Name: Bir Transpozon Sistemi Kullanılarak Fare Amniyotik Sıvı Hücreleri pluripotent kök hücrelerin üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Öğrenin fare amniyotik sıvı hücrelerini transposon sistemi kullanarak pluripotent kök hücrelere nasıl yeniden programlayacağınızı. Bu virüs içermeyen yöntem, rejeneratif tıpta hasta özgü terapiler için güvenli bir alternatif sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, CARIPARO Vakfı Hibe numarası 13/04 ve Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza Hibe numarası 10/02 tarafından desteklenmiştir. Martina Piccoli, Chiara Franzin ve Michela Pozzobon, Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza tarafından finanse edilmektedir. Enrica Bertin, CARIPARO Vakfı Hibe numarası 13/04 tarafından finanse edilmektedir. Paolo De Coppi, Great Ormond Street Hastanesi Çocuk Yardım Kuruluşu tarafından finanse edilmektedir.

Tüm işlemler İtalyan yasalarına göre idi. Murin AF örnekleri GFP adı C57BL / 6-Tg (UBC-GFP) 30Scha / J fareleri 13.5 gün sonra coitum (DPC) gebe farelerin hasat edilmiştir. 1. Transpozon Üretimi Not: Transposon sentezleme vektörleri standart klonlama prosedürleri kullanılarak elde edilmiştir. Fare AF hücreleri transfeksiyon için plazmid DNA, ticari kitler kullanılarak hazırlandı. <ol><li> 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde DH5α bakteri 50 ul plasmid DNA, 10 ng karıştırın. 20 dakika boyunca buz üzerinde mikrosantrifüj tüpü inkübe edin. </li><li> 40 sn için 42 ° C sıcaklıkta ısı şoku. </li><li> 2 dakika boyunca buz üzerinde mikrosantrifüj tüpü yerleştirin. </li><li> Önceden ısıtılmış (37 ° C) lizojeni etsuyu (LB) suyu 250 ul ekleyin. 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de (300 rpm) çalkalayın. </li><li> 0.1 mg / ml ampisilin ile LB levhaları üzerine her dönüşüm için 30 ul yayıldı. Plakalar kuru ve 37 ° C ov de ters inkübe izinernight. </li><li> Ertesi gün, öğleden sonra, her dönüşümden, steril 200 ul ipuçlarını kullanarak, 3 koloniler almak ve 0.1 mg / ml LB amp üzerine aktarın. </li><li> gece boyunca 37 ° C&#39;de (300 rpm) bakteri çalkalayın. </li><li> Plazmid Saflaştırma için, ticari kitler kullanın. -20 ° C&#39;de Hazır plazmid. </li></ol> 2. Fare Embriyonik fibroblast (MEF) Kültür <ol><li> % 0.1 jelatin ile 6 oyuklu plakaların kaplanması <ol><li> Altı gözeneğin her steril% 0.1 jelatin 1 ml ilave başlık altında Coat plakalar. jelatin 1 saat süreyle bir inkübatör (37 ° C) polimerize olsun. </li><li> aşırı atın ve 1 saat süre ile plakaları kurutunuz. </li><li> oda sıcaklığında saklamak plakaları mühür ve parafilm kullanın. </li></ol></li><li> Mitomisin C ile MEF inaktivasyonu <ol><li> 37 ° C banyo kullanılarak 4 x 10 6 MEF hücreleri şişe çözülme. </li><li> MEF ortamı ile bir Petri kabı (150 mm) başlık MEF tohumu. </li><li> 37 ° C&#39;de ve% 5 CO2 hücreleri geliştirin. </li><li> (DİKKAT) hücreler konfluent mitomisin C (5 mg / ml) ekleyin. </li><li> Bir inkübatör içine yerleştirin hücreleri (37 ° C ve% 5 CO2) 3 saat karıştırıldı. </li><li> mitomisin C yıkama hücreleri ile 1x Fosfat tamponlu salin (PBS) ile üç kez orta çıkarın. </li><li> 5 dakika için 37 ° C inkübatör içine ticari tripsin ve yeri hücre 2 ml ilave edilir. Sonra, tripsin reaksiyonu durdurmak için kesme aracının 18 ilave edin. </li><li> üreticinin protokolüne göre bir Bürker odası kullanarak hücreleri sayın. </li><li> 5 dakika boyunca 145 x g&#39;de santrifüje hücreleri. süpernatant atın. </li><li> Tohum 60.000 hücre /% 0.1 jelatin kaplı plakalar üzerinde inaktive EMB cm2. </li><li> AF ve / veya iPS AF hücreleri tohumlamadan önce 37 ° C&#39;de 24 saat% 5 CO2 hücreleri geliştirin. </li></ol></li></ol> 3. Fare AF Hücre İzolasyonu <ol><li> zamanlanmış çiftleşmesi kurmak ve vajinal PLU kontroleş yuva 24 saat sonra GS. </li><li> 13.5 DPC kadar gözlemleyin ve servikal dislokasyon yoluyla hamile baraj kurban. </li><li> % 70 etanol kullanılarak hayvanın karın duvarı temizleyin. </li><li> makas kullanarak, karın boşluğuna erişebilmek için karın duvarının uzunluğu incising orta hat laparotomi gerçekleştirin. </li><li> forseps kullanarak rahim Açığa. 1x PBS buz üzerine yerleştirildi steril dolu bir 100 mm Petri kabı içine makas ve transfer kullanarak rahim kaldırmak. </li><li> 10X büyütmede AF toplamak için Stereomikroskopta kullanın. </li><li> forseps ile rahim tutun ve makas ile rahim duvarına çıkarın. Fetal membranlar ve buna bağlı olarak amniotik sıvı sızıntısını önlemek için dikkatli olun. </li><li> Steril 1X PBS ile doldurulmuş bir 100 mm Petri kabı içine fetusu toplayın ve buz üzerine yerleştirin. </li><li> Temiz bir 100 mm Petri kabı ince bir nokta forseps ve yer ile bir fetus plasenta kavrayın. </li><li> ince nokta forseps kullanarak kesesi sarısı çıkarın. </li><li&gt; ince nokta forseps kullanarak amniyon Disrupt ve 15 ml konik şişe içine bir insülin şırınga kullanarak her bir fetus için AF 30 ul toplamak. </li><li> AF toplandıktan sonra,% 1 fetal inek serumu (FBS) ile takviye edilmiş, steril 1 x PBS ile her fetus yıkayın ve 15 ml AF içeren konik tüp toplar. </li><li> 5 dakika boyunca 145 xg&#39;de Santrifüj AF. kaputun altında Süpernatantı ve pelet AF hücreleri tohum. </li></ol> 4. Fare AF Hücre Kültürü <ol><li> Fare AF Hücrelerinin tohumlama <ol><li> Bir gün önce, ekim için, mitomisin C ile muamele edilmiş MEF ile% 0.1 jelatin kaplı 6 oyuklu plaka hazırlanması. </li><li> AF toplandıktan sonra, AF kültür ortamı kullanılarak (yaklaşık 1 x 10 7 hücre 6 fetusa elde edilen) mitotik inaktive MEF üzerine bir amniyosentez elde edilen hücreler tohum. </li><li> Her gün ortam değiştirilerek, 37 ° C ve% 5 CO2 hücreleri geliştirin. </li><li> 7 günlük bir kültürden, trans sonraAşağıda tarif edilen prosedür takip fect AF hücreleri. </li></ol></li></ol> 5. Transfeksiyon iPS-AF Hücre Üretimi ve Kültür Not: Fare AF hücreleri (PB-CAG-rtTA) transpozon plazmid transposaz sentezleme plasmidi (mPBase) ile birlikte ters tetrasiklin transaktivatör ile, PB-tetO2-IRES-OKMS transpozon plasmidi ile transfekte edilmiştir. Bütün plasmidler Profesör Andras Nagy 33 tarafından temin edilmiştir. <ol><li> 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde: (2 ug toplam DNA), 0.5 mPBase ug ve 0.5 PB-CAG-rtTA ug PB-tetO2-IRES-OKMS 1 ug karıştırın. </li><li> serumsuz ortam ile 100 uL (- DMEM Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı) DNA seyreltilir. </li><li> (Plazmid DNA oranında 8 uL transfeksiyon ajanı 2 ug (DNA) transfeksiyon maddesi) (örneğin, Fugene) transfeksiyon reaktifi 8 uL ekleyin 1.5 mL mikrosantrifüj tüpü ihtiva eden DNA&#39;ya. </li><li> Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca transfeksiyon reaktifi / DNA karışımı inkübe edin. </li><li> / Oyuk 2 mL&#39;lik bir son hacme sahip fare AF hücreleri, 6 gözlü bir levhaya oyuk başına transfeksiyon reaktifi / DNA karışımı, 100 uL damla damla eklenir ve yavaşça döndürülerek dağıtın. 24 saat boyunca bekletin. </li><li> Ertesi gün, doksisiklin 1.5 ug / mL (her bir oyuk için ortam, 2 mL) ile desteklenmiş taze iPS AF ortamı hücreleri beslenmesiyle Yamanaka en faktörleri (Oct4, Klf4 Myc&#39;nin, Sox2) ekspresyonunu indükler. </li><li> Taze Ortodoks içeren ortam (nokta 5.13 kadar doksisiklin ile desteklenmiş medya hücreleri korumak) ile, geçit olmadan, her gün hücreleri beslemek. </li><li> MCherry ifade 24 saat içinde ve günlük koloni oluşumu (koloniler tipik transfeksiyon sonra 20 ile 30 gün arasında görünür) hücreleri gözlemleyin. </li><li> Bir gün kolonisi seçmek önce, mitomisin C ile muamele edilmiş MEF ile 96 oyuklu bir doku kültür plakası hazırlanır. </li><li> hacim usin 50 uL tek koloniler seçinga 200 uL pipetle ve tek tek oyuklara bir 96-çukurlu plaka sırayla transfer edin. </li><li> Sonraki gün, ticari bir tripsin 50 ul ekleyerek tek hücre içine her koloni ayırmak ve 37 ° C&#39;de 5 dakika inkübe edilir. </li><li> koloni parçalara ayırma aşağı yukarı pipet ve. </li><li> doksisiklin ile desteklenmiş taze iPS AF ortamın 100 uL dolu 96 oyuklu bir plaka kaplama% 0.1 jelatin ile etkisizleştirilmiş MEF ile yeni bir kuyuya ayrışmış koloniyi içeren tripsin başına 50 uL. </li><li> Hücreler 60-70% konfluansa ulaştığında, 24 oyuklu plaka iyi ayrıldı. </li><li> koloniler doksisiklin olmadan durumda da görünüp görünmediğini doğrulamak için iki kuyu, doksisiklin olmadan doksisiklin ile diğeri, 2: Hücreler% 60-70 izdiham ulaştığınızda, 1 ayrıldı. </li><li> IPS-AF ortamında inaktive MEF üzerinde, doksisiklin bağımsız iPS-AF klonlar, korumaya devam ediyor. </li><li> CH, 37 ° C ve% 5 CO2, hücreleri yetiştirmekgünlük orta Anging. </li></ol> 6. Alkalin Fosfataz Boyama <ol><li> doksisiklin, bağımsız iPS AF hücreleri görünümü olduğunda imalatçının protokolü takip alkalin fosfataz boyama gerçekleştirin. </li></ol> 7. İmmünofloresan <ol><li> Doksisiklin, bağımsız iPS AF hücreleri görünümü olduğu zaman, inaktive MEF ile 24 oyuklu plaka iyi 150.000 hücre / cm2, tohum ve 37 ° C&#39;de ve% 5 CO2 seviyesinde 48 saat süre ile hücre büyür. </li><li> (DİKKAT), oda sıcaklığında 15 dakika süreyle% 4 paraformaldehid (PFA) oyuk başına 300 ul ilave edilerek hücreler sabitleyin. </li><li> % 0.1 NP-40 permeabilize hücrelerin 300 ul ekle. </li><li> % 0.1, PBS-Tween 20 300 ul hücreleri durulayın. </li><li> Oda sıcaklığında 1 st için bloke edici tampon (1 x PBS içinde% 10 at serumu) 300 ul ekle. </li><li> (1:10 Oct4 (1:80), Sox2 (1:80), Klf4 (1:80), Nanog: Aşağıdaki primer antikorlar kullanın0) ve SSEA1 (1:80). % 1 sığır serum albümini (BSA),% 10 normal keçi serumu ile SSEA1 seyreltilir, 0.3 M glisin,% 0.1 PBS-Tween-20. 1 x PBS içinde% 10 at serumu ile diğer tüm antikorlar seyreltilir. </li><li> 4 ° C&#39;de bir gece antikorlar inkübe edin. </li><li> % 0.1 PBS-Tween-20 300 ul ile durulayın. </li><li> 1 x PBS içinde% 10 at serumu içinde seyreltilmiş sekonder antikor kullanarak: Alexa594 konjüge edilmiş keçi anti-fare IgG (1: 200), Alexa594 konjüge edilmiş tavuk anti-keçi IgG (1: 200), Alexa594 konjüge edilmiş, tavuk anti-tavşan IgG (1: 200), Alexa568-konjuge keçi anti-fare IgM (1: 200). Oda sıcaklığında 2 saat süreyle inkübe edin. </li><li> 1x PBS ile durulayın. </li><li> 1x PBS: Hoechst çözeltisi (10.000 1) ile Leke çekirdekleri. </li></ol> Vitro Hücre Farklılaşma 8. <ol><li> asılı damla embriyoid organları (EBS) oluşturmak için, farklılaşma ortamı kullanılarak, Petri kapağı üzerine (2.000 hücre / 20 ul) tek damla yetiştirmek. </li><li> 37 ° C&#39;de inkübe edin yemekler4 gün boyunca% 5 CO2. </li><li> farklılaşma ortamında 3 gün süspansiyon kültüründe 100 mm bakteriyel dereceli tabaklara EBS aktarın. </li><li> Başka bir 14 gün boyunca (DMEM içinde 1:10 oranında seyreltilmiş) bazal membran matris ile kaplanmış 24 oyuklu plakalarda ve plaka EBS. </li><li> T (1: 100), αfp (1: 200) ile Tubb3 (1: 500) 37 immünofloresan analiz için, birincil antikorlar kullanır. </li></ol> 9. Vivo teratom oluşumu <ol><li> / - - Γc - / - farelerde Rag2 ve hindlimb kas içine 1 x 10 6 iPS-AF hücreleri içeren 1x PBS 100 ul enjekte edilir. </li><li> 6 hafta Hücre enjeksiyonundan sonra servikal dislokasyon ile fareler kurban. </li><li> Aşağıdaki analizler için farelerin hindlimb itibaren, kendi boyutuna göre ayırt tümör kitleleri, çıkarın. </li><li> Bir Kriyostat kullanarak izopentan dondurulmuş tümör 7-10 mikron kalınlığında enine kesitler halinde kesilmiştir. </li><li> Hematoksilen And Eozin (HE) Leke: <ol><li> Üreticinin protokolü takip edilerek, tümör dokusu yapısını değerlendirmek, HE ile leke. </li></ol></li><li> Immunoperoksidaz Leke için: <ol><li> Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca% 4 PFA ile teratom bölümleri sabitleyin. </li><li> % 0.1 Triton X-100 ile geçirgenliği. </li></ol></li><li> Aşağıdaki antikorlar ile inkübe: Tubb3 (1: 100), αfp (1:50) ile αSMA (1: 100), 1 x PBS içinde% 1 BSA içinde seyreltilmiştir. 1 (Tubb3 için), 37 ° C de saat ya da gece boyunca 4 ° C &#39;de (diğer antikorlar için) inkübe edin. </li><li> 20 dakika% 100 metanol kullanılarak blok peroksidaz. </li><li> 37 ° C&#39;de 45 dakika süreyle inkübe HRP ile konjüge edilmiş (1: 150), ikincil antikor anti-fare. </li><li> 1x PBS ile durulayın. </li><li> 5 dakika boyunca peroksidaz (HRP) alt-tabaka (Malzeme Tablosu) kuluçkalayın. </li><li> 5 dakika boyunca musluk suyu ile durulayın. </li><li> 9 saniye Hematoksilen QS ile Leke. </li><li> musluk suyuyla durulayın. </li></ol&gt; Hücreler 10. RNA Ekstraksiyonu <ol><li> İmalatçının tavsiye ettiği protokole göre, ticari bir RNA özütleme kiti kullanarak. </li></ol> Teratom 11. RNA Ekstraksiyon <ol><li> örnek çözdürme önlemek için bir havan ve sıvı azot kullanılarak teratom homojenize edilir. </li><li> Dokunun 25 mg tartılır. </li><li> RNA ekstraksiyonu için ticari reaktif 1 mL kloroform 200 uL ekleyin. </li><li> 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> 13.000 x g&#39;de santrifüj ve 15 dakika boyunca 4 ° C. </li><li> yeni bir tüpe süpernatant aktarın. </li><li> RNA, imalatçının protokolüne göre, ticari bir RNA özütleme kiti kullanmak saflaştırmak için. </li></ol> 12. Ters Transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu Analizi <ol><li> Ters transkripsiyon (RT) -polymerase zincir reaksiyonu (PCR) ve oligo (dT) edi bir ters transkriptaz kullanılarak birinci sarmal cDNA sentezlemeüreticinin protokolüne Ding, 50 ng / cDNA uL elde edildi. 10 ng / ml arasında bir konsantrasyonda RNaz içermeyen su ile cDNA seyreltilir. </li><li> RT-PCR 1 ng kullanılarak, üreticinin protokolüne uygun olarak DNA polimeraz kullanılarak gerçekleştirmek / cDNA uL. </li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

pluripotensin indüksiyon elde etmek için seçilen yöntem, uzun vadeli transplantasyonu ile ilgili hücre, klinik güvenliği için geçerlidir. Günümüzde, yeniden programlama için uygun çeşitli yöntemler vardır. Bütünleştirici olmayan yöntemler arasında, Sendai viral (SeV) vektörü bulaşmış hücreler 40 çekirdeği içine entegre olmayan proteinin büyük miktarlarda üretmek ve iPS hücreleri elde etmek için bir strateji olabilir bir RNA virüsüdür. SeV vektörleri öteleme dereceli iPS hücrelerinin üretimi için ...

Prenatal tanı genetik hastalıkların (örneğin kromozomal anormallikler, monogenetik veya çok faktörlü / polijenetik hastalıklar) ve konjenital anomali (yani konjenital diyafragma hernisi, kistik akciğer lezyonları, ekzomfalos, Gastroşizis) değerlendirmek için önemli bir klinik araçtır. Amniyotik sıvı (AF) hücreleri gebeliğin ikinci üç aylık döneminde rutin planlanan prosedürlerden elde etmek kolay (yani amniyosentez ve amniyoredüksiyon yapıldığında) ya da sezaryen bölümler 1, 2. Prenatal veya neonatal hastalarda AF hücrelerinin mevcudiyeti rejeneratif tıp için bu kaynak kullanma imkanı sağlar, ve birkaç araştırmacı AF 3, 4, 5, 6 izole bir kök hücre popülasyonu kullanarak farklı doku hasarları veya hastalıkları tedavi imkanı araştırıldı, 7, 8, 9, 10, 11, 12. Kolayca Hastalık genellikle hareketsiz olduğu bir zaman penceresinde, hastalıklı hastaların AF hücreleri elde etme ihtimali, yeniden programlama amacıyla bu hücre kaynağı kullanma düşüncesine yol açar. Gerçekten de, AF hücrelerinden türetilen uyarılmış pluripotent kök (IPS) hücreleri doğum öncesi uygun bir hastaya özgü tedavi hazırlamak amacıyla, in vitro ilaç testleri için veya doku mühendisliği yaklaşımlar ilgi hücrelerinde ayırt edilebilir. Birçok çalışma, daha önce AF hücrelerinin yeteneği hücre tipleri 13, 14, 15, 16, 17 &lt;geniş bir aralığı içine yeniden programlanması ve ayırt edilmesi göstermiştir/ sup&gt;, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27. Dört transkripsiyon faktörleri (Oct4, Sox2, Myc&#39;nin ve Klf4) zorla ifade ile Takahashi ve reprogrammed somatik hücre Yamanaka 28 ile keşfinden bu yana, ilerleme yeniden programlama alanında yapılmıştır. farklı yöntemler göz önüne alındığında, biz viral ve viral olmayan yaklaşımlar ayırt edebilirsiniz. İlk kısmen yeniden programlanan hücre hattının sonucu ve risk hem de yüksek verim ama retroviral transgen genellikle eksik susturulması, sahip viral vektörler (retrovirüsler ve lentiviruses), kullanımını bekliyoraraya sokma mutajenez 29, 30, 31. Yani plazmidler, vektörler, mRNA, protein, transpozonlar: viral olmayan yöntem farklı stratejiler kullanır. Transgenik dizilerin ücretsiz iPS hücrelerinin türetilmesi sızdıran transgen ifade ve girmeyle mutagenez potansiyel zararlı etkileri engelleyecek amaçlamaktadır. Yukarıda açıklanan tüm viral olmayan stratejiler arasında, piggyBac (PB) transpozon / transposase sistemi ekleme veya eksizyon olayları 32 katalize bir transgen ve transposase enzimin geçici ifadesini yan sadece ters terminali tekrarlar gerektirir. iPS hücresi üretimi için diğer yöntemlere göre transpozonlar kullanılarak avantajı retroviral vektörler aynı etkinliğini gösteren bir viral olmayan vektör yaklaşımla vektörü içermeyen iPS hücrelerini elde etme imkanı vardır. Bu reprogr için entegre transposon kodlama iz az eksizyon ile mümkündüriPS hücrelerinin 33 transpozazın yeni, geçici ifade, aşağıdaki faktörler amming. PB farklı hücre tipleri, 34, 35, 36, 37 etkili olduğu göz önüne alındığında, viral vektörler ile ilgili klinik yaklaşımın için daha uygundur, ve ksenobiyotik kullanarak mevcut virüs üretim protokolleri aksine kseno içermeyen iPS hücrelerinin üretimi sağlar Koşullar, bu sistem, kemirgen AF iPS hücreleri elde etmek için kullanılır. Burada fare AF hücrelerinin (iPS-AF hücreleri) 38 dan pluripotent iPS klonların üretimini göstermek için zaten yayınlanmış çalışmaları takip ayrıntılı bir protokol öneriyoruz.

<table><tbody><tr><td>100 mm Bakteriyel Dereceli Petri Kapları&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>351029</td><td> in vitro farklılaşma</td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol ve nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td>Fare AF, iPS-AF hücreleri ve farklılaşma ortamı için</td></tr><tr><td>Alexa568 konjuge keçi anti-fare IgM & nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21043</td><td>İkincil antikor (immünofloresan)</td></tr> <tr><td>Alexa594 konjuge tavuk anti-keçi IgG & nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21468</td><td>İkincil antikor (immünofloresan)</td></tr> <tr><td>Alexa594-konjuge tavuk anti-tavşan IgG & nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21442</td><td>İkincil antikor (immünofloresan)</td></tr> <tr><td>Alexa594 konjuge keçi anti-fare IgG & nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11005</td><td>İkincil antikor (immünofloresan)</td></tr> <tr><td>Alkalin Fosfataz kiti&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>85L1</td><td>Alkalen Fosfataz ve nbsp; boyama</td></tr><tr><td>Ampisilin</td><td>Sigma</td><td>A0166</td><td>Bakteri seçimi için</td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümini&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>BSA, engelleme çözümü için. RNA ekstraksiyonu için PBS 1x</td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Sigma</td><td>C2432'de</td><td></td></tr> seyreltilmiş <tr><td>DH5 ve alfa hücreleri</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18265-017</td><td>Klonlama prosedürü</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> için bakteriler <tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41965039</td><td>MEF, fare AF, iPS-AF hücreleri ve farklılaşma ortamı için</td></tr><tr><td>Doksisiklin ve nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D9891</td><td>Eksojen faktörlerin ekspresyonu için</td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpleri (1.5 ml)&nbsp;</td><td>Sarstedt&nbsp;</td><td>72.706</td><td>PB üretimi için&nbsp;</td></tr><tr><td>ES FBS&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10439024</td><td>Fare AF, iPS-AF hücreleri ve farklılaşma ortamı FBS</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270106</td><td>MEF orta</td></tr><tr><td>İnce nokta forseps</td><td>için F.S.T</td><td>Dumont #5&nbsp;</td><td>AF izolasyonu</td></tr><tr><td>Jelatin</td><td>JTBAKER</td><td>131</td> Bloke edici çözelti için PBS 1x Glycine Bio-Rad 161-0718 <td>içinde seyreltilmiş% 0.1 kullanılır</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>. PBS 1x</td></tr><tr><td>Hematoksilen QS</td><td>Vektör Laboratuvarlarında seyreltilmiş</td><td>H3404</td><td>Çekirdek tespiti</td></tr><tr><td>HE&nbsp;</td><td>Bio-Optica</td><td>04-061010</td><td>Teratomun histolojik analizi</td></tr><tr><td>Hoechst&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td>Çekirdek Tespiti</td></tr><tr><td>At Serumu&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16050-122</td><td>Engelleme çözeltisi için</td></tr><tr><td>HRP konjuge keçi anti-fare IgG</td><td>SantaCruz</td><td>sc2005</td><td>İkincil antikor (immünoperoksidaz)</td></tr> <tr><td>ImmPACT NovaRED&nbsp;</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>SK4805</td><td>Peroksidaz substratı</td></tr><tr><td>İğneli insülin şırıngası (25 G)</td><td>Terumo</td><td>SS + 01H25161</td><td>Amniyosentez prosedürü</td></tr><tr><td>Klf4&nbsp;</td><td>SantaCruz</td><td>sc-20691</td><td>Tavşan poliklonal IgG</td></tr><tr><td>L-glutamin&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030</td><td>Fare AF, iPS-AF hücreleri ve farklılaşma ortamı</td></tr><tr><td>için LB suyu (Lennox)</td> <td>Sigma</td><td>L3022</td><td>Bakteri üremesi için</td></tr><tr><td>LIF&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>L5158</td><td>Fare AF ve iPS-AF hücreleri için orta</td></tr><tr><td>Matrigel&nbsp;</td><td>BD</td><td>354234</td><td>in vitro farklılaşması için. DMEM'de 1:10 oranında seyreltilmiş</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma</td><td>32213</td><td>Peroksidaz bloke edici</td></tr><tr><td>MULTIWELL 24 kuyulu plaka</td><td>BD Falcon</td><td>353047</td><td> in vitro farklılaşması MULTIWELL</td></tr><tr><td>6 kuyulu plaka</td><td>BD Falcon</td><td>353046</td><td>MEF, fare AF ve iPS-AF hücre kültürü için</td></tr><tr><td>Nanog ve nbsp;</td><td>ReproCELL</td><td>RCAB0002P-F</td><td>Tavşan poliklonal IgG</td></tr><tr><td>Esansiyel olmayan amino asitler&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td>Fare AF, iPS-AF hücreleri ve farklılaşma ortamı için</td></tr><tr><td>Normal Keçi Serumu</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>S2000</td><td>Engelleme çözeltisi için. Hücre</td></tr><tr>geçirgenliği için PBS 1x<td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>12087-87-0</td> içinde seyreltilmiştir<td>. PBS 1x</td></tr><tr><td>Oct4</td><td>SantaCruz</td><td>sc-5279</td><td>Fare monoklonal IgG2b</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oligo (dT) içinde seyreltilmiş&nbsp;</td><td>RT-PCR</td>Paraformaldehit (çözelti) için <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18418012</td></tr> <tr><td></td><td>Sigma</td><td>441244</td><td>PFA, fiksatif, PBS</td></tr><tr><td>10x</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14200-067</td><td>D-PBS, Ca2 + / Mg2 + içermez. PBS 1x</td></tr><tr><td>Penisilin - Streptomisin elde</td> etmek için steril su ile seyreltilir;<td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15070063</td><td>MEF, fare AF, iPS-AF hücreleri ve farklılaşma ortamı için</td></tr><tr><td>Petri Kabı (150 mm)</td><td>BD Falcon</td><td>353025</td><td>MEF kültürü, doku kültürü için</td></tr><tr><td>PiggyBac transpozaz ekspresyonu plazmid&nbsp;</td><td>Profesör Andras Nagy laboratuvarı tarafından</td><td></td> <td>sağlanmıştır-mPBase</td></tr><tr><td>PiggyBac-tetO2-IRES-OKMS transpozon plazmidi</td><td>Profesör Andras Nagy laboratuvarı tarafından</td><td></td> <td>sağlanmıştır-PB-tetO2-IRES-OKMS</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Maxiprep Kiti</td><td>Plazmid saflaştırması için</td><td>Qiagen</td><td>12663</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kiti</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>Plazmid saflaştırması için</td></tr><tr><td>Ters tetrasiklin transaktivatörü transpozon plazmidi&nbsp;</td><td>Profesör Andras Nagy</td> <td>laboratuvarı-rtTA</td><td></td></tr> <tr><td>RNeasy Mini Kit</td> tarafından sağlanmıştır;<td>RNA ekstraksiyonu için</td> <td>Qiagen</td><td>74134</td></tr><tr><td>Sox2&nbsp;</td><td>SantaCruz</td><td>sc-17320</td><td>Keçi poliklonal IgG</td></tr><tr><td>SSEA1&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab16285</td><td>Fare monoklonal IgM</td></tr><tr><td>SuperScript II Ters Transkriptaz&nbsp;</td><td>RT-PCR için Thermo Fisher Scientific</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>T&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab20680</td><td>Tavşan poliklonal IgG</td></tr><tr><td>Taq DNA Polimeraz</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>10342020</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Tripsin ve nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300-054</td><td>Hücre kültürü geçişi</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Bio-Rad</td><td>161-047</td><td>Hücre geçirgenliği için, PBS 1x</td></tr><tr><td>TRIzol Reaktifi</td> içinde seyreltilmiş <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596-026</td><td>RNA ekstraksiyonu</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> için <tr><td>Tubb3&nbsp; &nbsp;</td><td>Promega&nbsp;</td><td>G712A</td><td>Fare monoklonal IgG1</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TWEEN-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td>Hücre geçirgenliği için, PBS 1x ve alfa içinde seyreltilmiş</td></tr><tr><td>; fp&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Ar-Ge D Sistemleri</td><td>MAB1368</td><td>Fare Monoklonal IgG1</td></tr><tr><td>&alpha;SMA&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab7817</td><td>Fare Monoklonal IgG2a</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transfeksiyon Reaktifi (FuGENE HD)</td><td>Promega&nbsp;</td><td>E2311</td><td>AF hücreleri transfeksiyonu için</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Nikon</td><td>SM2645</td><td>Amniyosentez yapmak için&nbsp;</td></tr><tr><td>200 &mu; l ipuçları</td><td>Sarstedt&nbsp;</td><td>70.760012</td><td>Bakteri kolonilerini koparmak için</td></tr><tr><td>Makas</td><td>F.S.T</td><td>14094-11 paslanmaz 25U</td><td>Amniyosentez yapmak için&nbsp;</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma</td><td>2860</td><td>Gebe barajının karın duvarını temizlemek için</td></tr><tr><td>Doku kültürü petri kabı (150 mm)&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>353025</td><td>MEF genişlemesi için</td></tr><tr><td>Mitomisin C</td><td>Sigma</td><td>M4287-2MG</td><td>MEF inaktivasyonu için</td></tr><tr><td>MULTIWELL 96 kuyu plakası</td><td>BD Falcon</td><td>353071</td><td>iPS-AF kültürü için</td></tr></tbody></table>

bir transpozon sistemi kullanılarak fare amniyotik sıvı hücreleri pluripotent kök hücrelerin üretimi

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

İndüklenmiş pluripotent kök (iPS) hücreler, fare ve insan somatik hücrelerden, tanımlanmış transkripsiyon faktörlerinin farklı yöntemler kullanılarak zorlanmış ekspresyonu ile üretilir. Burada, viral olmayan bir transpozon sistemi kullanarak fare amniyotik sıvı hücrelerinden iPS hücreleri ürettik. Elde edilen tüm iPS hücre hatları, in vitro ve in vivo olarak üç germ tabakasının tümünün türevlerine doğru farklılaşma yeteneği de dahil olmak üzere pluripotent hücrelerin özelliklerini sergiledi. Bu strateji, doğum kusurları için yeni tedaviler geliştirmek için hastalıklı fetüslerden alınan hücrelerin kullanılması olasılığını ortaya çıkarmaktadır.

reprogramming kapasitesini değerlendirmek, fare AF hücreleri GFP farelerin fetusa toplanmıştır. Hücreler PB- (a doksisiklin indüklenebilir bir şekilde MCherry fluoresan proteine ​​bağlanmış Yamanaka faktörleri (Oct4, Sox2 Myc'nin ve Klf4) ifade dairesel transpozon plazmid PB-tetO2-IRES-OKMS, transfekte ve tetrasiklin transaktivatör tersine edildi CAG-rtTA) transposaz ifade plazmidi (mPBase) ile birlikte plazmidler. Fare AF hücreleri MEF besleyici tabakası üzerinde in vitro büyüt...

Bu çalışmada, viral olmayan bir transpozon sistemi kullanarak fare amniyotik sıvı hücrelerinden indüklenmiş pluripotent kök hücreler üretiyoruz.

Bir Transpozon Sistemi Kullanılarak Fare Amniyotik Sıvı Hücreleri pluripotent kök hücrelerin üretimi

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Bu prosedürün genel amacı, bir transpozon sistemi kullanarak murin amniyotik sıvı hücrelerini izole etmek ve yeniden programlamaktır. Bu tekniğin en büyük avantajı kolay bir şekilde gerçekleştirilebilmesidir. Terapötik bir ortamda, insan hastalığı fetüslerinden alınan hücreler, doğumdan önce hastaya özgü tedavinin başka bir yolunu hazırlamak için ilaç testi veya doku mühendisliği için ilgilenilen hücrelere farklılaştırılabilir.Bu yöntem, programlamanın temel sorularını yanıtlamaya yardımcı olabilir. Transpozon sistemi farklı hücre tiplerinde etkilidir. Viral vektörlere göre klinik yaklaşım için daha uygundur ve oksino içermeyen IPS hücrelerinin üretimine izin verir.İzolasyona başlamak için, barajın karın duvarını yüzde 70 etanol kullanarak temizleyin. Makas kullanarak, karın boşluğuna erişmek için karın duvarının uzunluğunu keserek orta hat laparotomisi yapın. Uterusu ortaya çıkarmak için forseps kullanın ve ardından makas kullanarak eksize edin.Uterusu steril 1xPBS ile doldurulmuş 100 milimetrelik bir tabağa aktarın ve buz üzerinde tutun. Çanağı 10X büyütmede bir stereomikroskop altına yerleştirin ve rahim duvarını makasla çıkarırken fetal zarlara zarar vermemeye dikkat ederek ute

the-production-pluripotent-stem-cells-from-mouse-amniotic-fluid-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu video indüklenebilir lentivirüs kullanarak bağlı pluripotent kök hücreleri üretmek için prosedürü ifade Oct4, Sox2, c-Myc ve Klf4 gösterir.

Sox-2 Zorla İfade yoluyla MEFS iPS Hücreler oluşturma, Eki 4, c-Myc ve Klf4

Stemgent Dox Đndüklenebilir Fare TF lentivirüs Set bağlı pluripotent kök (IPS) hücreleri fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) yeniden programlamak. Burada fare reprogramming transkripsiyon faktörleri Oct4 DOX indüklenebilir ifade için protokol göstermek, Sox2, Klf4 ve c-Myc ifade ortak MES pluripotency belirteçlerinin iPS koloniler oluşturmak için.

Dört Transkripsiyon Faktör Fare Embriyonik Fibroblastlar yeniden programlanması Bağlı Pluripotent Kök Hücre Üretimi, Doksisiklin lentiviral İletim Sistemi Đndüklenebilir

Onlar pluripotency için standart testleri geçmek bile oluşturuluyor indüklenen pluripotent kök hücre (IPSC) hatları gelişim potansiyeli birbirinden farklı çizgiler üretir. Burada sahip tam olarak pluripotency IPSC hattı tanımlayan iPSCs, tamamen edilen fareler üretmek için bir protokol...

İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Elde Edilen Fare Üretimi

Burada tek bir lentiviral yeniden programlanması vektörü kullanılarak periferal kan 3-4 ml insan iPSCs üretimi için basit ve etkili bir protokol göstermektedir. Hazır kan hücrelerinin yeniden programlanması daha geniş bir araştırma toplum için erişilebilir kılarak IPSC teknoloji kullanımı hızlandırmak için vaat ediyor.

STEMCCA lentiviral Vektör Kullanma Çevresel Blood İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücre Üretimi

Fare embriyonik fibroblastı, transkripsiyon faktörleri Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc'nin zorla ekspresyonu ile düşük verimlilikte indüklenmiş pluripotent kök hücrelere yeniden programlanabilir. Yeniden programlama reaksiyonunun nadir ara ürünleri, hücre yüzeyi yapıcıları Thy-1.2, Ssea-1 ve Epcam'a karşı antikorlarla etiketleme yoluyla izole edilen FACS'dir.

Bir programlayabilme Fare Modeli iPS Hücre araürünler Hücre Yüzey Etiket Aracılı Arıtma

Uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs), klinik uygulamalar ve temel araştırma için hastaya özgü dokuların bir kaynağı temsil eder. Burada, non-entegre epizomal plasmidleri kullanılarak viral içermeyen iPSCs içine donmuş buffy kat elde edilen insan periferal kan mononükleer hücreleri (PBMNCs) yeniden programlamak için detaylı bir protokol mevcut.

Bütünleşmeyen episomal plasmidler kullanılarak dondurulmuş Buffy tüylerdeki uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Bu protokol, insan yetişkin periferik kan hücrelerinden entegrasyon gerektirmeyen iPSC'lerin verimli bir şekilde üretilmesi için ayrıntılı bir yöntemi açıklar. Yeniden programlama faktörlerini ifade etmek için dört oriP/EBNA bazlı epizomal vektörün kullanılmasıyla, KLF4, MYC, BCL-XL veya OCT4 ve SOX2, 1 mL periferik kandan binlerce iPSC kolonisi elde edilebilir.

Epizomal vektörlerin kullanılması insan periferik kan mononükleer hücrelerinden entegrasyon içermeyen uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Bu iletişim kuralı birincil amniyotik sıvı ve membran Mezenkimal kök hücrelerin içine İndüklenmiş pluripotent kök hücreler tamamen kimyasal olarak tanımlanan koşullarda bir sigara entegre episomal yaklaşım kullanarak yeniden programlama açıklar. Yordamlar, ayıklama, kültür, yeniden programlama ve elde edilen İndüklenmiş pluripotent kök hücreler sıkı yöntemlerle karakterizasyonu ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Birincil amniyotik sıvı ve membran hücreler Pluripotent Xeno-Alerjik koşullarında için yeniden programlama

Burada, piggyBac bazlı bir donör plazmid ve Cas9 nickaz mutantı kullanarak insan pluripotent kök hücrelerinde dikişsiz gen düzenleme için ayrıntılı bir yöntem açıklıyoruz. İnsan embriyonik kök hücrelerinde (hESC'ler) hepatosit nükleer faktör 4 alfa (HNF4α) lokusunun ekzon 8'ine iki nokta mutasyonu getirildi.

Kesintisiz Genom Düzenleme Kullanarak İnsan Pluripotent Kök Hücrelerine Nokta Mutasyonlarının Tanıtılması

Burada, gen transfeksiyonuna veya retroviral vektörlere ihtiyaç duymadan, memeli pluripotent hücrelerini verimli bir şekilde üretmek için kimyasal epigenetik silme kullanımını mekanosensing ile ilgili ipuçlarıyla birleştiren bir yöntem sunuyoruz. Bu nedenle, bu strateji translasyonel tıp için umut vericidir ve kök hücre organoid teknolojisinde kayda değer bir ilerlemeyi temsil etmektedir.

Memeli Pluripotent Hücreleri Üretmek için Epigenetik Modifikasyonu ve Biyomekanik İpuçlarını Birleştiren İki Adımlı Bir Strateji

Öğrenin fare amniyotik sıvı hücrelerini transposon sistemi kullanarak pluripotent kök hücrelere nasıl yeniden programlayacağınızı. Bu virüs içermeyen yöntem, rejeneratif tıpta hasta özgü terapiler için güvenli bir alternatif sunar.

Bir Transpozon Sistemi Kullanılarak Fare Amniyotik Sıvı Hücreleri pluripotent kök hücrelerin üretimi

Daha fazla video keşfet