Name: 생물 시료의 대사 프로파일 링에 대한 쉬스 모세관 전기 영동 - 질량 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: 배우세요 생물 시료의 대사 프로파일링을 위한 쉬스리스 모세관 전기영동-질량분석법을. 고감도로 양이온 및 음이온 대사물질을 분석하여 대사체학 연구에 활용할 수 있습니다.

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Rawi Ramautar 박사는 네덜란드 과학 연구 기구(NWO Veni 722.013.008)의 Veni 보조금 제도의 재정적 지원에 감사를 표합니다.

참고 : 신진 대사 프로파일 링 연구를위한 쉬스 CE-MS의 사용을 여기에 설명 된 프로토콜은 연구용으로 만 사용됩니다. 아래에 설명 된 절차는 최근에 출판 된 작품의 4,5을 기준으로합니다. 또한 실험적인 세부 사항은이 논문에서 찾을 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하기 전에 모든 관련 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하십시오. 이 프로토콜에 설명 된 실험을 수행 할 때, 보호 안경, 실험실 코트와 장갑을 포함한 모든 적절한 실험실 안전 절차를 사용하십시오. 시약 솔루션 및 예제 1. 준비 <ol><li> 백그라운드 전해질의 제조 (BGE) <ol><li> 새로운 BGE 용액 (10 % (V / V) 아세트산의 pH 2.2)을 매일 준비한다. </li><li> 10 mL 유리 바이알에 9.0 mL의 물을 추가하고 흄 후드에서 물에 아세트산 1.0 mL로 추가한다. 충분히 와류를 사용하여 용액을 혼합한다. </li></ol></li><li> 대사 standar을 제조D 혼합물 <ol><li> 물 50 ㎕를 60 양이온 대사 물질을 함유하는 50 μM 양이온 표준 혼합물 50 μl를 잘 용해 용액을 혼합한다. -80 ° C에서 보관 사용하지 않을 때입니다. </li><li> 물 50 μL에 30 음이온 대사 물질을 함유하는 50 μM 음이온 표준 혼합물 50 μl를 잘 용해 용액을 혼합한다. 사용하지 않을 때에는 -80 ° C에서, 동일한 표준 혼합물의 동결 / 해동 사이클을 방지하기 위해 분량 씩,이 용액을 저장한다. 참고 : -80 ° C에서 제대로 저장 될 때 표준 혼합물 3 개월 동안 안정되어 대사 산물. </li></ol></li><li> 아교 모세포종 세포주 추출물의 제조 <ol><li> 1 ㎖의 얼음처럼 차가운 0.9 % 식염수 (21)로 접착 인간 U-87 MG 아교 모세포종 세포를 세 번 세척 하였다. </li><li> 자기편 셀에 2 ml의 얼음처럼 차가운 메탄올 / 물 용액 (8/2, v / v)의 추가 및 고무 세포 스크레이퍼 (21)를 밀고 사용 쳤어요. </l난&gt; <li> 2 분 동안 메탄올 / 물 튜브 용액 및 초음파 처리를 수집합니다. </li><li> 16,100 XG, 4 ° C에서 10 분 동안 메탄올 / 물 분획 (최종 비율 8/8/2, V / v / v)로 원심 분리기에 샘플을 클로로포름을 추가합니다. </li><li> 메탄올 / 물 층을 수집하고 진공 농축기를 사용하여이 부분을 증발. 쉬스 CE-MS에 의해 분석을 위해 50 μl의 물에 건조 된 자료를 복원합니다. 때 사용 -80 ° C에서 샘플을 보관하지. </li></ol></li></ol> 2. 쉬스 CE-MS 시스템 설정 <ol><li> 다공성 팁 터와 베어 융합 실리카 카트리지의 설치 <ol><li> 은 CE 기기의 다공성 팁 터 (30 μm의 내경 X 90cm 총 길이)로 새로운 베어 융합 실리카 카트리지를 놓습니다. </li><li> 100 % 메탄올을 사용하여 CE 기기를 제어하는 ​​소프트웨어와 함께 15 분 동안 50 psi에서 앞으로 린스를 적용하고 시각적으로 액체가 capil로부터 유출되었는지 확인이 헹굼 단계에서 라히 콘센트. 시각적으로 액체가 모세관 도전성로부터 유출되는지 여부를 검사 할 BGE 용액을 사용하여 5 분 동안 50 psi에서 역방향의 헹굼을 수행한다. </li><li> 어떠한 액적 형성 모세관 출구에서 관찰되지 않은 경우에는 100 psi의 압력에서의 단계를 반복 2.1.2. 어떤 액체 방울 형성이 단계 동안 관찰되지 않은 경우 새로운 베어 융합 실리카 카트리지를 설치합니다. </li><li> 10 분 동안 50 psi에서 물에 10 분 동안 50 psi에서 0.1 M NaOH를 다음 10 분 동안 50 psi에서 물을 분리 모세관 헹구고 10 분 동안 마지막 BGE와 50 PSI. 주 : 2.1.4 2.1.1까지 단지 새로운 모세관 카트리지의 설치에 필요한 단계. </li></ol></li><li> ESI-MS에 모세관 다공질 팁 이미 터 결합 참고 : MS 기기 교정 및 CE 시스템에 연결되어 있는지 확인, MS에 CE 모세관을 연결하기 전에. 에 ESI 전압을 설정0의 nanospray 소스와 MS 장비를 장착한다. 가스 한 기체 (2)와 인터페이스 히터 온도는 5 psi에서 1500 V. 세트 커튼 설정 이온 분무 전압을인가하여 발생하는 매우 낮은 유속으로 ESI 적용되지 않았다. <ol><li> 물 관에서 융합 실리카 카트리지의 스프레이 팁을 제거하고 MS 기기에 연결하기위한의 nanospray 소스 어댑터에 설치합니다. 은 CE 기기에서 BGE 튜브의 높이가 스프레이 팁의 높이를 일치하는지 확인합니다. </li><li> 5 분 동안 50 psi에서 BGE와 린스에 의해 도전 모세관을 통해 액체의 흐름을 확인합니다. 이 세정 동안 ESI 분무기 바늘의 기지에서 드롭 형성이 관찰해야 단계. </li><li> 순방향으로 10 분 동안 50 psi에서 BGE와 분리 모세관 플러시. 드롭 형성은이 단계에서 다공성 팁 터 (스프레이 팁)의 끝에서 관찰해야한다. </li><li> (C)의 거리에서 MS 입구의 입구 다공성 팁 이미 터를 배치IRCA 2mm 3. </li><li> 1 분의 램프 시간을 이용하여 30 kV로의 전압을인가하고 65 0 먼저 ESI 전압을 이용하여 대사 프로파일 링 연구 1,000 m / z에 대한 m / z 범위에서 MS 데이터를 취득 시작한다. 참고 : 더 전기 분무가 없을 것 같이 질량 스펙트럼 신호의 무효합니다. </li><li> 데이터 측정을 계속하는 동안 1000 V에 ESI 전압을 설정합니다. 일정한 배경 신호까지 200 V의 증가와 함께 ESI 전압을 증가 적어도 15 분 동안 관찰된다. </li><li> 최대 가장 안정한 MS 신호 (총 이온 electropherogram)를 제공하는 위치를 참조하기 위해, X, Y 또는 Z 방향으로 이동하여 MS 입구의 중심에 대하여 다공질 팁 이미 터의 위치를 ​​최적화한다. </li><li> 다공질 팁 이미 터의 위치를 ​​최적화하고 최적 ESI 전압을 결정한 후 0 V로 ESI 전압을 설정하고, 5 분의 램프 시간을 사용하여 1 kV의 30 kV로에서 CE의 전압을 감소시킨다. </li><li> 석사 방법 날기 만들기g 최적 ESI 전압 및 대사 산물 표준 및 생체 시료의 분석을위한 CE 기기에 CE 방법. </li></ol></li></ol> 대사 표준 및 생물학적 샘플 3. 분석 <ol><li> 쉬스 CE-MS 시스템의 성능 평가 <ol><li> 전송할 CE 유리 병에 맞는 입구 샘플 트레이에이 병을 넣어 빈 100 μL의 microvial (PCR 유리 병)에 음이온 성 대사 산물 표준 혼합물의 20 μL. 참고 : 신뢰할 수있는 주사에 대한 microvial에 필요한 최소 부피는 2 μL이다. <ol><li> 단계 2.2.9 중 작성된 MS의 인수 음이온 모드 방법을 시작하고 이후 CE 기기를 제어하는 ​​소프트웨어를 사용하여 CE 시퀀스를 시작합니다. </li><li> 10 psi에서 1.0 BGE 주입 후 60 초에서 2.0 psi에서 주입 한 다음 3 분 동안 50 psi에서 BGE와 분리 모세관 린스 (NL 20 모세관 체적의 3 %에 해당) 및비서. 주 :이어서, MS의 데이터 획득이 트리거된다. </li><li> 입구에서 30 분 동안 0.5 PSI의 압력으로 1.0 분의 램프 시간과 -30 kV로의 전압을인가한다. 30 분 전기 영동 분리 후, MS 데이터 취득을 중지하고 (전기 영동 분리 다공질 팁 모세관 터의 내구성을 향상 후 CE 전압의 점진적인 감소)을 5 분의 램프 시간을 사용 -1 kV의 세륨 전압을 감소시킨다. </li></ol></li><li> 샘플 주사 사이에, 3 분 동안 30 psi에서 물과 모세관, 0.1 M 수산화 나트륨, 물 및 BGE 각각 헹군다. </li><li> 이주 회 분석 음이온 대사 혼합물의 신호 강도를 측정함으로써, 기록 된 데이터를 분석한다. </li><li> 음이온 성 대사 산물 표준은 10, 28 분 사이의 영역에 표시할지 여부를 평가합니다. </li><li> 세 개의 구조적으로 관련된 이성체, 즉, D- 글루코스 -1- 인산, D- 포도당 -6- 인산과 D- 과당 -6- 인산이 있는지 확인일부 분리, 즉 처음 두 피크 사이의 해상도는 0.75 경이고 마지막 두 피크들 (도 1 참조) 0.50 년경이다. 주 : 1.5의 해상도는 두 개의 인접한 피크의베이스 라인 분리를 나타냅니다. </li><li> 반복 3.1.1 및 양이온 성 대사 산물 혼합물 3.1.2 단계를 반복합니다. MS 검출 긍정적 인 이온 모드에 있으며 CE 전압이 30 kV로 있는지 확인합니다. </li><li> 이주 회 분석 양이온 대사 혼합물의 신호 강도를 측정함으로써, 기록 된 데이터를 분석한다. </li><li> 양이온 성 대사 산물 표준 8과 22 분 사이의 영역에 표시할지 여부를 평가합니다. 이소류신과 루신 (15) 사이에 15.5 분을 마이그레이션 여부를 확인하고 해상도가 0.5 년경 있는지 확인. </li></ol></li><li> 생물학적 샘플 분석 <ol><li> 반복 3.1.1과 아교 모세포종 세포주의 추출물의 음이온 성 대사 프로파일 3.1.2 단계를 반복합니다. 참고 : 대사 콘시료 전처리 후의 텐트 20 셀 / NL 년경의 셀 밀도에 대응하고, 따라서, 20 NL 주입 분석 당 400 세포에 상응한다. . </li><li> 5 MDA 질량 정확도를 사용하여 대사 젖산 (m / z 89.0243)에 대한 추출 이온 electropherogram를 생성하고 신호 강도가 10 만 카운트 이상 여부를 확인합니다. </li><li> 반복 3.1.1과 아교 모세포종 세포주의 추출물의 양이온 대사 프로파일 3.1.2 단계를 반복합니다. 참고 : 매우 풍부한 정보 전체 이온 electropherogram이 모드에서 20 NL 주사 관찰해야한다. </li><li> 분석하거나 사용하지 후, 15 분 동안 50 psi에서 물과 모세관 헹구고 바이알 함유 물과 같은 물을 함유하는 튜브의 다공질 부 (배출 부)에서 모세관의 입구 부분을 저장한다. </li></ol></li></ol>

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다공성 팁 이미 터를 사용하는 쉬스 CE-MS 방법은 높은 극성 및 대전 대사 분석을 위해 제공되었다. 이 방법의 독특한 특징은 음이온 성 또는 양이온 성 대사 산물에만 MS 검출 및 CE 전압의 극성을 전환함으로써 프로파일 될 수 있다는 것이다. 생물학적 시료에서 매우 극성 하전 대사 광범위한 구조적으로 유사한 대사에 중요한이며, (낮은) 나노 몰 범위의 검출 한계가 높은 분리 효율로 분석 될 수있다. 제시된 프로토콜은 생물학적 샘플의 대사 프로파일 링 방법의 유용성을 예시하기 위해 세포 추출물의 대사 프로파일 링 쉬스 CE-MS의 사용에 초점을 맞추었다. 여기에 설명 된 방법은 또한 적당한 시료 전처리 과정이 사용된다는 것을 고려할 인간 소변 5 생물학적 샘플, 다른 유형의 대사 프로파일을 위해 사용될 수있다. 쉬스 CE-MS 운전 방식D는 CE의 본질 저 유량 특성의 이용을 허용하는 다공성 이미 터 선단에 기초한다. 이러한 맥락에서 안정 ESI 신호 재현성 프로파일 대사 연구를위한 필수 조건이다. 따라서, 스프레이 팁이 제대로 MS 입구 앞에 위치되는 것이 중요하다. 이 셋업에서, 상기 ESI 프로세스는 BGE의 특성에 주로 의존하며, 따라서 BGE 최적화가 중요하다. 쉬스 구성 시스 - 액체 조성물의 모든 종류의 이온화 효율을 향상시키기 위해 첨가 될 수있는 시스 - 액체 CE-MS 시스템에 비해 적은 다재다능하다. 쉬스 ESI 분무기 바늘이 완전히 전도성 액체 (즉, BGE 용액)으로 가득해야합니다. 불안정한 ESI 신호는 부분적으로 또는 완전히 연결 모세관에서 발생할 수 있습니다. BGE와 높은 압력에서 세척하면이 문제를 해결할 수 있습니다. 그렇지 분리 모세관 교체 될 필요가있다. 전에 분석 성능 평가 안정한 ESI 배경 신호일일에서 다른 일치하는 첫 번째 생성해야합니다. 프로파일 대사 연구를위한 쉬스 CE-MS 법의 해석 성능 대사 표준 혼합물을 사용하여 매일 체크 할 필요가있다. 동일한 실험 조건 하에서, 일관된 이동 시간, 즉 3 % 미만의 편차 이내 일 (N = 10) 사이 일 (N = 5) 대사 산물 표준 혼합물 (12.5 μM)의 20 NL 주입하여 피크 높이 / 지역 (15 % 이하 변화) 및 (60,000과 400,000 사이의 범위) 판 번호를 얻을 수 있습니다. 검출 한계는 대부분의 대사 산물 표준에 대한 나노 몰 범위에 있어야합니다. 만 이러한 기준이 충족 될 때 생물학적 시료의 대사 프로파일 링을위한 준비 방법입니다. 상기 MS 악기 튜닝 할 필요가없는 경우에 재 교정 다공질 팁 모세관 터 변경 될 필요가있다. 분석 CE-MS 사이의 효과적인 세척 단계에뿐만 아니라, 높은 중요하다전위 잔효를 방지 할뿐만 아니라 분리 성능을 유지한다. 잠재적 이월는 샘플에 오염 때문에 새로운 BGE 튜브와 교체에 의해 해결 BGE 유리 병으로 인해 발생할 수 있습니다. 쉬스 CE-MS 법을 사용하지 않을 때, 분리 모세관을 분리하고 물에 모세관 모세관 수명을 연장하기 위해 물을 함유하는 튜브의 보호 슬리브로 침수 외부의 입구 측을 저장하는 것이 중요하다. 이 프로토콜에보고 된 절차에 따라 사용될 때 요약 제안 쉬스 CE-MS 방법은 생물학적 샘플의 대사 프로파일을위한 강력한 전위를 나타낸다. 이 단계에서, 실험실 간 비교 데이터가 확실히 대사 체학이 접근법의 (장기) 재현성 및 안정성을 평가하기 위해 쉬스 CE-MS 필요하다. 이 프로토콜은 그러한 연구를 촉진 할 수있다. 다양한 분석 과제는 여전히 고려 될 필요가있다. 최적의 반환 한에 대한필요치 않는 상기 CE 전류는 바람직하게는 5 이하 μA 모세관 다공질 팁 터에만 높은 처리량 검정법의 개발을 방해 할 수 91cm의 길이로 제공되며,이 단계에서 유지되어야한다. 또한, 낮은 pH 분리 버퍼는 구조적으로 관련된 당 포스페이트의 초기 분리를 달성하기위한 최적의하지 않을 음이온 대사 프로파일 링에 사용 하였다. 중요는 음이온 성 대사 산물 (부분적으로) 사용에 부정적인 분리 조건하에 충전되는 분석 할 수 있다는 것이다. 다음 단계는 현재이 임상 대사 프로파일 링 연구위한 쉬스 CE-MS 방법의 유용성을 평가하는 하나의 다공성 팁 모세관 에미는 최대 100 생물학적 시료의 분석에 사용될 수있다. 전반적으로, 쉬스 CE-MS 방식의 발전은의 생물학적 기능의 깊은 이해를 향해, 즉 대사 체학의 분야에서 새로운 방향을 엽니 다충분한 제한의 경우.

현대 대사 체학에서 상한 분석 분리 기술은 대표적인를 얻기 위해 대사 산물 클래스 다양한 분석에 사용되는 것은 생물체 하나의 생리적 상태의 아웃 읽었다. 대사 체학 연구의 궁극적 인 목적은 주어진 생물학적 / 임상 질문에 대한 답을 얻는 것이다. 현재, 인간의 대사 체 데이터베이스는 내인성 및 외인성 모두 화합물 (영양소, 미생물, 마약 및 기타 소스에서 후자의 발신)를 대표하는 40,000 개 이상의 대사 산물의 항목으로 구성되어 2. 물리 화학적 특성 및 이러한 대사 물질의 농도 범위에서 큰 다양성을 주어 다른 분리 메카니즘 여러 분석 기법은 주어진 생물학적 샘플에서 가능한 많은 대사 프로파일을 위해 함께 사용한다. 예를 들어,은 등 Psychogios. 대사 교수 다섯 분석 분리 기술의 조합을 사용4,000 개 이상의 화학적으로 다양한 대사 산물 3의 검출 결과 인간 혈청의 iling. 본 논문에서는 관심 생물학적 시료 4,5의 대사 프로파일 링을 위해 최근에 개발 된 CE-MS 전략에 지급됩니다. CE에서,보다 구체적으로, 모세관 영역 전기 영동 (CZE; 일반적 CE라고한다)는, 화합물은 따라서,이 분석 방법은 극성 및 대전 대사 분석에 매우 적합 그들의 전하로 크기의 비율에 기초하여 분리된다. CE 분리기구하여 생물학적 시료 6-8의 대사 조성물에 상보적인 뷰를 제공 크로마토 그래프 - 기반의 기술과 근본적으로 상이하다. 소와 동료들은 생물학적 시료 9, 10의 대사 산물의 글로벌 프로파일 링을위한 CE-MS의 유틸리티를 보여 처음이었다. 지금까지 대사 체학을위한 CE-MS의 가능성과 유용성이 널리 11-15을 입증하고있다.CE는 일반적으로 기술 (16, 17)을 인터페이싱 시스 액체를 통해 MS에 결합되고; 그러나, 시스 액에 의한 모세관 배출물의 희석으로, 검출 감도가 본질적으로 손상된다. 최근에는 고전 외피 - 액체 계면 5,18,19을 이용한 CE-MS에 비해 쉬스 인터페이스의 사용은 상당히 다양한 생물학적 시료에 존재하는 대사 물질의 검출 범위를 개선하는 것이 증명되었다. 약 300 분의 기능은 시스 - 액체 CE-MS (5)으로 관찰 한 반면, 예를 들어, 900 년경 분자 기능 쉬스 CE-MS에 의해 인간의 소변에서 검출되었다. 사용되는 쉬스 인터페이스는 나노 ESI-MS와 함께 CE의 본질적 저 유량 특성의 효과적인 사용을 허용, Moini (20)에 의해 발명 된 다공성 팁 터에 근거했다. 대사 체학 분야 쉬스 CE-MS의 사용을 촉진하기 위해,프로토콜은 아교 모세포종 세포주 추출물의 분석에 예시 된 바와 같이이 방법은 생물학적 시료에서 매우 극성 대사 산물의 해석에 사용하는 방법을 설명하기 제시된다. 양이온 대사 산물의 프로파일을위한 쉬스 CE-MS 방법도 이에 분석 시간을 줄이고의 글로벌 프로파일에 대한 단일 분석 플랫폼을 제공 동일 모세관 분리 조건을 이용하여 음이온 성 대사 산물의 프로파일을 위해 사용될 수 있음을 나타낸다 충전 대사. 프로토콜은 또한 MS 장비와 쉬스 다공질 팁 이미 터의 유효 정렬 전략을 설명한다.

<table><tbody>CESI를 MS OptiMS 융합 실리카 카트리지<tr><td>에 연결하는 데 필요한</td> <td>CESI 8000 기기</td><td>Sciex</td><td>A98089</td> OptiMS 어댑터</tr><tr><td>, 30&nbsp; &뮤; m ID x 90&nbsp; cm 총 길이</td><td>Sciex</td><td>B07367</td><td></td></tr><tr><td>OptiMS 어댑터 Sciex Nanospray III 소스</td><td>Sciex</td><td>B07363</td><td></td></tr><tr><td>CESI 바이알</td><td>Sciex</td><td>B11648</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 바이알</td><td>Sciex</td><td>144709</td><td></td></tr><tr><td>빙하 아세트산</td><td>시그마</td><td>A6283</td><td>흄 후드에서 사용</td></tr><tr><td>양이온 성 대사 산물 혼합물</td><td>인간 대사체 기술</td><td>H3304-3034</td><td></td></tr><tr><td>음이온 대사 산물 혼합물</td><td>인간 대사체 기술</td><td>H3304-1031</td><td></td></tr><tr><td>메탄올 (LC-MS 울트라 크로마솔프)</td> <td>시그마</td><td>14262</td><td>흄 후드</td></tr> 사용 <tr><td>수산화 나트륨 용액</td><td>시그마</td><td>72079</td><td>0.1 M</td></tr><tr><td>U-87 MG 교모세포종 세포주</td><td>시그마</td><td>89081402</td> 클로로포름 시그마 650498 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>독성; 흄 후드에 사용</td></tr></tbody></table>

생물 시료의 대사 프로파일 링에 대한 쉬스 모세관 전기 영동 - 질량 분석

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

대사 체학에서, 분석 기술의 다양한 복잡한 샘플 (내인성) 대사의 글로벌 프로파일에 사용된다. 본 논문에서는 프로토콜은 모세관 전기 영동 - 질량 분석 (CE-MS)에 의해 생물학적 시료에서 음이온과 양이온 성 대사 산물의 분석을 위해 제공됩니다. 화합물들은 전하로 크기의 비율에 기초하여 분리 될 때 CE는 극성이 높은 충전 및 대사 산물의 분석에 적합하다. 최근에 개발 된 쉬스 인터페이스 디자인, 즉, 다공질 팁 인터페이스 이온화 (ESI) MS 전기 분무를 위해 CE 결합에 사용된다. 이 인터페이스 방식은 극성 대사 클래스의 광범위한 나노 몰 검출 한계의 결과로, MS와 함께 CE의 본질적 저 유량 특성의 효과적인 사용을 할 수 있습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 분석을 위해 낮은 pH를 분리 조건에서 다공성 팁 이미 터와 베어 융합 실리카 모세관을 이용에 근거생물학적 시료에서 대사 클래스의 광범위한. 동일한 쉬스 CE-MS 방법 만 MS 검출을 스위칭하여 당 포스페이트, 뉴클레오티드 및 유기산을 포함한 아미노산 클레오 작은 펩티드 또는 음이온 대사를 포함한 양이온 성 대사 산물의 프로파일을 위해 사용될 수 있음을 입증한다 분리 전압 극성. 뇨, 뇌척수액 및 교 아세포종 세포주 추출물과 같은 다양한 생물학적 시료에서 매우 풍부한 정보 대사 프로파일은 CE-MS 분석의 1 시간이 프로토콜에 의해 얻을 수있다.

제안 쉬스 CE-MS 방법은 고효율 제공 할 수있다, 즉, 60,000에서 400,000 범위의 플레이트 번호 BGE로서 10 % 아세트산 (PH 2.2)를 사용하여 나노 몰 검출 한계의 음이온 및 양이온의 대사에 대한 정보. 극성이 높은 음이온 성 대사 분석에있어서의 분리 성능은 세 구조적으로 관련된 당 인산 이성질체 (도 1)에 대해 설명된다. 기준선 분리가 세 가지 분석 물질에 대해 획득되지 않았지만, 부분이 분리 분석이 동일한 정확한 질량을 가지고 MS에 의해 자신의 선택적 검출을 허용하기에 충분하다. 세포의 제한된 수의 대사 프로파일을위한 쉬스 CE-MS 법의 전위, 즉 20 NL 사출 400 셀에 대응하는 (셀 밀도는 20 셀 / NL 경 임) 추출물 양이온 대사 분석을 위해 설명된다 아교 모세포종 세포주 (300 개 이상의 분자 기능은 S / N-비율 ≥ 5 위에 검출 된 그림 2). <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54535/54535fig1.jpg" /> 음이온 모드에서 쉬스 CE-MS로 얻은 세 설탕 인산 이성질체 (25 μM)에 대한 쉬스 CE-MS. 추출 이온 electropherogram에 의해 분석 설탕 인산 이성질체의 그림 1. 실험 조건 : BGE, 10 % 아세트산 (PH 2.2); 분리 전압, -30 kV의 (+0.5의 PSI는 CE 모세관의 입구에 적용); 샘플 주입, 60 초 동안 2.0 PSI. 권한 4 재현. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54535/54535fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54535/54535fig2.jpg" /> 이소류신 및 L 그림 2. 분석양이온 모드 쉬스 CE-MS로 수득 개의 아미노산 이성질체 (25 μM)의 쉬스 CE-MS. 추출 이온 electropherogram 의해 eucine. 실험 조건 : BGE, 10 % 아세트산 (PH 2.2); 분리 전압은 30 kV로; 샘플 주입, 60 초 동안 2.0 PSI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54535/54535fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54535/54535fig3.jpg" /> 세포주 추출물에서 양이온 성 대사 산물 프로파일 링 쉬스 CE-MS 그림 3. 잠재적. 대사 프로파일 (총 이온 electropherogram) 양이온 모드 쉬스 CE-MS와 아교 모세포종 세포주 추출물에서 관찰했다. 실험 조건 : BGE, 10 % 아세트산 (PH 2.2); 분리 전압은 30 kV로; 샘플 주입, 60 초 동안 2.0 PSI. 권한 4 재현 </s&gt;까지. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54535/54535fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

쉬스 다공질 팁 인터페이스 설계를 이용하여 모세관 전기 영동 - 질량 분석법에 의한 생체 시료의 대사 프로파일 링을위한 프로토콜이 제시된다.

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

이 절차의 전반적인 목표는 시스리스(sheathless) 다공성 팁 인터페이스를 이용한 모세관 전기영동-질량분석법(CE-MS)을 통해 극성이 높고 전하를 띤 대사물을 분석하는 방법을 보여주는 것입니다. 많은 대사물이 전하를 띨 수 있으며, 양이온성 또는 음이온성일 수 있다고 가정할 때, 이들을 분리하기에는 모세관 전기영동과 같은 전기적 분리법이 가장 적합한 방법입니다. 하지만 최근 몇 년 동안 그 민감도는 충분하지 않았습니다.이는 인터페이스 문제 때문이었으며, 해당 방법 또한 견고하지 않았습니다. 하지만 저희는 자유 인터페이스(free interface)로서 시스(sheath)를 사용하고 이 새로운 프로토콜을 적용함으로써 두 가지 문제를 모두 성공적으로 해결했다고 생각합니다. 새로운 시스리스 다공성 팁(sheathless porous tip) 인터페이스를 이용한 모세관 전기영동-질량분석법은 대사체학 분야의 핵심적인 임상 질문들을 해결하는 데 활용될 수 있습니다.예를 들어, 이 기술을 사용하면 극성이 매우 높은 전하 대사체의 프로파일링을 용이하게 수행할 수 있습니다. 화합물들은 전하 대 크기 비율에 따라 분리됩니다. 이 기법은 생물학적 시료에 포함된 이러한 유형의 화합물들을 프로파일링하는 데 매우 적합합니다.제안된 sheathless CE-MS 방법론의 독특한 특징은 CE 전압 극성과 MS 검출 극성만 전환함으로써 음이온성 및 양이온성 대사물을 프로파일링하는 데 사용할 수 있다는 점입니다. 일반적으로 CE-MS는 상대적으로 최신이며 복잡한 기술로 간주되기 때문에, 이 방법을 처음 접하는 사용자는 어려움을 겪을 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 다공성 팁 이미터를 갖춘 새로운 bare fused silica 카트리지를 모세관 전기영동 또는 CE 장비에 장착하십시오.CE 장비를 제어하는 소프트웨어를 사용하여 50 psi의 압력으로 15분 동안 메탄올 전방 린스를 수행합니다. 이때 모세관 출구에서 액체가 흘러나오는지 육안으로 확인하십시오. 그다음, 배경 전해질 또는 BGE 솔루션을 사용하여 50 psi의 압력으로 5분 동안 반대 방향으로 린스를 수행하여 전도성 모세관에서 액체가 흘러나오는지 육안으로 검사합니다.모세관 배출구에서 액체가 흘러나오는 것이 관찰되지 않은 경우, 100 psi의 압력으로 이전 단계를 반복하십시오. 다음으로, 분리 모세관을 50 psi에서 10분 동안 물로 헹군 후, 50 psi에서 10분 동안 0.1 molar 수산화나트륨, 50 psi에서 10분 동안 물, 그리고 50 psi에서 10분 동안 BGE 용액 순으로 헹굽니다. 그 후, 물 튜브에서 융합 실리카 카트리지의 스프레이어 팁을 제거하고, MS 기기에 연결하기 위해 이를 나노스프레이 소스 어댑터에 장착하십시오.CE 기기 내 BGE 용액 바이알의 높이가 스프레이어 팁의 높이와 일치하는지 확인하십시오. BGE 용액으로 50 psi에서 5분 동안 린싱하여 전도성 모세관을 통해 액체가 흐르는지 확인하십시오. 이 린싱 단계 동안, 전기분무 이온화(electrospray ionization, ESI) 스프레이어 바늘의 끝부분에 액체 방울이 맺히는 것이 관찰되어야 합니다.세척 후, 분리 모세관을 BGE 용액으로 50 psi에서 10분 동안 순방향으로 흘려줍니다. 이 단계에서 다공성 팁 이미터의 끝부분에 액체 방울이 관찰되어야 합니다. 이제 다공성 팁 이미터를 MS 입구 입구로부터 약 2~3 mm 거리에 위치시킵니다.1분의 램프 시간을 사용하여 30 kV의 전압을 가하고, 먼저 ESI 전압을 0으로 설정한 후 대사 프로파일링 연구를 위해 65에서 1000의 질량 대 전하 범위에서 MS 데이터 수집을 시작합니다. 데이터를 측정하는 동안 ESI 전압을 1000 V로 설정하십시오. 최소 15분 동안 일정한 백그라운드 신호가 관찰될 때까지 ESI 전압을 200 V씩 증가시킵니다.미리 준비한 음이온성 대사체 표준 혼합물 20 µL를 빈 100 µL 마이크로바이알로 옮깁니다. 마이크로바이알을 CE 바이알에 넣고, CE 바이알을 입구 샘플 트레이에 배치합니다. 이전에 생성한 MS 분석 음이온 모드 방법을 시작한 후, CE 기기 제어 소프트웨어를 사용하여 CE 시퀀스를 시작합니다.그 다음, 분리 모세관을 50 psi의 BGE 용액으로 3분 동안 헹군 후, 2 psi에서 60초, 1 psi에서 10초 동안 순차적으로 주입합니다. 입구에 30 kV의 전압을 1분의 램프 시간(ramp time)으로 인가하고, 0.5 psi의 압력으로 30분 동안 유지합니다. 30분간의 전기영동 분리가 끝나면 MS 데이터 수집을 중단하고, 5분의 램프 시간을 사용하여 CE 전압을 1 kV로 낮춥니다.시료 주입 사이에 분리 모세관을 물, 0.1 molar 수산화나트륨, 물, 그리고 BGE 용액으로 30 psi에서 3분 동안 세척합니다. 분석이 완료되면, 분석된 음이온성 대사물질 혼합물의 이동 시간과 신호 강도를 결정하여 기록된 데이터를 분석합니다. 음이온성 대사물질 표준물질이 10분에서 28분 사이의 영역에 나타나는지 확인합니다.그런 다음, 구조적으로 연관된 세 가지 이성질체인 D-glucose 1-phosphate, D-glucose 6-phosphate 및 D-fructose 6-phosphate가 부분적으로 분리되었는지 확인합니다. 고극성 음이온성 대사물질 분석을 위한 sheathless CE-MS 방법의 분리 성능을 구조적으로 연관된 세 가지 당 인산 이성질체에 대해 입증하였습니다. 이 세 가지 분석물에 대해 베이스라인 분리가 이루어지지는 않았으나, 이들은 정확한 질량이 동일하므로 MS를 통해 선택적으로 검출할 수 있을 정도의 부분 분리만으로도 충분합니다.이 시스리스(sheathless) CE-MS 방법론을 사용하여 생물학적 시료를 분석할 때는 학술적 표준물을 이용해 시간이 경과함에 따른 분석 성능을 정기적으로 점검하는 것이 중요합니다. 전반적으로, 시스리스 방법론을 통해 초미량의 생물학적 시료 내 이러한 유형의 화합물들을 프로파일링할 수 있으며, 이는 의생명 과학 분야, 바이오 분석 화학 분야 및 기타 연구 영역에서 이러한 시료를 분석할 수 있는 많은 가능성을 열어줍니다. 이 영상을 시청한 후에는 고극성 및 전하를 띤 대사체 프로파일링을 위해 시스리스 다공성 인터페이스를 통해 CE를 MS에 결합하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

sheathless-capillary-electrophoresismass-spectrometry-for-metabolic

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

질량분석법(UPLC-MS)과 결합된 초고성능 액체 크로마토그래피에 의한 비표적 대사 산물 프로파일링은 대사를 조사하는 강력한 기술입니다.  이 문서에서는 시료 조직 및 준비, 데이터 수집, 데이터 분석, 품질 관리 및 대사 산물 식별을 포함하여 혈청의 비표적 대사 산물 프로파일링에 사용되는 일반적인 워크플로우를 간략하게 설명합니다.

울트라 성능 액체 크로마토 그래피 - 질량 분석법 (UPLC-MS)에 의해 혈청 대규모 비 타겟 Metabolomic 프로파일

타겟이 불분명 한 대사는 대사 프로파일의 스냅 샷을 생성하는 가설을 제공합니다. 이 프로토콜은 혈청 세포 또는 조직에서 대사 산물의 추출 및 분석을 보여줍니다. 대사 산물의 범위는 액체 - 액체 상 추출을 사용하여 조사하는, 마이크로 ultraperformance 액체 크로마토 그래피 / 차동 분석 소프트웨어에 결합 고해상도 질량 분석법 (UPLC-HRMS).

Ultraperformance 액체 크로마토 그래피 고해상도 질량 분석 (UPLC-HRMS)를 사용하여 생물 소스에서 타겟이 불분명 한 대사

대사 산물 프로파일 링은 건강과 질병에있는 신진 대사의 연구에 소중한 자산이다. 극성 스위칭 및 급속한 듀티 사이클 고분해능 질량 분석법에 결합 통상 대별 액체 크로마토 그래피를 이용해서, 우리는 높은 감도, 정밀도 및 해상도를 가진 생물학적 물질의 극성 대사 조성을 분석하는 프로토콜을 기술한다.

민감한, 대규모 양적 대사 체학을위한 전략

우리는 빠른 시내 현장 샘플링의 높은 정밀도와 최소한의 침공에 신진 대사 활동의 스냅샷의 화학 특성을 촉진 하기 위하여 모 세관 기반 마이크로-샘플링를 사용 하 여 개별 셀의 작은 부분을 사용할 수 있는 단계를 설명 배아를 사용자 단일 셀 모 세관 전기 이동 법 질량 분석 플랫폼을 사용 하 여 라이브.

단일 셀 대사체학 라이브 개구리 (Xenopus laevis) 배아에 대 한 현미경 모 세관 전기 이동 법 질량 분석

단백질 대사 산물 및 단백질-단백질 상호 작용은 모든 세포 기능에 중요 한. 여기, 우리는 선택의 이러한 상호 작용 단백질으로의 병렬 분석을 허용 하는 프로토콜을 설명 합니다. 우리의 프로토콜 식물 세포 배양에 대 한 최적화 되었습니다 및 질량 분석 기반 단백질 및 대사 산물 검출 친 화력 정화를 결합 했다.

2 1: 원스텝 단백질 단백질과 단백질 대사 산물 단지의 병렬 분석에 대 한 친 화력 정화

본 기사의 목적은 대사체학 분석, 특히 모 세관 전기 영동-질량 분 광 법을 위해 배양 된 부착 세포 로부터 수성 대사 산물을 추출 하기 위한 프로토콜을 설명 하는 것 이다.

모 세관 전기 영동-질량 분 광 법에의 한 대사체학 분석을 위해 배양 된 부착 세포 로부터 수성 대사 산물의 추출

통합 셀 조작 플랫폼은 주변 조건하에서 개별 현탁액 셀의 온라인 분석을 위한 단일 프로브 질량 분석 설정과 함께 사용하기 위해 개발되었습니다.

단일 현탁액 세포에서 약물 및 대사 산물의 질량 분석 분석을 위한 단일 프로브와 결합된 통합 셀 조작 플랫폼

여기서 우리는 모세관 전기포고증 - 질량 분석 접근법을 사용하여 생물유체로부터 나노 물질에 의해 획득된 완전한 생체 분자 코로나, 단백질 및 대사산물을 특성화하는 프로토콜을 제시합니다.

나노 물질에 의해 획득 된 단백질과 대사 산물 코로나특성화를위한 모세관 전기 전구 질량 분광법 접근법

이 프로토콜의 목표는 생물학적 샘플에서 대사 및 분자 검출을 최대화하기 위해 MALDI MSI를 사용하여 실험을 계획할 때 샘플 준비에 대한 자세한 지침을 제공하는 것입니다.

MALDI 질량 분광화상 영상을 이용한 대사 프로파일링을 위한 샘플 준비

프로토콜은 복잡한 lysate 기반 세포 없는 시스템에서 대사 반응을 연구하기 위한 굴절 지수 또는 질량 분광 검출에 결합된 고성능 액체 크로마토그래피 방법을 설명합니다.

리자테 기반 세포 없는 시스템에서 대사산물 프로파일링을 위한 굴절률 또는 질량 분광 검출에 결합된 액체 크로마토그래피

배우세요 생물 시료의 대사 프로파일링을 위한 쉬스리스 모세관 전기영동-질량분석법을. 고감도로 양이온 및 음이온 대사물질을 분석하여 대사체학 연구에 활용할 수 있습니다.

생물 시료의 대사 프로파일 링에 대한 쉬스 모세관 전기 영동 - 질량 분석

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