가노이드는 in vitro 에서 환자 특이적 종양을 충실하게 재현하여 종양 면역억제 메커니즘, 약물 스크리닝, 약물 내성 메커니즘 및 암 감시 접근법을 탐구하기 위한 혁신적인 접근 방식을 제공합니다.

흑색종 환자 유래 오가노이드 모델을 통한 치료 기회 발굴

학습하세요 환자 유래 종양 이종이식 모델을 활용한 신항암 치료제 효능 평가 및 예후 바이오마커 발굴 방법을. 이 기법은 종양 이형성을 유지하여 임상적 관련성이 높은 전임상 연구에 필수적입니다.

전임상 환자 유래 종양 소설 안티 - 암 치료의 조사를위한 이종 이식 모델의 개발 및 유지 보수

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