Name: 신호 전달 단백질의 기능을 흉내 낸 : 인공 신호 전달 요법을 향해 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: 학습하세요 합성 화학 전달체를 이용한 단백질 간 인위적 신호 전달 메커니즘과 GST 효소 활성 조절 방법을. 이 연구는 인공 신호 전달 요법 개발에 중요한 통찰을 제공합니다.

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이 연구는 미네르바 재단, HFSP 조직 및 유럽 연구위원회 그랜트에 의해 지원되었다 (부여 338265 시작).

&#39;화학 트랜스 듀서&#39;의 1. 합성 <ol><li> 사전 준비 <ol><li> 초순수 114 ml의 아세트산 및 400 mL의 트리 에틸 아민 278 mL를 혼합하여 2 M 트리 에틸 암모늄 아세테이트 (TEAA) 버퍼를 준비한다. 어두운 병에 보관 7 pH를 조정하고 1 L.의 최종 볼륨에 물을 추가합니다. 참고 :이 솔루션은 수년간 안정적입니다. </li><li> 초순수 20ml에 아스코르브 산 18 mg을 용해시켜 5 mM의 아스코르브 산 용액을 제조 하였다. 새로운 솔루션을 사용; 용액을 하루 동안 안정하다. </li><li> 11 ml의 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)에 TBTA 10 초순수 ml의 물과 58 mg의 구리 (II) 설페이트 수화물 25 mg을 용해시켜 10mM의 구리 (II) / 트리스 (benzyltriazolylmethyl) 아민 (TBTA) 용액을 제조 하였다. 두 용액을 혼합한다. 실온에서 보관하고 빛으로부터 보호. </li></ol></li><li> 활용 절차 <ol><li> 80 μL에서 수정 된 올리고 뉴클레오티드의 100 nmol의 (ODN-1) 용해신선한 초순수. pH가 = 7. 아스코르브 산 (물에 5 밀리미터)의 갓 만든 용액 80 μl를 추가, 2 M의 TEAA의 20 μl를 추가합니다. </li><li> DMSO 180 μL에 아지 수정 에타 크린 산의 1.5 μmol (574.5 μg의)를 용해 용액에 추가합니다. 구리 (II) / TBTA 용액 (55 %에서 10 밀리미터 (v / v)의 DMSO / 물)에서 40 μl를 추가 신속하게 60 초 동안 아르곤을 사용하여 솔루션을 드가. </li><li> 가까운 단단히, 아르곤 다시 제거하고, 밤새 교반. </li><li> (이동상 : A) 반응의 진행을 모니터링하고 RP-HPLC에 의해 복합체를 정제 5 % 아세토 니트릴, 5 % TEAA, 90 % 초순수; B) 65 % 아세토 니트릴, 5 % TEAA, 30 % 초순수). 24 </li></ol></li></ol> 2. PDGF에 의해 GST의 활동을 제어 <ol><li> 사전 준비 <ol><li> 8 mM의 최종 농도로 인산 및 광고를 달성하기 초순수 16.1 ㎖의 인산염 완충 식염수 (PBSx1) 33.9 mL를 혼합하여 분석 완충액 50 ㎖를 준비D의 MgCl 2 23.8 mg을 5 mM의 최종 농도를 달성한다. </li><li> 50 mM 트리스 (pH 7.5), 50 mM의 NaCl을 함유하는 완충액으로 단백질을 용해시켜 GST M1-1의 원액을 제조, 1 mM 디티 오 트레이 톨 (DTT) 및 30 μM의 최종 농도 5 mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA). -80 ℃에서이 작은 분량 씩에 솔루션 및 저장소를 나눈다. 정량법 버퍼에, 섹션 2.1.5.1에 ​​따르면, 갓 희석하고 얼음에 보관하십시오. 주 : 효소 활성의 감소가있을 때까지 상기 용액을 약 5 시간 동안 안정하거나한다. </li><li> 다음 지침에 따라 기판을 준비 : <ol><li> 100 mM의 스톡 용액의 최종 농도로 초순수 325 μL의 환원 글루타티온 (GSH) 10 ㎎을 녹인다. 2.1 mM의 작업 용액의 최종 농도에 대한 분석 버퍼의 979 μl의이 원액에서 21 μl를 희석. </li><li> (E)의 492 μL에 2,4- 디 니트로 클로로 벤젠 10 ㎎ (CDNB)을 녹이고100 mM의 스톡 용액의 최종 농도 thanol. 4.32 mM의 작업 용액의 최종 농도에 대한 분석 완충액 956.8 μL의 스톡 용액으로부터 43.2 μL 희석. </li></ol></li><li> 96 웰 플레이트에서 별도의 라인 (12 웰)의 각 기판을 넣어. 솔루션의 빠르고 쉽게 철회 할 수 있도록 각 웰에 최소 60 μl를 삽입합니다. 빛 보호를위한 알루미늄 시트와 함께 접시를 커버. </li><li> 상기 분석 버퍼는 다음 원액을 준비한다 : <ol><li> 이량 체 0.6 μM의 최종 농도로 50 GST M1-1 희석. </li><li> 30 μM 원액에 &#39;화학 물질 변환기를&#39;희석. </li><li> 40 μM의 최종 농도로 희석 PDGF. </li><li> 250 μM의 최종 농도 PDGF 앱 타머를 희석. </li></ol></li></ol></li><li> 상기 &#39;화학 센서&#39;의 존재와 PDGF의 GST의 활동을 측정합니다. <ol><li> 실험 절차의 난을 설정동역학 측정을 위해 플레이트 판독기 n 개의. <ol><li> 는 &#39;표준 프로토콜&#39;과 같은 새로운 실험을 만듭니다. </li><li> &#39;절차&#39;를 눌러 절차 설정 창을 엽니 다. </li><li> 가 상단에 팝업 목록에서 플레이트 제조 업체에 따라 &#39;384 판&#39;유형을 선택합니다. </li><li> 왼쪽 메뉴를 눌러 &#39;읽기&#39;. </li><li> 상기 검출 방법은 &#39;흡광도&#39;선택에. </li><li> 읽기 유형에 대해서는 &#39;종점&#39;을 선택합니다. </li><li> 파장 창에서 340 nm의 쓰기. </li><li> 상단 오른쪽에있는 &#39;전체 판&#39;바닥에 눌러 잘 선택을 측정한다. </li><li> 를 눌러 &#39;확인&#39;을 닫습니다 &#39;읽기&#39;창. </li><li> 선택 왼쪽 메뉴에 &#39;운동 시작&#39;. </li><li> 실행 시간 10 분을합니다. </li><li> 최소 간격 옵션을 선택합니다. </li><li> 를 눌러 &#39;확인&#39;운동 창을 닫습니다. </li><li> &#39;읽기&#39;라인 전을 드래그운동 측정 NTO. </li><li> &#39;검증&#39;버튼을 누른 다음 &#39;확인&#39;버튼을 누릅니다. </li><li> 실험을 저장합니다. </li><li> &#39;재생&#39;버튼을 누릅니다. 대화 상자가 나타납니다 - 측정이 시작되어야 할 때 단지 &#39;확인&#39;버튼을 누릅니다. </li></ol></li><li> 상기 삼중 실험을 수행하는 네 개의 샘플링 &#39;화학 센서&#39;및 GST M1-1 3.25 μL를 각각 함유하는 3.25 μl를 준비하기 위해. 각각, 각 샘플 0, 1.2, 2.4, 또는 PDGF 및 123.5, 122.3, 121.1의 4.9 μL, 또는 분석 버퍼의 118.6 μL에 추가합니다. </li><li> 10 분 동안 실온에서 용액을 인큐베이션. </li><li> 384 투명 웰 플레이트에 각 웰에 샘플의 40 μl를 삽입합니다. 기판 첨가 멀티 피펫의 사용을 허용하는 경우에만, 홀수 또는 웰은 동일한 행에 짝수 웰에 샘플을 삽입한다. </li><li> 12 채널 다중 피펫을 사용하여, 신속 t 각 10 μL를 추가96 웰 플레이트 (섹션 2.1.4)에 미리 준비 하였다 그는 기판. 거품을 방지하기 위해 신속하고 부드럽게 혼합한다. 독자에 플레이트를 삽입하고 운동 측정을 시작합니다. GST 동력학이 매우 빠르게되기 때문에, 기판을 첨가하고 반응 속도 측정의 시작 사이의 시간을 최소화하려고. </li></ol></li><li> GST 활성화 &#39;화학 변환기&#39;에 의해 중재 / 억제 사이클. <ol><li> 상기 삼중 실험을 수행 5 샘플 분석 완충액 84.5 μL, &#39;화학 센서&#39;의 3.25 μL 및 GST M1-1 3.25 μl를 함유하는 각각을 준비하기 위해. 3 분 동안 실온에서 인큐베이션. </li><li> 분석 버퍼의 3.65 μL 샘플 2-5에 PDGF의 1과 3.65 μl를 샘플 추가합니다. 3 분 동안 실온에서 인큐베이션. </li><li> 샘플 1-2 분석 버퍼의 3.12 μL 샘플 3-5에 PDGF 앱 타머의 3.12 μl를 추가합니다. 3 분 동안 실온에서 인큐베이션. </li><li> 샘플 분석 버퍼의 24.4 μl를 추가샘플 4-5에 PDGF의 1-3 24.4 μL. 3 분 동안 실온에서 인큐베이션. </li><li> 5 분 동안 실온에서 5 품어을 샘플링 샘플 1 ~ 4 및 PDGF 앱 타머의 7.8 μL에 대한 분석 버퍼의 7.8 μl를 추가합니다. </li><li> 384 투명 웰 플레이트에 각 웰에 시료 40 μl를 삽입합니다. 만 홀수로 또는 만 같은 줄에서조차 우물에 삽입 샘플. </li><li> 12 채널 다중 피펫을 사용하여 신속하게 각 기판 10 μL를 추가 (96- 웰 플레이트에 미리 제조 됨). 거품을 방지하기 위해 신속하고 부드럽게 혼합한다. 독자에 플레이트를 삽입하고 운동 측정을 시작합니다. </li><li> t에서 340 나노 = 활성화 / 금지 재활용 성을 평가하기 위해 t에서 340 내지 = 1.5 분에서 측정 된 OD 0.5 분으로 측정 한 OD를 감산하여 각 조건 하에서 V 0 [MOD / 분]를 계산한다. 25 </li></ol></li><li> 환경의 변화에 ​​&#39;화학 센서&#39;의 실시간 응답을 평가합니다. <ol> &lt;리&gt; PDGF 첨가 실시간 효과 <ol><li> 운동 측정 용 플레이트 리더의 실험 절차를 설정합니다. </li><li> 반복 2.2.1.1-2.2.1.10 단계를 반복합니다. </li><li> 실행 시간 3.5 분합니다. </li><li> 최소 간격 옵션을 선택합니다. </li><li> 를 눌러 &#39;확인&#39;운동 창을 닫습니다. </li><li> 운동 측정에 &#39;읽기&#39;라인을 끕니다. </li><li> 왼쪽 메뉴에 /에서 아웃 플레이트를 선택합니다. </li><li> 옵션 &#39;아웃 플레이트 (아무 대화 상자)&#39;을 선택합니다. </li><li> 왼쪽 메뉴의 &#39;지연&#39;옵션을 선택하고 30 초를 입력합니다. </li><li> 왼쪽 메뉴에 /에서 아웃 플레이트를 선택합니다. </li><li> 옵션 &#39;(어떤 대화)의 판&#39;을 선택합니다. </li><li> 2.2.1.14을하지만 섹션 2.2.1.11에서 25 분 대신 10 분으로 운동을 설정 - 단계 2.2.1.4를 반복하여 두 번째 운동 측정을 만듭니다. </li><li> &#39;검증&#39;버튼을 누른 다음 &#39;확인&#39;버튼을 누릅니다. </li><li> 실험을 저장합니다. </li><li> &#39;괞 찮아을 눌러Y &#39;버튼을 클릭합니다. 대화 상자가 나타납니다 - 측정이 시작되어야 할 때 단지 &#39;확인&#39;버튼을 누릅니다. </li><li> GST M1-1의 1 μL 및 분석 버퍼 38 μL의 &#39;화학 센서&#39;의 1 μl를 혼합하여 두 개의 샘플을 준비합니다. 이 두 우물 사이에 빈 우물을 떠나, 384 투명 잘 판의 두 우물에 샘플을 삽입합니다. </li><li> 신속하게 각 기판 10 μL를 추가 부드럽게 혼합하고 빠르게 거품을 방지하기 위해, 리더로 플레이트를 삽입 운동 측정을 시작하는 12 채널 다중 피펫 사용. </li><li> 플레이트는 (3.5 분 후)를 열 때, 신속하게, 우물 중 하나에 PDGF의 1.125 μl를 추가 부드럽게 믹스, 플레이트 나머지 운동 측정을 가까이 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> PDGF 앱 타머를 추가 실시간 효과 <ol><li> 반복 2.4.1.1-2.4.1.15 단계를 반복합니다. </li><li> GST M1-1의 1 μL, 1 μl를 혼합하여 두 개의 샘플을 준비합니다 &#39;화학 센서 &#39;및 분석 버퍼의 36.9 μL에서 PDGF의 1.125 μL. 이 두 우물 사이에 빈 우물을 떠나, 384 투명 잘 판의 두 우물에 샘플을 삽입합니다. </li><li> 거품을 방지 리더에 플레이트를 삽입하고 운동 측정을 시작하기 위해 빨리 빨리, 각각의 기판에서 10 μl를 추가 부드럽게 혼합하고, 12 채널 멀티 피펫을 사용하여. </li><li> 플레이트는 (1.5 분 후)를 열 때, 신속하게, 우물 중 하나에 PDGF 앱 타머의 1.2 μl를 추가 부드럽게 믹스와 플레이트 나머지 운동 측정을 가까이 할 수 있습니다. </li></ol></li></ol></li><li> &#39;화학 센서&#39;와 PDGF의 존재에 GST에 의해 JS-K 전구 약물 활성화를 측정한다. <ol><li> 운동 측정 용 플레이트 리더의 실험 절차를 설정합니다. <ol><li> 는 &#39;표준 프로토콜&#39;과 같은 새로운 실험을 만듭니다. </li><li> &#39;절차&#39;를 눌러 절차 설정 창을 엽니 다.</li><li> 가 상단에 팝업 목록에서 플레이트 제조 업체에 따라 &#39;384 판&#39;유형을 선택합니다. </li><li> 왼쪽 메뉴를 눌러 &#39;읽기&#39;. </li><li> 상기 검출 방법은 &#39;흡광도&#39;선택에. </li><li> 읽기 유형에 대해서는 &#39;종점&#39;을 선택합니다. </li><li> 파장 창에서 305 nm의 쓰기. </li><li> 상단 오른쪽에있는 &#39;전체 판&#39;버튼을 누르면 잘 선택을 측정한다. </li><li> 를 눌러 &#39;확인&#39;을 닫습니다 &#39;읽기&#39;창. </li><li> 선택 왼쪽 메뉴에 &#39;운동 시작&#39;. </li><li> 실행 시간 10 분을합니다. </li><li> 최소 간격 옵션을 선택합니다. </li><li> 를 눌러 &#39;확인&#39;운동 창을 닫습니다. </li><li> 운동 측정에 &#39;읽기&#39;라인을 끕니다. </li><li> &#39;검증&#39;버튼을 누른 다음 &#39;확인&#39;버튼을 누릅니다. </li><li> 실험을 저장합니다. </li><li> &#39;재생&#39;버튼을 누릅니다. 대화 보X 표시됩니다 - 측정이 시작되어야 할 때 단지 &#39;확인&#39;버튼을 누릅니다. </li></ol></li><li> NO 생산을위한 측정은 아질산염 / 질산염 열량 키트를 사용합니다. 96 웰 플레이트에서 세 번째 행으로, 한 행에 내가 두 번째 행에 시약은 Griess 70 μL, 및은 Griess II 시약의 70 μl를 분석 버퍼 50 μl를 삽입합니다. </li><li> 상기 삼중 실험을 수행하는 네 개의 샘플링 &#39;화학 센서&#39;각각 함유하는 4.8 μL를 준비하기 위해. 분석 완충액 155.2 μL를 추가 샘플 1; GST-M1-1의 3.2 μL 및 분석 버퍼의 152 μl를 추가, 2를 샘플링하는 단계; PDGF의 9.6 μL 및 분석 버퍼의 145.6 μl를 추가, 3을 샘플링하는 단계; 와, 4 샘플 GST-M1-1의 3.2 μL, PDGF의 9.6 μL 및 분석 버퍼의 142.4 μl를 추가합니다. </li><li> 10 분 동안 실온에서 용액을 인큐베이션. </li><li> 384 투명 웰 플레이트에 각 웰에 시료 50 μl를 삽입합니다. 만 홀수 또는 단지를에 삽입 샘플동일한 라인에도 웰 기질 첨가 멀티 피펫의 사용을 허용한다. </li><li> 각 웰에 JS-K의 0.54 μL (DMSO 5 mm)를 추가합니다. </li><li> 빠르게 거품을 방지하기 위해 신속하게 (96 웰 플레이트에 미리 제조 됨)을 조심스럽게 믹스 GSH 용액 10 μL를 추가하고, 12 채널 다중 피펫 사용. 독자에 플레이트를 삽입하고 운동 측정을 시작합니다. </li><li> Griess의 I 시약 50 μL와 50 μL 즉시 운동 측정 한 후, 12 채널 다중 피펫을 사용하여, 미리 준비된 96- 웰 플레이트에서 분석 완충액 행에 각 시료 50 μL를 가지고 신속하게 추가 은 Griess II 시약. RT에서 10 분 동안 광으로부터 보호하면서 인큐베이션하고 550 nm에서 흡광도를 측정한다. 참고 : 분석 완충액 및 시약의 볼륨이 키트 &#39;프로토콜에 따라 달라집니다. </li></ol></li></ol>

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우리는 천연 단백질을 변형하지 않고 자연적으로 관련이 없는 두 단백질인 GST와 PDGF 사이의 인공 통신을 유도할 수 있는 '화학 변환기'를 설계하고 테스트하는 방법을 제시했습니다. 부자연스러운 GST-PDGF 통신은 '화학 변환기'가 있는 상태에서 GST 활성의 변화를 추적하고 PDGF 농도를 증가시키는 효소 분석을 사용하여 실시간으로 감지할 수 있습니다. PDGF에 의한 GST의 활성화를 검출하는 것 외에도, 이러한 분석은 경쟁 압타머에 의한 GST의 비활성화와 항암 전구약물의 PDGF 매개 절단을 추적하는 데 사용되었습니다. 올리고뉴클레오티드 입력에 반응하여 단백질의 활성을 제어할 수 있는 다른 전환 가능한 단백질 결합제가 기술되었습니다. 26 그러나, 본원에 기술된 프로토콜은 천연 단백질의 존재에 반응하는 새로운 종류의 단백질 결합제의 기능을 따르는 수단을 실증한다. 이러한 방식으로 단백질 바이오마커에 의한 효소 조절을 실시간으로 감지할 수 있으며, 이는 이러한 시스템을 사용하여 전구약물 및 GST의...

신호 전달 경로는 거의 모든 세포 과정에 중요한 역할을 담당하고, 셀이 급속히 환경 신호에 응답 할 수있다. (1)이 경로는 종종 세포 내 효소의 활성 결과 세포 외 수용체에 시그널링 분자의 결합에 의해 유발된다. 증폭 및 세포 내 신호 전달이 효소는 높은 특이성을 가역적으로 활성화되는 단백질 - 단백질 상호 작용의 네트워크를 형성하는 신호 전달 단백질의 작용에 의해 매개된다. 이러한 네트워크의 조절 곤란 자주 암 발생을 유도하기 때문에, 약물 악성 신호 전달 경로를 방해하도록 설계된다 &#39;암 신호 전달 요법&#39;이 확립에 많은 관심이 있었다. 최근 부자연 신호 전달 경로를 생성하는 약물의 능력에 의존하여 전달 요법을 알리기 위해 다른 방법을 제안 하였다. <su특히 p&gt; 3, 우리는 신호 전달 단백질의 작용을 모방 합성 제제를 설계함으로써, 간접적으로 세포의 기능을 조절하는 것이 가능하다고 판단된다. 예를 들어, 이들 네트워크는 인공 드럭을 절단하는 효소를 활성화하는 생체 단백질을 가능하게 할 수있다. 또한, 이러한 신호 전달 단백질 모방 체는 치료 효과의 결과로, 자연스러운 세포 신호 전달 경로를 활성화 할 수 있습니다. 이러한 접근의 가능성을 증명하기 위해, 최근 인 글루타치온 에스 - 트랜스퍼 라제 (GST)를 활성화시켜 항암 전구 약물의 분해를 유발 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF)를 가능하게하는 합성 &#39;화학 변환기&#39;4 작성한 하지 자연 바인딩 파트너. 이 &#39;변환기&#39;의 구조에 대한 GST 가의 억제제 수정 항 PDGF의 DNA 앱 타머 구성된다. 따라서,이 합성 에이전트에 결합 부위와 분자의 가족에 속하는다른 단백질, 이량의 5-7와 같은 화학 유도 (식별자) 8 ~ 10도 올리고 뉴클레오티드 합성 분자 복합체를 기반으로 단백질 바인더의 그룹. 11-21 이러한 시스템의 설계의 기초가되는 일반적인 원리는 본 명세서에 기술되고 합성 종래 효소 분석법이 &#39;변환기&#39;의 기능을 테스트하기위한 상세한 프로토콜이 제공된다. 이 작업은 세포 단백질 간의 통신을 매개하고, 따라서, 인공 세포 신호 전달 경로를 유도하는 데 사용될 수있다,이 클래스의 추가적인 &#39;센서&#39;를 개발 촉진하기위한 것이다. 도 1은 비 천연 단백질 간의 통신을 매개 할 수있는 합성 &#39;화학 센서&#39;의 동작 원리를 설명한다. 제자를위한 합성 바인더 통합이 그림은 &#39;화학 센서&#39;에서고용주 식별 번호 (EIN) I 및 II (바인더 I 및 II)는 자연 바인딩 파트너가 아닌 단백질의 촉매 활성 I를 트리거하는 단백질 II 수 있습니다. II 단백질의 부재에서, 변환기는 효소 (단백질 I)의 촉매 사이트를 결합하고 그 활성 (도 1의 상태 II)를 억제한다. 단백질 II의 &#39;변환기&#39;결합, 단, 그 결과의 유효 농도를 단백질 I. 향해 친화력을 감소 바인더 I 단백질 II의 표면 (도 1의 상태 ⅲ) 사이의 상호 작용을 촉진 &#39; 솔루션 무료 &#39;트랜스 듀서는 트랜스 듀서 단백질의 해리 리드하는 감소 I 복잡하고 단백질 I의 재 활성화에 (그림 1, 상태 ⅳ). (1) &#39;변환기&#39;, 단백질 목표의 각각에 대해 (2) 상호 작용 betwe을 특정 바인더가 있어야합니다 함께 다음 단계는 효율적인 &#39;변환기&#39;의 디자인을 기본 세 가지 기본 원칙을 강조바인더 II 단백질 엉 II 내가 단백질 II의 표면과 상호 작용 할 수 있어야 바인더 I 단백질 I, (3) 바인더 사이의 상호 작용보다 더 강한해야합니다. 이 마지막 원칙은 반드시 단백질 II 향해 높은 친화력 및 선택성을해야 내가 혼자 바인더를 필요로하지 않습니다. 대신, 단백질에 근접 합성 분자를 가져 오는 것은,이 단백질 분자의 표면 사이의 상호 작용을 촉진 할 가능성이 있음을 보여 우리의 최근의 연구에 기초한다. 19,22,23 <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54396/54396fig1.jpg" /> 그림 1 :. &#39;화학 트랜스 듀서는&#39;활성 단백질 I (상태 I)에 추가 될 때 &#39;화학 센서&#39;의 작동 원리, 그것은 바인더를 통해 활성 부위에 I를 결합하여 그 활성 (주 II)를 억제한다. II 단백질의 존재하지만, 결합되지 않은 &quot;화학 transducer &#39;는 바인더 I 단백질 II의 표면 사이의 상호 작용을 촉진 바인더 II를 통해 단백질 II와 상호 작용합니다. 이 유도 바인더 I-단백질 II 상호 작용은 내가 복잡하고 단백질에 내가 재 활성화 (상태 IV). &#39;transducer&#39; 단백질의 해리 리드 바인더 I의 유효 농도를 감소 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54396/54396fig1large.jpg" target="_blank">여기를 클릭하십시오이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 .</a>

<table><tbody><tr><td>1-클로로-2,4-디니트로벤젠</td><td>시그마-알드리치</td><td>237329</td><td></td></tr><tr><td>아세트산</td><td>바이오 랩</td><td>01070521</td><td></td></tr><tr><td>아세트니트</td><td>릴 J.T.Baker</td><td>9017-03</td><td></td></tr><tr><td>아스코르브산</td><td>시그마-알드리치</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>구리(II) 황산염 5수화물</td><td>Merck-Millipore</td><td>102790</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드</td><td>Merck-Millipore</td><td>802912</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco의 인산염 완충 식염</td>수 <td>생물학 산업</td><td>02-023-5A</td><td></td></tr><tr><td>에타크린산</td><td>Tokyo Chemical Industry Co. Ltd</td><td>E0526</td><td></td></tr><tr><td>글루타티온-s-전이효소 M1-1</td><td>이스라엘 구조 단백질체학 센터(이스라엘 Rehovot, Weizmann Institute of Science)JS-K</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>J4137</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타티온 감소</td><td>시그마-알드리치</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘</td><td>J.T.Baker</td><td>0162</td><td></td></tr><tr><td>질산염/아질산염 비색 분석 키트</td><td>케이맨 화학</td><td>780001</td><td></td></tr><tr><td>올리고뉴클레오티드</td><td>WM Keck 재단 예일 대학교</td><td></td><td>맞춤 주문</td></tr><tr><td>PDGF-BB</td><td>이스라엘 구조 단백질체학 센터 (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TBTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>678937</td><td></td></tr><tr><td>Triethylamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0886</td><td></td></tr><tr><td>탈염 컬럼</td><td>GE Healthcare</td><td>illustra MicroSpin G-25 컬럼</td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Waters&nbsp;</td><td>2695 분리 모듈</td><td></td></tr><tr><td>HPLC 컬럼</td><td>Waters</td><td>XBridgeTM OST C18 컬럼(2.5 & M, 4.6 mm &times; 50 mm)</td><td></td></tr><tr><td>HPLC 컬럼</td><td>Waters</td><td>XBridgeTM OST C18 컬럼 (2.5&nbsp; &뮤; M, 10mm &타임; 50 mm)</td><td></td></tr><tr><td>플레이트 리더</td><td>BioTek</td><td>synergy H4 hybrid</td><td></td></tr></tbody></table>

신호 전달 단백질의 기능을 흉내 낸 : 인공 신호 전달 요법을 향해

Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy

다양한 환경 신호에 대한 세포의 반응을 조절하는 신호 전달 경로는 서로 상호 작용하고 높은 특이성으로 서로를 활성화하는 신호 단백질의 기능에 의해 매개됩니다. 따라서 이러한 단백질의 기능을 모방하는 합성 물질은 부자연스러운 신호 전달 단계를 생성하고 결과적으로 세포의 기능을 변경하는 데 사용될 수 있습니다. 우리는 네이티브 단백질 간의 인위적인 통신을 유도할 수 있는 '화학적 트랜스듀서'를 설계하기 위한 지침을 제시합니다. 또한 혈소판 유래 성장 인자(PDGF)와 글루타티온-S-전이효소(GST)라는 두 가지 관련 없는 단백질 간의 통신을 유도할 수 있는 특정 '변환기'를 합성하고 테스트하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이러한 부자연스러운 PDGF-GST 통신이 항암 전구약물의 절단을 제어하는 데 사용될 수 있는 방법도 제시되어 '인공 신호 전달 요법'에 이러한 시스템을 사용할 수 있는 가능성을 나타냅니다. 이 연구는 세포 내 단백질-단백질 통신을 매개하고 결과적으로 인공 세포 신호 경로를 유도하는 데 사용될 수 있는 이 등급의 추가 '변환기' 개발을 촉진하기 위한 것입니다.

설계, 합성 및 PDGF와 GST 사이에 인공 커뮤니케이션을 유도 할 수있는 &#39;화학 센서&#39;의 작용 메커니즘은 그림 2에 제시되어있다. &#39;변환기&#39;의 구조는 PDGF DNA 앱 타머 및 비스 - 에타 크린 아미드를 통합 (BEA ), 각각 26 nm의 144 nm의, 알려진 GST 억제제 (그림 2a). (19)이 바인더 (해리 상수, K d 개를 &#39;변환기&#39;, 즉 다른 친 화성을 가진 두 PDGF와 GST를 결합 할 수 있도록 &#39;들)이다 이러한 설계에있어서 또. 4는 PDGF 결합하면 BEA 유닛과 현저 BEA 억제제의 효능을 감소시킬 PDGF의 표면 사이의 비특이적 인 상호 작용을 유도한다. 19,22,23도 2b는 예시 이 시스템을 기본 운영 메커니즘....

우리는 자연적으로 관련이 없는 단백질 간의 통신을 유도할 수 있는 합성 '화학적 변환기'를 개발하기 위한 지침을 제시합니다. 또한 성장 인자(growth factor)가 해독 효소를 활성화하고 결과적으로 항암 전구약물의 절단을 조절할 수 있도록 하는 특정 '변환기'를 합성하고 테스트하기 위한 자세한 프로토콜이 제시되어 있습니다.

Signal transduction pathways, which control the response of cells to various environmental signals, are mediated by the function of signaling proteins ...

본 실험의 전반적인 목적은 합성 화학적 트랜스듀서에 의해 유도된 두 단백질 간의 비천연적 통신을 분광학적으로 추적하는 것입니다. 이는 자연계에 존재하지 않는 신호 전달 경로를 수행할 수 있는 신호 전달 단백질의 합성 유사체를 개발할 수 있는 가능성을 입증할 것입니다. 일반적인 분광광도계를 통해 비천연적 단백질 간 통신을 추적하는 능력은 인공 화학적 트랜스듀서의 기능을 개발 및 개선하는 데 도움이 되며, 인공 신호 전달 치료법 달성에 더 가까워지게 할 것입니다.화학적 트랜스듀서는 혈소판 유래 성장 인자(PDGF) 압타머, 2가 에타크리닉 아마이드 GST 억제제, 형광체 및 소광제로 구성됩니다. 화학적 트랜스듀서의 합성은 이 영상에서 다루지 않습니다.상세 내용은 텍스트 프로토콜에 설명되어 있습니다. 화학적 트랜스듀서의 작동 원리가 여기에서 설명됩니다. 두 개의 EA 그룹이 효소의 활성 부위에 결합하면 화학적 트랜스듀서가 GST의 효소 활성을 억제합니다.PDGF를 첨가하면 PDGF 화학 변환기 복합체가 형성됩니다. 이는 변환기-GST 상호작용을 방해하여 GST의 효소 활성을 복구합니다. 이어서 변형되지 않은 PDGF 앱타머를 첨가하면 화학 변환기가 방출되어 효소를 다시 억제할 수 있게 됩니다.PDGF에 의한 GST 활성 조절을 조사하는 실험을 시작하기 전에, 플레이트 리더에서 키네틱 측정을 위한 실험 절차를 설정하십시오. 표준 프로토콜로 새 실험을 생성합니다. Procedure를 선택하여 Procedure Settings 창을 엽니다.창 상단의 팝업 목록에서 플레이트 제조사에 맞는 384 Plate Type을 선택하십시오. 왼쪽 메뉴에서 Read를 선택합니다. Detection Method로 Absorbance를 선택하십시오.판독 유형의 종점(Endpoint)을 설정합니다. 파장(Wavelength) 창에 340 nanometers를 입력하십시오. 전체 플레이트(Full Plate)를 선택하고, 측정할 웰을 지정하십시오.그런 다음 OK를 클릭하여 Read 창을 닫습니다. 왼쪽 메뉴에서 Start Kinetic을 선택합니다. Run Time을 10분으로 설정합니다.Minimum Intervals 옵션을 선택하십시오. 그런 다음 OK를 클릭하여 Kinetic 창을 닫으십시오. Read Line을 Kinetic Measurement로 드래그하십시오.Validate 버튼을 선택한 후 OK 버튼을 선택합니다. 실험 내용을 저

mimicking-function-signaling-proteins-toward-artificial-signal

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

아데 닐릴 시클 라제 시그널링의 억제 감작있는 G 단백질 결합 수용체 결과의 지속적인 활성화. 필수 분자 경로를 식별하기 위해 nonbiased 접근이 필요하지만,이 전략은 확장 셀 기반 캠프 민감성 분석의 개발이 필요합니다. 여기서, 우리는 작은 분자 및 siRNA의 검사에 대한 민감성 분석을 설명합니다.

아데 닐 레이트 사이 클라 제의 약물에 의한 과민성 : 작은 분자와 siRNA의 심사 응용 프로그램에 대한 분석 최적화 기술과 소형화

여기에 설명된 방법은 anti-apoptotic bacterial effector 단백질의 활성을 해부하기 위해 정의된 단계에서 apoptotic signaling cascade를 유도하는 데 사용됩니다. 이 방법은 또한 pro-apoptotic 또는 독성 단백질의 유도성 발현 또는 다른 신호 경로와의 간섭을 해부하는 데 사용할 수 있습니다.

유도 발현 시스템을 적용하면 세포 내 신호와 세균 독성 요인의 간섭을 연구하기 위해

이 프로토콜은 세포 분화 및 Xenopus 배아 발달 동안 mitogen - 활성화 단백질 키니 아제 (MAPK) 활동을 조절하는 optogenetic 전략을 설명합니다. 이 방법은 포유류 세포 배양 및 높은 공간적 및 시간적 해상도를 갖는 Xenopus 태아와 같은 다세포 생균에서 MAPK 신호 전달 경로의 가역적 활성화를 허용한다.

세포 분화 동안 미토 겐 활성 단백질 키나아제 경로의 광 매개 가역적 변조<em&gt; Xenopus</em&gt; 배아 발달

여기, 우리는 다양 한 세포 모델에서 신호 경로 변경을 식별 하기 위해 항 체 배열에 대 한 프로토콜을 제시. 마약/산소/초 violet 빛/방사선, 또는 overexpression/downregulation/녹아웃, 한 이러한 변경 사항을 다양 한 질병 모델에 대 한 중요 하 고 치료 효과가 있을 것입니다 또는 약물의 메커니즘을 확인할 수 있습니다. 여부를 나타낼 수 있습니다. 저항입니다.

항 체 배열에 의해 신호 변환 통로의 심문에 의해 Tyrosine Kinase 억제제에 평가

여기서 설명된 것은 생물학적으로 상승적인 miRNAs및 그들의 조립체를 짧은 트랜스게네인으로 특성화하기 위한 프로토콜이며, 이는 유전자 치료 애플리케이션을 위한 동시 과발현을 허용한다.

교모세포종에서 기능적으로 연관된 miRNAs의 특성화 및 유전자 치료를 위한 인공 클러스터로의 엔지니어링

신호 전달 경로의 광유전학적 조작은 발달, 재생, 항상성 및 질병에서 신호전달이 어떻게 해독되는지 조사하는 강력한 전략이 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 초기 제브라피시 배아에서 광-산소-전압 감지 도메인 기반 결절 및 뼈 형태 형성 단백질(BMP) 신호 활성제를 사용하기 위한 실용적인 지침을 제공합니다.

제브라피시 배아의 광유전학적 신호전달 활성화

Guanosine triphosphate (GTP) 결합은 G-Protein-Coupled Receptor (GPCR) 활성화에서 가장 초기의 사건 중 하나이다. 이 프로토콜은 방사성 표지 된 GTP 유사체 [ 35 S] 구아노 신 -5'-O- (3- 티오) 트리 포스페이트 ([ 35 S] GTPγS)의 결합을 모니터링함으로써 특정 GPCR- 리간드 상호 작용을 약리학 적으로 특성화하는 방법을 설명합니다. 관심있는 리간드에 대한 반응.

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인간 승모판의 단백질 조성은 여전히 ​​부분적으로 알려지지 않았는데, 그 이유는 세포질이 낮아 단백질 생합성이 낮기 때문에 분석이 복잡하기 때문입니다. 이 연구는 승모판 프로테옴의 분석을 위해 단백질을 효율적으로 추출하기위한 프로토콜을 제공합니다.

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이 방법은 엑스레이 결정학 및 소 각 x 선 산란 (SAXS), 복제, 표현, 및 구조 결심을 위한 재조합 Nsa1의 정화를 설명 하 고 다른 단백질의 하이브리드 구조 분석에 대 한 적용 둘 다를 포함 하는 주문 하 고 도메인을 난잡.

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단일 셀 기반 3 차원 (3D) 어셈블리를 인공 비 계 없이 건설에 대 한 새로운 방법을 설명 합니다.

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학습하세요 합성 화학 전달체를 이용한 단백질 간 인위적 신호 전달 메커니즘과 GST 효소 활성 조절 방법을. 이 연구는 인공 신호 전달 요법 개발에 중요한 통찰을 제공합니다.

신호 전달 단백질의 기능을 흉내 낸 : 인공 신호 전달 요법을 향해

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