Name: 작은 RNA 정량 비는 코딩을위한 고밀도 지방 단백질의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: 학습하세요 고밀도 지단백질(HDL)에서 소량 RNA를 정량화하는 방법을 통해 심장대사 질환의 바이오마커를 발굴하고 질병 진단 및 치료 전략 개발에 활용하는 기술을 탐색하세요.

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이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health), 국립 심장, 폐 및 혈액 연구소(National Heart, Lung and Blood Institute)에서 K.C.V. HL128996, HL113039 및 HL116263에 수여하는 상을 받았습니다. 이 연구는 또한 미국심장협회(American Heart Association)로부터 K.C.V. CSA2066001, D.L.M POST26630003, R.M.A. POST25710170에 수여하는 상을 수상했습니다.

1. HDL 정제 (~ 5.5 일) <ol><li> 밀도 구배 초 원심 분리 (DGUC, ~ 5 일) <ol><li> 신선한 정맥 혈액에서 분리 된 혈장 9 mL의 100 배 산화 방지제의 90 μL를 추가합니다. </li><li> 단계 1.1.1 (0.0278 g / mL의 KBr을 플라즈마)에서 플라즈마의 9 용액에 0.251 g을 KBr을 추가하여 1.025 g / mL의 1.006 g / ㎖에서 KBr을 가진 플라즈마 밀도를 조정합니다. 모든 소금은 실온에서 용해 및 튜브를 초 원심 분리기 및 모든 거품이 위로 상승하기 위해 전송 될 때까지 플라즈마를 바위. </li><li> 벤드 끝에서 90 ° 1cm로 18 G 바늘의 끝은, 베벨면이 위쪽을 향. 주사기와 18 게이지 바늘을 사용하여, 조심스럽게 플라즈마 (표 1)을 통해 오버레이 솔루션 # 1의 3 mL를 넣습니다. 참고 : 구부러진 바늘이 모든 VLDL / IDL, LDL을 보장하고, HDL 오버레이와 혼합하지 않고 제거됩니다. </li><li> 튜브 및 carefu의 메 니스 커스 위로부터 3mm 공간 -이 떠나는 상단 기포의 대부분을 제거에서야 베드로 SW-40Ti 양동이에 튜브를 배치합니다. </li><li> 균형에 (뚜껑 포함) 각 버킷의 무게를, 정확히 반대 버킷 (버킷 + 모자)와 균형 : # 5, # 3 # 6 # 4, # 2 # 1. 참고 :이 버킷 균형과 항상 일치해야합니다. </li><li> (자료 목록) 초 원심 분리기의 회 전자를 놓습니다. A # 4 중간 브레이크와 4 ° C에서 24 시간 동안 274,400 XG에 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 양동이에서 회 전자에서 양동이와 튜브를 제거합니다. </li><li> 조심스럽게 주사기와 구부러진 바늘을 사용하여 오버레이의 상단 층에서 2 mL를 제거합니다. 이 4 저장 될 수 VLDL / IDL 분획 것 ° C 또는 -80 기음. </li><li> VLDL / IDL의 부분을 제거한 후, 샘플 (플라즈마)의 나머지 7 mL로 수집하고 15 ML 원뿔 튜브에 배치합니다. 오버레이 용액 # 2 (표 1) 9 mL의 샘플 볼륨을 준비한다. </li><li> 1.080 g을 1.025 g / ㎖에서 샘플의 농도를 조정 / KBr을 가진 mL를 사용하여9 mL의 시료 또는 0.0828 g 약 0.746 g을 KBr / 샘플 용액을 KBr. 모든 KBr을 (약 20 분)에 용해시키고 보장 기포가 위로 상승하면서 튜브를 초 원심 분리기에 전송 될 때까지 조심스럽게 샘플을 바위. </li><li> 주사기와 바늘로 조심스럽게 샘플 (표 1)을 통해 오버레이 솔루션 # 3의 3 mL를 넣습니다. 튜브의 상단에 메 니스 커스 (meniscus)에서 3mm 공간 - 2 둡니다. </li><li> 튜브의 상단에 남아있는 거품의 대부분을 제거하고 조심스럽게 SW-40Ti 양동이에 가득 초원 심 분리기 튜브를 배치합니다. </li><li> 균형에 (뚜껑 포함) 각 버킷을 달아 정확히 1.1.5에서와 같이, 반대 버킷 + 모자와 균형. </li><li> 초 원심 분리기의 회 전자를 배치 (재료의 목록 참조). A # 4 중간 브레이크와 4 ° C에서 24 시간 동안 274,400 XG에 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 양동이에서 회 전자에서 양동이와 튜브를 제거합니다. </li><li> 조심스럽게 주사기를 사용하여 오버레이의 상층 (2)로부터 용액을 제거 할NT를 바늘. 이 4 저장 될 수있는 LDL 분획 것 ° C 또는 -80 기음. </li><li> LDL 분획을 제거한 후, 샘플 (플라즈마)의 나머지 대략 7 mL로 수집하고 새로운 15 ML 원뿔 튜브에 배치합니다. 1.080 g / ㎖ 용액 # 4 (표 1)를 9 mL의 최대 샘플 (혈장)의 용적을 가지고. </li><li> 1.30 g에 1.080 g / ㎖에서 샘플의 농도를 조정 / KBr을 샘플의 각 mL를 위해 KBr을을 9 mL의 시료 (플라즈마)에 3.33 g을 KBr을 사용하거나 0.37 g과 용액. 바위 또는 약간의 모든 KBr을 (염)이 용해 될 때까지 샘플을 선동하고 튜브를 초 원심 분리기에 전송합니다. </li><li> 주사기와 바늘로 조심스럽게 샘플 (표 1)을 통해 오버레이 솔루션 # 5의 3 mL를 넣습니다. </li><li> 튜브의 상단에 메 니스 커스 (meniscus)에서 2 3mm 공간을 떠나, 튜브의 상단에 남아있는 거품의 대부분을 제거하고 조심스럽게 SW-40Ti 양동이에 가득 초원 심 분리기 튜브를 배치합니다. </li><li> (각 버킷 무게상기 균형에 모자), 정확히으로 1.1.5에서와 같이, 반대 버킷 + 모자와 균형. </li><li> 초 원심 분리기의 회 전자를 배치 (재료의 목록 참조). A # 4 브레이크와 4 ° C에서 48 시간 동안 274,400 XG에 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 양동이에서 회 전자에서 양동이와 튜브를 제거합니다. </li><li> 조심스럽게 주사기와 구부러진 바늘을 사용하여 오버레이의 상위 계층에서 약 2 mL로 제거합니다. 이것은 4 ℃ 또는 -80 ℃에서 저장 될 수있는 HDL 분획이다. 참고 : DGUC HDL 다음은 높은 염 용액을 제거하기 위해 투석 할 수있다. </li><li> 밀폐 된 투석 슬리브 (10,000 MW 컷오프)에 수집 된 HDL의 비율을 배치하고 1 L 1X PBS에서 하룻밤 투석, 투석합니다. 변경 투석 버퍼 (1X PBS) 24 시간 이상 3 회. 자기 교반 바와 PBS의 부드러운 교란은 투석이 향상됩니다. </li><li> BCA 방법을 사용하여 8-HDL DGUC의 단백질 농도를 결정한다. </li></ol></li><li> 고속 단백질 액체 색도그래피 (FPLC) 또는 크기 배제 크로마토 그래피 (~ 6 시간) <ol><li> 0.22 μm의 마이크로 원심 필터를 통해 500 μL에 DGUC-HDL (총 단백질)의 1.2 mg의 필터 주입 직전에, (재료의 목록 참조). 주 : 0.22 μm의 필터 이전에 0.45 ㎛의 마이크로 필터를 통해 원심 DGUC-HDL 샘플의 추가 필터링 일부 샘플에 요구 될 수있다. </li><li> 필터링 된 DGUC-HDL 샘플을 수집 FPLC (채우기) 주입 주사기를로드하고 주사기에 기포가 FPLC에 주입하기 전에이 없는지 확인. </li><li> 2.6 MPa의 압력에 제한이 0.3 mL / 분으로 FPLC 유량을 설정한다. 주입 전에 샘플 버퍼 0.2 컬럼 부피 (약 15 mL)로 열 평형. FPLC (주입 루프) 악기에 버퍼의 3 mL의 시료를 주입하고 실행을 시작합니다. 72 분획 총 1.5ml의 분획을 수집한다. </li></ol></li></ol> 2. 높은 처리량 작은 RNA시퀀싱 (sRNAseq ~ 구일) <ol><li> RNA 분리 (~ 1 일) <ol><li> 제조자의 지시에 따라서 비색 키트를 사용하여 총 콜레스테롤 수준을 결정함으로써 DGUC-HDL FPLC에 대응하는 분획을 확인한다. DGUC-HDL을 함유하는 분획 7 FPLC -이 FPLC 셋업을 사용하여, 6 찾으려. </li><li> DGUC-HDL FPLC 분획의 모든 볼륨 (약 8 -1 0 mL를 풀 1.45 ML의 부분의 볼륨)를 수집하고 사용하여 집중 10 kDa의 분자량 컷 - 오프 원심 필터 유닛 1 시간 동안 4,000 XG에 4 ° C에서 또는 HDL 농축까지 약 100 μL입니다. </li><li> HDL을 모아서 농축하고 BCA 방법을 사용하여 8 HDL 총 단백질 농도를 정량화. </li><li> 세트의 각 샘플에서 분주 할 수 있습니다 최대 1 mg의 HDL 총 단백질의 높은 농도를 결정합니다. 예를 들어, 각 샘플의 전체 단백질 HDL 동일한 양으로부터 RNA를 분리. </li><li> 사용 RNA 분리를 수행수정 된 프로토콜 (자료 목록 참조). <ol><li> 1 분 동안 페놀 용해 시약 (재료의 목록 참조) 시료와 소용돌이의 10 배 볼륨을 추가합니다. </li><li> 실온에서 5 분간 인큐베이션. </li><li> 클로로포름 (단계 2.1.5.1에서 사용되는 페놀 용해 시약 용적의 20 %)를 첨가하고, 15 초 동안 격렬하게 진탕. </li><li> 3 분 - 2 실온에서 품어. </li><li> 냉장 원심 분리기에서 4 ° C에서 12,000 XG에 15 분 동안 원심 분리기. </li><li> 상간 피하는 새로운 튜브 상부 수성 상을 전송. </li><li> 1 분 동안 수성 상 및 와류에 100 % 에탄올 1.5 부피를 추가한다. </li><li> 적어도 1 시간 또는 하룻밤 -80 ° C에서 보관 샘플. </li><li> 제공된 미니 열을 사용하여 RNA 분리 프로토콜을 계속합니다. </li><li> 30 μL의 RNase없는 H 2 O로 용출 처음 2 분 동안 저속 (2,000 XG)에서 프릿, 스핀에 직접 15 μL H 2 O의 추가다음 1 분 동안 고속 (최대)에 스핀. H 2 O의 추가 15 μL로이 단계를 반복합니다 </li></ol></li><li> 즉시 -80 ° C에서 스르나 라이브러리 생성 또는 저장소에 진행합니다. </li></ol></li><li> 라이브러리 생성 (~ 6의 시간) <ol><li> 아래에 설명 된대로 PCR 증폭 한 수정으로 제조업체의 지침에 따라 같이 스르나 라이브러리 생성 키트 프로토콜을 사용하여 스르나의 cDNA 라이브러리를 준비합니다. <ol><li> 0.5 μL DNase의 /의 RNase없는 H 2 O를 포함하는 얼음에 PCR의 mastermix을 준비, 15 μL PCR 믹스 (PML) 1 μL RNA PCR 프라이머 (RP1) 샘플 당 (오류를 피펫 팅을위한 추가 10 % 포함). </li><li> PCR을 16.5 μL 각 (cDNA를) 시료에 혼합 추가합니다. </li><li> 다중 각 시료에 인덱스 / 바코드 번호를 할당하고 샘플 (해당 번호에) 1 μL PCR 프라이머 색인을 추가합니다. </li><li> 의 microfuge를 사용하여 빠른 스핀을 수행합니다. 참고 : 전체 볼륨해야지금 샘플 당 30 μL합니다. </li><li> 표 2 및 3에 설명 된 바와 같이 PCR 증폭 용 사이클링 조건을 수행한다. </li></ol></li></ol></li><li> 크기 스르나 도서관 어댑터 제거 선택 : 어댑터 (~ 1.5 시간) <ol><li> 대상 : 다음 크기 매개 변수와 제조업체의 지침에 따라 자동 DNA 크기 선택기를 사용하여 라이브러리 크기 선택을 수행하는 156 bp의 시작 : 135 bp의, 끝 : 177 bp의, 범위 신고 : 브로드. </li></ol></li><li> DNA 정리 (~ 0.5 시간) <ol><li> 정리 크기 선택 제조업체의 지침에 따라 스르나의 cDNA. </li><li> 깨끗한 용출 및 2 × 7 μL DNase의 /의 RNase없는 H 2 O와 스르나의 cDNA 집중 </li></ol></li><li> 정량화 및 평가 스르나의 cDNA 라이브러리 수율 및 품질 (~ 1의 시간) <ol><li> manufact의 당 (자재 목록)을 bioanalyzer에 고감도 DNA 칩을 이용 스르나의 cDNA 라이브러리의 품질과 크기를 평가의 urer의 지시. </li><li> 제조자의 지시에 따라, 고감도 DNA 분석 (자재 목록)를 사용하여 개별 스르나 cDNA 라이브러리 농도를 정량화. 주 : 플로우 셀 가능하면 같은 차선에서 실행되는 다른 지수와의 모든 샘플을 가지고하는 것이 좋습니다. 하나 이상의 레인이 필요한 경우, 적절한 경우 및 제어 샘플을 혼합한다. </li></ol></li><li> 높은 처리량 스르나 시퀀싱 (~ 7 일) <ol><li> 풀 개인은 몰 농도에 따라 스르나 라이브러리를 색인. </li><li> 2.5.2 - 화면 bioanalyzer에 고감도 DNA 칩을 이용하여 2.5.1 에서처럼 라이브러리 DNA 농도를 측정 품질 스르나 라이브러리를 풀링. </li><li> 제조업체의 지침 (자료 목록)에 따라 시퀀싱 라이브러리 qPCR에 정량 키트를 사용하여 적절한 순서 깊이를 보장하기 위해 어댑터 콘텐츠 정량 PCR (qPCR에)을 수행합니다. </li><li> 하나의 읽기를 사용하여 순서를 수행, 50 (B)25 M은 제조업체의 지침에 따라, / 샘플을 읽고 - P 프로토콜은 약 20의 깊이에 도달합니다. </li></ol></li></ol> 3. 데이터 분석 (~ 1 일) <ol><li> 역 다중화 된 시료의 전처리 원시 fastq 파일 (자료 목록)에, 사용 설명서의 지시에 따라, bcl2fastq2를 사용합니다. </li><li> 어댑터 9 트림 및 제거 Cutadapt를 사용하여 &lt;읽고 사용자 설명서 지침 (자료 목록)에 따라 길이 16 뉴클레오티드 (국세청). </li><li> 사용자 설명서 지침 (자료 목록)에 따라, NGSPERL 프레임 워크 removeSequenceInFastq 기능을 사용하여 어댑터 이월 (CTACAGTCCGACGATC) : 스톱 솔루션 시퀀스를 포함하는 스르나 라이브러리에 존재하는 오염 시퀀스 (CCACGTTCCCGTGG STP)를 제거합니다. </li><li> 사용자 설명서 지침 (자료 목록)에 따라, FastQC이 양적 과학 센터 (CQS) 도구를 사용하여 품질 관리 측정을 수행합니다. </li><li> &quot;동일&quot;의 비 중복 목록을 생성 (축소 redunda를 읽고NT를 읽기) 기록 사본 번호는 사용 설명서의 지시 재료 (목록)에 따라, CQSTools를 사용하여. </li><li> 사용자 설명서 지침 (자료 목록)에 따라, (-a -m 100 --best --strata -v 1 옵션) 정렬은 Bowtie1.1.2 1 불일치를 허용하여 인간 게놈에 읽습니다. </li><li> 정렬, 계산을 읽을 수행하고 사용자 설명서의 지시에 따라, NGSPERL를 사용하여 요약 작업을 초래한다. </li><li> 스프레드 시트 파일로 내보낼 수 테이블을 변환합니다. </li><li> 당 매핑의 miRNA (RPMM)를 읽으로 그 클래스 (예,의 miRNAs의 총 수 읽기) 및 보고서 신호 판독의 표준화가 총에 특정 클래스 (예를 들어,의 miRNAs)의 읽습니다. (예를 들면, RPMM = (은 miR-X는 / miRNA의 총 # *이 1,000,000) 읽습니다). </li><li> 낮은 수준과 높은 수준의 차동 소프트웨어로 일반 단일 컬러 기술로 입력 정상화 카운트 테이블은 사용자 설명서 지침 (자료 목록)에 따라 분석한다. 참고 : 현재, 아니 잘 특성화 하우스 키핑 유전자가 / SRNHDL-스르나에 관해서. 스파이크의 제어가 사용될 수 있지만, 문제가 될 수있다. 총 단백질 입력 또는 볼륨을 HDL하는 정규화하는 것이 좋습니다. 가장 중요한 것은 실시간 PCR 또는 정량 PCR을 사용하여의 miRNAs와 sRNAs을 정량화하기 위해 다양한 전략 중 하나에 의해 시퀀싱 결과를 확인하는 것이 좋습니다. </li></ol>

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이 프로토콜은 고순도의 HDL에 높은 처리량 시퀀싱 또는 실시간 PCR에 의해 miRNA가 다른 sRNAs을 정량화하기 위해 설계되었습니다. 어떠한 접근 방식으로, 특별한 고려가 정화 HDL 및 RNA의 처리의 각 단계에 부여하고 sRNAs 정량화한다. 이 프로토콜은 플라즈마의 ≥ 2 mL로 시작하는 프로젝트를 위해 설계되었습니다. 그러나 고품질의 RNA 분석을 성공적으로 친 화성 크로마토 그래피를 이용하여 인간 또는 마우스 혈장 적은 80 μL로부터 정제 HDL 완료 될 수있다 그러나, 큰 시동 플라즈마 볼륨은 여기에 제시된 방법을 이용하여 더 나은 데이터를 생성한다. 샘플 처리 및 추출 방법은 크게 miRNA의 / 스르나의 품질과 수율을 변경할 수 있습니다. 항응고제의 사용은 플라즈마 컬렉션에 필수적인 반면, 하류 추출 가능성에 영향을 미친다. 예를 들어, 헤파린 용이 RNA 추출 14,15 동안 제거되지 않으며, PCR 16-18 이용 하류 효소를 억제 할 수있다. 또한, 제감수 시...

세포 외 비 코딩 작은 RNA를 (sRNAs)는 질병 바이오 마커 및 잠재적 인 치료 대상의 새로운 클래스를 나타낼 가능성 세포 간 통신 (1)를 용이하게한다. 스르나의 가장 널리 연구 유형은 대략 길이가 22 국세청하며 더 이상 전구체 형태 및 기본 증명서 2에서 처리되는 마이크로 RNA (miRNA의)입니다. 전사적의 miRNAs는 단백질 - 전기 변환 및 mRNA의 분해 (2)의 유도의 억제를 통해 유전자 발현을 조절하는 것으로 입증되었다. 그럼에도 불구하고,의 miRNAs는 sRNAs 많은 종류의 하나입니다; sRNAs가 부모의 tRNA (tRNA의 유래 sRNAs, TDR), 작은 핵 RNA를 (스르나 유래 sRNAs, sndRNA), 작은 핵소체의 RNA (snoRNA 파생 sRNAs, snRNA), 리보솜 RNA를에서 절단 될 수있는 (sRNAs, RDR을 rRNA의 유래 ) RNA를 Y (yDR) 및 기타 다른 RNA를 1. 이 소설 sRNAs의 몇 가지 예는 miRNA가 유사한 기능을하는 것으로보고되었다; 그러나, 생물학적 쿵푸유전자 조절의 역할 3-6 가능성이 있지만 이러한 sRNAs의 많은 nctions가 결정되어야 남아있다. 가장 흥미로운의 miRNAs 및 기타 sRNAs는 타액, 혈장, 소변, 담즙를 포함하는 세포 외 체액에서 안정적으로 존재한다. 세포 외 sRNAs 가능성이 세포 외 소포 (EV), 지질 단백질, 및 / 또는 세포 외 리보 핵산 단백질 복합체와의 연결을 통해 RNases로부터 보호됩니다. 이전에, 우리는 지질 단백질, 즉 고밀도 지단백질 (HDL), 플라즈마 7 전송의 miRNAs을보고했다. 본 연구에서는 HDL은 순차적 밀도 구배 초 원심 분리 방법 (DGUC), 고속 단백질 액체 크로마토 그래피 (크기 배제 크로마토 그래피 겔 여과, FPLC), 및 친 화성 크로마토 그래피 (안티 - 아포 지단백 AI (apoA-I) 면역를 사용하여 분리 하였다 ) 7. 실시간 PCR 기반 저밀도 어레이 개별 miRNA의 분석 모두 사용하여 miRNA의 레벨은 HDL을 정량 치료에서 분리 된네와 콜레스테롤 혈증 환자 7. 이 방법을 사용하여, 우리는의 miRNAs 프로필 및 고순도 HDL 준비의 특정의 miRNAs를 정량화 할 수 있었다. 2011 년부터, 우리는 친 화성 크로마토 그래피는 HDL의 순도를 향상 있지만, 항체 포화 크게 수율을 제한하고 엄청난 비용이 될 수 있다고 판단했다. 현재, 우리의 프로토콜은 다운 스트림 RNA 분리 및 스르나의 정량화를위한 ​​고품질의 HDL 샘플을 생산 FPLC, 다음 DGUC의 2 단계 연속 탠덤 방법을 권장합니다. 때문에 높은 처리량 예를 들어 sRNAs (sRNAseq),의 miRNAs의 순서 및 기타 비 miRNA의 스르나 클래스의 증가에 대한 인식의 최근 진보, sRNAseq는 현재 최첨단의 miRNA 및 스르나 프로파일입니다. 따라서, 우리의 프로토콜은 정량화의 miRNAs와 sRNAseq를 사용하여 HDL 샘플의 다른 sRNAs을 권장합니다. 그럼에도 불구하고, HDL로부터 분리 된 총 RNA는 또한 개별의 miRNAs 다른 sRNAs 정량화 또는 실시간 PCR A를 사용 sRNAseq 결과를 검증하기 위해 사용될 수있다pproaches. 여기에 우리가 수집, 정제, 정량, 데이터 분석 및 고순도 HDL-sRNAs의 검증을 위해 상세 프로토콜을 설명합니다. 이 논문의 전반적인 목표는 인간 혈장에서 분리 된 고순도의 HDL에 스르나 정량의 타당성과 과정을 설명하는 것입니다.

<table><tbody><tr><td>초원심분리기&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>A99839</td><td>Optima XPN-80</td></tr><tr><td>초원심분리기 로터</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td>SW-41Ti</td></tr><tr><td>AKTA 순수 FPLC 시스템</td><td>GE 헬스케어</td><td>29018224</td><td></td></tr><tr><td>3x FPLC Superdex 200 컬럼 증가 인라인</td><td>GE 헬스케어</td><td>28990944</td><td>10/300 gl</td></tr><tr><td>SynergyMx</td><td>BioTek Instruments</td><td>7191000</td><td></td></tr><tr><td>테이블탑 원심분리기</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004525</td><td>Sorvall ST40R</td></tr><tr><td>냉장 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>22629867</td><td>5417R (USA Scientific을 통해 구매)</td></tr><tr><td>마이크로퓨지&nbsp;</td><td>USA Scientific</td><td>2631-0006</td><td></td></tr><tr><td>PippenPrep</td><td>세이지 사이언스</td><td>PIP0001</td><td></td></tr><tr><td>2100 바이오분석기&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>G2938B</td><td></td></tr><tr><td>고감도 DNA Assay</td><td>, Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Sequencing Library qPCR 정량 분석 키트</td><td>, Illumina</td><td>SY-930-1010</td><td></td></tr><tr><td>ProFlex Thermal Cycler</td>, <td>Applied Biosystems</td><td>4484073</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 12k Flex</td><td>Applied Biosystems</td><td>4471134</td><td></td></tr><tr><td>EpMotion Robot</td><td>Eppendorf</td><td>960000111</td><td>5070</td></tr><tr><td>초투명 원심분리기 튜브</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Bromide</td><td>Fisher Chemicals</td><td>P205-500</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원뿔형 튜브</td><td>Thermo Scientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 필터 0.45 &micro; m</td><td>Millipore</td><td>UFC30HV00</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심 필터 0.22 &micro; m</td><td>Millipore</td><td>UFC30GV00</td><td></td></tr><tr><td>miRNAEasy 총 RNA 분리 키트</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>총 콜레스테롤 발색 키트</td><td>Cliniqa (Raichem)</td><td>R80035</td><td></td></tr><tr><td>10,000 m.w. 컷오프 원심분리 필터</td><td>Amicon</td><td>UFC801024</td><td>Millipore</td></tr><tr><td>PCR 스트립 튜브</td>를 통해 구매 <td>Axygen</td><td>PCR-0208-C</td><td>Fisher를 통해 구매</td></tr><tr><td>microRNA RT 키트</td><td>Life Technologies</td><td>4366597</td><td>1000회 반응</td></tr><tr><td>PCR 마스터 믹스</td><td>Life Technologies</td><td>4440041</td><td>50 mL 병</td></tr><tr><td>Pierce BCA 키트</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>클린 및 농축기 키트</td><td>Zymo</td><td>D4014</td><td></td></tr><tr><td>투석 튜빙</td><td>Spectrum Labs</td><td>132118</td><td>Fisher를 통해 구매</td></tr><tr><td>bcl2fastq2</td><td>Illumina</td><td>n/a</td><td>Software</td></tr><tr><td>Cutadapt</td><td>https://github.com/marcelm/cutadapt</td><td>n/a</td><td>Software</td></tr><tr><td>NGSPERL</td><td>github.com/shengqh/ngsperl</td><td>n/a</td><td>Software</td></tr><tr><td>CQSTools</td><td>github.com/shengqh/CQS.Tools</td><td>n/a</td><td>Software</td></tr><tr><td>Bowtie 1.1.2&nbsp;</td><td>http://bowtie-bio.sourceforge.net</td><td>해당 사항 없음</td><td>소프트웨어</td></tr><tr><td>GeneSpringGX13.1.1</td><td>애질런트</td><td>해당</td><td>사항</td></tr></tbody></table> 없음 소프트웨어

작은 rna 정량 비는 코딩을위한 고밀도 지방 단백질의 분리

Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification

작은 비 코딩 RNA를의 다양성 (스르나)는 급속하게 확장되고 유전자 조절을 포함한 생물학적 과정에서 자신의 역할이 부상하고있다. 가장 흥미로운 sRNAs은 세포의 외부 발견하고 안정적으로 모든 생물학적 체액에 존재한다. 따라서, 세포 외 sRNAs 질병 바이오 마커의 새로운 클래스를 나타낼 가능성 세포 신호 및 세포 간 통신 네트워크에 참여하고 있습니다. 바이오 마커로서의 가능성을 평가하기 위해, sRNAs 플라즈마, 소변 및 기타 유체에 정량화 할 수있다. 그럼에도 불구하고, 충분히 내분비 신호로서 세포 sRNAs의 영향을 이해하기 위해서는, 캐리어 수송성 및 세포 및 조직은 세포 외 스르나 풀 기여 생물학적 유체 (예, 플라즈마)에 이들을 보호하고, 세포 수있는 조직 된 결정하는 것이 중요 수용성의 세포 외 스르나를 이용. 이러한 목표를 달성하기 위해, 세포 외 캐리어 고순도의 집단을 분리하는 것이 중요스르나의 프로파일 링 및 정량. 우리는 이전에 지질 단백질, 특히 고밀도 지단백질 (HDL)을, 셀 및 HDL-의 miRNAs 사이의 기능적인 마이크로 RNA (miRNA의) 크게 질병에 변경되는 수송 있음을 증명하고있다. 여기서는 상세히 밀도 구배 초 원심 분리 (DGUC)과 고속 단백질 액체 크로마토 그래피 (FPLC)를 탠덤 HDL 분리를 이용하는 새로운 프로토콜 높은 모두 사용 하류 프로파일과의 miRNAs 포함한 모든 sRNAs의 정량 고순도 HDL을 얻었다 -throughput 시퀀싱 및 실시간 PCR 접근법. 이 프로토콜은 HDL에 sRNAs의 조사를 위해 귀중한 자원이 될 것입니다.

이 프로토콜은 높은 처리량 시퀀싱 또는 실시간 PCR (도 1)에 의해 고순도 HDL에 sRNAs의 정량화를 허용하도록 서로 연결 설정 방법의 연속이다. 가능성이 프로토콜의 영향을 설명하기 위해, HDL은 탠덤 DGUC 및 FPLC 방법으로 인간 혈장에서 정제 하였다. HDL로 (콜레스테롤 분포) 대응 수집 FPLC 분획을 농축하고, 총 RNA는 HDL (총 단백질) 1 mg 내지 분리 하였다. 스르나 라이브러리는 N = 4 건강한 사람을 대상으로 수집 HDL 생성되었다. 모든 인간의 혈액 / 혈장 샘플을 활성 임상 시험 심사위원회 프로토콜 (# 070416)에 따라 수집, 의학의 밴더빌트 대학이 승인 한 사람을 대상으로는 동의에 등록되었다. 준비 스르나 라이브러리는 고급 유전체학 (VANTAGE) DNA 시퀀싱 센터와 데이터 분석을 수행 하였다에 대한 밴더빌트 기술에 순서가되었다내부 파이프 라인을 사용. 데이터 시각화는 소프트웨어를 그래...

이 프로토콜은 고밀도 지단백질 small RNA의 분리 및 정량화를 설명합니다.

작은 RNA 정량 비는 코딩을위한 고밀도 지방 단백질의 분리

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most ...

본 프로토콜의 전반적인 목표는 정제된 지질단백질 상의 소형 비코딩 RNA(small non-coding RNAs)를 정량화하는 것입니다. 이 프로토콜은 건강 상태 및 질병 상태에서의 지질단백질 소형 RNA 시그니처를 정의하고, 지질단백질 소형 RNA를 질병 바이오마커 또는 세포 간 메시지로 활용하는 방안을 발전시키는 등 지질단백질 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 질병 또는 실험 조건에서 소형 RNA의 변화를 확인하기 위해 고순도의 지질단백질을 분석할 수 있다는 점입니다.이 기술의 함의는 심혈관 대사 질환의 치료로까지 확장됩니다. 이는 세포 외 RNA가 새로운 질병 바이오마커 클래스이며, 지질단백질 소형 RNA가 향후 연구에서 약물 표적으로서 흥미로운 잠재력을 가지고 있기 때문입니다. 본 방법은 HDL 소형 RNA를 위해 설계되었으나, 초저밀도 및 저밀도 지질단백질 소형 RNA에 맞게 조정하여 적용할 수도 있습니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 개인은 적절한 장비의 부족과 밀도 구배 초원심분리용 시료 준비에 관한 전문 지식의 부족으로 인해 어려움을 겪을 수 있습니다.본 프로토콜은 고처리량 시퀀싱 또는 실시간 PCR을 사용하여 고순도 HDL상의 소형 RNA를 정량하기 위해 연결된 기성 방법들로 구성되어 있습니다. 이 영상에서는 HDL의 정제 과정을 다룹니다. 본 프로토콜은 보조 연구원인 Evan Shadari가 시연할 예정입니다.시작하려면, 9 mL의 혈장(plasma)에 100x 항산화제 90 µL를 추가합니다. 그런 다음, 혈장 9 mL당 0.251 g의 브롬화칼륨(potassium bromide)을 추가하여 혈장의 밀도를 1.025 g/mL로 조정합니다. 모든 염이 용해될 때까지 혈장을 상온에서 흔들어 섞어줍니다.그런 다음, 혈장을 초원심분리 튜브로 옮기고 상단에 기포층이 형성되었는지 확인하십시오. 혈장 아래에 갇힌 공기가 없어야 합니다. 다음으로, 18 gauge 바늘 끝에서 1cm 지점에 90도 굴곡을 주고, 베벨(beveled) 면이 위를 향하도록 준비하십시오.그런 다음, 주사기와 구부러진 바늘을 사용하여 3 mL의 오버레이 용액 1번을 플라즈마 위에 조심스럽게 분주합니다. 표면의 기포 대부분을 제거하고, 메니스커스와 튜브 가장자리 사이에 2~3 mm의 간격을 둡니다. 그런 다음, 튜브를 SW 40 Ti 버킷에 조심스럽게 넣습니다.캡을 닫은 상태에서

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

본 논문은 격리, 정화 및 exosomes의 감지,뿐만 아니라 분자의 콘텐츠 분석 기술에 대한 방법을 보여줍니다. 이러한 방법은 세포 배양 매체와 생물 학적 체액 모두에서 exosome 고립에 대한 적응력, 그리고 분자 내용의 분석을 넘어도 기능성 연구에 유용할 수 있습니다.

RNA 함유 Exosomes의 분리 및 특성

RIP 칩을 통해 RNA 관련 단지를 분리하고 식별 단계 프로토콜로 단계.

RIP 칩을 사용하여 세포 추출물에서 mRNAs, microRNAs 및 Ribonucleoprotein 단지의 단백질 구성 요소의 분리 및 확인에 방법

이 프로토콜은 인간 혈청에서 작은 RNA를 추출하는 방법을 설명합니다. 우리는 DNA 배열에 사용하기 위해 암 혈청에서 마이크로 RNA를 분리하고 또한 singleplex 정량 PCR이 방법​​을 사용했습니다. 프로토콜은 고품질의 RNA를 수득 수정하여 페놀 및 아니 디늄 티오 시아 네이트 시약을 이용한다.

인간 혈청에서 작은 비 암호화 RNA를의 분리

MicroRNA(miRNA)는 널리 보존된 조절 분자 부류입니다. 여기에서는 두 가지 강력한 ligation 단계와 high-throughput sequencing에 의존하는 miRNA 클로닝 방법에 대해 설명합니다. 당사의 방법은 miRNA의 정확한 게놈 전체 정량을 가능하게 합니다.

높은 처리량 시퀀싱에 의한 마이크로 RNA 정량을위한 작은 RNA 분자의 고효율 내고

특정 조직에서 세포의 서브 세트의 유전자 발현 분석가 중대한 과제이다. 이 문서에서는 레이저 캡처 미세 절제와 빠른 immunolabeling 방법을 결합하여 특정 세포 집단에서 고품질의 총 RNA를 분리하는 방법에 대해 설명합니다.

셀 특정 부분 집단에서 RNA 분리 빠른 Immunolabeling과 결합 레이저 캡처 이외에 Microdissection을 사용하여

마이크로 RNA는 중요한 조절 역할을하고 다양한 인간 질병에 대한 새로운 치료 대상으로 떠오르고있다. miRNAs의 고밀도 지단백질에 수행되는 것을 도시하고있다. 우리는 빠른 속도로 인간 혈장에서 miRNA의 분석에 적합한 정제 HDL을 분리하는 간단한 방법을 개발했다.

고도로 정제 된 고밀도 지단백질에서의 miRNA의 높은 넣어 관통 분리에 대한 신속하고 단순화 된 방법

후 성적인 요소는 유전자 발현을 조절 하 고 B 세포 기능을 조절 하는 유전자 프로그램으로 작용할 수 있습니다. 결합 하 여 체 외에서 B 세포 자극, qRT-PCR, 및 높은 처리량 예측에 관한 시퀀스 및 mRNA 순서 접근, 우리 B 세포에서 miRNA 및 유전자 표현의 epigenetic 변조를 분석할 수 있습니다.

MicroRNAs 받 클래스 스위치 DNA 재조합 및 플라즈마 세포 차별화에 B 세포 유도에서 mRNAs의 게놈 넓은 분석의 HDAC 억제제 중재 변조

지질 방울은 C 형 간염 바이러스 (HCV) 등 여러 가지 병원균의 복제에 중요한 소기관이다. 우리는 관련 단백질의 양적 질량 분석에 대한 지질 방울을 분리하는 방법을 설명; 그것은 바이러스 감염, 환경 스트레스, 또는 약물 치료와 같은 조건의 다양한에서 사용할 수 있습니다.

양적 질량 분광법 분석을위한 지질 물방울 절연

여기서, 정량적 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 기반 프로토콜은 지 단백질 입자의 천연 마이크로 RNA 함량 (절대/상대)의 결정을 위해 제시 된다. 또한, 마이크로 RNA 레벨을 증가 시키는 방법 뿐만 아니라, 지 단백질 입자의 세포 흡수 율을 결정 하는 방법이 입증 되어 있다.

마이크로 로르 나를 사용한 네이티브 단백 입자의 농축과 그에 따른 절대/상대 미세 유 변 함량 및 셀룰러 전송 속도의 후속 측정

이 프로토콜은 유세포 분석을 위한 여러 막 결합 마커의 염색을 통해 지방 세포에서 고품질 RNA를 얻는 방법론과 SVF-대식세포의 표현형을 포함하여 단일 공정에서 인간 내장 지방에서 생존 가능한 지방 세포 및 기질 혈관 분획-SVF 세포를 분리하기 위한 효율적인 콜라겐분해효소 분해 방법을 제공합니다.

RNA 분석 및 대식세포 표현형에 적합한 인간 내장 지방 조직에서 생존 가능한 지방 세포 및 기질 혈관 분획 분리

학습하세요 고밀도 지단백질(HDL)에서 소량 RNA를 정량화하는 방법을 통해 심장대사 질환의 바이오마커를 발굴하고 질병 진단 및 치료 전략 개발에 활용하는 기술을 탐색하세요.

작은 RNA 정량 비는 코딩을위한 고밀도 지방 단백질의 분리

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