Name: 셀 모양 변경 허가 및 세포 운동에서의 영상 초파리 낭배 사용 DE-cadherin의 기자 형질 전환의 파리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 42 s
Description: 학습하세요 Drosophila 낭배에서 세포 형태 변화와 운동을 실시간 영상으로 분석하는 방법을. 이 기법은 apical constriction과 morphogenetic movement를 연구하는 발달생물학자에게 강력한 도구를 제공합니다.

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이 연구는 Astellas Foundation for Research on Metabolic Disorders(HT), Takeda Science Foundation(HT) 및 사립 대학 전략 연구 재단(HT)을 위한 MEXT 지원 프로그램의 지원을 받았습니다.

참고 : DE-CAD :: GFP 10 : 본 연구에 사용 된 형질 전환 초파리는 다음과 같습니다. 애플 플레이트 1. 준비 <ol><li> 마이크로파 12.5 g 한천, 125 mL의 100 % 시판 사과 주스, 12.5 g의 글루코스, 및 375 mL의 H 2 O 열 혼합물의 혼합물을 제조하고, 3cm 세포 배양 접시에 부어. 나중에 사용하기 위해 4 ° C에서 혼합물을 저장합니다. </li><li> 사과 플레이트를 제조 한 후, 파리가 알을 배치 할 수 있도록 그 위에 반죽 효모 붙여 넣기의 얇은 층을 추가합니다. </li></ol> 2. 배아 준비 및 라이브 영상 프로토콜 <ol><li> 짝이어서 반죽 효모에 덮여 사과 접시에 하룻밤 알을 낳기 위해 병에 약 50 파리 (25 명의 남성과 25 명의 여성)을 놓습니다. 병의 입에 사과 주스 플레이트를 설정합니다. 거꾸로 인큐베이터에서 병을 유지합니다. 제 프롬프트 알루미늄 호일 플라스틱 초파리 재고 병 포장전자는 더 많은 알을 낳기 위해 날아갑니다. </li><li> 다음날 아침, 새와 오래된 사과 주스 플레이트를 교체합니다. </li><li> 파리 알루미늄 호일로 병을 포장하여 3 ~ 4 시간 동안 알을 낳기 수 있습니다. </li><li> 세 4 시간 후, 브러시 또는면 나쁜를 사용하여 사과 주스 플레이트에서 배아 체에서 배아를 수집하고 PBS로 씻는다. 12 웰 배양 접시에 배아를 PBS로 2 ~ 3 회 이상 세척 할 것. </li><li> 12 웰 배양 접시에 5 분 동안 50 % 표백제와 배아를 Dechorionate. </li><li> dechorionation 과정에 따라, PBS와 배아를 2 ~ 3 번 더 씻는다. </li><li> PBS 선택 단계 그들의 경계에서의 투명도 수준에 기초하여 현미경 5 배아 함유 3cm 세포 배양 접시에 배아를 옮긴다. 200 μL 피펫 팁을 사용하여 준비된 배아 피펫. </li><li> 다음으로, 유리 커버 슬립에 선택한 두 배아를 배치하고 가늘게 꼰 티슈로 여분의 PBS를 제거합니다. 최대의 배아에게 지느러미 쪽의 방향미세 트위스트 티슈 페이퍼를 이용하여 커버 슬립. 그 후, 미세 바늘과 트위스트 티슈 페이퍼를 사용하여 실리콘 그리스와 유리 커버 슬립에 배아를 연결합니다. </li><li> 슬라이드의 하단에 공간을두고, 배아에 할로 카본 오일 (700)의 작은 방울을 추가하고 거꾸로 들여 쓰기 슬라이드에서 배아를 포함 coverslip에 배치합니다. </li><li> 공 초점 영상 시스템 아르곤 / 488 레이저 및 오일 액침 대물 (63X)를 이용하여 태아를 조사한다. 주 : 해당 발달 단계에서 배아를 식별은 낭 배기 이벤트의 이미지를 캡처하는 것이 중요합니다. 이러한 조건에서, 거의 모든 배아는 배아 분석 성인 개발 배양 될 수있는 적어도 14 단계까지 정상적으로 발전 관찰한다. </li></ol>

<ol><li>Haruta, T., Warrior, R., Yonemura, S., Oda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proximal+half+of+the+Drosophila+E-cadherin+extracellular+region+is+dispensable+for+many+cadherin-dependent+events+but+required+for+ventral+furrow+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">The proximal half of the Drosophila E-cadherin extracellular region is dispensable for many cadherin-dependent events but required for ventral furrow formation.</a> Genes Cells. 15 (3), 193-208 (2010).</li>
<li>Oda, H., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution%3A+structural+and+functional+diversity+of+cadherin+at+the+adherens+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Evolution: structural and functional diversity of cadherin at the adherens junction.</a> J. Cell Biol. 193 (7), 1137-1146 (2011).</li>
<li>Fernandez-Sanchez, M. E., Serman, F., Ahmadi, P., Farge, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+induction+in+embryonic+development+and+tumor+growth+integrative+cues+through+molecular+to+multicellular+interplay+and+evolutionary+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanical induction in embryonic development and tumor growth integrative cues through molecular to multicellular interplay and evolutionary perspectives.</a> Methods Cell Biol. 98, 295-321 (2010).</li>
<li>Alderton, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis%3A+Epithelial+to+mesenchymal+and+back+again%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Metastasis: Epithelial to mesenchymal and back again.</a> Nat. Rev. Cancer. 13 (1), 3(2013).</li>
<li>Fabregat, I., Malfettone, A., Soukupova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Insights+into+the+Crossroads+between+EMT+and+Stemness+in+the+Context+of+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Med%22%5BJournal%5D)">New Insights into the Crossroads between EMT and Stemness in the Context of Cancer.</a> J. Clin. Med. 5 (3), (2016).</li>
<li>Serrano-Gomez, S. J., Maziveyi, M., Alahari, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+epithelial-mesenchymal+transition+through+epigenetic+and+post-translational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Regulation of epithelial-mesenchymal transition through epigenetic and post-translational modifications.</a> Mol. Cancer. 15, (2016).</li>
<li>Yu, A. Q., Ding, Y., Li, C. L., Yang, Y., Yan, S. R., Li, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TALEN-induced+disruption+of+Nanog+expression+results+in+reduced+proliferation%2C+invasiveness+and+migration%2C+increased+chemosensitivity+and+reversal+of+EMT+in+HepG2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol.+Rep%22%5BJournal%5D)">TALEN-induced disruption of Nanog expression results in reduced proliferation, invasiveness and migration, increased chemosensitivity and reversal of EMT in HepG2 cells.</a> Oncol. Rep. 35 (3), 1657-1663 (2016).</li>
<li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-to-mesenchymal+transition+is+dispensable+for+metastasis+but+induces+chemoresistance+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epithelial-to-mesenchymal transition is dispensable for metastasis but induces chemoresistance in pancreatic cancer.</a> Nature. 527 (7579), 525-530 (2015).</li>
<li>Kalluri, R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basics+of+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">The basics of epithelial-mesenchymal transition.</a> J. Clin. Invest. 119 (6), 1420-1428 (2009).</li>
<li>Huang, J., Zhou, W., Dong, W., Watson, A. M., Hong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed%2C+efficient%2C+and+versatile+modifications+of+the+Drosophila+genome+by+genomic+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Directed, efficient, and versatile modifications of the Drosophila genome by genomic engineering.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (20), 8284-8289 (2009).</li>
</ol>

저자는 공개할 것이 없습니다.

이전에 Drosophilla1에서 위장 형성 과정의 라이브 이미지를 캡처하는 유사한 절차를 보고했지만, 여기에 설명하는 방법은 상세하고 내인성 카드헤린 발현을 추적하기 쉽기 때문에 위장 형성과 관련된 주요 요인의 유전자 스크리닝에 매우 유용합니다. 이 이미징 절차의 성공을 극대화하려면 들여쓰기 슬라이드를 사용하는 것이 필수적입니다. 기계적 압력은 때때로 배아 사멸을 유발합니다. 따라서 기계적 스트레스가 배아 위장 형성 과정을 방해할 수 있으므로 배아를 가능한 한 부드럽게 다루는 것도 중요합니다. 배아 고정 중에 적절한 양의 그리스를 사용하면 라이브 이미징 절차의 결과가 더욱 향상됩니다. 
배아의 탈융모와 선택이 모두 신속하게 수행되도록 하는 것이 이 프로토콜로 성공하는 핵심 요소입니다. 완전히 건조되기 전에 가는 바늘을 사용하여 배아를 붙이는 것도 이 절차의 결과를 극대화하는 데 중요합니다. 배아를 고정한 후 DE-cadherin으로 표지된 G...

낭 배기는 초파리 1, 2 등의 다세포 동물의 배아 개발하는 동안 발생하는 형태 학적으로 동적 이벤트의 첫 번째 집합입니다. 흥미롭게도, 증거 신흥 것은이 과정이 기계 및 분자 메커니즘 (3) 사이의 상호 작용을 통해 조절되는 것이 좋습니다. 또한, 낭 배기에 중요한 과정입니다 중간 엽 전이 (EMT)로 상피는 또한 암 전이 4-8로 인간의 질병 과정에 연루되어있다. 혀끝의 수축을 제어 등, 많은 유전자가 또한 알려진 바와 같이 암 전이 9에서 관찰 된 EMT의 핵심 요소가 될 수 있습니다. 따라서, 낭배시의 정점 수축은 전술 한 조절 메커니즘을 조사하는 암 전이에 대한 이해를 향상시키는 우수한 모델이다. 이 기술의 이점은 우리는 따라서 실시간에서 낭배시 세포의 움직임을 관찰 할 수 있다는 우리 것암 전이뿐만 아니라 낭 배기에 관여하는 유전자를 선별 할 수. 비교적 알려지지 않지만, 세포 간 접착 정점 수축 1에서 중심 역할을하는 것으로 생각된다. 초파리 유전학은 잘 규제 분자 메커니즘을 탐구 단일 세포 수준의 연구에 적합합니다. 이 모델은 낭배 동안 혀끝의 수축의 중요성을 발견 할 수있게됩니다. 또한,이 방법은 암의 전이에 관여하는 유전자를 선별 할 수있다. 초파리의 낭배의 캡처 라이브 이미지는 더욱 더 상세하게 조직의 재 배열을 관리하는 분자 메커니즘을 이해 할 수있게했다. 여기서, 우리는이를 달성하기 위해 간단한 방법의 포괄적 인 설명을 제공한다.

<table><tbody><tr><td>Halocarbon oil 700</td><td>Sigma</td><td>MKBH 5726</td><td></td></tr><tr><td>진공 그리스 실리콘</td><td>Beckman 335148</td><td></td><td></td></tr><tr><td>유리 커버슬립&nbsp;</td><td>Matsunami 유리</td><td>두께 No1</td><td>24-36 mm</td></tr><tr><td>배아 stariner</td><td>코닝</td><td>Corning3477</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 Drosophilla 재고 병</td><td>Hitec</td><td>MKC-100</td><td></td></tr><tr><td>DE-Cadherin 넉 인 플라이</td><td></td><td></td><td>REF (10)</td></tr></tbody></table>

셀 모양 변경 허가 및 세포 운동에서의 영상 초파리 낭배 사용 de-cadherin의 기자 형질 전환의 파리

Imaging of Cell Shape Alteration and Cell Movement in Drosophila Gastrulation Using DE-cadherin Reporter Transgenic Flies

낭 배기는 초파리와 같은 다세포 동물의 배아 개발하는 동안 발생하는 형태 학적으로 동적 이벤트의 첫 번째 집합입니다. 이 형태 학적 변화는 중간 엽 전이 (EMT)로 상피로 인식되고 있습니다. EMT의 조절 곤란이 섬유화와 암 전이와 관련된다. EMT 분자 메커니즘들에 의해 제어된다 신흥 증거가있다. 혀끝의 수축을 제어 등, 많은 주요 유전자도 알려진 바와 같이 암 전이에서 관찰 된 EMT 중요한 요소가 될 수 있습니다. 초파리 낭배 동안 EMT와 마찬가지로, 상피 세포는 그 모양을 변경하도록 유도 될 수 있으며, 다양한 세포 유형으로 세포의 운명을 리디렉션 재 프로그램 될 수있다. 여기에서 우리는 배아 발달의이 단계에서 형태 형성 세포 이동 및 세포 운명 식별의 개시를 분석하기 위해 초파리 낭 배기의 강력한 이미징 방법을 제공한다. 이 방법을 사용하여, 우리는 C를 식별엘의 낭배시의 재 배열 및 GFP를 이용 낭배 동안 정점 수축의 중요성을 입증은 DE-cadherin의 표지.

여기서, 우리는 초파리 배아의 낭배 이벤트 및 배아 준비 절차에 대한 일반적인 개요 (도 1)를 나타낸다. 세포막 DE 헤린 : GFP 및 세포 이동의 라이브 영상은 초파리 낭배시에 수행된다 (도 2)를 이용하여 라벨링된다. DE-cadherin의의 GFP 파리는 우리가 세포 부착 접합을 시각화 할 수 있기 때문에, 우리는 혀끝의 세포 모양이 시스템을 사용하여 움직임을 추적 할 수 있습니다. 더 중요한 것은,이 시스템은 우리가 내생 DE-cadherin의 발현 패턴을 추적 할 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54764/54764fig1.jpg"> 그림 1 : 배아 준비 절차의 일반 개요. <stro...

여기에서는 초파리 위장 형성의 실시간 이미지를 캡처하는 절차를 설명합니다. 이를 통해 초기 발달과 관련된 정점 수축을 더 잘 이해하고 조직 구조 변형 중 세포 움직임을 제어하는 메커니즘을 더 자세히 분석할 수 있었습니다.

셀 모양 변경 허가 및 세포 운동에서의 영상 초파리 낭배 사용 DE-cadherin의 기자 형질 전환의 파리

Gastrulation is the first set of morphologically dynamic events that occur during the embryonic development of multicellular animals such as Drosophila. ...

이 절차의 전반적인 목표는 초파리 위형성 중 세포의 모양과 움직임을 더 잘 이해하는 것입니다. 여기에서 우리는 배아 발달의 이 단계에서 형태 유전학적 세포 이동의 시작을 분석하기 위해 Drosophila gastrulation의 강력한 측정 방법을 제공합니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 배변화 시 세포 재배치가 배가형성 중 정점 수축과 함께 확인될 수 있다는 것입니다.실험을 시작하려면 375 밀리리터의 물 혼합물을 준비하십시오. 125 밀리리터 100 % 상업적으로 이용 가능한 사과 주스. 한천 12.5 그램.포도당 12.5g. 다음으로, 한천이 녹을 때까지 혼합물을 전자 레인지에서 가열합니다. 그리고 3cm 세포 배양 접시에 붓습니다.나중에 사용할 수 있도록 혼합물을 섭씨 4도에서 보관하십시오. 사과 접시를 준비한 후 그 위에 반죽한 효모 페이스트를 얇게 바르면 파리가 알을 낳을 수 있습니다. 25마리의 수파리와 25마리의 암컷 파리를 반죽한 효모로 덮인 사과 접시에 담긴 병에 담습니다.플라스틱 초파리 스톡 병을 알루미늄 호일로 싸서 파리가 더 많은 알을 낳도록 합니다. 젖병을 거꾸로 뒤집어 인큐베이터에 하룻밤 동안 보관하십시오. 다음날 아침, 사과 주스 플레이트를 새 것으로 교체하십시오.그런 다음 병을 알루미늄 호일로 싸서 파리가 3-4시간 동안 알을 낳도록 합니다. 파리가 알을 낳은 후 면봉으로 접시에서 알을 풀어줍니다. 배아를 여과기에 모으고 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척합니다.12웰 배양 접시에서 PBS로 배아를 세 번 더 씻습니다. 12-well culture 접시에 50% 표백제로 배아를 Dechorionate합니다. 탈착 과정에 따라 PBS로 배아를 세 번 더 씻습니다.PBS가 들어있는 3cm 세포 배양 접시에 배아를 옮깁니다. 그리고 현미경으로 5단계 배아를 선택하는데, 배아 경계선의 투명도 수준에 따라 배아를 선택합니다. 200마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 병기 결정된 배아를 수집합니다.다음으로, 선택한 두 개의 배아를 유리 커버 슬립에 놓고 티슈 페이퍼로 여분의 PBS를 제거합니다. 미세하게 꼬인 티슈 페이퍼를 사용하여 배아의 등쪽을 커버 슬립까지 향하게 합니다. 그런 다음 배아를 유리 덮개에 부착하고 가는 바늘을 사용하여 실리콘 그리스를 묻힙니다.배아에 속이 빈 탄소 오일 700을 작은 방울 떨어뜨리고 배아가 들어있는 커버 슬립을 움푹 들어간 슬라이드에 거꾸로 놓습니다. 슬라이드 아래쪽에 약간의 공간을 남겨 둡니다. 그런 다음 커버 슬립을 슬라이드에 붙입니다.마지막으로, 컨포칼 이미징 시스템, 아르곤 488 레이저 및 오일 이멀젼 대물렌즈를 사용하여 배아를 검사합니다. 저속 촬영 이미지는 500초 동안 세포 이동의 DE-cadherin GFP를 사용하여 라이브 이미징에서 캡처하여 개별 세포의 정점 영역, 위장 형성 중 초파리를 분석했습니다. 500초가 되면 정점 수축과 침습이 명확하게 보입니다.우리의 방법을 사용하여. 우리는 Drosophila gastrulation의 분자 메커니즘뿐만 아니라 암 전이에 관여하는 상피에서 중간엽으로의 전이를 더 이해할 수 있습니다.

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연구

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Developmental Biology

발생생물학

여기 GFP 태그 glial 세포와 결합하여 라이브 미세 분석을 사용하여 개발 Drosophila의 눈을 glial 세포의 마이 그 레이션을 검사하기 위해 프로토콜을 설명합니다.

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Drosophila의 hemocytes은 개발 배아의 전체를 통해 분산. 이 프로토콜은 찬란 표시된 hemocytes와 배아를 사용하여 이러한 마이 그 레이션을 마운트 및 이미지하는 방법을 보여줍니다.

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의 입식 이미징 Drosophila 태아

과일 파리, Drosophila melanogaster의 조기 개발이 잘 이미징 방식에 적합 세포 모양의 변화의 숫자에 의해 특징입니다. 이 문서 Drosophila의 배아 라이브 공촛점 이미징에 필요한 기본적인 도구와 방법을 설명하며, cellularization라는 세포 모양의 변화에​​ 초점을 맞출 것이다.

생활의 이미징 셀 모양 변경 Drosophila 태아

이 프로토콜은 그대로 애벌레 뇌의 맥락에서 라이브 세포 이미징을 수행하는 데 사용하는 효율적인 방법을 자세히 설명합니다. 라이브 세포 이미징 방식은 지속적으로 이전에 간과 된 메커니즘을 밝혀, 비대칭 신경 줄기 세포 분열의 연구뿐만 아니라 다른 신경 인성과 발달 과정에 대한 귀중한 있습니다.

의 라이브 영상<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레 Neuroblasts

초파리의 성체 구조는 상상 원반이라고 하는 주머니와 같은 구조에서 파생됩니다. 이러한 디스크의 분석은 조직 결정, 구획 경계 설정, 세포 증식, 세포 운명 사양 및 평면 세포 극성을 포함한 많은 발달 과정에 대한 통찰력을 제공합니다. 이 프로토콜은 광/형광 현미경 검사를 위해 가상 디스크를 준비하는 데 사용됩니다.

해부하고, 상상 디스크의 면역 염색에서 초파리

이 프로토콜은 살아있는 초파리 번데기 눈 신경 상피를 이미징하는 효율적인 방법을 제시합니다. 이 방법은 조직의 움직임과 불균일한 토폴로지를 보상하고, 여러 GFP 태그가 지정된 접합 단백질을 사용하여 세포 경계의 시각화를 향상시키며, 쉽게 조립할 수 있는 이미징 장비를 사용합니다.

의 라이브 영상 초파리 번데기 눈

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그만큼<em&gt; 초파리</em&gt; 가상적인 디스크 종양 모델 : 유전 모자이크를 사용하여 유전자 발현 및 종양 침윤의 시각화 및 정량화

이 프로토콜은 과일 파리가 변형을 겪으면서 Drosophila 복부 상피에서 세포 배향 및 조직 성장의 역학을 이미징 및 분석하기 위해 설계되었습니다. 여기에서 기술된 방법론은 Drosophila 또는 그밖 모형 유기체에 있는 다른 발달 단계, 조직 및 subcellular 구조물의 연구 결과에 적용될 수 있습니다.

푸팔 단계 동안 개발 초파리 에피텔리아에서 조직 방향 과 성장 역학의 이미징 및 분석

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형광 항체 주입을 통한 살아있는 초파리 배아의 저농도 단백질 및 번역 후 변형 시각화

여기에서는 번데기를 완전히 제거하는 번데기 단계에서 초파리 다리의 장기 라이브 이미징을 위한 프로토콜이 제시됩니다. 이 프로토콜은 다른 조직에도 적용할 수 있습니다.

번데기 제거 후 Drosophila Pupal 다리 발달의 장기 라이브 이미징

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