생물학적 설정에서 생성 및 관측 화학 발광위한 새로운 기술

이 프로토콜의 전반적인 목표는 신호 대 잡음비 및 검출 한계 측면에서 기존 광학 기술에 비해 이점을 제공할 수 있는 새로운 전임상, 상호 운용, 화학발광 이미징 기술을 제공하는 것입니다. 이 방법은 생물학과 관련된 많은 분야에서 기존 광학 이미징 기술로는 접근할 수 없었던 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 신호 대 잡음비가 높고 순간광이나 방사선이 필요하지 않다는 것입니다.

따라서 우리가 발견한 것은 이 기술의 의미가 이 기술이 제공해야 하는 높은 신호 대 잡음 비율 때문에 암을 포함한 여러 질병 상태의 상호 운용성 이미징으로 확장된다는 것입니다. 이 기술에는 입사광이 필요하지 않기 때문에 입사광 흡수에는 문제가 없습니다. 또한, 화학발광 코어 분자를 기능화하는 데 사용할 수 있는 대형 화학 도구 상자가 있습니다.

절차를 시작하려면 역삼투압수에 트리스(비피리딘)루테늄(II)클로라이드의 100마이크로리터 표준 용액을 준비합니다. 그런 다음 현미경 슬라이드에서 각 표준물질을 역삼투수에 있는 25밀리몰의 질산암모늄 용액 100마이크로리터와 결합합니다. 생물 발광 리더 이미징 소프트웨어를 열고 초기화를 클릭합니다.

이미징 모드에서 발광과 사진은 확인하고 형광은 선택 해제되어 있는지 확인합니다. 발광 노출 시간, 비닝, f/stop 및 방출 필터 매개변수를 설정합니다. 사진 노출 시간, 비닝 및 f/스톱 매개변수를 설정합니다.

그런 다음 이미징할 샘플에 따라 피사체 높이를 설정합니다. 카메라와 샘플 스테이지 사이의 거리를 14cm로 설정하기 위해 시야를 B로 설정합니다. 샘플 스테이지의 생물 발광 리더 이미징 챔버 바닥을 검은색 건설 종이로 덮습니다.

그런 다음 표준 혼합물 방울이 있는 첫 번째 슬라이드를 샘플 스테이지에 놓고 방울이 녹색 라이트박스 십자선 중앙에 위치하도록 합니다. 다음으로, 맞춤형 분무기의 3온스 스프레이 병에 물과 에탄올을 50/50 용액에 1:3 트리에틸아민 용액으로 채웁니다. 흡인 파이프에 기포가 없는지 확인하십시오.

분무기 어셈블리를 이미징 챔버에 놓고 스프레이 노즐이 액적의 카메라 시야를 방해하지 않고 이미징할 액적을 향하도록 합니다. 분무기 전원 스위치와 전원 표시등이 켜져 있고, 자기 토글 스위치가 꺼져 있으며, 전원 분무기와 원격 코드가 엉키지 않았는지 확인합니다. 슬라이드의 표시와 같은 핫스팟을 작은 검은색 시공 용지 조각으로 덮습니다.

분무기 원격 코드를 최소 40cm 두께의 이미징 챔버에 배치합니다. 분무기 코드를 압착하지 않고 챔버 도어를 부드럽게 닫습니다. 기기 소프트웨어에서 acquire를 클릭하고 자동 저장을 활성화한 다음 데이터 파일 경로를 설정합니다.

이미징 시퀀스를 시작합니다. 딸깍 소리와 함께 셔터가 열리면 분무기 토글을 세 번 전환하여 트리에틸아민 용액을 샘플에 세 번 분사합니다. 각 표준 슬라이드에 대해 절차를 반복하여 루테늄 이미징 에이전트의 최소 검출 가능 농도를 결정합니다.

in vivo 이미징 절차를 시작하려면 인산염 완충 식염수에 8-33 나노몰의 트리스(비피리딘)루테늄(II) 클로라이드를 포함하는 용액 100마이크로리터를 준비합니다. 질산암모늄 세륨의 25밀리몰 수용액을 준비합니다. 다음으로, 100마이크로리터의 루테늄 이미징 에이전트를 건강한 마우스의 꼬리 정맥에 정맥 주사합니다.

이산화탄소 질식으로 주입 후 10분 후에 마우스를 희생시킵니다. Y컷으로 몸통의 피부를 제거한 다음 늑골 아치를 제거하여 심장과 폐를 노출시킵니다. 우심방의 배출구를 절단하고 24게이지 바늘을 통해 20ml의 PBS를 좌심실에 주입합니다.

뱃살을 잘라 신장과 간을 노출시킨다. 관심 기관이 간, 신장 또는 비장인 경우 기관을 통해 눈에 띄는 세로 절단을 만듭니다. 생물 발광 리더 소프트웨어에서 새로운 이미징 시퀀스를 준비합니다.

전체 복부 이미징의 경우, 열린 복부가 카메라를 향하고 머리가 기기 뒤쪽을 향하도록 하여 이미징 챔버에 마우스를 놓습니다. 관심 기관을 녹색 라이트박스 십자선의 중앙에 놓습니다. 분무기 어셈블리에서 스프레이 병과 노즐을 철저히 씻어낸 다음 병에 질산암모늄 세륨 용액을 채웁니다.

분무기를 이미징 챔버에 놓고 스프레이 노즐이 이미징 부위를 향하도록 합니다. 카메라가 방해받지 않는지, 코드가 엉키지 않았는지, 원격 코드의 40cm 이상이 챔버에 있는지 확인하십시오. 챔버를 닫고 이미징 시퀀스를 시작합니다.

딸깍 소리와 함께 셔터가 열리면 토글을 세 번 전환하여 이미징 부위에 산화제를 세 번 분사합니다. 이미징 후 분무기 어셈블리를 제거하고 스프레이 노즐을 철저히 헹구어 질산암모늄 세륨의 결정화를 방지합니다. 후속 개별 장기 이미징 및 정량화를 위해 기기에서 마우스를 제거하고 열린 체강에서 시작하여 내부 장기를 절제합니다.

뒷다리 피부를 잘라 근육 조직 샘플을 절제합니다. 관심 기관이 간인 경우 신장 또는 비장은 장기를 세로로 반으로 자릅니다. 그런 다음 오르간을 페트리 접시나 검은색 건축 종이 조각에 놓습니다.

전체 동물과 동일한 방식으로 각 기관을 이미지화하고 각 시퀀스 후에 스프레이 노즐을 헹굽니다. 이 절차에서는 마우스에 루테늄 기반 이미징 에이전트를 주입하고 관심 조직에 산화제를 분사하여 화학발광을 유도했습니다. 이미징 에이전트의 최소 검출 가능 농도는 이러한 조건에서 제곱센티미터당 6.9피코몰로 결정되었습니다.

백색광의 화학발광(Chemiluminescence) 관심 기관의 이미지는 생물 발광 판독기를 사용하여 얻었습니다. 화학발광 신호는 정맥 주사 후 신장에서 주로 관찰되었으며, 이는 친수성 트리스(비피리딘)루테늄(II)양이온의 신장 제거를 나타냅니다. 이미징 에이전트와 PBS 단독의 신호 대 잡음비는 신장에서 27:1, 간에서 21:1이었습니다.

마우스 슬와골 림프절은 또한 루테늄 기반 이미징 에이전트의 보다 농축된 용액의 피하 주사로 평가되었습니다. 이미징 에이전트를 포함하는 림프절은 PBS만 포함하는 림프절보다 훨씬 더 큰 광도를 보였습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 두 시간 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 주변광을 차단하고 루테늄 트리스 bpy로 인한 오염을 방지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 개발 후 이 기술은 생체 분자 이미징 분야의 연구원들이 생쥐의 암과 같은 질병 상태를 탐구할 수 있는 길을 열 것입니다. 이 방법은 기존 광학 이미징 기술로는 접근할 수 없었던 질문에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 기존 기술로 조사할 수 있는 모든 질문은 잠재적으로 화학발광으로 해결할 수 있습니다.