셀 모양 변경 허가 및 세포 운동에서의 영상 초파리 낭배 사용 DE-cadherin의 기자 형질 전환의 파리
2016년 12월 29일
여기에서는 초파리 위장 형성의 실시간 이미지를 캡처하는 절차를 설명합니다. 이를 통해 초기 발달과 관련된 정점 수축을 더 잘 이해하고 조직 구조 변형 중 세포 움직임을 제어하는 메커니즘을 더 자세히 분석할 수 있었습니다.
이 절차의 전반적인 목표는 초파리 위형성 중 세포의 모양과 움직임을 더 잘 이해하는 것입니다. 여기에서 우리는 배아 발달의 이 단계에서 형태 유전학적 세포 이동의 시작을 분석하기 위해 Drosophila gastrulation의 강력한 측정 방법을 제공합니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 배변화 시 세포 재배치가 배가형성 중 정점 수축과 함께 확인될 수 있다는 것입니다.
실험을 시작하려면 375 밀리리터의 물 혼합물을 준비하십시오. 125 밀리리터 100 % 상업적으로 이용 가능한 사과 주스. 한천 12.5 그램.
포도당 12.5g. 다음으로, 한천이 녹을 때까지 혼합물을 전자 레인지에서 가열합니다. 그리고 3cm 세포 배양 접시에 붓습니다.
나중에 사용할 수 있도록 혼합물을 섭씨 4도에서 보관하십시오. 사과 접시를 준비한 후 그 위에 반죽한 효모 페이스트를 얇게 바르면 파리가 알을 낳을 수 있습니다. 25마리의 수파리와 25마리의 암컷 파리를 반죽한 효모로 덮인 사과 접시에 담긴 병에 담습니다.
플라스틱 초파리 스톡 병을 알루미늄 호일로 싸서 파리가 더 많은 알을 낳도록 합니다. 젖병을 거꾸로 뒤집어 인큐베이터에 하룻밤 동안 보관하십시오. 다음날 아침, 사과 주스 플레이트를 새 것으로 교체하십시오.
그런 다음 병을 알루미늄 호일로 싸서 파리가 3-4시간 동안 알을 낳도록 합니다. 파리가 알을 낳은 후 면봉으로 접시에서 알을 풀어줍니다. 배아를 여과기에 모으고 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척합니다.
12웰 배양 접시에서 PBS로 배아를 세 번 더 씻습니다. 12-well culture 접시에 50% 표백제로 배아를 Dechorionate합니다. 탈착 과정에 따라 PBS로 배아를 세 번 더 씻습니다.
PBS가 들어있는 3cm 세포 배양 접시에 배아를 옮깁니다. 그리고 현미경으로 5단계 배아를 선택하는데, 배아 경계선의 투명도 수준에 따라 배아를 선택합니다. 200마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 병기 결정된 배아를 수집합니다.
다음으로, 선택한 두 개의 배아를 유리 커버 슬립에 놓고 티슈 페이퍼로 여분의 PBS를 제거합니다. 미세하게 꼬인 티슈 페이퍼를 사용하여 배아의 등쪽을 커버 슬립까지 향하게 합니다. 그런 다음 배아를 유리 덮개에 부착하고 가는 바늘을 사용하여 실리콘 그리스를 묻힙니다.
배아에 속이 빈 탄소 오일 700을 작은 방울 떨어뜨리고 배아가 들어있는 커버 슬립을 움푹 들어간 슬라이드에 거꾸로 놓습니다. 슬라이드 아래쪽에 약간의 공간을 남겨 둡니다. 그런 다음 커버 슬립을 슬라이드에 붙입니다.
마지막으로, 컨포칼 이미징 시스템, 아르곤 488 레이저 및 오일 이멀젼 대물렌즈를 사용하여 배아를 검사합니다. 저속 촬영 이미지는 500초 동안 세포 이동의 DE-cadherin GFP를 사용하여 라이브 이미징에서 캡처하여 개별 세포의 정점 영역, 위장 형성 중 초파리를 분석했습니다. 500초가 되면 정점 수축과 침습이 명확하게 보입니다.
우리의 방법을 사용하여. 우리는 Drosophila gastrulation의 분자 메커니즘뿐만 아니라 암 전이에 관여하는 상피에서 중간엽으로의 전이를 더 이해할 수 있습니다.
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개요
본 논문은 Drosophila 배엽 형성의 실시간 이미지를 캡처하는 절차를 제시하며, 이를 통해 초기 발달 과정 중 정단 수축(apical constriction)에 대한 이해를 높입니다. 이 기술은 조직 구조 수정에 관여하는 세포 운동의 세밀한 분석을 가능하게 합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 발생생물학
- 세포생물학
배경
- 초파리 배아 형성(gastrulation)은 배아 발달의 결정적인 단계입니다.
- 세포의 형태와 움직임을 이해하는 것은 발달 과정을 파악하는 데 필수적입니다.
- 정단 수축(Apical constriction)은 형태 형성 운동에서 중요한 역할을 합니다.
- 실시간 이미징 기술을 통해 역동적인 세포 행동에 대한 통찰을 얻을 수 있습니다.
연구 목적
- Drosophila 배아 형성 과정 중의 세포 이동에 대한 이해를 높이기 위함입니다.
- 형태 형성적 세포 이동을 측정하기 위한 견고한 방법을 개발하기 위함입니다.
- 배아 형성 과정 동안의 세포 재배열과 정단 수축을 확인하기 위함입니다.
사용된 방법
- 이미징을 위한 특정 혼합물 준비.
- 가스트룰라 형성 과정 중 초파리 배아의 라이브 이미징.
- 세포 이동 및 형태 변화 분석.
- 주요 형태 형성 사건의 식별.
주요 결과
- 초파리 낭배 형성의 생체 이미지 캡처 성공.
- 정단 수축 및 세포 재배열 확인.
- 초기 발생 과정 중 세포 역학에 대한 이해 증진.
- 발생 생물학의 향후 연구를 위한 견고한 방법론 제시.
결론
- 본 절차는 초파리(Drosophila)의 낭배 형성에 대한 귀중한 통찰을 제공합니다.
- 생체 내 영상화(Live imaging)는 세포 이동을 연구하는 강력한 도구입니다.
- 연구 결과는 발달 과정에 대한 폭넓은 이해에 기여합니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
Drosophila 배아 형성(gastrulation) 과정 중 세포 형태 변화와 이동의 실시간 이미징은 섬유화 및 암 전이에 관여하는 과정인 상피-간엽 이행(EMT)의 분자적 메커니즘을 분석하는 강력한 플랫폼을 제공합니다. 이 방법은 정단 수축(apical constriction)과 세포 재배열의 고해상도 시각화를 가능하게 하여, EMT 관련 경로의 초기 단계 표적 검증에 대한 예측 신뢰도를 높여줍니다. 이러한 접근 방식은 발생 생물학에서 바이오 제약 R&D의 질병 관련 메커니즘 연구로 이어지는 중개적 연속성을 강화합니다.
바이오 제약 R&D에서의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 살아있는 다세포 환경에서 EMT 관련 유전자 기능과 경로 역학의 조사를 가능하게 합니다.
- 질병 기전과 연관된 형태 형성 사건을 직접 시각화함으로써 생물학적 리스크 제거를 지원합니다.
- 정단 수축 및 세포 운명 전환을 조절하는 유전자의 기능적 타겟 검증을 용이하게 합니다.
- 종양학 및 섬유화 포트폴리오에서 EMT 조절 타겟의 우선순위를 정하는 데 필요한 예측 신뢰도를 제공합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 세포의 이동과 형태 변화를 실시간으로 정량화하기 위해 검증된 이미징 시스템을 구축합니다.
- 정량적 분석 결과로서 정단 수축(apical constriction) 및 세포 재배열의 재현성 있는 측정을 가능하게 합니다.
- EMT 조절 화합물에 대한 표현형 스크리닝 플랫폼의 표준화를 지원합니다.
- 후속 고함량 스크리닝(high-content screening) 워크플로우를 위한 견고한 생물학적 시스템을 준비합니다.
중개 및 전임상 연구
- 발달 과정의 EMT 프로세스를 전이 및 조직 재형성과 관련된 질병 모델과 일치시킵니다.
- 전임상 연구를 위한 중개 바이오마커 선택에 정보를 제공하는 기전적 통찰력을 제공합니다.
- 생세포 표현형 근거를 바탕으로 EMT 타겟 후보 물질의 리스크 조정 추진을 가능하게 합니다.
- EMT 유도 질환 분야에서 발견부터 전임상 검증까지의 연속성을 강화합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
이 이미징 방법은 초기 가설 검증부터 EMT 관련 표적의 전임상 모델 개발에 이르기까지의 발견 연속체에 통합됩니다.
- 발견 생물학: EMT 및 형태 형성 조절 인자에 대한 가설 검증과 경로 규명을 지원합니다.
- 스크리닝: 세포 형태 및 이동에 대한 정량적이고 재현 가능한 결과물을 제공하여 분석 준비 상태를 가능하게 합니다.
- 분석: 유전적 또는 약리학적 섭동의 비교 분석을 위한 고함량 이미징 데이터를 제공합니다.
- 중개 연구: 발달 기전과 질병 관련 EMT 모델을 연결하여 바이오마커 일치성을 확보합니다.
- 기업적 재사용: 다양한 EMT 및 형태 형성 연구에 적용 가능한 재사용 가능한 이미징 플랫폼을 제공합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: EMT 표적 발굴 프로그램의 예측 신뢰도를 높이고 기전적 리스크를 완화합니다.
- 운영적 가치: 프로젝트 간 재현성을 위해 표준화되고 확장 가능한 이미징 워크플로우를 제공합니다.
- 전략적 가치: Go/No-go 결정에 근거를 제공하며 EMT 관련 적응증의 후기 단계 생물학적 리스크를 줄입니다.
- 포트폴리오 영향: 여러 치료 영역에 걸쳐 EMT 조절 자산의 리스크 조정 우선순위 지정을 지원합니다.
실행 시 고려 사항
- 라이브 이미징, 공초점 현미경 및 Drosophila 배아학에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 타임랩스 분석을 위한 고급 이미징 장비 및 분석 소프트웨어에 대한 접근 권한이 필요합니다.
- 재현성을 위해 배아 단계 설정 및 이미징 프로토콜의 팀 간 표준화가 필수적입니다.
- 다른 모델 시스템에 적용하려면 리포터 컨스트럭트 및 이미징 조건의 최적화가 필요할 수 있습니다.
- 실질적인 제약 사항으로는 처리량의 한계와 정밀한 배아 핸들링의 필요성이 있습니다.
