작은 RNA 정량 비는 코딩을위한 고밀도 지방 단백질의 분리

이 프로토콜의 전반적인 목표는 정제된 지단백질에서 작은 non-coding RNA를 정량화하는 것입니다. 이 프로토콜은 건강 및 질병에서 지단백질 small RNA signature를 정의하고 지단백질 small RNA를 질병 바이오마커 또는 세포 간 메시지로 발전시키는 것과 같은 지단백질 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 질병 또는 실험 조건에서 작은 RNA 변화에 대해 고순도 지단백질을 분석할 수 있다는 것입니다.

세포외 RNA는 새로운 종류의 질병 바이오마커이고 지단백질 small RNA는 향후 연구에서 약물 표적으로 흥미로운 잠재력을 가지고 있기 때문에 이 기술의 의미는 심장 대사 질환 치료로 확장됩니다. 이 방법은 HDL small RNA를 위해 설계되었지만 매우 낮은 밀도 및 저밀도 지단백질 small RNA에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 밀도 구배 초원심분리를 위한 시료 준비에 적절한 장비와 전문 지식이 부족하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다.

이 프로토콜은 고처리량 염기서열분석 또는 real time PCR을 사용하여 고순도 HDL에서 작은 RNA의 정량화를 위해 함께 연결된 확립된 방법으로 구성됩니다. 이 비디오는 HDL의 정제를 다룹니다. 이 프로토콜은 제 조수인 Evan Shadari가 시연할 예정입니다.

먼저 90마이크로리터의 100x 항산화제를 9ml의 혈장에 첨가합니다. 그런 다음 플라즈마 9ml당 0.251g의 브롬화칼륨을 추가하여 혈장 밀도를 밀리리터당 1.025g으로 조정합니다. 소금이 모두 녹을 때까지 실온에서 플라즈마를 흔듭니다.

그런 다음 플라즈마를 울트라 원심분리기 튜브로 옮기고 상단에 기포 층이 있는지 확인합니다. 플라즈마 아래에 공기가 갇히지 않아야 합니다. 다음으로, 비스듬한 면이 위를 향하도록 끝에서 90cm 굽힘을 추가하여 18 게이지 바늘을 준비합니다.

그런 다음 주사기와 구부러진 바늘을 사용하여 3ml의 오버레이 용액 1번을 플라즈마에 조심스럽게 놓습니다. 표면의 거품 대부분을 제거하고 반월판과 튜브 가장자리 사이에 2-3mm를 남겨 둡니다. 그런 다음 튜브를 SW 40 Ti 버킷에 조심스럽게 넣습니다.

캡으로 각 버킷의 무게를 측정하고 원심분리기에서 반대쪽 위치를 차지할 버킷의 균형을 정확히 맞춥니다. 다음으로, 로터를 울트라 원심분리기에 넣고 섭씨 4도에서 24시간 동안 274, 400회 G로 실행하고 브레이크는 중간 값으로 4로 설정합니다. 다음 날, 로터에서 버킷을 조심스럽게 제거하고 버킷에서 튜브를 들어 올립니다.

그런 다음 주사기와 구부러진 바늘을 사용하여 오버레이의 최상층에서 2밀리리터를 천천히 제거합니다. 이것은 VLDL IDL 분수입니다. 그런 다음 나머지 7ml의 혈장을 모아 15ml 원뿔형 튜브로 옮깁니다.

플라즈마의 부피를 최대 9 밀리리터까지 끌어 올려 오버레이 용액 2 번을 추가하십시오. 그런 다음 0.746g의 브롬화칼륨을 첨가하여 밀도를 밀리리터당 1.080g으로 조정합니다. 다음으로, 샘플을 부드럽게 흔들어 소금을 녹이면 약 20분이 걸립니다.

그런 다음 공기를 가두지 않고 샘플을 울트라 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 상단에 거품 층이 만들어졌는지 확인하십시오. 구부러진 바늘을 사용하여 3 밀리리터의 오버레이 용액 3 번을 조심스럽게 오버레이합니다.

그런 다음 대부분의 기포를 제거하고 튜브를 SW 40 Ti 버킷에 조심스럽게 로드합니다. 균형을 잡고 앞에서 설명한 대로 24시간 동안 회전시킵니다. 다음 날, 구부러진 바늘을 사용하여 오버레이의 최상층에서 2밀리리터를 조심스럽게 제거합니다.

이것이 LDL 분수입니다. 그런 다음 남은 샘플을 새로운 15ml 원뿔형 튜브로 옮기고 용액 번호 4로 부피를 최대 9ml까지 가져옵니다. 이제 약 3.33g의 브롬화칼륨을 첨가하고 소금이 녹을 때까지 샘플을 흔들어 밀도를 밀리리터당 1.30g으로 조정합니다.

그런 다음 샘플을 울트라 원심분리기 튜브로 옮기고 5번 용액을 3ml씩 조심스럽게 주입합니다. 이제 이전과 같이 샘플을 초원심분리하되 48시간 동안 사용합니다. 이틀 후, 주사기와 구부러진 바늘을 사용하여 오버레이의 위쪽 2밀리리터를 수집합니다.

이것이 HDL 분율을 구성합니다. 높은 소금 해결책을 제거하려면, HDL 분획을 10, 000 분자량 컷오프를 가진 습식 투석 슬리브로 옮기십시오. 그런 다음 섭씨 4도에서 부드럽게 저으면서 1 XPBS 1 리터로 24 시간 동안 투석합니다.

24시간 동안 PBS 용액을 세 번 교체합니다. 나중에 BCA 방법을 사용하여 HDL 분획의 단백질 농도를 측정합니다. 세포외 소포체 또는 엑소좀은 작은 HDL과 유사한 밀도를 가지므로 HDL과 동일한 밀도 분율로 존재할 수 있습니다.

따라서 HDL 분획은 FPLC에 의한 추가 정제가 필요합니다. FPLC를 사용하기 직전에 0.22미크론 원심 필터를 통해 500마이크로리터의 용액에 1.2mg의 DGUC HDL 분획을 실행합니다. 여과된 샘플을 FDLC 주입 주사기에 수집하여 기포가 갇히지 않도록 합니다.

다음으로, FPLC 유속을 분당 0.3밀리리터로 설정하고 압력 제한을 2.6메가파스칼로 설정합니다. 그런 다음 열을 0.2 열 부피의 buffer로 평형을 이룹니다. 이제 3ml의 버퍼가 있는 샘플을 FPLC 기기에 주입하고 실행을 시작합니다.

1.5ml 분획을 모아 총 72개 분획을 만듭니다. 제조업체의 지침에 따라 비색 키트를 사용하여 총 콜레스테롤 수치를 측정하여 DGUC HDL에 해당하는 FPLC 분획을 식별합니다. DGUC HDL을 포함하는 6-7개의 FPLC 분획을 찾을 수 있습니다.

모든 HDL 함유 분획을 풀링하고 10 킬로달톤 컷오프 원심 필터를 사용하여 섭씨 4도에서 한 시간 동안 또는 HDL 농축액이 약 100 마이크로 리터가 될 때까지 농축합니다. 그런 다음 HDL 농축액을 수집하고 BCA 방법을 사용하여 단백질을 정량화합니다. 나중에 동일한 양의 HDL 총 단백질을 사용하여 RNA를 분리합니다.

인간 플라즈마는 밀도-구배 분리를 사용하지 않고 FPLC에 의해 분별되었습니다. 6개의 분획은 HDL에 해당하고 6개는 매우 낮은 밀도의 지단백질에 해당했습니다. 검은색의 지질, 빨간색의 콜레스테롤, 파란색의 단백질은 모두 비색 키트로 측정되었습니다.

이에 비해 FPLC 이전에 밀도 구배 초원심분리를 사용하면 HDL 분획에서 거의 독점적으로 지질 단백질과 콜레스테롤을 찾을 수 있었습니다. 4명의 건강한 혈장 공여자로부터 채취한 HDL에서 총 RNA를 분리하고 단일 판독 50 염기쌍 프로토콜을 사용하여 염기서열분석을 수행했습니다. normalized reads의 분포는 21 및 34 nucleotides 주변의 작은 RNA의 농축을 보여줍니다.

도서관 분석에 따르면 판독값의 38%는 마이크로 RNA였고 37%는 TRNA에서 파생된 것으로 나타났습니다. 기타 RNA, 리보솜 RNA, 작은 RNA, 작은 nucleolar RNA 및 긴 non-coding RNA도 존재했습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 10일 이내에 수행할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 PCR 또는 노던 블로팅(northern blotting)과 같은 다른 방법으로 고처리량 염기서열분석에서 관찰된 HDL small RNA 변화를 검증하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 RNA 분리 단계 및 염기서열분석 준비 단계 중에 HDL 콜레스테롤 e-flux 수용 용량 및 HDL 항염증성 SA와 같은 다른 방법을 수행하여 HDL small RNA 변화와 HDL 기능 간의 상관관계를 결정하는 것과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 지질 및 지단백질 분야의 연구자들이 비콜레스테롤 화물, 특히 핵산 및 대사 질환(예: 고콜레스테롤혈증 또는 당뇨병)을 연구할 수 있는 길을 열었습니다.

그리고 인간 혈장을 다루는 작업은 매우 위험할 수 있으므로 혈액 매개 병원체에 대한 적절한 교육을 받아야 하며 이 기술을 수행할 때 적절한 개인 보호 장비를 착용해야 한다는 것을 잊지 마십시오.