Name: 생물학적 설정에서 생성 및 관측 화학 발광위한 새로운 기술 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: 배우세요 루테늄 복합체를 이용한 화학발광 영상 기술로 생물학적 설정에서 수술 중 영상의 신호 대 잡음비를 향상시키는 방법입니다. 이 기술은 암을 포함한 다양한 질병 상태의 영상 진단에 혁신적인 가능성을 제공합니다.

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저자는 도움이 되는 토론을 해준 Jan Grimm 교수와 Travis Shaffer, 그리고 원고를 편집해 준 David Gregory에게 감사를 표합니다. NIH Cancer Center Support Grant P30CA008748-48의 일부 지원을 받는 MSK Animal Imaging Core Facility에서 제공하는 기술 서비스에 감사의 뜻을 전합니다. 저자는 NIH(K25 EB016673 및 R21 CA191679, T.R. 및 4R00CA178205-02, B.M.Z.), MSK Center for Molecular Imaging and Nanotechnology(T.R.), Tow Foundation(B.C.), National Science Foundation Integrative Graduate Education and Research Traineeship(IGERT 0965983 at Hunter College for B.C. 및 T.M.S.)의 아낌없는 지원에 감사를 표합니다. 이 간행물에 보고된 연구는 King Abdullah University of Science and Technology의 자금 지원을 받았습니다.

윤리 문 : 승인 된 프로토콜과 기념 슬로안 케터링 암 센터 (MSK) 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 윤리적 지침에 따라 따라 수행 된 기술 된 생체 내 동물 실험의 모든. Nebulizing 장치 1. 건설 <ol><li> 두 개의 나사 (X 25mm 2 ~ 4)를 사용하여 파트 B (12.7 X 10.7 X 1.8 cm 3)의 중앙에 수직으로 나무 부 A (12.5 X 2.5 X 1.8 cm 3)를 연결합니다. 나무 부품 C를 연결합니다 (11 × 2.5 × 1.8 cm 3) 파트 C (11 X 2.5 × 1.8 cm 3) 여전히 이동 될 수 있도록 하나의 나사를 사용하여 부품 A (12.5 X 2.5 X 1.8 cm 3)의 중간에. 그림 1을 참조하십시오. </li><li> 두 개의 루프, 하나에 하나를 형성하기를 통해 두 개의 구멍 플라스틱 3온스 미니 스프레이 (D)의 스프레이 병 트리거의 하단 끝을 통해 드릴 및 스테인레스 스틸 막대를 밀어 (1/16 &quot;강 10cm) (E) 트리거의 측면. </l난&gt; <li> 오프 미끄러지는 케이블 타이를 방지하기 위해 덕트 테이프 (F)와 분 무병의 저면 부분을 감싸. 두 개의 플라스틱 케이블 타이를 이용하여 나무 파트 C (11 X 2.5 × 1.8 cm 3) (28cm) (G)에 스프레이 병을 연결합니다. </li><li> 011 서보 모터 (I)를 잘라 및 서보 제어 (H)의 느슨한 케이블을 다시 연결합니다. 그런 다음, 덕트 테이프를 사용하여 나무의 부품 A (12.5 X 2.5 X 1.8 cm 3)의 정상에 서보 모터를 연결합니다. </li><li> 종이 클립 (K)를 사용하여 서보 모터 레버 연필 (J)를 부착. 단단히 플라스틱 피복 꼬임 선 (L)를 사용하여 강철 막대의 연필 루프의 가장 바깥 쪽 부분을 연결 덕트 테이프로 연필 단부를 고정. </li><li> 서보 모터 제어부의 자기 케이블 커넥터 (M)을 절단하고, 스피커 케이블 (N)으로 다시 연결. 이어서, 목재 부 B (12.7 X 10.7 X 1.8 cm 3)에 서보 모터 제어부 테이프. 반 자기 커넥터가있는 W1 케이블을 잘라 구리의의 느슨한 끝으로 한 부분을 첨부peaker 케이블 (1m). 사용 가능한 W1 케이블과 9V 배터리의 (자기) I2 토글 스위치 및 P1 전원을 연결합니다. </li></ol> [방법] 2. 감도 결정 <ol><li> 1.5 ML의 microcentrifuge 관에서 260 μg의 (347 nmol의), 52 μg의 (69 nmol의), 26 μg의 (34 nmol의)의 양 역삼 투 물 (100 μL)의 [Ru로 (BPY) 3] CL 2의 솔루션을 준비 5 μg의 (6.9 nmol의) 3 μg의 (3.5 nmol의) 520 NG (694 pmol의) 260 NG (347 pmol의) 52 NG (69 pmol의) 26 NG (34 pmol의) 5 NG (6.9 pmol의) 3 NG (3.5 pmol의). </li><li> 각 100 μL 믹스 [(RU BPY)을 3] CL 암모늄 세륨 질산염 수용액 100 μL 2 용액 ((NH 4)이 세륨 (NO 3) 6) 현미경 슬라이드에 물 (25 mM)을한다. </li><li> 이미징 소프트웨어를 초기화하여 생물 발광 리더의 인수를 설정합니다. <ol><li> 사용자 프로필에 로그인하고 아퀴를 찾습니다sition 제어판. &quot;초기화&quot;악기가 준비가 될 때까지 기다려야을 클릭합니다. </li><li> 선택 해제 &quot;영상 모드&quot;를 찾아 &quot;발광&quot;과 &quot;사진&quot;이 선택되어 있는지 확인하고 &quot;형광&quot;. </li><li> 변경 &quot;노출 시간&quot;20 초에 &quot;발광&quot;에 대한 설정. &quot;비닝을&quot;다음과 같이 &quot;발광&quot;에 대한 나머지 설정을 중간; &quot;F / 정지&quot;: 1; 그리고 &quot;배출 필터&quot;를 엽니 다. 주 : 노출 시간은 계측 및 사용 실험 설정에 따라 적용해야 할 수 있습니다, 제시된 설정 다른 경우. </li><li> &quot;노출 시간&quot;:은 &quot;사진,&quot;다음 설정을 사용하여 자동; &quot;비닝&quot;: 중간; 및 &quot;F / 정지&quot;8. &quot;필드보기의&quot;드롭 다운 메뉴에 대한 target.Look 이미징에 따라 &quot;제목 높이&quot;를 조정합니다. 초기 설정은 &quot;C.&quot;입니다 는 C 사이의 &quot;B&quot;로 변경 (14cm 거리amera 및 샘플 단계). </li></ol></li><li> 산화제로부터 보호하기 위해 상기 촬상 챔버의 바닥에 검은 건설 용지에 현미경 슬라이드를 배치하여 분무기를 설정한다. 의 100 μLdroplet 믹스 [Ru로 (BPY)을 3] CL 2 -solution 수용액 100 μL (NH 4) 2 세륨과 (NO 3) 6. 녹색 상자의 십자선을 준수하십시오. <ol><li> 흑색 도화지에 촬상 대상을 배치, 관심 영역은 녹색광 박스 십자선의 중심이되도록 시료 스테이지 상에 디스플레이. 나무 지원에서 플라스틱 스프레이 병을 분리하여 분무기를 준비합니다. 그 플라스틱 저장 용기에 (물 / 에탄올 (3) 1)과 나무 지원에 다시 연결 트리 에틸 아민 용액을 채 웁니다. </li><li> 생물 발광 리더 내부의 분무기를 놓고 전원 코드가 분무기 코드에서 분리되어 있는지 확인하십시오. 확인이 전원 스위치에이고, 토글 스위치가 꺼져 있고 빨간색 LED가 켜집니다 분무 노즐 헤드에 의해 촬상 대상을 향해 카메라 뷰 방해를 최소화하면서 분무 흐름 촬상 주제에 관심의 영역을 향해 가리키는되도록 분무기를 놓는다. </li><li> 스프레이에서 그들을 보호하기 위해 (현미경 슬라이드 또는 주사 부위에 예를 들어, 흰색 마크) 잠재적 인 핫스팟을 통해 건설 용지의 작은 검은 조각을 놓습니다. 장소는 촬상 피사체 분무기 또는 자성 도어 래치를 방해하지 않도록, 촬상 챔버 내부 분무기 리모컨 코드의 적어도 40cm. 이미징 시스템 덮개를 닫습니다. 참고 : 십자선에서 설정 &quot;보기의 필드&quot;에 따라 크기를 변경할 것 &quot;이미지 생활;&quot; 이것은 &quot;B&quot;로 설정되어 있는지 확인합니다. </li></ol></li><li> 상기 영상 시퀀스를 시작하여 화상을 취득. 에서 &quot;획득&quot;을 클릭 &quot;취득 제어판.&quot; 제 1 이미징에 sequ줬어, 원하는 (권장) 경우 자동 저장을 활성화하고 데이터 폴더를 선택합니다. 순서가 끝날 때까지 &quot;편집 영상 레이블&quot;대화 상자를 무시합니다. 주 : 제어 소프트웨어는 기기의 동작을 단계별로 실시간으로 표시됩니다. 측정 준비 및 오른쪽 위치에 시료 스테이지를 이동 한 후에는 카메라 셔터를 열고, 측정 시간을 카운트한다. 셔터 개구는 기계에 의해 생성되는 클릭 소리로 들릴 수있다. </li><li> 화학 발광을 생성하는 전환 스위치를 세 번 전환 : 셔터가 열리면, 트리 에틸 아민의 용액을 세 버스트 (물 / 에탄올 (3) 스프레이 버스트 당 0.24 ± 0.04 mL의 1)을 스프레이. 참고 : 샘플 단계는 측정하는 동안 이동합니다. 이 수 있도록 기기 내부에 충분한 (최소 40cm) 케이블을 둡니다. 이 솔루션은 상승 관에 의해 열망 할 수있는 분무기로 살포 할 것을 파이프에 기포가 없는지 확인합니다. 몇 가지 예비 BATTERIE이필요한 경우 준비 분무기에 대한의. </li></ol> 생체 이미징 3. 전신 정맥 주입 후 <ol><li> 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에서 [Ru로 (BPY) 3] 2 nmol의 CL 8 내지 33를 함유하는 인산 완충 식염수 (PBS) 용액을 100 μL를 준비한다. 수용액 (NH 4)이 준비 세륨 (NO 3)과 동시에 물 (25 mM)을 6. </li><li> 정맥 건강한 마우스의 꼬리 정맥에 100 μL [(RU BPY) 3] Cl2를 주입 (N = 5). </li><li> CO 2 질식 통해 주사 후, 마우스를 안락사 10 분. <ol><li> 다음 심장과 폐를 노출하는 U 자형의 늑골 아치를 제거, 몸통에서 Y 컷과 피부를 제거합니다. 좌심실 (18)에 24 게이지 바늘을 통해 PBS 20 mL로 우심방에 배출구를 절단 주사하여 마우스를 관류. 조심스럽게 배를 잘라피부와 신장과 간을 노출. 눈에 보이는 컷을 만드는 기관을 통해 길이 방향으로 잘라. </li></ol></li><li> 다음과 같이 변경하여, 단계 2.3-2.6에 설명 된대로 인수를 설정합니다. <ol><li> 철저하게 분무기 플라스틱 저장 용기를 세척 한 후, 대신에 트리 에틸 아민의 물 (NH 4) 2 용액 세륨 (NO 3) (6) (25 밀리미터)로 채운다. 참고 : 그것은 철저하게 결정화 때문에, 모든 사용 후 분무기 노즐을 세척하는 것이 중요하다 (NH 4) 2 세륨 (NO 3) 6 여러 사용 후 스프레이 노즐을 파괴 할 수있다. </li></ol></li><li> 이미지에 대한 전체 동물 또는 기관 샘플을 사용합니다. <ol><li> 전체 복부 이미징 카메라와 악기의이면 가리키는 헤드 대향 개방 복부와 마우스 커스 위치. 기관을 중심으로하는 녹색 빛 상자 십자선에 (예를 들어, 간 또는 신장)을 이미지화한다. </li><li> 에프또는 기관 이미징 및 정량 각각의 촬상 기기에서 마우스를 제거하고 아래에 핀. 이미 개방 체강부터 내부 기관 (예, 신장, 간, 폐, 근육, 비장, 뇌 및 심장)을 절제. 근육 조직을 절제하기 위해 뒷다리 피부를 잘라. 조심스럽게 뇌를 절제하기 위해 메스로 두개골을 엽니 다. <ol><li> 관심있는 기관은 간, 신장, 비장 인 경우, 길이 방향으로 절반의 모든 장기를 잘라 배양 접시 또는 검은 건설 용지의 조각에 각 기관을 배치합니다. </li></ol></li><li> 단일 기관에 대한 화학 발광 추적의 상대적 방출을 설정하는 단계 2.3-2.6에 설명 된 절차를 따르십시오. </li></ol></li></ol> 림프절 4. 생체 내 이미징 <ol><li> [(RU BPY) 3] Cl2를 80 nmol의 PBS를 함유하는 용액 10 μL를 준비한다. 의 수용액 (NH 4) 2 세륨을 준비 (NO 3) 6 워싱턴에서동시에 터 (25 mm)이다. </li><li> subdermally 건강한 쥐의 뒷발에 용액 10 μL를 주입 (N = 5). 음성 대조군으로, 순수한 PBS 10 μL와 반대쪽의 발을 주입. 주입 후 CO 2 질식을 통해 15 분 생쥐를 희생. 오금 림프절까지 림프 운하를 노출 모두 뒷 다리에 피부를 제거합니다. </li><li> 단계 3.4에 설명 된대로 인수를 설정합니다. </li><li> 양쪽 뒷다리에서 오금 림프절을 제거 절반을 절단하고 정량화하기위한 목적으로, (단계 3.5.3) 이전에 설명한 바와 같이, 페트리 접시에서 산화제로 스프레이. </li></ol>

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여기서는 광학적 화학 발광 리포터에 의해 생성 된 광자의 방출을 통해 조직을 서술 할 수있는 기술을 제안 하였다. 다른 대조적으로, 더 많은 화학 발광이 리포터 시스템은 비 방사성 매우 높은 민감도 수준에서 검출을 용이하게하는 이미징 프로브를 이용하는, 기술, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 설립. 아마도 더 중요한 것은, 화학 발광 이미징 (광 형광 이미징처럼) 입사 광원 (20), 형광도를 최소화 대폭 배경 신호를 감소시키는 특성을 요구하지 않는다. 루테늄 기자 [Ru로 (BPY)...

최근 수십 년 동안, 이미징 기술은 의사들이 질병을 진단하고 모니터하는 방식을 혁명을 일으켰다. 이러한 영상 기술은, 그러나, 양전자 방출 단층 촬영 (PET), 단일 광자 방출 전산화 단층 촬영 (SPECT), 컴퓨터 단층 촬영 (CT) 및 자기 공명 영상 (MRI) 등의 전신 이미징 시스템에 크게 제한되어왔다. 특별한주의를 암에 지불 된, 기술 이미징 혁신은 크게이 질병 진단 및 치료하는 방식을 개선했습니다. 수술실 이러한 발전에도 불구하고, 이러한 영상 기술 단지에 맞지 않는 한 곳이있다. 전신 이미징 기술 수술 계획에 도움을 줄 수 있지만, 그들은 일반적으로 종양 조직을 모두 제거되었거나 잔류 종양 조직을 절제 한 숨겨져 남아 있는지 의사 실시간으로 판별 할 충분히 높은 공간 해상도가 부족하다. 더 침윤성는 것을 확인종양 마진이 남긴 가장 중요한 수술의 목표 중 하나이며, 외과 의사는 엄격하고 신중 조직 절제술 사이에 꽉 밧줄을 걸어 가야한다. 지나치게 제거하면, 환자에게 부작용이 악화된다; 너무 작은이 제거 된 경우, 재발률은 3이 증가한다. 따라서, 정확한 종양 마진을 묘사하는 것이 중요하며, 우리는 화학 발광 수술 촬상 다르게 설정 기술에 들키지 않고 남아 있었다 악성 조직의 시각화 외과 도와서 종양 마진의 확인의 정확성을 개선하는 데 도움이 될 수 있다고 믿는다. 현재 수술 이미징 시스템으로서의 가능한 유틸리티 조사되고 많은 영상 기술이있다. 이러한 β- 및 γ 방사선 방출 프로브 침 (4), 광 형광 5, 6 라만 분광법을 포함 </sup&gt;, 7, Cherenkov 발광 8,9. 그러나 현재까지 이들 중 어느 것도 표준 임상 도구로 설정되지되고있다. 광 형광 이미징 지금까지 이들 기술 중 가장 유망한 것으로 입증 가장 탐구 그러므로있다. 이미 많은 애플리케이션을위한 유용한 도구로 도시되었지만, 한계가없는 것은 아니다. 실제로, 그 주요한 결점은 본질적 autofluorescent 생체 조직에 의해 생성되는 배경 형광이다. 이 배경 autofluorescent 신호는 형광 신호의 발생을 위해 필요한 외부 광원에 의해 상기 형광 물질 외에, 주변 조직의 여기의 산물이다. 실용적인 관점에서 볼 때,이 형광도 잠재적으로 수술실에서이 기술의 유용성을 제한 할 수있는 낮은 신호 대 잡음비를 초래할 수있다. 교장형광 이미징 위에 화학 발광 이미징의 장점은 여기 광이 필요 없다는 것이다. 그 결과, 배경 형광도 없다. 화학 발광 이미지에서, 여기 에너지 대신에 화학적으로 생성된다. 이 프로세스는 높은 신호대 잡음비가 발생할 수 있으므로 의도하지 않은 배경 신호를 생성하지 않고. 이것은 궁극적으로 절제의보다 정밀하고 정확한 검출 될 수 있습니다. 다소 놀랍게도, 수술 중 영상 기술로이 방법의 유용성은 10 미개척 남아있다. 사실,이 기술에 가장 가까운 예는 마우스 (11), (12, 13)에 마이 엘 로퍼 옥시 다제에 의한 루미놀의 산화이다. 하이와 로우 백그라운드 신호 발생 (1) 최소 자기 형광 : 화학 발광 바이오 메디컬 이미징은 다음과 같은 장점을 제공 할 수있는 연구 오히려 비경 영역 그러므로gher 신호대 잡음비; (2) 표시 상태에서 근적외선 범위 화학 발광 배출량 가변 파장; 및 (3), 링커 기술과 함께 이미 존재하는 생체 분자를 표적으로하는 경우 표적 분자 이미징 프로브 (14)의 전체 라이브러리에 대한 액세스를 제공 functionalizable 화학 발광 착체. 이 원리 증명 연구는 루테늄 계 조영제를 이용한 생의학 속에서 화학 발광 이미징의 전위 유틸리티를 나타낸다. 이 화합물의 화학 발광 특성은 물론 1960 년대 중반 15 거슬러 올라가는 조사와 연구한다. 화학 활성화되면, 에이전트는 의료 촬상 목적에 적합 약 600 nm의 빛 (16)을 생성한다. 활성화 에너지는 여기 상태 물 17 -foll 650 NS의 수명이 리드 산화 환원 반응에 의해 제공된다이 여기 상태의 완화에 광자의 생성에 의해 빚진. 특수하게 설계된 원격 분무기를 사용하여, 우리는 두 화합물이 생체 외 및 생체 내에서 검출 할 수 있었다. 초기 실험 결과는이 기술의 추가 조사를 제안 매우 유망하다.

<table><tbody><tr><td>목재 부분 A (12.5 &times; 2.5 &times; 1.8 cm)</td><td>&nbsp; 3</td><td>/4" x 24" x 30" 자작나무 합판 시트에서 잘라낸</td>Woodcraft <td>131404</td></tr><tr><td>나무 부분 B (12.7 &times; 10.7 &times; 1.8 cm)</td>3<td>/4" x 24" x 30" 자작나무 합판 시트에서 잘라낸</td> <td>Woodcraft</td><td>131404</td></tr><tr><td>C 부분 (11 &times; 2.5 &times; 1.8 cm)</td>3/4" x 24" x 30&에서 잘라낸 <td>Woodcraft</td><td>131404</td><td> 르쿼; 자작나무 합판</td></tr><tr><td>시트 나사 (4 &times; 25 mm)</td><td>Screwfix</td><td>79939</td><td></td></tr><tr><td>Harmon Face Values 3 oz 미니 스프레이어</td><td>침대, 목욕 및 그 너머</td><td></td><td></td></tr><tr><td>스테인레스 스틸 막대 (1/16" 스틸 10cm)</td><td>Metals Depot Int. Inc.</td><td>2192</td><td></td></tr><tr><td>Pencil Classic HB</td><td>Papermate</td><td>58592</td><td></td></tr><tr><td>페이퍼 클립</td><td>Office Depot</td><td>221720</td><td></td></tr><tr><td>스피커 케이블</td><td>RCA Inc.</td><td></td><td></td>AH1650SN</tr><tr><td>에너자이저 9V 알카라인 배터리</td><td>에너자이저 홀딩스 Inc.</td><td>EN22</td><td></td></tr><tr><td>Hitech HS-82MG 마이크로 서보 모터, 3.4kg/cm 출력 토크 @ 6V</td><td>Hitech RCD USA Inc.</td><td>32082S</td><td></td></tr><tr><td>이름</td><td>회사</td><td>카탈로그 번호 코멘트</td><td></td></tr><tr><td>28cm 플라스틱 케이블 타이</td><td>General Electric Inc.</td><td>50725</td><td></td></tr><tr><td>덕트 테이프</td><td>3M Inc.</td><td>3939</td><td></td></tr><tr><td>littleBits w1 와이어</td><td>littleBits Inc.</td><td>w1 와이어</td><td></td></tr><tr><td>littleBits p1 파워</td><td>littleBits Inc.</td><td>p1 파워</td><td></td></tr><tr><td>littleBits i2 토글 스위치</td><td>littleBits Inc.</td><td>i2 토글 스위치</td><td></td></tr><tr><td>littleBits 011 서보</td><td>littleBits Inc.</td><td>011 서보</td><td></td></tr><tr><td>20cm 플라스틱 커버 와이어 트위스트 타이</td><td>Four Star Plastics</td><td>71TIE8000</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2,2&prime;-bipyridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate</td><td>Sigma-Aldrich Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>224758 암모늄 세륨 (IV) 질산염</td><td>시그마 - Aldrich Inc.</td><td>22249</td><td></td></tr><tr><td>이소플루오란</td><td>박스터 헬스케어</td><td>1001936060</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>시그마-알드리치</td><td>PBS1</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>시그마-알드리치</td><td>2854</td><td></td></tr><tr><td>트리에틸아민</td><td>시그마-알드리치 Inc.</td><td>T0886</td><td></td></tr><tr><td>수</td><td></td><td></td><td>질은 Milipore Mili-Q(R&ge; 18 M&Omega;)를 사용하여 정제했습니다.</td></tr><tr><td>여성 누드 (근친 교배) 생쥐</td><td>Jackson Laboratories</td><td>1929</td><td>나이 5 - 6 주</td></tr><tr><td>균주 C57BL/6J&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NU/J 수컷 마우스 at&nbsp;</td><td>Jackson Laboratories</td><td>2019</td><td>age 6 &ndash; 8 주</td></tr><tr><td>IVIS 200 생물 발광 리더</td><td>캘리퍼 라이브 사이언</td><td></td><td></td></tr>스 <tr><td>라이브 이미지 4.2 소프트웨어</td><td>Perkin-Elmer</td><td>128165</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>ThermoScientific</td><td>4951PLUS4</td><td></td></tr></tbody></table>

생물학적 설정에서 생성 및 관측 화학 발광위한 새로운 기술

A Novel Technique for Generating and Observing Chemiluminescence in a Biological Setting

수술 중 영상 기법은 외과적 개입을 보다 안전하고 효과적으로 만들 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 이러한 이유로 이러한 기법은 수술실로 빠르게 도입되고 있습니다. 여기에서는 수술 중 이미징에 대해 아직 연구되지 않은 기술인 화학발광 이미징을 활용하는 새로운 접근 방식을 제시합니다. 이 방법은 맞춤형 분무 시스템과 함께 루테늄 기반 화학발광 리포터를 사용하여 높은 신호 대 잡음비로 생체 외 또는 생체 내 이미지를 생성합니다. 루테늄 기반 리포터는 수성 산화 용액에 노출되고 주변 조직 내에서 재환원된 후 빛을 생성합니다. 이 방법을 통해 6.9 pmol/cm2의 낮은 리포터 농도를 감지할 수 있었습니다. 이 연구에서는 마우스의 피하 및 정맥 주사와 관련된 개념 증명 in vivo 연구에 대한 시각적 가이드를 제시합니다. 결과는 이 기술이 향후 전임상 연구를 위한 유망한 후보이며 궁극적으로 수술실에서 유용한 도구가 될 수 있음을 시사합니다.

프로토콜 제 1 절에서 설명 된 분무기 시스템을 저비용으로 용이하게 이용 가능한 재료로 구성 될 수있다. 원격 트리거 생물 발광 판독기 내부에 환원 / 산화제의 분사 (그림 1)에 대한 삽입 될 것입니다. 우리의 디자인은 렌즈로부터 14cm 거리에서 생물 발광 리더 내에서 분무기의 안전한 작동 할 수 있습니다. 렌즈의 김서림이나 흐려짐이 작동 동안 관찰되지 않았다. 우리는 시판 화학 발광 에이전트 [Ru로 (BPY) 3] 낮은 가격을 기준으로 우리의 방법의 개발을위한 CL 2, 수용액 잘 설명 산화 환원 행동 및 화학 발광 특성의 안정성 (그림 2) (19)를 선택했다. [(RU BPY) 3] (CL)이 (100 μL 한 방울을 산화하여 프로토콜 (2)에 기재된 바와 같이 최소한의 검출 신...

이 프로토콜은 루테늄 복합체를 화학발광 발광원으로 사용하여 생체 내 이미징 중에 높은 신호 대 잡음비를 생성하는 새로운 수술 중 이미징 기술을 설명합니다. 수술 중 영상은 수술 절차가 수행되는 방식에 혁명을 일으킬 수 있는 확장 분야입니다.

Intraoperative imaging techniques have the potential to make surgical interventions safer and more effective; for these reasons, such techniques are ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 신호 대 잡음비 및 검출 한계 측면에서 기존 광학 기술에 비해 이점을 제공할 수 있는 새로운 전임상, 상호 운용, 화학발광 이미징 기술을 제공하는 것입니다. 이 방법은 생물학과 관련된 많은 분야에서 기존 광학 이미징 기술로는 접근할 수 없었던 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 신호 대 잡음비가 높고 순간광이나 방사선이 필요하지 않다는 것입니다.따라서 우리가 발견한 것은 이 기술의 의미가 이 기술이 제공해야 하는 높은 신호 대 잡음 비율 때문에 암을 포함한 여러 질병 상태의 상호 운용성 이미징으로 확장된다는 것입니다. 이 기술에는 입사광이 필요하지 않기 때문에 입사광 흡수에는 문제가 없습니다. 또한, 화학발광 코어 분자를 기능화하는 데 사용할 수 있는 대형 화학 도구 상자가 있습니다.절차를 시작하려면 역삼투압수에 트리스(비피리딘)루테늄(II)클로라이드의 100마이크로리터 표준 용액을 준비합니다. 그런 다음 현미경 슬라이드에서 각 표준물질을 역삼투수에 있는 25밀리몰의 질산암모늄 용액 100마이크로리터와 결합합니다. 생물 발광 리더 이미징 소프트웨어를 열고 초기화를 클릭합니다.이미징 모드에서 발광과 사진은 확인하고 형광은 선택 해제되어 있는지 확인합니다. 발광 노출 시간, 비닝, f/stop 및 방출 필터 매개변수를 설정합니다. 사진 노출 시간, 비닝 및 f/스톱 매개변수를 설정합니다.그런 다음 이미징할 샘플에 따라 피사체 높이를 설정합니다. 카메라와 샘플 스테이지 사이의 거리를 14cm로 설정하기 위해 시야를 B로 설정합니다. 샘플 스테이지의 생물 발광 리더 이미징 챔버 바닥을 검은색 건설 종이로 덮습니다.그런 다음 표준 혼합물 방울이 있는 첫 번째 슬라이드를 샘플 스테이지에 놓고 방울이 녹색 라이트박스 십자선 중앙에 위치하도록 합니다. 다음으로, 맞춤형 분무기의 3온스 스프레이 병에 물과 에탄올을 50/50 용액에 1:3 트리에틸아민 용액으로 채웁니다. 흡인 파이프에 기포가 없는지 확인하십시오.분무기 어셈블리를 이미징 챔버에 놓고 스프레이 노즐이 액적의 카메라 시야를 방해하지 않고 이미징할 액적을 향하도록 합니다. 분무기 전원 스위치와 전원 표시등이 켜져 있고, 자기 토글 스위치가 꺼져 있으며, 전원 분무기와 원격 코드가 엉키지 않았는지 확인합니다. 슬라이드의 표시와 같은 핫스팟을 작은 검은색 시공 용지 조각으로 덮습니다.분무기 원격 코드를 최소 40cm 두께의 이미징 챔버에 배치합니다. 분무기 코드를 압착하지 않고 챔버 도어를 부드럽게 닫습니다. 기기 소프트웨어에서 acquire를 클릭하고 자동 저장을 활성화한 다음 데이터 파일 경로를 설정합니다.이미징 시퀀스를 시작합니다. 딸깍 소리와 함께 셔터가 열리면 분무기 토글을 세 번 전환하여 트리에틸아민 용액을 샘플에 세 번 분사합니다. 각 표준 슬라이드에 대해 절차를 반복하여 루테늄 이미징 에이전트의 최소 검출 가능 농도를 결정합니다.in vivo 이미징 절차를 시작하려면 인산염 완충 식염수에 8-33 나노몰의 트리스(비피리딘)루테늄(II) 클로라이드를 포함하는 용액 100마이크로리터를 준비합니다. 질산암모늄 세륨의 25밀리몰 수용액을 준비합니다. 다음으로, 100마이크로리터의 루테늄 이미징 에이전트를 건강한 마우스의 꼬리 정맥에 정맥 주사합니다.이산화탄소 질식으로 주입 후 10분 후에 마우스를 희생시킵니다. Y컷으로 몸통의 피부를 제거한 다음 늑골 아치를 제거하여 심장과 폐를 노출시킵니다. 우심방의 배출구를 절단하고 24게이지 바늘을 통해 20ml의 PBS를 좌심실에 주입합니다.뱃살을 잘라 신장과 간을 노출시킨다. 관심 기관이 간, 신장 또는 비장인 경우 기관을 통해 눈에 띄는 세로 절단을 만듭니다. 생물 발광 리더 소프트웨어에서 새로운 이미징 시퀀스를 준비합니다.전체 복부 이미징의 경우, 열린 복부가 카메라를 향하고 머리가 기기 뒤쪽을 향하도록 하여 이미징 챔버에 마우스를 놓습니다. 관심 기관을 녹색 라이트박스 십자선의 중앙에 놓습니다. 분무기 어셈블리에서 스프레이 병과 노즐을 철저히 씻어낸 다음 병에 질산암모늄 세륨 용액을 채웁니다.분무기를 이미징 챔버에 놓고 스프레이 노즐이 이미징 부위를 향하도록 합니다. 카메라가 방해받지 않는지, 코드가 엉키지 않았는지, 원격 코드의 40cm 이상이 챔버에 있는지 확인하십시오. 챔버를 닫고 이미징 시퀀스를 시작합니다.딸깍 소리와 함께 셔터가 열리면 토글을 세 번 전환하여 이미징 부위에 산화제를 세 번 분사합니다. 이미징 후 분무기 어셈블리를 제거하고 스프레이 노즐을 철저히 헹구어 질산암모늄 세륨의 결정화를 방지합니다. 후속 개별 장기 이미징 및 정량화를 위해 기기에서 마우스를 제거하고 열린 체강에서 시작하여 내부 장기를 절제합니다.뒷다리 피부를 잘라 근육 조직 샘플을 절제합니다. 관심 기관이 간인 경우 신장 또는 비장은 장기를 세로로 반으로 자릅니다. 그런 다음 오르간을 페트리 접시나 검은색 건축 종이 조각에 놓습니다.전체 동물과 동일한 방식으로 각 기관을 이미지화하고 각 시퀀스 후에 스프레이 노즐을 헹굽니다. 이 절차에서는 마우스에 루테늄 기반 이미징 에이전트를 주입하고 관심 조직에 산화제를 분사하여 화학발광을 유도했습니다. 이미징 에이전트의 최소 검출 가능 농도는 이러한 조건에서 제곱센티미터당 6.9피코몰로 결정되었습니다.백색광의 화학발광(Chemiluminescence) 관심 기관의 이미지는 생물 발광 판독기를 사용하여 얻었습니다. 화학발광 신호는 정맥 주사 후 신장에서 주로 관찰되었으며, 이는 친수성 트리스(비피리딘)루테늄(II)양이온의 신장 제거를 나타냅니다. 이미징 에이전트와 PBS 단독의 신호 대 잡음비는 신장에서 27:1, 간에서 21:1이었습니다.마우스 슬와골 림프절은 또한 루테늄 기반 이미징 에이전트의 보다 농축된 용액의 피하 주사로 평가되었습니다. 이미징 에이전트를 포함하는 림프절은 PBS만 포함하는 림프절보다 훨씬 더 큰 광도를 보였습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 두 시간 안에 완료할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 주변광을 차단하고 루테늄 트리스 bpy로 인한 오염을 방지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 개발 후 이 기술은 생체 분자 이미징 분야의 연구원들이 생쥐의 암과 같은 질병 상태를 탐구할 수 있는 길을 열 것입니다. 이 방법은 기존 광학 이미징 기술로는 접근할 수 없었던 질문에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 기존 기술로 조사할 수 있는 모든 질문은 잠재적으로 화학발광으로 해결할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

생활 동물 세균성 감염의 bioluminescence 이미징을위한 방법은 설명되어 있습니다. 병원균은 살아있는 동물에 감염 광학 온 몸이 이미징을 허용 루시페라제 표현을 수정합니다. 동물 모델은 루시페라제 표현 병원균에 감염과 질병의 발생 과정은 bioluminescence 이미징에 의해 실시간으로 시각하실 수 있습니다.

마우스의 이미지 세균 감염에 루시페라제를 사용하여

여기 우리는 그들의 성장과 전이 동안 전이성 유방암 세포에 표현 반딧불과 renilla 루시 페라 제 효소 모두의 발광 생물 반응을 구축 시각화 및 정량화 할 수있는 방법을...

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생체발광-루시퍼라제 효소에 의해 방출되는 광은 소분자 기질인 루시페린-광감각 단백질을 활성화시키기 위해 이용될 수 있고, 이로써 광 자극에 또 다른 차원을 추가하고 시간적 및 공간적 스케일에 걸쳐 세포에서 다수의 광-매개 기능의 조작을 가능하게 한다.

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생물학적 설정에서 생성 및 관측 화학 발광위한 새로운 기술

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