신호 전달 단백질의 기능을 흉내 낸 : 인공 신호 전달 요법을 향해

이 실험의 전반적인 목표는 합성 화학 변환기에 의해 유도된 두 단백질 사이의 부자연스러운 통신을 분광법으로 추적하는 것입니다. 이 연구는 자연에서 발견되지 않는 신호 전달 경로를 수행할 수 있는 신호 전달 단백질의 합성 유사체를 개발할 수 있는 가능성을 입증할 것입니다. 일반적인 분광 광도계를 통해 부자연스러운 단백질과 단백질의 통신을 추적할 수 있는 능력은 인공 화학 변환기의 기능을 개발 및 개선하고 인공 신호 전달 요법을 달성하는 데 더 가까이 다가갈 수 있도록 도와줄 수 있습니다.

화학적 변환기는 혈소판 유래 성장 인자 또는 PDGF 압타머로 구성됩니다. 2가 에타크린성 아미드 GST 억제제, 형광단 및 담금질제. 화학 변환기의 합성은 이 비디오에서 시연되지 않습니다.

그러나 텍스트 프로토콜에 설명되어 있습니다. 화학 변환기의 작동 원리가 여기에 설명되어 있습니다. 화학적 트랜스듀서는 두 EA 그룹이 효소 활성 부위에 결합할 때 GST의 효소 활성을 억제합니다.

PDGF의 첨가는 PDGF 화학 변환기 복합체의 형성으로 이어집니다. 이는 트랜스듀서-GST 상호작용을 방해하여 GST 효소 활성을 복원합니다. 변형되지 않은 PDGF 압타머를 다음에 첨가하면 화학적 변환기가 방출되고 효소를 다시 억제할 수 있습니다.

PDGF에 의한 GST 활성 제어를 검사하기 위한 실험을 시작하기 전에 역학 측정을 위해 플레이트 리더에서 실험 절차를 설정합니다. 표준 프로토콜로 새 실험을 만듭니다. 절차를 선택하여 절차 설정 창을 엽니다.

창 상단의 팝업 목록에서 플레이트 제조업체에 따라 384 플레이트 유형을 선택합니다. 왼쪽 메뉴에서 읽기를 선택합니다. 검출 방법으로 흡광도를 선택합니다.

읽기 유형에 대한 endpoint. [Wavelength] 창에 340나노미터를 입력합니다. Full Plate를 선택하고 측정할 웰을 선택합니다.

그런 다음 확인을 클릭하여 읽기 창을 닫습니다. 왼쪽 메뉴에서 Start Kinetic(Kinetic 시작)을 선택합니다. 실행 시간을 10분으로 설정합니다.

최소 간격 옵션을 선택합니다. 그런 다음 확인을 클릭하여 Kinetic 창을 닫습니다. Read Line을 Kinetic Measurement로 드래그합니다.

유효성 검사 단추를 선택한 다음 확인 단추를 선택합니다. 실험을 저장합니다. 재생 단추를 선택합니다.

대화 상자가 나타나지만 운동 측정을 시작할 준비가 될 때까지 확인 버튼을 선택하지 마십시오. 플레이트 리더가 설정되면 다음 단계는 화학 트랜스듀서와 PDGF가 있는 상태에서 GST 활성을 측정하기 위한 샘플을 준비하는 것입니다. PDGF의 4가지 농도를 3회씩 테스트하려면 각각 3.25마이크로리터의 화학 변환기와 3.25마이크로리터의 GST M-1이 포함된 4개의 샘플을 준비하십시오.

각 샘플에 각각 0, 1.2, 2.4 또는 4.9 마이크로리터의 PDGF를 추가합니다. 그런 다음 각 샘플에 적절한 부피의 분석 버퍼를 추가하여 총 부피를 130마이크로리터로 만듭니다. 샘플을 실온에서 10분 동안 배양합니다.

10분 후 각 시료 40마이크로리터를 384 투명 웰 플레이트의 웰로 옮깁니다. 4개의 샘플 각각을 같은 행의 홀수 또는 짝수 웰로만 옮깁니다. 기질 추가를 위해 다중 피펫터를 사용할 수 있습니다.

다음으로, 12채널 멀티 피펫터를 사용하여 96웰 플레이트에서 이전에 준비된 각 기질 10마이크로리터를 각 샘플에 빠르게 추가합니다. 거품이 생기지 않도록 빠르지만 부드럽게 섞습니다. 즉시 플레이트를 플레이트 리더에 삽입하고 대화 상자에서 OK 버튼을 선택하여 운동 측정을 시작합니다.

화학 물질 변환기에 의해 매개되는 GST 활성화 억제 주기를 검사하려면 각각 84.5마이크로리터의 분석 완충액을 포함하는 5개의 샘플을 준비합니다. 3.25마이크로리터의 화학 변환기 및 3.25마이크로리터의 GST M1-1. 실온에서 3분 동안 배양합니다.

샘플 1에 3.65마이크로리터의 분석 버퍼를 추가하고 샘플 2, 3, 4 및 5에 3.65마이크로리터의 PDGF를 추가합니다. 실온에서 3분 동안 배양합니다. 샘플 1 및 2에 3.12마이크로리터의 분석 버퍼를 추가하고 샘플 3, 4 및 5에 3.12마이크로리터의 PDGF 압타머를 추가합니다.

실온에서 3분 동안 배양합니다. 24.4마이크로리터의 분석 버퍼를 샘플 1, 2 및 3에 추가합니다. 그리고 24.4 마이크로 리터의 PDGF를 샘플 4와 5에 추출합니다.

실온에서 3분 동안 배양합니다. 샘플 1에서 4에 7.8마이크로리터의 분석 버퍼를 추가하고 샘플 5에 7.8마이크로리터의 PDGF 압타머를 추가합니다. 실온에서 5분 동안 배양합니다.

샘플을 384 투명 웰 플레이트로 옮깁니다. 실험을 세 번 수행하고 샘플에 기질을 빠르게 추가합니다. 플레이트를 리더기에 삽입하고 운동 측정을 시작합니다.

이 분석을 시작하려면 프로토콜 텍스트에 설명된 대로 역학 측정을 위해 플레이트 리더에서 실험 절차를 설정하십시오. 384 투명 웰 플레이트의 두 웰에 두 개의 샘플을 준비합니다. 각 웰에 대해 1마이크로리터의 GST M1-1과 1마이크로리터의 화학 트랜스듀서를 38마이크로리터의 분석 버퍼에 혼합합니다.

두 우물 사이에 빈 우물을 남겨 두십시오. 12채널 멀티 파이펫을 사용하여 각 웰에 10마이크로리터의 기판을 빠르게 추가합니다. 그리고 거품이 생기지 않도록 부드럽고 빠르게 섞습니다.

즉시 플레이트를 리더에 삽입하고 운동 측정을 시작하십시오. 3.5분 후 플레이트 리더가 열리면 웰 중 하나에 1.125마이크로리터의 PDGF를 빠르게 추가하고 부드럽게 혼합한 다음 나머지 운동 측정을 위해 플레이트가 리더에 다시 들어갈 수 있도록 합니다. 이 실험을 위해 샘플을 준비하기 전에 프로토콜 텍스트에 설명된 대로 역학 측정을 위해 플레이트 리더에서 실험 절차를 설정합니다.

아질산염/질산염 비색 키트는 산화질소 생산을 측정하는 데 사용됩니다. 96웰 플레이트에서 웰당 50마이크로리터의 분석 버퍼를 첫 번째 줄에 분배합니다. 70 마이크로 리터의 Griess One 시약은 두 번째 줄에 잘 들어갑니다.

그리고 3 번째 줄에 70 마이크로 리터의 Griess Two 시약이 있습니다. 각각 4.8마이크로리터의 화학물질 변환기를 포함하는 4개의 샘플을 준비합니다. 하나를 샘플링하려면 155.2마이크로리터의 분석 버퍼를 추가합니다.

두 개의 샘플에 3.2마이크로리터의 GST M1-1과 152마이크로리터의 분석 버퍼를 추가합니다. 3개의 샘플에 9.6마이크로리터의 PDGF와 145.6마이크로리터의 분석 버퍼를 추가합니다. 그리고 4개의 샘플에 3.2마이크로리터의 GST M1-1, 9.6마이크로리터의 PDGF 및 142.4마이크로리터의 분석 버퍼를 추가합니다.

샘플을 실온에서 10분 동안 배양합니다. 384개의 투명 웰 플레이트에 웰당 50마이크로리터의 샘플을 분배하여 실험을 3회 수행합니다. 기질 추가를 위해 다중 피펫터를 사용할 수 있도록 동일한 라인의 홀수 또는 짝수 웰에만 샘플을 분주합니다.

각 샘플에 0.54마이크로리터의 JS-K 전구약물을 추가합니다. 각 샘플에 10마이크로리터의 글루타치온 용액을 빠르게 넣고 거품이 생기지 않도록 부드럽고 빠르게 혼합합니다. 플레이트를 리더기에 삽입하고 운동 측정을 시작합니다.

kinetic 측정 직후, 각 시료 50마이크로리터를 분석 완충액이 있는 96웰 플레이트의 첫 번째 행의 각 웰로 옮깁니다. 그런 다음 플레이트의 두 번째 행의 각 웰에서 플레이트의 첫 번째 행의 웰로 50 마이크로 리터를 옮깁니다. 및 플레이트의 세 번째 열로부터 플레이트의 첫 번째 열의 웰로 웰 당 50 마이크로 리터.

실온에서 10분 동안 빛으로부터 보호하면서 배양하십시오. 550나노미터에서 흡광도를 측정하기 전에. 화학 물질 변환기없이 화학 물질 변환기를 사용하여 GST 활성을 측정하면 화학 물질 변환기가 GST 활성을 억제하는 것으로 나타났습니다.

GST는 GST-화학 변환기 복합체에 PDGF의 농도 증가를 추가하여 재활성화됩니다. PDGF의 순차적 첨가 및 GST-화학적 트랜스듀서 복합체에 변형되지 않은 PDGF 압타머는 PDGF와 GST 사이의 통신이 가역적임을 밝혔습니다. GST-트랜스듀서 복합체에 PDGF를 첨가하면 기판을 첨가한 후 3.5분 후에 GST 활성이 급격히 증가했습니다.

GST, PDGF 및 화학 변환기의 혼합물에 PDGF 압타머를 첨가하면 GST 활성이 감소했습니다. 이러한 결과는 시스템이 환경 변화에 실시간으로 반응한다는 것을 나타냅니다. 그 후, GST에 의해 활성화되어 독성 산화질소를 방출하는 항암 전구약물인 JS-K를 사용하여 전구약물 활성화를 제어하는 이 시스템의 능력을 조사했습니다.

화학 변환기에 JS-K를 첨가하고 GST와 PDGF의 다양한 조합으로 방출되는 산화질소 양을 측정한 결과, GST와 PDGF의 존재만이 JS-K를 활성화한다는 것을 확인했습니다. 이 모든 것은 합성 제제가 어떻게 성장 인자로 하여금 천연 효소 파트너가 아닌 글루타티온 S-트랜스퍼라제의 촉매 활성을 유발할 수 있는지를 보여줍니다. 따라서 이러한 부류의 미래 생체 모방체는 환경 신호에 대한 세포의 반응을 변경하거나 새로운 특성을 제공하는 데 사용될 수 있습니다.