Name: 기능 유전체학에게 검사를 활용하여 암 세포 회전 타원체 문화에 잠재적으로 소설 약 표적을 식별하는 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: 배우세요 siRNA 스크리닝을 활용한 암 세포 회전 타원체 배양에서 유전자 침묵 효과를 분석하는 방법을. 이 기술은 새로운 약물 표적을 식별하고 생리학적으로 관련성 높은 환경에서 유전자 기능을 연구하는 데 활용됩니다.

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저자는 현미경 검사에 도움을 준 Fredrik Walberg(FACS 및 이미징 시설, ICR)에게 감사의 뜻을 전합니다. 이 작업은 Breast Cancer Now의 자금 지원을 받았습니다. RN은 Breast Cancer Now Career Development Fellowship(2011MaySF01)을 수상했습니다.

96 웰의 siRNA 플레이트 1. 준비 참고 : 96 웰 플레이트의 바깥 가장자리 따라서 60 96 웰 플레이트 당 siRNA의 양을 제한하는 다른 웰에 비해 증착 더 쉽다. 이를 제한하는 일반 매체 또는 PBS와 외부 우물를 입력합니다. 또한, 히트 확인 화면이 판 편견을 완화하는 것이 좋습니다. <ol><li> 초저 부착 판의 해당 우물에 500 NG / (제조업체의 권장 사항에 따라) 감소 혈청 배지에서 μL와 나누어지는 10 μL를 - (250)에 siRNA를 희석. 세중의 모든 화면을 수행합니다. 참고 : 형질 전환 효율이 평가 될 수 있도록 플레이트 디자인에 적합한 비 대상 (음) (예 : UBB와 PLK1로, 긍정적 인) 죽이고 siRNA의 컨트롤을 통합. 세포가 형질 전환 혼합물에 첨가되는 바와 같이 siRNA의 작업 둘러 장착 플레이트의 사용은 중요하다. 우리는 배제 할 수없는 일부 제조 업체 초저 첨부 파일플레이트는 회전 타원체 성장에 미묘한 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 우리는 이러한 최종 사용자가 테스트하는 것이 좋습니다. </li><li> -20 ° C에서 접착 밀봉 저장과 커버 플레이트. </li></ol> 세포주의 2 역 형질 <ol><li> 화면의 날에, 실온에서 해동 판 및 벤치 탑 원심 분리기를 이용하여 1,000 XG에서 5 분 동안 회전. 각 잘 멀티 채널 피펫을 사용하여 최적화 된 형질 시약을 포함하는 감소 된 혈청 배지 10 μL를 추가합니다. 형성의 siRNA를 포함하는 형질 단지 15 분 동안 접시를 남겨주세요. 참고 : 본 연구 (10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 항생제가 보충 된 DMEM 고 글루코스 배양 (둘 베코 변형 이글 배지)) 기능 유전체학 스크리닝 유방암 세포주 BT474를 이용했다. </li><li> 선별 된되는 세포 (0.05 % 트립신 및 0.53 mM의 EDTA)들이 플라스크에서 분리 될 때까지 세포주과 특이 적절한 양을 사용하여 중화를를 Trypsinize벤치 탑 원심 분리기에 IC 매체와 1,000 XG에 5 분 스핀 트립신을 제거합니다. 매체의 적절한 부피의 세포를 재현 탁하고 세포 계수기를 사용하여 정확한 세포 수를 결정한다. 참고 : 일반적으로 잘 5,000 세포 검사 대부분의 세포 라인에 걸쳐 회전 타원체 형성에 충분하다. 정확하게 정확한 크기 비교를 위해 단일 세포 현탁액으로 세포 수를 계산하는 것이 중요하다. </li><li> 차가운 매체 (4 °에 C) 180 μL 당 5,000 세포에 세포를 희석. 주 : 재구성 기저막 매트릭스 성분의 첨가에 부정적인 형질 감염 효율에 영향을 미칠 것이며, 그것을 사용하지 않는 것이 좋다. 세포주 최적화 타원체 형성 능력을 확인하고 녹다운 효과가 화면에 앞서 수행되어야한다. </li><li> 저수지에 세포 현탁액을 전송, 피펫 믹스와의 siRNA는 (2.1) 이전에 준비가 포함 된 96 웰 매우 낮은 부착 판의 각 웰에 180 μL를 추가합니다. </li><li> Centrifug전자 10 분을위한 미리 냉각 된 4 ° C 원심 분리기 1000 XG에 판 다음은 37 ° C 조직 문화 인큐베이터로 돌아갑니다. </li><li> 참고 : 세포가 우물의 바닥에 모자이크로 표시됩니다. 향후 12 이상 - 24 시간 세포는 하나의 영역을 형성하기 위해 함께 집계됩니다. </li><li> 24 시간 후, 세포가 웰의 중앙에 하나의 타원체를 형성 관찰한다. 성장을 촉진하기 위해 각 웰에 전체 매체의 100 μL를 추가합니다. </li><li> 삼일 후 매체를 보충. 부드럽게 잘 각에서 매체의 100 μL를 제거하고 신선한 매체의 100 μL를 추가합니다. </li><li> 7 일째, 정량적 시간 경과 타원체 성장을 모니터링 할 수있는 플레이트 리더의 자동 회전 타원체의 크기를 정량화 (섹션 3 참조). </li><li> 그 후, 발광 세포 생존 염료를 (제 4 장 참조)을 사용하여 세포 생존을 결정합니다. </li></ol> 3. 자동 이미지 인식 <ol><li> 사이토 7 일에 벤치 탑, 마이크로 웰 플레이트 영상에 번호판을 검사합니다. <ol> &lt;, 96 - 음 판 &#39;적절한 플레이트 유형을 선택하고 실험의 이름을 입력 : 리&gt; 다음을 선택, 소프트웨어를 엽니 다. 주 : 추가 정보는 소프트웨어에 추가 할 수 있습니다. </li><li> &#39;Tumorsphere&#39;응용 프로그램을 선택합니다. 회전 타원체 초점이 최적의 콘트라스트를 갖도록 초점을 변경합니다. 참고 : 우리는 &#39;이미지 기반의 초점을&#39;예상되는 회전 타원체 크기로 상당한 변화를 권장합니다. </li><li> 스캔 및 &#39;시작 스캔&#39;을 필요로 우물을 선택합니다. </li><li> 평판 스캐너 소프트웨어를 이용하여 객체 마스크를 정확하게 회전 타원체의 크기를 나타내는 것을 보장한다. 식민지 직경, 국경의 팽창, 최소 두께 및 정밀 설정을 조정하여이 작업을 수행, 각 셀 라인에 특정는 11, 12을 테스트했다. 주 : 구형 영역은 소프트웨어 알고리즘을 사용하여 계산한다. 예를 들어, 정확하게 &#39;하이&#39;는로 정밀도를 조정 이레 동안 성장 BT474의 타원체의 면적을 계산d를 200 μM로 최소 식민지 직경을 설정합니다. 이는 구형 영역의 적절한 회전 타원체 마스크 대표를 생산한다. 주의 : 이러한 데이터는 다음 주석 된 데이터 파일 형태로 내보내기 기능을 이용하여, 컴퓨터에서 반출 될 수있다. 날짜 판 중간 표준화, 통합 및 회전 타원체 지역에 통계적으로 유의 한 영향을 미치지 된 siRNA를 확인하기 위해 분석 중 Z 점수 또는 엄격하게 표준화 된 평균 차이 (SSMD)에 있습니다. </li></ol></li></ol> 4. 세포 생존 확인 <ol><li> 구형 영역이 계산 된 후, 발광 생존 세포 염색을 이용 가능성을 결정한다. 제조업체의 지침에 따라 시약을 준비합니다. </li><li> 조심스럽게 각 웰로부터 매체의 100 μL를 제거하고 생존 염료의 100 μL를 추가합니다. 15 분 후, 플레이트 발광 플레이트 판독기를 사용하여 스캔 부화. 참고 :이 데이터는 다음의에서, 내보내기 기능을 사용하여 컴퓨터에서 내보낼 수 있습니다주석 데이터 파일의 형태. 날짜 판 중간 표준화, 통합 및 회전 타원체 생존에 통계적으로 유의 한 영향을 미치지 된 siRNA를 확인하기 위해 분석 중 Z 점수 또는 엄격하게 표준화 된 평균 차이 (SSMD)에 있습니다. </li></ol>

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오픈 액세스 수수료는 Nexcelom Bioscience, LLC에서 지원했습니다.

암의 3 차원 모델을 더욱 선택적으로 암세포를 죽이기 위해 설계되었다 공지 및 신규 화합물의 효능을 평가하기 위해 이용되고있다. 암세포 타원체 따라서, 3 차원의 효능을 증가 화합물을 생체에 영향을 미칠 가능성이 생체 내 종양에서 발견 된 것과 더 유사한 조건을 표시하는 구조이다. 그러나, 이러한 양상은 암 치료에 상당한 효과를 가질 수있는 약물 설계의 대상이되지 않은 잠재적으로 새로운 타겟들의 식별을 허용하지 않는다. 우리는 암 세포주 타원체에서 최대 7 일 동안 내구성 유전자 침묵 허용 siRNA의 기능 유전체학 접근 방식을 개발했다. siRNA를 화면이 수행되기 전에 최적화를 요구하는 프로토콜 몇몇 중요한 단계가있다. 대규모로 재현 가능한 타원체를 형성 할 수있는 능력은 필수적이다. 또한,ppropriate 형질 전환 조건은 엄격하게 최적화되어야한다. 우리는 적절한 비 타겟팅 여러 가지 형질 전환 시약을 시운전하고 화면을 시도하기 전에 컨트롤을 죽이는 것이 좋습니다. 우리는 MCF10DCIS.com, MDA-MB-231 JIMT1은 siRNA를 형질 의무가 있었다 즉 BT474이 일반적으로 사용되는 여러 유방암 세포주를 표시 할 수 있었다. 또한, 우리는 원리 증명 BT474의 타원체에 유방암에서 200 가장 자주 돌연변이 유전자를 선별 데이터를 제공, HER2의 증폭 및 PIK3CA의 발암 돌연변이에 대한 자신의 의존성을 확인했다. 흥미롭게도, 전사 인자 FOXO3의 침묵은 회전 타원체 크기의 감소하지만 생존에 큰 영향 귀착되었다. FOXO3는 그들의 환경 (16)에 더 쉽게 적응할 수 있도록 암 세포의 신진 대사 능력을 변경하는 저산소증에 대한 반응을 조절하는 것으로 알려져있다. 이 ATP의 풍요 로움을 감지하는이 역할은 잠재적으로 세포 생존 판독을 방해 할 수세포 대사의 주요 제품 중 하나. 회전 타원체 소형화 관찰 지원에서는, 헬라에 FOXO3의 침묵은 종양 성장을 손상과 세포 사멸을 유도 17 이종 나타났다. 어떤 유전자 가양 초래할 수 그들의 3 차원 구조를 유지하기 위해 암 세포의 능력에 영향을 미칠 수 있다는 점이다. 예를 들어, E-cadherin의의 최저은 BT474의 회전 타원체 구조의 용해 결과. 이것은 이전에 E-cadherin의 항체 (18)를 대상으로 사용하여보고했다. 모든 선별 플랫폼과 같이, 잠재적 인 타겟이 관찰 결과의 재현성을 평가하기 rescreened한다. 이 기술은 siRNA의 중재 유전자 최저, 즉 과도 특성에 제한이 있습니다. 침묵 지속 이상 칠일은 siRNA를 함께 달성하지 않았다. 이 방법의 장점은 여러 가지 다른 바이 옴과 결합 될 수 있다는⚻에 정해진 염료뿐만 아니라 구형 저산소증의 공간 정보를 제공 또는 아폽토시스를받은 셀을 모니터링, 예를 들면, 회전 타원체의 생존력을 평가 것과. 플레이트 판독기 스캔 비교적 빠르고 비파괴 때문에 또한, 구형의 크기 된 siRNA의 영향은 시간이 지남보다는 실험 종료 시점에서 평가 될 수있다. 사실, 우리는 현재 우리의 심사 파이프 라인 내에서 이러한 도로의 몇몇을 모색하고 있습니다. 새로운 종속성을 식별하기 위해 3 차원 배양을 이용하는 다른 방법은 대상 또는 단백질의 특정 패밀리의 넓은 범위를 억제하는 화학 라이브러리의 사용이다. 사실, Bitler 등. 난소 투명 세포 암종 19 ARID1A 상태 및 EZH2 저해제의 합성 사멸 작용을 확인하는 방법이 타겟을 이용했다. CRISPR-Cas9 유전자 편집 기술의 발견은 organoid 배양 물 및 생체 내에서의 유전자 스크린의 개발이 허용되었다. 그러나, t그의 접근 방식은 적절한 동물 시설을 가지고에 의존하고 20 금지 비용이 될 수있다. 결론적으로, 우리는 우리가 프로토콜을 설명했다고 생각이 더 정확하게 모델 소설 암 대상 또는 설립 목표의 강력한 검증의 식별을 허용 생체 내 종양 미세 환경의 특징 인 산소와 영양소 그라디언트. 더욱이, 우리는 프로토콜 타원체를 형성하고, 따라서 통상적으로 높은 처리량의 siRNA 스크린의 암 연구 커뮤니티에서 사용할 수있는 세포주의 임의의 타입에 적용될 수있다.

고형 종양은 성공적으로 환자를 치료할 수있는 상당한 도전 과제를 제시 상당한 임상 학적, 유전 미세 환경 내 종양 얼룩이 표시. 신규를 식별하는 데 사용되는 모델의 대부분은 이러한 치료의 많은 기능을 포함하지 않는 타겟. 실제로, 병원에서 사용되는 현재의 타겟 치료법 2 차원 배양 조건 하에서 성장 암세포에 의존하는 스크리닝 방법을 이용 지난 10 년간 개발되어왔다. 이 같은 수용체 티로신 키나제 억제제와 같은 다양한 성공, 초래되었지만, 이는 암의 더 복잡한 모델이 완전히 생체 내에서 종양을 유도으로부터 전환 할 새로운 치료법의 수를 늘리 요인을 인식하는 데 필요한 것을 알 수 있다는 임상 시험에 대한 전임상 모델. 또한, 이제도 2 차원 배양 시스템에 반영하지 못하는 것을 알 수있다동작 1, 2를 생체 내. 예를 들어, 종양 혈관 저조한에 미세 환경 내에서 산소 및 영양분에 대한 수요가 공급을 능가 같은 높고 낮은 배달 지역 개발한다. 같은 탄산 탈수 효소 IX (CAIX)로 설립 저산소 마커에 대한 종양 부분의 면역 조직 화학 염색에 의해 검출 된 종양에서 낮은 산소 (저산소증)의 존재는, 유방암에 가난한 임상 결과 3,4 따라서 통합 기능 등으로 상관 관계 심사 모델에 저산소증은 생체 내에서 더 효과가있을 것입니다 새로운 약물 표적을 발견하는 우리의 능력을 향상시킬 수있다. 사실, 저산소증을 포함 성공적 대상으로 공격적인 종양은 임상 우선 순위 5입니다. 보다 정확하게 종양 미세 암세포 의해 발생 조건 요소 요점을 되풀이하는 시도 전통적인 2D siRNA를 선별의 변질은 여러 유전자의 동정하게되었다 번째생체 내에서 종양 성장에 중요한 것으로 밝혀졌다. 이러한 낮은 혈청 조건 (6), 저산소 조건 7에서 조합 8에서 수행 기능 유전체학 화면을 포함한다. 낮은 혈청에서 성장 예를 들어, 6 Phosphofructo -2- 아제 / 프 룩토 오스 -2,6- Biphosphatase 4 (PFKFB4) 탄소 입력 당분 조절을 담당하는 단백질의 침묵 만 전이로부터 유래 전립선 암 라인 아폽토시스 유도. 동일한 조건 하에서 정상적인 전립선 세포주 PFKFB4의 침묵은 반면 PFKFB4 고갈 완전히 전립선 암 세포주의 성장은 6 이종 절제 아무런 영향을 미치지 않았다. 유방암 세포주 연장 패널의 모노 카르 복실 트랜스 -4- (MCT4)의 입을 우선적 저산소 조건에서 세포주 성장의 감소를 이끌었다. 이 취약점은 유방암 세포주 직교 이방성의 xenogra에서 생체 내에서 검증 된FTS. 영양 스트레스 조건에서 아마도 가장 현저하게, 아세틸 -CoA 신테 2 (ACSS2) 아세틸 -CoA로 아세트산 변환을 담당하는 효소의 입을 저감 암세포 번호 (저산소 혈청)하지만 정상 배양 조건에서 거의 또는 전혀 영향을 미치지 8. ACSS2의 절제 영양소 구배는 종양 미세 환경 내에서 이러한 영역들에있는 세포가 종양 진행 8에 필수적인 것을 단독으로 존재하지 않는 것이 제안 유방암과 전립선 암 이종 이식편의 성장에 영향. 또한 ACSS2은 종양에서 증가 ACSS2 활성이 바람직하지 않은 조건 하에서 성장을 지원하는 기본 메커니즘이 될 수 있음을 시사하고 교 모세포종, 간세포 암종 9,10 중요한 것으로 밝혀졌다. 종합적으로, 이러한 연구는 생체 내에서 발생하는 조건을 recapitulating와 siRNA의 화면을 수행하는 단계 (G)의 식별을 가능하게 증명암 생존을위한 필수 ENES. 뿐만 아니라 영양소의 스트레스 조건 하에서 2D 암 세포의 성장에 영향을 미치는, 이러한 연구에서 표적 유전자의 결핍 종양 이종 이식 6,8- 관찰되었다 미러링 어떤 암 세포주 타원체의 성장을 억제 하였다. 따라서, 암세포는 타원체 ACSS2 사일런 싱에 대한 민감성을 부여 종양 미세 환경에서 발생하는 조건의 몇몇 함유한다. 실제로 타원체 영양소 구배 (혈중 산소) pH의 변화를 표시, 3 차원 (3D) 세포 - 세포 접촉뿐만 아니라, 세포주기 정지 및 아폽토시스를받은 세포 증식 민첩함의 변화. 이는 괴사 지역의 암 회전 타원체의 존재에 의해 예로, 기능은 기존의 2D 문화에서 찾을 수 없습니다. 암세포 타원체 이미 소분자 억제제를 스크리닝하는 것이 더 중요한 생물학적 모델로 사용되고 있지만, 이것은 화합물의 효능 검증 또는 콤포넌트의 용도 변경을 허용했다unds 원래 다른 질병 (11)을 위해 디자인. 현재 구형 스크리닝 방법은 고 함량으로 높은 처리량의 특정 유전자 파괴의 분석을 허용하지 않는다. 여기서는 처음 설명 암 세포주 타원체 작은 간섭 RNA (siRNA를) 기술을 이용하여 특정 유전자의 의존성을 폭로하는 기능 유전체학 파이프 라인. 우리는 인간의 유방암에서 200 가장 자주 돌연변이 유전자를 대상으로 siRNA를 가진 주문품의 라이브러리를 설계 BT474 유방암 구 상체의 회전 타원체의 크기와 신진 대사 활동에 유전자 결핍의 영향을 평가 하였다. 우리는 견고하고 재현성 ERBB2와 PIK3CA는 3D 문화에서 침묵의 영향을 감지 할 수 있었다. 또한, 우리는 면역 조직 화학 법을 사용 BT474의 타원체의 공간 구조에 대한 유전자 파괴의 효과를 평가할 수있다.

<table><tbody><tr><td>자장가 오</td><td>즈 생명과학</td><td>LL70500&nbsp;</td><td>지질 기반 transfection 시약</td></tr><tr><td>Viromer</td><td>Lipocalyx</td><td>VB-01LB-01</td><td>바이러스 유사 고분자 형질주입 시약</td></tr><tr><td>초저 부착 플레이트</td><td>Corning</td><td>CLS7007</td><td>96 웰 플레이트</td></tr><tr><td>호일 플레이트 씰</td><td>ThermoFisher</td><td>AB-0626</td><td></td></tr><tr><td>발광 세포 생존도 염료</td><td>Promega</td><td>G7570</td><td>CellTitre-Glo</td></tr><tr><td>피펫 팁(200 &#956; L)</td><td>Starlab</td><td>S1111-0806</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁 (10 &#956; L)</td><td>Starlab</td><td>S1111-3800</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁 (1, 000 &#956; L)</td><td>Starlab</td><td>S1122-1830</td><td></td></tr><tr><td>혈청학적 피펫(5mL)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1253.025</td><td></td></tr><tr><td>혈청학적 피펫(10mL)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1254.025</td><td></td></tr><tr><td>혈청학적 피펫(25mL)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1685.020</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 매체</td><td>GIBCO</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 매체</td><td>GIBCO</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>GIBCO</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>페타 소 혈청</td><td>GIBCO</td><td>16140063</td><td></td></tr><tr><td>siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>Cherry picked Library</td><td></td></tr><tr><td>Countess Cell Counter</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Cell counting chamber slides</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10312</td><td></td></tr><tr><td>Celigo S</td><td>Nexcelom</td><td>연락처 회사</td><td></td></tr><tr><td>Victor X5</td><td>Perkin Elmer</td><td>연락처 회사</td><td></td></tr><tr><td>벤치탑 원심 분리기</td><td>다양한</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 반전 명시야 현미경</td><td>Zeiss</td><td>연락처 회사</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 CO2; 인큐베이터</td><td>다양한</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mulitichannel 피펫</td><td>다양한</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

기능 유전체학에게 검사를 활용하여 암 세포 회전 타원체 문화에 잠재적으로 소설 약 표적을 식별하는

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

암 기능 드라이버 이벤트의 식별 새로운 약물 표적의 다음 세대의 발견을위한 암 생물학에 대한 우리의 이해를 발전의 중심과 필수적이다. 그것은 암의 더 복잡한 모델은 생체 내에서 종양을 유도하고 임상 시험에 대한 전임상 모델에서 전환을 새로운 치료법의 효능을 증가 기여 요인을 완벽하게 감사하는 데 필요한 것이 명백 해지고있다. 여기에서 우리는 siRNA의 기능 검사를 실시 할 수 균일하고 재현성 종양 회전 타원체를 생성하는 방법을 제시한다. 이 타원체는 기존의 두 차원 문화에 존재하지 않는 고형 종양에서 발견되는 많은 특성을 표시합니다. 우리는 일반적으로 사용되는 여러 유방암 세포주이 프로토콜 의무가있는 것으로 나타났다. 더욱이, 우리는 원리 증명 유방암 세포주 BT474을 이용하여 데이터를 제공하는, 그 확인포스파티딜 이노시톨 -4,5- biphosphate 3- 키나아제 (PIK3CA)의 상피 세포 성장 인자 수용체 및 HER2의 증폭에 돌연변이 의존성 종양 타원체로 성장 될 때. 마지막으로, 우리는 더 조사하고 면역 조직 화학 염색을 사용하여 이러한 종속성의 공간에 미치는 영향을 확인 할 수 있습니다.

매우 낮은 첨부 파일 96 웰 플레이트의 회전 타원체 분석은보다 쉽게 생체 내 종양에서 발견되는 생리 학적 조건을 되풀이되었습니다 컨텍스트의 잠재적 관련한 종양에 대한 높은 처리량 표현형 평가를 제공합니다. 실제로 암 세포주 BT474 및 MCF10DCIS.com 형태 꽉 구형 구조 (도 1a)와 회전 타원체 부분의 면역 조직 조사 세포 및 핵의 형태에 독특한 공간적 변화를 보였다. 시간이지나면서 이러한 BT474의 타원체와 같은 일부 타원체는 괴사 지역, 공격적인 고형 종양 (그림 1B)의 일반적인 기능을 개발한다. 일부 스페 로이드는 같은 MDA-MB-231 세포주로 괴사 코어를 개발하지만, 역으로 쪼개진 caspsase-3 발현, 세포 사멸의 마커 (그림 1C)와 상관 관계 증식 마커 사료된다에 표시 표시된 변화를하지 않습니다. 그 여러 세포주가 실제로 레셉입니다 설정하려면siRNA를 매개 유전자 침묵의 BT474에 포지티브,, MCF10DCIS.com, MDA-MB-231 JIMT1 세포는 역 칠일에 대한 siRNA를 형질 감염시켰다. 테스트 한 모든 세포주 (도 1D)에 필수적인 유전자 유비퀴틴 B (UBB) 상당히 감소 타원체 생존 침묵 동안 형질 감염 (가짜) 시약 또는 제어 된 siRNA의 형질 감염의 존재는, 구형의 생존에 영향을 미치지 않았다. 우리는 선택되지 않은에서 가장 자주 돌연변이 유전자, ER +, HER2 + 트리플 부정적인 유방암을 포위 인간의 siRNA 라이브러리를 설계했습니다. 이 라이브러리는 MYC, PIK3CA 및 TP53 누구의 기여 발암에 설정되지 않은 것과 알려진 기능의 유전자로 구성되어 있습니다. 스크린은 또한 몇몇 비 - 타겟팅 제어 siRNA를 포함 (컨트롤 # 1, # 2 제어)와 siRNA를 컨트롤 (표 1)을 죽이는 역할 등 PLK1 UBB와 같은 필수 유전자를 타겟팅. 우리는 가슴 canc를 사용하기로 결정했습니다그들은 쉽게 재구성 된 기저막의 첨가없이 회전 타원체로 형성 어 세포주 BT474는 주력 세포주를 확립되고 알려진 게놈 구조를 가진다. 예를 들어, BT474 세포가 에스트로겐 수용체 (ER의 +)에 대한 긍정적 인 TP53 (E285K) 및 PIK3CA (K111N) (13)은 인간 상피 성장 인자 수용체 2 (HER2 +) 및 항구 돌연변이 과발현. 위에서 설명한 프로토콜을 채택, 우리는 충격 유전자 파괴는 siRNA를 역 형질 7 일 (그림 1E) 후 회전 타원체의 크기와 생존에 미친 모니터링. 흥미롭게도, 유전자의 대부분은 구형 영역 또는 생존 (도 2A)에 유의 한 영향을 미치지 않았다. FOXO3, PIK3CA, ERBB2 및 SF3B1의 침묵은 회전 타원체의 크기에서 가장 중요한 재현 감소 결과. 이러한 감소는 ERBB2 및 SF3B1 사일런 후 구형 생존율 관찰되었다. 고무적, 우리는 conf의PIK3CA, ERBB2 및 SF3B1은 명 시야 현미경 (도 2B)를 사용하여 구형의 크기에 침묵의 영향을 irmed. 우리는 이전에 다양한 세포주 모델에 필수적인 유전자로 SF3B1 식별함으로써 siSF3B1는 UBB 14 이외에 좋은 살해 제어를 나타낸다. 흥미롭게도, E-cadherin의 모든 200 유전자의 침묵은 구형의 생존력 (도 2A)이 크게 증가 하였다. 회전 타원체 형태의 조사는 E-cadherin의 침묵이 가능한 세포가 잘 낮은 첨부 파일의 하단에 (그림 2B)을 쉬고, 회전 타원체 아키텍처의 전체 분석 결과 것으로 나타났다. 회전 타원체 체적 화면 데이타 수동 재조사이 때문에 세트 크기 제한되는 상기 오브젝트에 관찰되었다하지만 영역 정량화로부터 제거되었다는 것을 보여 주었다. 앞서 강조된 바와 같이, BT474 세포는 수용체 타이로신 키나아제 및 HER2 과발현에서 발암 돌연변이 항구 PIK3CA (K111N). 우리는 비 대상 컨트롤 형질이 효과 (그림 2C)을 없었다 동안 ERBB2와 PIK3CA의 침묵이 감소 된 회전 타원체 생존 결과 확인했다. 다음으로 구형 조직학 siRNA의 붕괴의 영향을 조사 하였다. BT474의 타원체는 역 비 대상 제어의 siRNA와 siRNA를가 PIK3CA, ERBB2와 UBB을 대상으로 형질 감염시켰다. ERBB2와 UBB의 침묵은 사료된다는 siRNA를 (그림 2D)를 제어에 비해 프로 증식 마커의 감소 결과. 프로 세포 사멸 마커의 활성화는 카스파 제 -3는 세포 사멸을 초래하지 않았다 HER2 및 PIK3CA의 고갈을 제안, UBB 침묵 후에 관찰 아니라 세포 독성보다 세포 증식 억제 하였다 된 절단. 실제로, HER2 및 PIK3CA의 침묵은 형질 타원체 대조군에 비해 세포주기 정지 단백질 p27의 단백질 발현의 증가를 초래했다. 천만에 "FO : 유지-together.within 페이지 ="1 "&gt; 함께 찍은, 이러한 결과는 BT474 세포 종양 HER2 및 PIK3CA 3 차원 회전 타원체로 성장하면 신호에 의해 구동되는 것을 보여 더 중요한 것은, 이러한 결과는가 가능하다는 것을 보여줍니다. 디자인은 견고하고 재현성 암세포 타원체 유전자의 수백 맞춤 siRNA를 선별 라이브러리를 구현한다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54738/54738fig1.jpg"> 그림 1 : 3 차원 성장을위한 세포주 최적화. A. 유방암 세포주는 MCF10DCIS.com BT474 및 7 일 동안 낮은 부착 플레이트에서 배양 하였다. 시야 대표 이미지는 거꾸로 현미경을 사용하여 촬영 하였다. 스케일 바는 100 μm의 =. B. MCF10DCIS.com 및 BT474 회전 타원체 28 일 동안 배양 하였다. 4 일 - 새로운 미디어의 100 μL는 매 3 보충했다. 회전 타원체는 3.8 % 포름 알데히드, 전자에서 수정 된mbedded, 절단 및 헤 마톡 실린 및 에오신 (H &amp; E) 염색. 대표 이미지는 낮은과 높은 배율에 표시됩니다. 스케일 바는 각각 100 μm의 33 μm의를 나타냅니다. C. MDA-MB-231 타원체 21 일 동안 배양 하였다. 4 일 - 새로운 미디어의 100 μL는 매 3 보충했다. 타원체는 3.8 %의 포름 알데히드에 고정 포함, 사료된다으로 구분하고 염색 및 카스파 제 -3을 절단했다. 대표 이미지가 표시됩니다. 스케일 바는 100 μm의 =. D. BT474, MCF10DCIS.com, MDA-MB-231 및 JIMT1 세포주 역방향 모의 (형질 감염 시약 만)와 제어 된 siRNA와 UBB 형질 하였다 초저 부착 플레이트는 타원체를 형성하도록 방사시켰다. 새로운 배지 (100 μL)를 1 일 및 제 7 일 이후에 첨가하고, 세포 생존력을 정량 하였다. 데이터는 # 1를 제어하기 위해 정규화 세중 수행 두 개의 독립적 인 생물 복제의 SD ± 평균을 나타냅니다. 통계적 유의성은 UNPA을 사용하여 계산 하였다IRED 학생 t 테스트 (P &lt;0.05). E. 기능적 암 세포주 타원체 유전자 의존성 심문하는 데 사용되는 역 형질 감염 프로토콜을 요약하는 흐름도. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54738/54738fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54738/54738fig2.jpg"> 그림 2 : BT474 타원체 폭로 암 유전자 종속 기능 게놈 조사. A. BT474 세포 중으로 역에서 200 인간 유전자 siGENOME의 siRNA의 라이브러리로 형질 감염시켰다. 회전 타원체의 크기와 생존이 관찰되었다. 원시 데이터 값은 중간 플레이트 정규화하고, Z 스코어가 1.7보다 크게 특이점 15 중간 플레이트의 표준 편차를 계산 하였다 식별 하였다. 외곽 유전자를 참고 ERBB2, SF3B1, PLK1와 UBB차 E-CAD. 크게 구형 영역과 생존을 증가 또는 감소 된 siRNA는 빨간색 제어의 siRNA의 묘사 곳, 파란색과 빨간색으로 음영 처리됩니다. B. 세포는 역 비 타겟팅 제어, E-cadherin의 (E-CAD), PIK3CA, ERBB2 또는 UBB siRNA를 형질 전환 한 후 회전 타원체를 형성하기 위해 매우 낮은 부착 판에 방사했다. 7 일 후, 대표 회전 타원체의 이미지가 거꾸로 현미경을 사용하여 촬영 한 시야. 스케일 바는 100 μm의 =. C. 세포는 역 비 타겟팅 제어, PIK3CA, ERBB2 또는 UBB siRNA를 형질 전환 한 후 회전 타원체를 형성하기 위해 매우 낮은 부착 판에 방사했다. 7 일 후, 세포 생존율을 정량화 하였다. 데이터는 # 1를 제어하기 위해 정규화 세중 수행 두 개의 독립적 인 생물 복제의 SD ± 평균을 나타냅니다. 통계적 유의성은 부대 학생 t 테스트 (p &lt;0.05)를 사용하여 계산 하였다. D. 7 일 후, 타원체는 고정 포함, 절단 및 염색H &amp; E, 사료된다, 절단 된 카스파 제 3, P27합니다. 대표 이미지가 표시됩니다. 스케일 바는 100 μm의 =. siControl의 회전 타원체의 H &amp; E 인해 염색을 위해 선택 처리 및 개별 그대로 회전 타원체의 인공물에 작게 표시됩니다. 그러나이 스캔 된 이미지 및 세포 생존 결과를 관찰 변경을 손상하지 않습니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54738/54738fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 1 </td><td> 이 </td><td> 삼 </td><td> 4 </td><td> (5) </td><td> 6 </td><td> (7) </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> (10) </td><td> (11) </td><td> (12) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 한 비 - 타겟팅 </td><td> TP53 </td><td> DST </td><td> KMT2C </td><td> 치료 1 </td><td> FCGBP </td><td> ARID1B </td><td> FBXM7 </td><td> TTC40 </td><td> 이 비 - 타겟팅 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> GATA3 </td><td> TTN </td><td> MUC12 </td><td> MUC4 </td><td> AHNAK </td><td> HUWEI1 </td><td> DNAH11 </td><td> ITPR2 </td><td> ABCA13 </td><td> CREBBP </td><td></td></tr><tr><td></td><td> MAP2K4 </td><td> PIK3CA </td><td> F5 </td><td> 형 ApoB </td><td> ANKRD30A </td><td> MUC17 </td><td> DNAH17 </td><td> LAMA2 </td><td> 에이스 </td><td> CSMD2 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> STARD9 </td><td> USH2A </td><td> FAT3 </td><td> LPR2 </td><td> CSMD3 </td><td> MYO18B </td><td> DNAH5 </td><td> MDN1 </td><td> ARHGAP5 </td><td> DNAH9 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> CXCR3 </td><td> MUC16 </td><td> RB1 </td><td> PKHD1L1 </td><td> DNAH2 </td><td> SYNE2 </td><td> DYNC1H1 </td><td> PCLO </td><td> CACNA1B </td><td> ERBB2 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> PLK1 </td><td> SYNE1 </td><td> 촉매제 </td><td> PTEN </td><td> SPTA1 </td><td> 치료 2 </td><td> VHL </td><td> RYR1 </td><td> COL6A3 </td><td> UBB </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 </td><td> 이 </td><td> 삼 </td><td> 4 </td><td> (5) </td><td> 6 </td><td> (7) </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> (10) </td><td> (11) </td><td> (12) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 한 비 - 타겟팅 </td><td> ENAM </td><td> RYR2 </td><td> BRCA2 </td><td> 치료 1 </td><td> FMN2 </td><td> HECW1 </td><td> LAMB4 </td><td> 시 </td><td> 이 비 - 타겟팅 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> FHOD3 </td><td> MACF1 </td><td> RYR3 </td><td> C2ORF16 </td><td> DMD </td><td> FRG1 </td><td> HERC2 </td><td> MYH11 </td><td> STAB1 </td><td> ZDBF2 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> GOLGA6L2 </td><td> 코 </td><td> SMG1 </td><td> CACNA1E </td><td> DNA14 </td><td> GCC2 </td><td> HIVEP2 </td><td> NIPBL </td><td> TANC1 </td><td> ZNF536 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> HMCN1 </td><td> NF1 </td><td> UBR5 </td><td> CACNA1F </td><td> DYNC2H1 </td><td> GON4L </td><td> HYDIN </td><td> PKD1L1 </td><td> TF </td><td> ANK3 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> HRNR </td><td> OBSCN </td><td> USP34 </td><td> CYMA5 </td><td> FAM208B </td><td> GPR112 </td><td> ITSN2 </td><td> RNF213 </td><td> TPR </td><td> ASPM </td><td></td></tr><tr><td></td> PLK1 <td> PCDH15 </td><td> XIRP2 </td><td> COL7A1 </td><td> FLG2 </td><td> 치료 2 </td><td> VHL </td><td> SAGE1 </td><td> UNC80 </td><td> UBB </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 </td><td> 이 </td><td> 삼 </td><td> 4 </td><td> (5) </td><td> 6 </td><td> (7) </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> (10) </td><td> (11) </td><td> (12) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 한 비 - 타겟팅 </td><td> DCHS2 </td><td> MUC5B </td><td> ZFHX4 </td><td> 치료 1 </td><td> MYO9A </td><td> SPHKAP </td><td> CXORF22 </td><td> NCOR1 </td><td> VPS13D </td><td></td></tr><tr><td></td><td atr></td><td> DMXL2 </td><td> MXRA5 </td><td> ANK2 </td><td> KIAA1210 </td><td> PRUNE2 </td><td> TCHH </td><td> DANH6 </td><td> NOTCH2 </td><td> ANKRD12 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> BIRC6 </td><td> DNAH10 </td><td> TENM1 </td><td> ATM </td><td> LRP1 </td><td> SCN10A </td><td> VPS13C </td><td> DNAH7 </td><td> SPEN </td><td> C5ORF42 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> CDH1 </td><td> DNAH3 </td><td> PEG3 </td><td> DIDO1 </td><td> MAP1A </td><td> SCN2A </td><td> IPTR3 </td><td> ERBB3 </td><td> SRRM2 </td><td> CCDC88A </td><td></td></tr><tr><td></td><td> CUBN </td><td> NOCK11 </td><td> RELN </td><td> DNAH8 </td><td> MED12 </td><td> SHROOM2 </td><td> CEP350 </td><td> FAT4 </td><td> SZT2 </td><td> CHD4 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> PLK1 </td><td> EYS </td><td> SACS </td><td> KIAA1109 </td><td> MED13 </td><td> 치료 2 </td><td vhl></td><td> KMT2A </td><td> VPS13A </td><td> UBB </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 </td><td> 이 </td><td> 삼 </td><td> 4 </td><td> (5) </td><td> 6 </td><td> (7) </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> (10) </td><td> (11) </td><td> (12) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 비 타겟팅 </td><td> QSER1 </td><td> ARID1A </td><td> WDFY3 </td><td> 치료 1 </td><td> SDK1 </td><td> TEX15 </td><td> LAMA1 </td><td></td><td> 이 비 - 타겟팅 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> COL14A1 </td><td> SHROOM3 </td><td> ATRX </td><td> EFCAB5 </td><td> SF3B1 </td><td> CBFB </td><td> AHNAK2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> CSMD1 </td><td> TBX3 </td><td> KIAA0947 </td><td> FOXA1 </td><td> ITPR1 </td><td> DDX3X </td><td> KIF4A </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> MEFV </td><td> UBR4 </td><td> MYCBP2 </td><td> INPPL1 </td><td> FLG </td><td> HECTD4 </td><td> FAT2 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> MGAM </td><td> VCAN </td><td> NBEAL1 </td><td> MAP3K1 </td><td> AKAP9 </td><td> GPR98 </td><td> FOXO3 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> PLK1 </td><td> ZNF462 </td><td> SETX </td><td> NRP1 </td><td> HERC1 </td><td> 치료 2 </td><td> VHL </td><td></td><td></td><td> UBB </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> 표 1 : 플레이트 레이아웃 및 인간의 siRNA 라이브러리 드 - 컨볼 루션. 표는 화면에 사용되는 낮은 부착 판에 대한 siRNA를 풀 및 레이아웃 각각의 콘텐츠가 포함되어 있습니다.

전임상 시험에서 인간 대상 시험으로 전환되는 새로운 약물 표적을 식별하는 것은 과학적인 우선 순위입니다. 이를 위해 여기에서는 유전자 고갈이 암 세포주 스페로이드에 미치는 영향을 조사하기 위한 기능적 유전체학 접근 방식을 설명하며, 이는 생체 내에서 인간 암을 보다 적절하게 모델링합니다.

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

이 siRNA 스크리닝 프로토콜의 목표는 유전자 침묵이 암 세포주 스페로이드 성장에 미치는 영향을 조사하는 것입니다. 기존의 2차원 세포 배양 기술과 비교했을 때, 암 스페로이드는 생체 내 종양에서 발생하는 것과 더 유사한 상태를 나타냅니다. 이 방법은 인간 암에서 자주 변경되는 유전자의 기능 평가에 유용하며, 더 중요한 것은 3차원 배양, 특히 저산소증에서 볼 수 있는 것과 같은 보다 복잡한 배양 조건에서 어떤 유전자가 잠재적인 발암유전자 또는 종양 억제자인지 결정하는 데 사용할 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 연구자가 선호하는 세포주에서 관심 있는 특정 유전자를 연구하는 데 사용할 수 있도록 쉽게 적용할 수 있다는 것입니다. 우리는 이것이 현재의 표적 sRNA 스크리닝 접근 방식을 기반으로 한다고 믿습니다. 전체 게놈 균주가 아닌 표적 스크리닝을 통해 과학자들이 특정 질문을 하고 보다 강력한 결과를 생성할 수 있다는 것은 일반적으로 높이 평가됩니다.유전자 침묵이 스페로이드 생존력과 크기에 미치는 영향을 분석했지만, 세포사멸과 같은 다른 화면 판독을 위해 생체 인식 염료를 사용할 수도 있습니다. 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 Patty Wai입니다. 먼저 siRNA 라이브러리가 포함된 96웰 플레이트를 실온에서 해동합니다.그런 다음 벤치 탑 원심 분리기를 사용하여 1, 000 번 g으로 5 분 동안 회전합니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 최적화된 transfection 시약을 함유한 10마이크로리터의 환원된 혈청 배지를 각 플레이트의 well에 추가합니다. siRNA를 함유한 transfection complex가 형성될 수 있도록 15분 동안 배양합니다.여느 스크리닝 파이프라인과 마찬가지로, transfection 조건에서 세포주의 스페로이드 형성 능력은 전체 스크리닝을 수행하기 전에 강력하게 최적화되어야 합니다. 다음으로, 플라스크에서 분리될 때까지 스크리닝할 세포를 트립신화합니다. 세포가 분리되면 적절한 용량의 세포주 특이적 배지로 트립신을 중화하고 원심분리기 튜브로 옮기고 벤치탑 원심분리기에서 1, 000회 g로 5분 동안 회전하여 세포를 수집합니다.상등액을 버리고 펠릿을 적절한 부피의 배지를 가진 단일 세포 현탁액으로 재현탁합니다. 자동화된 세포 계수기를 사용하여 세포 계수를 수행합니다. 다음 5, 찬 매체를 가진 180 마이크로리터 당 000의 세포에 현탁액을 묽게 하십시오.세포 현탁액을 저장소로 옮깁니다. 180마이크로리터로 설정된 멀티채널 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 혼합하고 siRNA가 포함된 96웰 플레이트로 이동합니다. 1, 10 분 동안 미리 냉각된, 4 섭씨 온도 원심 분리기에 있는 1, 000 시간 g에 격판덮개를 원심 분리기, 그 후에 37 섭씨 온도 조직 배양 incubator에 있는 판을 배양하십시오.이 시점에서 세포는 우물 바닥에 모자이크로 나타납니다. 24시간 후 현미경으로 세포를 관찰합니다. 이 시점에서 세포는 웰 중앙에 단일 스페로이드를 형성하기 위해 함께 응집되어야 합니다.인큐베이터로 돌아가기 전에 성장을 촉진하기 위해 각 웰에 100마이크로리터의 완전한 배지를 추가합니다. 3일 동안 자란 후 각 웰에서 100마이크로리터의 배지를 부드럽게 제거하고 100마이크로리터의 새 배지를 추가합니다. 7일째에는 현미경으로 스페로이드를 검사한 다음 시간 경과에 따른 스페로이드 성장을 정량적으로 모니터링할 수 있는 플레이트 리더에서 스페로이드 크기를 정량화합니다.스페로이드 크기를 정량화하려면 먼저 컴퓨터에서 소프트웨어를 엽니다. 96웰 플레이트를 선택하고 적절한 플레이트 유형을 선택한 다음 실험 이름을 입력합니다. 그런 다음 스페로이드가 포함된 96웰 플레이트를 벤치탑, 마이크로 웰 플레이트 이미징 세포분석기에 삽입합니다.그런 다음 Tumorsphere 애플리케이션을 선택합니다. 이미지 기반 초점을 선택하여 스페로이드에 초점이 맞춰지고 최적의 대비를 갖도록 초점을 변경합니다. 스캔이 필요한 웰을 선택하고 스캔을 시작합니다.다음으로, 개체 마스크가 스페로이드 크기를 정확하게 나타내는지 확인합니다. 7일 동안 성장한 BT474 스페로이드의 경우 정밀도를 높음으로 조정하고 최소 콜로니 직경을 200미크론으로 설정합니다. Export 기능을 사용하여 스페로이드 영역에 통계적으로 유의미한 영향을 미치는 siRNA를 식별하기 위해 분석될 주석이 달린 데이터 파일 형태로 데이터를 내보냅니다.이미징 후 각 웰에서 100마이크로리터의 배지를 제거하고 100마이크로리터의 발광 생존도 염료를 추가하여 세포 생존도를 결정합니다. 플레이트를 15분 동안 배양한 후 발광 플레이트 리더를 사용하여 플레이트를 스캔합니다. 이 프로토콜은 다른 암 세포주와 함께 사용하도록 조정될 수도 있습니다.비표적 대조군의 역형질주입 절차는 시험된 어떤 라인의 생존력에도 유의한 영향을 미치지 않은 반면, 양성 세포사멸 대조군인 유비퀴틴 B의 형질주입은 생존능을 유의하게 감소시켰다. BT474 세포를 200개 유전자 Human siGENOME siRNA Library와 3회씩 역형질주입했습니다. 스페로이드 면적 및 생존력이 관찰되었습니다.z-score가 1.7보다 큰 유의한 이상치가 확인되었습니다. 스페로이드 면적과 생존율을 현저히 증가 또는 감소시킨 SiRNA는 파란색으로 음영 처리되며, 빨간색은 대조군 siRNA를 나타냅니다. 이 현미경 사진 세트는 비표적 대조군인 E-Cadherin, PIK3CA, ERBB2 또는 SF3B1 siRNA를 사용한 역형질주입 7일 후 BT474 스페로이드의 대표적인 이미지를 보여줍니다.이 히스토그램은 각 siRNA를 사용한 처리가 역transfection 7일 후 세포 생존력에 어떤 영향을 미쳤는지 보여줍니다. ERBB2 및 PIK3CA의 knockdown은 대조군에 비해 세포 생존율을 현저히 감소시켰습니다. 이 이미지는 스페로이드가 성공적으로 면역 염색되어 표적 단백질에 대한 유전자 침묵의 영향을 밝힐 수 있음을 보여줍니다.일단 마스터하면 하루에 여러 세포주에서 수백 개의 유전자를 스크리닝할 수 있으며, 이를 통해 3차원 배양에서 생존에 중요한 잠재적으로 새로운 유전자를 강력하게 식별할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 sRNA 매개 유전자 침묵에 적합한 암세포 스페로이드를 성공적으로 배양하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 또한 스페로이드에 대한 면역조직화학(immunohistochemistry)을 수행하여 유전자 침묵(gene silencing)의 영향을 조사할 수 있습니다.이것은 기본 생물학을 알려줄 수 있는 귀중한 공간 정보를 제공할 수 있습니다.

utilizing-functional-genomics-screening-to-identify-potentially-novel

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

수성 2상 시스템을 사용하여 고처리량 96웰 플레이트 형식으로 암세포 스페로이드를 로봇 프린팅하기 위한 프로토콜이 제시됩니다.

약물 테스트를위한 수성 2 단계 시스템으로 암 세포 타원체의 로봇 생산

여기, 췌장암 세포 및 섬유 아 세포, 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 대사 기능을 측정 하 여 다음의 3 차원 (3D) 회전 타원 체 공동 문화의 준비에 대 한 메서드를 설명 합니다.

준비 및 췌장암 세포 및 섬유 아 세포의 3 차원 회전 타원 체 공동 문화의 변화 분석 결과

다양 한 질병의 표시 더 순수 관련 모델 개발 및 구현에 약물 발견 프로그램 되. 여기에 설명 된 새로운 모델 시스템 spheroids를 경작 하 고 종양학 신약에 대 한 검색 하는 높은 처리량 1536-잘 접시 기반 시스템에서 상영 될 수 방법을 3 차원 종양을 보여 줍니다.

마약 검사에 대 한 높은 처리량 3 차원 종양 Spheroids의 생성

이 프로토콜은 약물 을 평가하기 위해 증식, 세포 독성 테스트, 유세포 분석, 면역 형광 염색 및 공초점 이미징의 정량화를 포함한 환자 유래 스페로이드 생성 및 하류 분석을 설명합니다. 반대로 신생물 치료제로 후보자의 잠재력. 이 프로토콜은 각 환자 및 질병 단계에 대한 특정 약물을 식별하여 정밀 의학을 지원합니다.

암 줄기 세포를 표적으로 하는 반대로 신 생물 성 약 검열을 위한 생리학 환자 파생된 3D Spheroids

여기에서, 우리는 2D 문화 보다는 생체 내 종양의 물리 화학 구배를 모방하는 3D 암 세포 스페로이드에 있는 생존과 죽음을 평가하기 위한 몇몇 간단한 방법을 제시합니다. 따라서 스페로이드 모델은 생체 내 조건으로의 번역을 개선하여 암 약물 효능의 평가를 허용합니다.

암세포의 3D 스페로이드 배양에서 세포 생존력과 사망 평가

현재 프로토콜은 원발성 암세포에서 3D 종양 배양 모델을 생성하고 세포 생존력 분석 및 현미경 검사를 사용하여 약물에 대한 민감도를 평가하는 것을 설명합니다.

환자 유래 종양 샘플에서 3차원 스페로이드 설정 및 약물에 대한 민감도 평가

재현성이 높은 스페로이드를 성장시키고 이미지 캡처 및 단백질체학을 사용하여 표현형 특성을 분석하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

기능적 3D 스페로이드 세포 배양의 반자동 표현형 분석

이 글에서는 3차원 종양 스페로이드를 구성하기 위한 표준화된 방법을 보여줍니다. 자동화된 이미징 시스템을 사용한 스페로이드 관찰 및 이미지 기반 딥러닝 분석을 위한 전략도 설명합니다.

약물 평가 연구를 위한 3D 종양 스페로이드 생성

우리는 유전자 조작 마우스 모델에서 발생하는 종양과 해당 인간 종양 유형에서 발생하는 종양의 치료 표적을 식별하고 비교하기 위해 게놈 분석 및 기능적 게놈 스크리닝을 활용하는 종간 비교 종양유전체학 접근 방식을 개발했습니다.

악성 말초 신경초 종양의 마우스 모델에서 치료 표적을 식별하기 위한 유전자 프로파일링 및 게놈 규모 드롭아웃 스크리닝

여기에서 우리는 세포외 플럭스 분석을 통해 3차원(3D) 신경아교종 스페로이드와 이미징 기반 정규화를 통합하는 대사 프로파일링 플랫폼을 구축합니다. 이 접근법을 통해 약물 치료에 대한 종양 대사 반응을 보다 정확하게 평가할 수 있으며 잠재적인 내성 메커니즘에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

약물 스크리닝을 위한 3차원 뇌종양 스페로이드의 대사 프로파일링의 발전

배우세요 siRNA 스크리닝을 활용한 암 세포 회전 타원체 배양에서 유전자 침묵 효과를 분석하는 방법을. 이 기술은 새로운 약물 표적을 식별하고 생리학적으로 관련성 높은 환경에서 유전자 기능을 연구하는 데 활용됩니다.

기능 유전체학에게 검사를 활용하여 암 세포 회전 타원체 문화에 잠재적으로 소설 약 표적을 식별하는

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