Name: 에서 Polyketomycin를 사용하여 데모 : 그 생합성 유전자 클러스터에 천연 제품에서 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces)의 diastatochromogenes Tü6028 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: 학습하세요 항생 활성을 가진 천연물질을 식별하고 정제하며 유전체 마이닝을 통해 생합성 유전자 클러스터를 규명하는 방법을 Streptomyces diastatochromogenes를 이용하여. 이 기법은 새로운 항생제 발견에 필수적입니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

S. Zhang은 China Scholarship Council의 지원을 받습니다. 저자들은 이 실험실에서 폴리케토마이신 프로젝트에 참여했던 전 사람들과 폴리케토마이신 생산자를 제공한 튀빙겐 대학의 Hans-Peter Fiedler 교수에게 매우 감사하고 있습니다. 이 연구는 DFG (RTG 1976)의 지원을 받았습니다.

<ol><li>Fleming, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+antibacterial+action+of+cultures+of+a+penicillin%2C+with+special+reference+to+their+use+in+isolation+of+B.+influenzae%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Exp+Pathol%22%5BJournal%5D)">On the antibacterial action of cultures of a penicillin, with special reference to their use in isolation of B. influenzae.</a> Br J Exp Pathol. 10 (3), 226-236 (1929).</li>
<li>Lemke, A., Kiderlen, A. F., Kayser, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphotericin+B%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Amphotericin B.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 68 (2), 151-162 (2005).</li>
<li>Kirkpatrick, P., Raja, A., LaBonte, J., Lebbos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Daptomycin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Daptomycin.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 2 (12), 943-944 (2003).</li>
<li>Zakeri, B., Wright, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+biology+of+tetracycline+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical biology of tetracycline antibiotics.</a> Biochem. cell Biol. 86 (2), 124-136 (2008).</li>
<li>Schatz, A., Bugle, E., Waksman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptomycin%2C+a+Substance+Exhibiting+Antibiotic+Activity+Against+Gram-Positive+and+Gram-Negative+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Streptomycin, a Substance Exhibiting Antibiotic Activity Against Gram-Positive and Gram-Negative Bacteria.</a> Exp. Biol. Med. 55 (1), 66-69 (1944).</li>
<li>Burg, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avermectins%2C+new+family+of+potent+anthelmintic+agents%3A+producing+organism+and+fermentation%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Avermectins, new family of potent anthelmintic agents: producing organism and fermentation.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 15 (3), 361-367 (1979).</li>
<li>Egerton, J. R., Ostlind, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avermectins%2C+new+family+of+potent+anthelmintic+agents%3A+efficacy+of+the+B1a+component%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Avermectins, new family of potent anthelmintic agents: efficacy of the B1a component.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 15 (3), 372-378 (1979).</li>
<li>Walsh, C. T., Fischbach, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+products+version+2.0%3A+connecting+genes+to+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Natural products version 2.0: connecting genes to molecules.</a> J. Am. Chem. Soc. 132 (8), 2469-2493 (2010).</li>
<li>Momose, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyketomycin%2C+a+new+antibiotic+from+Streptomyces+sp.+MK277-AF1.+II.+Structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antibiot.+%28Tokyo%29%22%5BJournal%5D)">Polyketomycin, a new antibiotic from Streptomyces sp. MK277-AF1. II. Structure determination.</a> J. Antibiot. (Tokyo). 51 (1), 26-32 (1998).</li>
<li>Paululat, T., Zeeck, A., Gutterer, J. M., Fiedler, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+of+polyketomycin+produced+by+Streptomyces+diastatochromogenes.T%C3%BC6028%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antibiot.+%28Tokyo%29%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis of polyketomycin produced by Streptomyces diastatochromogenes.Tü6028.</a> J. Antibiot. (Tokyo). 52 (2), 96-101 (1999).</li>
<li>Momose, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyketomycin%2C+a+new+antibiotic+from+Streptomyces.+sp.+MK277-AF1.+I.+Taxonomy%2C+production%2C+isolation%2C+physico-chemical+properties+and+biological+activities%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antibiot.+%28Tokyo%29%22%5BJournal%5D)">Polyketomycin, a new antibiotic from Streptomyces. sp. MK277-AF1. I. Taxonomy, production, isolation, physico-chemical properties and biological activities.</a> J. Antibiot. (Tokyo). 51 (1), 21-25 (1998).</li>
<li>Daum, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organisation+of+the+biosynthetic+gene+cluster+and+tailoring+enzymes+in+the+biosynthesis+of+the+tetracyclic+quinone+glycoside+antibiotic+polyketomycin%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Organisation of the biosynthetic gene cluster and tailoring enzymes in the biosynthesis of the tetracyclic quinone glycoside antibiotic polyketomycin.</a> Chembiochem. 10 (6), 1073-1083 (2009).</li>
<li>Bode, H. B., Bethe, B., Höfs, R., Zeeck, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Big+effects+from+small+changes%3A+possible+ways+to+explore+nature%27s+chemical+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Big effects from small changes: possible ways to explore nature's chemical diversity.</a> Chembiochem. 3 (7), 619-627 (2002).</li>
<li>Wolfender, J. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HPLC+in+Natural+Product+Analysis%3A+The+Detection+Issue%5BTitle%5D)+AND+%22Planta+Med%22%5BJournal%5D)">HPLC in Natural Product Analysis: The Detection Issue.</a> Planta Med. 75 (07), 719-734 (2009).</li>
<li>Stahl, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStahl%2C+E+%22Thin-layer+chromatography.+A+laboratory+handbook%22">Thin-layer chromatography. A laboratory handbook</a>. , 2nd edition (1967).</li>
<li>Snyder, L. R., Kirkland, J. J., Glajch, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparative+HPLC+Separation%5BTitle%5D)+AND+%22Pract.+HPLC+Method+Dev%22%5BJournal%5D)">Preparative HPLC Separation.</a> Pract. HPLC Method Dev. , 616-642 (2012).</li>
<li>Granath, K. A., Kvist, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+weight+distribution+analysis+by+gel+chromatography+on+sephadex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Molecular weight distribution analysis by gel chromatography on sephadex.</a> J. Chromatogr. A. 28, 69-81 (1967).</li>
<li>Jackman, L. M., Sternhell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Nuclear+Magnetic+Resonance+Spectroscopy+in+Organic+Chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Ser.+Org.+Chem%22%5BJournal%5D)">Application of Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy in Organic Chemistry.</a> Int. Ser. Org. Chem. , (1969).</li>
<li>Xian, F., Hendrickson, C. L., Marshall, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">High resolution mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 84 (2), 708-719 (2012).</li>
<li>Metzker, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequencing+technologies+-+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Sequencing technologies - the next generation.</a> Nat. Rev. Genet. 11 (1), 31-46 (2010).</li>
<li>Tatusova, T., et al. Prokaryotic Genome Annotation Pipeline. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTatusova%2C+T+%22NCBI+Handb.+2nd+Ed%22">NCBI Handb. 2nd Ed</a>. , (2013).</li>
<li>Angiuoli, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+an+online+repository+of+Standard+Operating+Procedures+%28SOPs%29+for+%28meta%29genomic+annotation%5BTitle%5D)+AND+%22OMICS%22%5BJournal%5D)">Toward an online repository of Standard Operating Procedures (SOPs) for (meta)genomic annotation.</a> OMICS. 12 (2), 137-141 (2008).</li>
<li>Aziz, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RAST+Server%3A+rapid+annotations+using+subsystems+technology%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">The RAST Server: rapid annotations using subsystems technology.</a> BMC Genomics. 9, 75(2008).</li>
<li>Overbeek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SEED+and+the+Rapid+Annotation+of+microbial+genomes+using+Subsystems+Technology+%28RAST%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The SEED and the Rapid Annotation of microbial genomes using Subsystems Technology (RAST).</a> Nucleic Acids Res. 42, 206-214 (2014).</li>
<li>Brettin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RASTtk%3A+a+modular+and+extensible+implementation+of+the+RAST+algorithm+for+building+custom+annotation+pipelines+and+annotating+batches+of+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">RASTtk: a modular and extensible implementation of the RAST algorithm for building custom annotation pipelines and annotating batches of genomes.</a> Sci. Rep. 5, 8365(2015).</li>
<li>Seemann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prokka%3A+rapid+prokaryotic+genome+annotation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Prokka: rapid prokaryotic genome annotation.</a> Bioinformatics. 30 (14), 2068-2069 (2014).</li>
<li>Meyer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GenDB--an+open+source+genome+annotation+system+for+prokaryote+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">GenDB--an open source genome annotation system for prokaryote genomes.</a> Nucleic Acids Res. 31 (8), 2187-2195 (2003).</li>
<li>Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+local+alignment+search+tool%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Basic local alignment search tool.</a> J. Mol. Biol. 215 (3), 403-410 (1990).</li>
<li>Madden, T. The BLAST Sequence Analysis Tool. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMadden%2C+T+%22NCBI+Handb.+2nd+Ed%22">NCBI Handb. 2nd Ed</a>. , Chapter 16 (2003).</li>
<li>Marchler-Bauer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CDD%3A+NCBI%27s+conserved+domain+database%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">CDD: NCBI's conserved domain database.</a> Nucleic Acids Res. 43, (Database issue) 222-226 (2014).</li>
<li>Medema, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((antiSMASH%3A+rapid+identification%2C+annotation+and+analysis+of+secondary+metabolite+biosynthesis+gene+clusters+in+bacterial+and+fungal+genome+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">antiSMASH: rapid identification, annotation and analysis of secondary metabolite biosynthesis gene clusters in bacterial and fungal genome sequences.</a> Nucleic Acids Res. 39, (Web Server issue) 339-346 (2011).</li>
<li>Blin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((antiSMASH+2.0--a+versatile+platform+for+genome+mining+of+secondary+metabolite+producers%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">antiSMASH 2.0--a versatile platform for genome mining of secondary metabolite producers.</a> Nucleic Acids Res. 41, (Web Server issue) 204-212 (2013).</li>
<li>Weber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((antiSMASH+3.0+-+a+comprehensive+resource+for+the+genome+mining+of+biosynthetic+gene+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">antiSMASH 3.0 - a comprehensive resource for the genome mining of biosynthetic gene clusters.</a> Nucleic Acids Res. 43, (W1) 237-243 (2015).</li>
<li>Ziemert, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+natural+product+domain+seeker+NaPDoS%3A+a+phylogeny+based+bioinformatic+tool+to+classify+secondary+metabolite+gene+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The natural product domain seeker NaPDoS: a phylogeny based bioinformatic tool to classify secondary metabolite gene diversity.</a> PLoS One. 7 (3), 34064(2012).</li>
<li>Rausch, C., Weber, T., Kohlbacher, O., Wohlleben, W., Huson, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+prediction+of+adenylation+domains+in+nonribosomal+peptide+synthetases+%28NRPS%29+using+transductive+support+vector+machines+%28TSVMs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Specificity prediction of adenylation domains in nonribosomal peptide synthetases (NRPS) using transductive support vector machines (TSVMs).</a> Nucleic Acids Res. 33 (18), 5799-5808 (2005).</li>
<li>Röttig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NRPSSpredictor2--a+web+server+for+predicting+NRPS+adenylation+domain+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">NRPSSpredictor2--a web server for predicting NRPS adenylation domain specificity.</a> Nucleic Acids Res. 39, (Web Server issue) 362-367 (2011).</li>
<li>Medema, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimum+Information+about+a+Biosynthetic+Gene+cluster%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Minimum Information about a Biosynthetic Gene cluster.</a> Nat. Chem. Biol. 11 (9), 625-631 (2015).</li>
<li>Mullis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+enzymatic+amplification+of+DNA+in+vitro%3A+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Symp.+Quant.+Biol%22%5BJournal%5D)">Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction.</a> Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 51, Pt 1 263-273 (1986).</li>
<li>Bierman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmid+cloning+vectors+for+the+conjugal+transfer+of+DNA+from+Escherichia+coli+to+Streptomyces+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Plasmid cloning vectors for the conjugal transfer of DNA from Escherichia coli to Streptomyces spp.</a> Gene. 116 (1), 43-49 (1992).</li>
<li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli.using+the+heat+shock+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Transformation of plasmid DNA into E. coli.using the heat shock method.</a> J. Vis. Exp. (6), e253(2007).</li>
<li>Bimboim, H. C., Doly, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+alkaline+extraction+procedure+for+screening+recombinant+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA.</a> Nucleic Acids Res. 7 (6), 1513-1523 (1979).</li>
<li>MacNeil, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Streptomyces+avermitilis.+genes+required+for+avermectin+biosynthesis+utilizing+a+novel+integration+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Analysis of Streptomyces avermitilis. genes required for avermectin biosynthesis utilizing a novel integration vector.</a> Gene. 111 (1), 61-68 (1992).</li>
<li>Pospiech, A., Neumann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+quick-prep+of+genomic+DNA+from+Gram-positive+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">A versatile quick-prep of genomic DNA from Gram-positive bacteria.</a> Trends Genet. 11 (6), 217-218 (1995).</li>
<li>Makitrynskyy, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotropic+regulatory+genes+bldA%2C+adpA+and+absB+are+implicated+in+production+of+phosphoglycolipid+antibiotic+moenomycin%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biol%22%5BJournal%5D)">Pleiotropic regulatory genes bldA, adpA and absB are implicated in production of phosphoglycolipid antibiotic moenomycin.</a> Open Biol. 3 (10), 130121(2013).</li>
<li>Kalan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cryptic+polyene+biosynthetic+gene+cluster+in+Streptomyces+calvus+is+expressed+upon+complementation+with+a+functional+bldA+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">A cryptic polyene biosynthetic gene cluster in Streptomyces calvus is expressed upon complementation with a functional bldA gene.</a> Chem. Biol. 20 (10), 1214-1224 (2013).</li>
<li>Gessner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changing+Biosynthetic+Profiles+by+Expressing+bldA+in+Streptomyces+Strains%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Changing Biosynthetic Profiles by Expressing bldA in Streptomyces Strains.</a> ChemBioChem. 16 (15), 2244-2252 (2015).</li>
</ol>

저자는 공개할 것이 없습니다.

이 실험에서는 스트렙토 diastatochromogenes 게놈의 코스 미드 라이브러리를 생성하고 매우 시간 소모적 인 과정을 통해 polyketomycin 유전자 클러스터의 식별 결과 오래전 스크리닝 하였다. 단일 유전자의 특성은 타겟 유전자 삭제하고, 생성 된 돌연변이 체 (12)의 분석을 통해 가능했다. 최근, S.의 diastatochromogenes 초안 게놈 서열은 polyketomycin 생합성 유전자 클러스터의 빠른 확인을 가능하게 얻었다. 초안 게놈 시퀀스는 여전히 많은 콘티가 포함되어 있지만, 우리는 쉽게 생합성 유전자를 검출 할 수있다. 설명 된 과정은 개월 이내에 달성 될 수있다. 그러나, 절차는 다수의 단계를 포함한다. 단일 단계는 다음 단계로의 진행을 방지하는 여러 번 실패 할 수있다 : 속은 스트렙토 생리 활성 화합물을 생성하는 능력에 대해 공지되어있다. 그들은 종종 20 개 이상의 바이오스를 수행하는 동안일반적으로 하나 또는 두 화합물은 실험실 조건에서 일어난다 ynthetic 유전자 클러스터. 침묵 유전자 클러스터를 깨울 수있는 OSMAC 방식 (다른 조건에서 하나의 균주의 배양)의 적용은 때로는 충분하지 않을 수 있습니다. 예다면 발현 성 조절 유전자 ADPA 44, 45, 46 등 bldA 조절 유전자의 유전자 조작은, 다른 이차 대사 산물의 생산을 활성화 할 수있는 효과적인 방법이다. NMR 분석에 의해 예 화합물의 구조 규명을 위해, 정제 된 화합물을 일반적으로 2 개 이상의 밀리그램이 필요하다. 따라서, 10 개 이상의 L 문화의 발효는 종종 필요합니다. 산소, pH 및 온도 조건을 유지 할 수있는 발효기없이, 문화 및 후속 추출이 양을 처리 할 수있는 작은 실험실에서 어려울 수 있습니다. 정제 중에, 상기 화합물은 산화에 의한 방사선 또는 온도로 변경 될 수있다.또한, 이상의 정제 단계는 높은 분해의 가능성을 사용한다. 천연 생성물의 구조 및 게놈 클러스터를 분석 할 때, 때때로 해당하는 클러스터를 식별하는 것을 용이하지 않다. 단지 초안 게놈 시퀀스가있는 경우 첫째, 클러스터의 일부가 누락 될 수 있습니다. 둘째, 생합성에 필요한 모든 유전자 클러스터에 있지. 셋째, 때때로 많은 클러스터 킬로베이스가 서로 분리 된 두 부분으로 분할된다. 넷째, 적절한 유전자 클러스터 어느 하나를 결정하기 어려울 수있다. 이 모듈의 개수에 기초하여 확장 유닛의 개수를 계산, 또는 상기 선택 영역을 분석하여 하나의 확장 유닛을 식별 할 수있다 큰 PKS 유형 I 또는 NRPS 시스템의 경우에, 쉽게집니다. 그러나, 반복적으로 작동하는 경우에, 합성 화합물의 예측 특히 STRA 경우가 종종 불가능 효소에 40 개 이상의 유전자 클러스터를 보유하고 있습니다. 다섯째, 자연은 매우 복잡하고 아직 알 수없는 화합물이 가득합니다. 종종 다른 생합성 경로의 혼합물이다. 신규 화합물은 다른 화합물에 관한 아직 식별 여부되지 않는다면 생합성 모델을 제안하고 증명 클러스터를 식별하기 어려울 수있다. 클러스터가 식별되면, 단일 크로스 오버 기술은 가정을 확인하는 것이 빠른 방법이다. PCR, 자살 벡터, 접합, 긍정적 인 클론의 선택, 생산 분석에 복제에 필요한 유일한 단계입니다. 이 기법의 단점은 염색체 내로 벡터의 통합으로 인해 상기 재조합으로 안정하지 않다는 것이다. 따라서, 상기 하나의 유전자를 분석하기 위하여, 정확한 유전자 결실이 필요하다. 또한 그것은 유전자 수준에서 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces) 균주를 조작하는 까다로운 일이 될 수 있습니다. 설명 된 절차는 t을 할당 할 수 있습니다방선균 또는 다른 미생물에 의해 생성 된 임의의 다른 화합물을 오. 생합성 유전자 클러스터 및 합성 화합물에 대한 지식은 우리에게 다제 내성 병원균과의 싸움을 위해 그들을 향상을 목표로 기존의 분자를 수정할 수있는 추가 기회를 제공합니다.

식물과 미생물로부터 천연 제품은 항상 임상 약물 개발 및 연구를위한 중요한 원천이었다. 최초의 항생제 페니실린은 알렉산더 플레밍 (1)에 의해 곰팡이에서 1928 년에 발견되었다. 요즘, 많은 천연 제품은 임상 치료에 사용된다. 다른 생리 활성 이차 대사 산물의 다양한 종류를 생산하는 자사의 능력에 대해 알려진 하나 속 스트렙토 마이 세스입니다. 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces)은 그람 양성 세균과 방선균의 클래스와 순서 방선균 목에 속한다. 임상 적으로 사용되는 항생제의 거의 3 분의 2는 3 테트라 사이클린 4 daptomycin, 암포 테리 신 2와 같이 주로 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces)에서, 방선균 목에서 파생됩니다. 두 노벨상은 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces) 항생제 연구의 분야에서 수상했습니다. 첫번째는 스트렙토 마이신의 발견은 먼저 대한 셀만 브와 왁스 갔다결핵에 대한 효과적인 tibiotic. 5 2015 년, 생리학 및 의학 노벨상의 일환으로, S.의 avermitilis에서 avermectin에의 발견은 물론 수상했다. avermectin에 기생 -6,7- 질환의 치료에 사용된다. 예컨대 스트렙토 같은 미생물 천연 제품의 발견에 대한 전통적인 접근은 일반적으로 다른 성장 조건 하에서 배양 균주뿐 아니라 추출 및 이차 대사 산물의 분석을 포함한다. 생체 활성 분석 (항균 항암 활성에 대한 분석은 예) 화합물의 활성을 검출하기 위해 수행된다. 마지막으로, 관심있는 화합물을 분리하였고, 화학 구조가 밝혀져있다. 천연물의 구조는 종종 복잡한 분자 형성되어 단일 부분으로 구성된다. 블록 건물로 이어지는 몇 가지 있지만, 제한, 주요 생합성 경로가 있습니다자연 산물의 생합성에 사용되는 KS. 주요 생합성 경로는 설탕 부분으로 이어지는 폴리 케 티드 경로, 아미노산을 사용 테르 페 노이드 및 알칼로이드, 경로으로 이어지는 경로 및 경로입니다. 각 경로는 특정 효소 (8)의 집합을 특징으로한다. 화합물의 구조를 기반으로 이러한 생합성 효소가 예측 될 수있다. 오늘날, 차세대 시퀀싱 및 생물 정보학적인 분석과 함께 화합물의 상세한 구조 분석을 담당 생합성 유전자 클러스터를 식별 할 수있다. 클러스터 정보는 더 자연 제품 연구에 대한 새로운 방법을 연다. 이 유전자 삭제 또는 변경 및 기타 경로에서 유전자 조합 생합성에 의해 천연 제품의 수율, 목표 화합물의 변형을 증가시키는 이종 표현을 포함한다. Polyketomycin은의 배양액으로부터 독립적으로 분리 하였다두 균주 스트렙토 마이 세스 특검팀. MK277-AF1 9 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces) diastatochromogenes Tü6028 10. 구조는 NMR 및 X 선 분석에 의해 밝혀졌다. Polyketomycin는 β-D-amicetose와 α-L-axenose 두 디 옥시 당 부분으로 연결하는 테트라 decaketid 및 다이 메틸 살리실산으로 구성되어있다. 그것은 심지어 MRSA (11) 그람 양성 다제 내성 균주에 대해, 세포 독성 항생제 활동을 표시합니다. S. diastatochromogenes Tü6028의 게놈 코스 미드 라이브러리를 생성하고 몇 년 전에 상영되었다. (41) 유전자를 포함, 52.2 킬로바이트의 크기로 polyketomycin 유전자 클러스터를 특정 유전자를 프로브를 사용하여 강렬한 작품 12의 몇 달 후 확인되었다. 최근, S.의 diastatochromogenes 초안 게놈 서열은 polyketomycin 생합성 유전자 클러스터의 빠른 확인 선도 얻었다. 이러한 개요에서, 방법은 아이덴 돕는천연물을 tify 및 생합성 유전자 클러스터는 예를 들어 polyketomycin하여 설명한다 명료. 여기에서 우리는 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces) diastatochromogenes Tü6028에 의해 생성 polyketomycin에 대해 도시의 생합성 유전자 클러스터에 천연 제품에서 이어지는 하나의 단계를 설명합니다. 프로토콜은 항생 물질 특성을 갖는 천연 생성물의 동정 및 정제를 포함한다. 또한 구조 분석 및 생합성 유전자 클러스터의 식별에 게놈 마이닝 리드의 결과와 비교. 이 절차는 방선균 또는 다른 미생물 유래의 다른 화합물에도 적용 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>agar</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td><td>5210.4</td><td></td></tr><tr><td>agarose</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td><td>6352.4</td><td></td></tr><tr><td>D-mannitol&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td><td>4175.1</td><td></td></tr><tr><td>포도당&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td><td>6780.1</td><td></td></tr><tr><td>LB&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td><td>X964.3</td><td></td></tr><tr><td>맥아 추출물&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td><td>X976.2</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td><td>2189.1</td><td></td></tr><tr><td>펩톤&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, 독일 카를스루에&</td><td></td><td></td></tr><tr><td>nbsp;</td><td>W.Schoenemberger GmbH, Magstadt, Germany</td><td></td><td>Hensec-Vollsoja</td></tr><tr><td>트립틱 콩 육수</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td><td>X938.3</td><td>Caso-Bouillon</td></tr><tr><td>효모 추출물&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td><td>2363.2</td><td></td></tr><tr><td>Solvents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td><td>3738.5</td><td></td></tr><tr><td>아세톤&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td><td>9372.2</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Avantor Performance Materials B.V., Deventer, The Netherlands</td><td>JT-9012-03</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorofrom&nbsp;</td><td>Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Germany</td><td>1530754</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td><td>4720.1</td><td></td></tr><tr><td>DMSO-d6 (Dimethyl sulfoxide-d6) 99.9 atom% D</td><td>ARMAR Chemicals, D&ouml; ttingen, 스위스</td><td>15200.204</td><td></td></tr><tr><td>에틸 아세테이트</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td><td>6784.4</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td><td>6331.4</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td><td>7342.1</td><td></td></tr><tr><td>Enzymes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>제한 효소</td><td>New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>polymerase&nbsp;</td><td>New England Biolabs GmbH, 독일 프랑크푸르트 암 마인</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA 중합효소 I 대형 (Klenow) 단편</td><td>Promega GmbH, 독일 만하임</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antibiotics</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>apramycin</td><td>AppliChem GmbH, 다름슈타트, 독일&nbsp;</td><td>A7682.0005</td><td></td></tr><tr><td>fosfomycin</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Germany</td><td>P5396-50G</td><td></td></tr><tr><td>kanamycin</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td><td>T832.2</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid/Vectors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pKC1132</td><td>Bierman et al. 1992</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer& 주의; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pokPI_for</td><td>TGATGGTGCCGCTGGCCATGG</td><td>프라이머는 pokPI 유전자</td><td></td>를 포함하는 단편을 증폭합니다</tr><tr><td>. pokPI_rev</td><td>AGCGTTCACTGTTCCGCCCGAC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacterial strains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacillus subtilis COHN ATCC6051</td><td></td><td>Gram-positive test strain&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli ET12567 pUZ8002&nbsp;</td><td>MacNeil et al. 1992</td><td>conjugation</td><td></td>용 균주</tr><tr><td>Escherichia coli XL1 Blue</td><td>Agilient Technologies, Santa Clara, USA</td><td>그람 음성 테스트 균주 + 클로닝 호스트&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Streptomyces diastatochromogenes T&uuml; 6028</td><td>Paululat et al., 1999</td><td>Polyketomycin producer</td><td></td></tr><tr><td>Online services</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>antismash (Antibiotics and Secondary Metabolite Analysis Shell)</td><td>http://antismash.secondarymetabolites.org/</td> <td>Detection of secondary metabolite gene cluster</td><td></td></tr><tr><td>BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)</td><td>http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</td><td>생물학적 염기서열</td><td></td>GenDB https://www.uni-giessen.de/fbz/fb08/Inst/bioinformatik/software/gendb ORF의 주석 사이의 유사성 영역을 찾습니다</tr><tr><td></td><td></td><td>&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MiBIG (Minimum Information about a Biosynthetic Gene cluster)</td><td>http://mibig.secondarymetabolites.org/</td> <td>Database of biosyntetic gene clusters</td><td></td></tr><tr><td>NaPDoS</td><td>http://napdos.ucsd.edu/</td> <td>seconary metabolite gene cluster</td><td></td></tr><tr><td>NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline</td><td>http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/annotation_prok/</td> <td>ORFs의 주석;</td><td></td></tr><tr><td>NRPSpredictor</td><td>http://nrps.informatik.uni-tuebingen.de/</td> <td>NRPS 도메인</td><td></td></tr><tr><td>Prokka (rapid prokaryotic genome annotation)</td> 감지 <td>http://www.vicbioinformatics.com/software.prokka.shtml</td><td>ORF의 주석&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RAST (Rapid annotation using subsystems technology)</td><td>http://rast.nmpdr.org/</td> <td>ORF의 주석&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>기타 프로그램</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chem Station Rev. A.09.03</td><td>Agilent Technologies, Waldbronn, Germany</td><td>HPLC 처리 프로그램&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Clone Manager Suite 7</td><td>과학 및 교육 소프트웨어, Cary, USA</td><td>복제 실험 설계&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Newbler v2.8</td><td>Roche Diagnostics</td> 시<td>퀀싱 정렬은 다음과 같습니다<</td><td></td></tr><tr><td>strong>Machines&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Avanti J-6000, Rotor JA-10</td><td>Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC/MS</td><td>Agilent Technologies, Waldbronn, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>_Autosampler: G1313A</td><td>Agilent Technologies, Waldbronn, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>_Pre-column: XBridge C18 (20 mm x 4.6 mm; 입자 크기: 3.5 &마이크로; m)</td> <td>Agilent Technologies, Waldbronn, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>_Column : Xbridge C18 (100mm &times; 4.6 mm; 입자 크기: 3.5 &mu; m)</td> <td>Agilent Technologies, Waldbronn, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>_semi-prep Pre-Column : Zorbax B-C18 (9.4 x 150 mm; 입자 크기: 5 &마이크로; m)</td> <td>Agilent Technologies, Waldbronn, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>_semi-prep 칼럼 : Zorbax B-C18 (9.4 x 20 mm; 입자 크기: 5 &마이크로; m)</td> <td>Agilent Technologies, Waldbronn, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>_Degasser : G1322A&nbsp;</td><td>Agilent Technologies, Waldbronn, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>_Quarternary 펌프: G1311A</td><td>Agilent Technologies, Waldbronn, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>_Diode 어레이 검출기(DAD)G1315B(&lambda; = 254nm 및 400nm)</td><td>Agilent Technologies, Waldbronn, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>_Quadrupole 질량 검출기(MSD) G1946D(2-3000 m/z)</td><td>Agilent Technologies, Waldbronn, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>회전 증발기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>_heating 욕조 Hei-VAP Value/G3</td><td>Heidolph Instruments GmbH & Co.KG, Schwabach, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>_vacuum 펌프 시스템 SC 920 G</td><td>KNF&nbsp; 글로벌 전략&nbsp; AG, Sursee, 스위스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>기타 재료</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sephadex LH20</td><td>GE Healthcare,&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>크로마필 PVDF-45/15MS (기공 크기 0.45 &마이크로; m; 필터 &오슬래시; 15mm)</td><td>MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG, D&uuml; ren, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPE 컬럼 Oasis HLB 20 35 cc (6g)</td><td>Waters GmbH, Eschborn, Germany&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. 대장균&nbsp; </td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td><td></td><td>매체: LB, 구성: LB, 1 L H2O: 20 g</td></tr><tr><td>Bacillus&nbsp; </td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td><td></td><td>매체: LB, 구성: LB, 양 1 L H2O: 20 g</td></tr><tr><td>Streptomyces sp.</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td><td></td><td>매체: TSB, 구성: CASO Boullion, 1 L H2O: 30 g</td></tr><tr><td>곰팡이&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td><td></td><td>매체: YPD, 구성: 효모 추출물, 1 L H2O: 10 g</td></tr><tr><td>곰팡이&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td><td></td><td>매체: YPD, 구성: 펩톤, 1 L H2O: 20 g</td></tr><tr><td>곰팡이&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td><td></td><td>매체 : YPD, 구성 : 포도당, 1 L h 2O : 20 g</td></tr><tr> < colspan = "4 "> 한천 플레이트의 경우 2 % 한천 추가</td></tr></tbody></table>

에서 polyketomycin를 사용하여 데모 : 그 생합성 유전자 클러스터에 천연 제품에서 스트렙토 마이 세스 (streptomyces)의 diastatochromogenes tü6028

From a Natural Product to Its Biosynthetic Gene Cluster: A Demonstration Using Polyketomycin from Streptomyces diastatochromogenes T&#252;6028

스트렙토 균주 다양한 생리 활성을 가진 다른 화합물을 많이 생성하는 그들의 능력에 대해 공지되어있다. 상이한 조건에서 배양들은 신규 화합물의 생산 효율을 높일 수있다. 따라서, 생산 균주의 배양 물을 에틸 아세테이트로 추출하고, 조 추출물을 HPLC에 의해 분석된다. 또한, 추출물 다른 분석하여 자신의 생체 활성에 대해 시험한다. 구조 해명 들어 관심의 화합물은 다른 크로마토 그래피 방법의 조합에 의해 정제한다. 게놈 마이닝 결합 게놈 서열은 다른 컴퓨터 프로그램을 사용 천연물 생합성 유전자 클러스터의 식별을 허용한다. 유전자 비활성화 실험을 수행 할 수 있고, 정확한 유전자 클러스터가 발견되었음을 확인한다. 생성 된 돌연변이 체는 특히 천연 제품의 생산에 대해 분석한다. 정확한 유전자 클러스터가 비활성화되면,균주의 화합물을 제조하는 데 실패한다. 워크 플로는 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces) diastatochromogenes Tü6028에 의해 생성 된 항균 화합물 polyketomycin에 대해 표시됩니다. 게놈 시퀀싱은 여전히 ​​매우 비싼 때 약 10 년 전, 유전자 클러스터의 복제 및 식별은 매우 시간이 많이 소요되는 과정이었다. 게놈 마이닝과 함께 빠른 게놈 시퀀싱 클러스터 식별 재판을 가속화하고 새로운 방법 생합성을 탐구하고 유전 적 방법으로 새로운 천연 제품을 생성하기 위해 열립니다. 이 논문에 기재된 프로토콜은 방선균 또는 다른 미생물 유래의 다른 화합물에 할당 될 수있다.

이 개요에서 우리는 그 생합성 유전자 클러스터에 이르는 항생제의 식별에서 하나의 단계를 설명합니다. 몇 년 전 우리가 파지로 그들을 패키지 코스 미드 라이브러리를 복제, 대장균 숙주 세포를 형질 도입하고, polyketomycin 클러스터의 중복 영역을 갖는 클론을 식별하기 위해 식민지의 수천을 선별했다. 코스 미드의 시퀀싱도 어렵고 비용 처리 (12)이었다. 변형에 대한 추가 연구를 수행하기 위해 우리는 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces) diastatochromogenes Tü6028의 전체 게놈 염기 서열. 초안 게놈 시퀀스를 통해 우리가 쉽게 polyketomycin 유망한 화합물을 인코딩 다른 클러스터의 생합성 유전자 클러스터를 확인했다. 도 7은 코스 미드 라이브러리 스크리닝 정교한 클로닝하여 생합성 클러스터를 식별하는 "이전"방법을 비교하고,거친 시간 척도에 후속 게놈 마이닝과 전체 게놈 시퀀싱에 의해 "새로운"방법. 새로운 시퀀싱 기술 및 새로운 게놈 마이닝 프로그램은 전체 프로세스의 속도. <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/54952/54952fig7.jpg"> 그림 7 : 생합성 유전자 클러스터 할당의 "이전"과 "새로운"방법의 비교. "오래된"방법은 양성 클론의 선택과 각 코스 미드 (들)의 시퀀스와 코스 미드 라이브러리의 클로닝 (위)와; "새로운"방법은 전체 게놈 시퀀싱 및 변형 (아래)의 게놈에있는 모든 보조 대사 유전자 클러스터를 식별하기 위해 -mining를 포함한다. 단일 단계의 소요 시간은 대략적인 시간 스케일에 표시됩니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54952/54952fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

다음은 (A) 항균 활성을 갖는 천연 제품의 식별, (B) 화합물의 정제 (C)의 생합성의 첫 모델 (D) 게놈 시퀀싱 / -mining 및 상세한 프로토콜을 제시 ( E) 생합성 유전자 클러스터의 확인.

에서 Polyketomycin를 사용하여 데모 : 그 생합성 유전자 클러스터에 천연 제품에서 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces)의 diastatochromogenes Tü6028

Streptomyces strains are known for their capability to produce a lot of different compounds with various bioactivities. Cultivation under different ...

이 워크플로우의 전반적인 목표는 게놈 마이닝을 통해 항생제 활성이 있는 천연 제품을 식별하고, 화합물을 정제하고, 생합성 유전자 클러스터를 결정하는 것입니다. myto 내성 병원체의 수가 증가함에 따라 새로운 항생제가 시급히 필요합니다. 스트렙토마이신 균주는 항생제 생산자로 알려져 있으며 우리는 그 잠재력을 활용해야 합니다.항생제 바이오신 이종 클러스터에 대한 지식을 바탕으로 생합성 경로를 제안하고 화합물을 추가로 변형할 수 있습니다. 이러한 절차는 해당 유전자 클러스터를 식별하는 데 도움이 됩니다. 라디오는 스트렙토마이신 균주로 시연됩니다.그러나 다른 미생물에 적용될 수 있습니다. 시작하려면 스트렙토마이신 균주를 다른 매체 또는 배양 시간과 같은 다양한 조건에서 던집니다. 3, 000 시간 G.And에 10 분 동안 분리기분리에 의하여 세포를 추수하십시오 새로운 플라스크로 상등액을 옮기십시오.배양 배지에서 화합물을 추출하려면 1 몰 염산을 첨가하여 상등액을 PH4로 조정하십시오. 그리고 분리 깔때기로 옮깁니다. 그런 다음 같은 부피의 에탈 아세테이트를 넣고 혼합물을 180rpm에서 30분 동안 흔듭니다.다음으로, 에탈 아세테이트 상을 수집하고 여과지를 통해 둥근 바닥 플라스크로 옮깁니다. 에탈 아세테이트를 섭씨 40도 및 240bar에서 회전 증발로 증발시킵니다. 균사체에서 화합물을 추출하려면 세포를 2배 부피의 아세톤으로 재현탁합니다.튜브의 세포를 180rpm으로 30분 동안 흔듭니다. 여과지를 통해 액체를 걸러냅니다. 그런 다음 섭씨 40도 및 550bar에서 회전 증발기를 사용하여 아세톤을 증발시킵니다.건조 된 추출물을 20 밀리리터의 물 에탈 아세테이트에 용해시키고 이전과 같이 화합물 추출을 계속합니다. 그런 다음 건조 추출물을 메탄올에 용해시킵니다. 0.45마이크로미터 기공 크기 필터를 통해 필터링합니다.그리고 추출물을 HPLC 바이알로 옮깁니다. 샘플을 HPLC 기계에 주입하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 미처리 추출물을 분석합니다. 디스크 확산 분석을 사용하여 항생제 활성을 식별하려면 다양한 테스트 균주 사전 배양을 각 한천 플레이트에 퍼뜨립니다.그런 다음 용해된 추출물 20-50마이크로리터를 멸균 종이 디스크에 피펫팅합니다. 또한 용제가 함유된 음성 대조군과 적절한 항생제가 함유된 양성 대조군을 준비합니다. 종이 디스크를 30분 동안 건조시킨 후 테스트 배양액이 있는 플레이트에 옮깁니다.적절한 조건에서 테스트 스트레인 플레이트를 배양합니다. 그런 다음 각 테스트 변형률에 대한 명백한 억제 영역을 결정합니다. 억제 영역이 존재하는 경우, 대규모 배양에서 책임 화합물을 정제하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 구조를 규명합니다.정제하는 동안 화합물은 산화, 방사선 또는 온도로 인해 변할 수 있습니다. 더 많은 정제 탭을 사용할수록 성능 저하 가능성이 높아집니다. 최대 5mg의 화합물은 일반적인 게유전자를 분석하는 데 필요한 최소값입니다.분리된 화합물의 화학 구조를 분석하고 생합성에 관여할 수 있는 효소를 예측합니다. 여기서 poly cidomycin은 절차를 설명하기 위한 예로 사용됩니다. 먼저, 구조를 명백한 단일 부분으로 세분화합니다.폴리시도마이신은 테트라사이클릭 부분, 2개의 단당류 및 디메틸살리실산으로 구성됩니다. 다음으로, 모이어티가 파생될 수 있는 클러스터에서 추정 유전자를 예측합니다. 여기서 테트라 사이 클릭 부분은 폴리 키 유형 synphase type II.에서 파생 될 수 있습니다 반면, dimethylsalicylic moiety는 반복 폴리 키 유형 synphase type I.에서 파생 될 수 있습니다. 마찬가지로 6 개의 deoxy 당인 두 개의 당 부분은 생합성 중에 dNDP-glucose-4, 6-dehydratase를 포함하는 포도당에서 합성되고 두 개의 glycosyltransferase에 의해 부착 될 수 있습니다.차세대 염기서열분석 기술로 게놈 DNA를 염기서열분석합니다. 2차 대사산물 유전자 클러스터의 식별을 위해 antiSMASH, Natural Product Domain seeker 또는 NRPS predicter와 같은 프로그램을 실행합니다. 게놈 염기서열을 fasta 형식으로 제출합니다.몇 시간 후 결과는 이메일 링크를 통해 전송됩니다. 연쇄상 연쇄상 발색체 디아스타토크로모진(streptimyoces diastatochromogenes)의 게놈 초안에서, antiSMASH는 22개의 추정 유전자 클러스터를 식별했습니다. 효소 경로에 대한 추정 유전자 클러스터를 분석합니다.화합물 합성에 관여할 수 있는 유전자가 포함된 클러스터를 검색합니다. 아스타토크로모제에서 클러스터 II는 poly keytype synphase type II 유전자, iterative PKS type I에 대한 3개의 유전자, dTDP-glucose-4, 6-dehydratase 유전자 및 2개의 glycosyltransferase 인코딩 유전자를 포함합니다. 클러스터를 다른 클러스터와 비교하기 위해 antiSMASH는 유사한 생합성 유전자 클러스터 및 해당 제품에 대한 주석 및 추가 정보가 포함된 MIBiG 데이터베이스에 대한 링크를 제공합니다.화합물의 구조를 알려진 다른 화합물과 비교하여 유사성을 확인합니다. 원인이 되는 생합성 유전자 클러스터를 식별하는 것은 간단할 수 있습니다. 그러나 몇 가지 경우에는 매우 어려울 수도 있습니다.제안된 유전자 클러스터가 화합물의 생합성을 담당하는지 확인하기 위해 클러스터 내의 유전자를 검색하고 생합성의 중심 기능을 가진 효소를 코딩합니다. 폴리시도마이신 유전자 군집을 확인하기 위해, PKS 유형 II의 케토신타제 알파를 코딩하는 유전자 pokPI one을 선택하고 프레임 외 삭제에 의해 비활성화했습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 단일 크로스오버 구축물의 클로닝 및 접합 후.단일 크로스오버 돌연변이를 확인하십시오. 이를 위해 100ml의 생산 배지에 검증된 유전자 중단을 포함하는 단일 클론을 접종합니다. 이전에 사용한 것과 동일한 조건에서 세포를 배양합니다.앞과 같이 미처리 추출물 추출을 진행합니다. 마지막으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 HPLC MS 분석을 통해 생산을 확인합니다. HPLC 크로마토그램의 해당 피크와 화합물의 질량은 검출 가능하지 않아야 합니다.poly cidomycin 생합성 유전자 클러스터는 유전자 결실 실험에 의해 검증되었습니다. 여기에 표시된 것은 야생형 S.Diastatochromogenes의 미처리 추출물과 인터럽트 pokPI one 유전자를 가진 돌연변이 균주의 HPLC 크로마토그램입니다. 돌연변이 균주는 더 이상 폴리 시도마이신을 생성하지 않습니다.일단 숙달되면 이 절차를 몇 달 안에 완료할 수 있습니다. 수년 전만 해도 생합성 유전자 클러스터를 식별하는 데 많은 시간이 걸렸습니다. 오늘날 게놈 염기서열 분석과 게놈 마이닝은 이 과정을 강력하게 가속화하고 있습니다.이 비디오를 시청한 후에는 새로운 화합물에서 생합성 유전자 클러스터로 이동하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 전체 절차를 한 단계로 보여드렸으므로 지금 다른 천연 제품 생산업체에 할당할 수 있습니다. 유전자 클러스터와 합성된 화합물에 대한 지식은 생합성 경로에 대한 통찰력을 제공합니다.이것은 우리에게 그것들을 개선하기 위해 이미 존재하는 분자를 수정할 수 있는 더 많은 기회를 제공합니다.

from-natural-product-to-its-biosynthetic-gene-cluster-demonstration

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

합성 오페론 인코딩 모두 분비 장치와 curli 섬유의 구조 단량체의 디자인이 설명되어 있습니다. 이 amyloids와 자기편 고분자의 과잉은의 준수 측정 게인을 할 수...

단일 합성 Curli 오페론을 생성하여 공학 점착성의 박테리아를

을 통해 에리스로 마이신의 heterologous...

을 통해 생산 단지 항생제 에리스로 마이신을 자랑하는 논리, 실험 단계, 그리고 Heterologous 자연 제품 생합성의 잠재적<em&gt; E. 대장균</em

다양한 응용 분야에 걸쳐 구현하기 위해 향상된 효소 안정성을 제공하는 효소 포장 외막 소포체(OMV)의 생산, 정제 및 사용을 위한 프로토콜이 제시됩니다.

에서 외부 막 소포 내에서 감독 단백질 포장<em&gt; 대장균</em&gt; : 디자인, 생산 및 정제

이 연구는 pMGX 플라스미드 시스템을 사용하여 대장균 에서 단일 플라스미드로부터 다중 유전자의 T7 매개 공동 - 발현을위한 방법을 기술한다.

유도 성 T7 RNA 중합 효소 매개 멀티젠 발현 시스템, pMGX

여기서 우리는 대장균 또는 니코티아나 벤타미아나에서생합성 효소의 합성 발현을 통해 디테르페노이드 대사산물을 생산하고 정화하기 위한 프로토콜을 쉽게 사용하고 크로마토그라피 생성물을 제시합니다. 정화. 생성된 대사산물은 분자 구조 특성화, 효소 기능성 연구 및 생체 활성 검정을 포함한 다양한 연구에 적합합니다.

디테르페노이드 천연제품의 효소 생산 및 정화를 위한 맞춤형 접근법

여기서 우리는 특정 표적 펩티드를 바이오티게팅하는 대장균 비오틴 단백질 리가제 BirA의 신규한 변이체를 선택하는 방법을 제시한다. 프로토콜은 표적 펩티드의 세균 디스플레이를 위한 플라스미드의 생성, BirA 라이브러리의 생성, BirA 변이체의 선택 및 특성화에 대해 설명한다.

새로운 생물항제 효소 선택을 위한 박테리아 펩타이드 디스플레이

질량 분광법 유도 게놈 마이닝 프로토콜이 확립되고 여기에 설명되어 있습니다. 그것은 게놈 순서 정보 및 LC-MS/MS 분석을 기반으로 하고 복잡한 미생물 및 식물 추출물에서 분자의 식별을 용이하게 하는 것을 목표로 합니다.

새로운 천연 제품을 발견하는 도구로 질량 분광법 유도 게놈 채굴

이 프로토콜은 연쇄상 구균 베네수엘라 세포 없는 전사 변환(TX-TL) 시스템에서 재조합 단백질의 높은 수율을 합성하는 향상된 방법을 자세히 설명합니다.

합성 생물학 및 천연 제품 응용 을 위한 고수성 연쇄상 구형 전사 -번역 도구 키트

우리는 mini-Tn7 기반 발현 시스템을 사용하여 Acinetobacter baumannii의 조작된 유출 결핍 균주에 유출 펌프 유전자의 단일 복제 염색체 보완을 위한 손쉬운 절차를 설명합니다. 이 정밀한 유전 도구는 유전자 발현을 제어할 수 있으며, 이는 다제내성 병원체에서 유출 펌프의 특성 분석에 핵심입니다.

유출 결핍 박테리아 균주 및 단일 복제 유전자 발현 시스템을 사용한 Acinetobacter baumannii 의 다제 유출 시스템 특성 분석

여기에서는 테트라사이클린 제어 기반 유도 합성 회로를 설계, 구축 및 전달하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 기생충 제거 및 사이토카인 발현에 대한 합성 회로의 영향은 제시된 파이프라인을 채널화하여 연구할 수 있습니다. 이 프로토콜은 전염병의 합성 회로 기반 치료법을 연구하는 연구자와 관련이 있습니다.

Immunometabolic Circuits in Infection for Advancing Host Directed Therapies(숙주 지향 치료법 발전을 위한 감염의 면역대사회로)

학습하세요 항생 활성을 가진 천연물질을 식별하고 정제하며 유전체 마이닝을 통해 생합성 유전자 클러스터를 규명하는 방법을 Streptomyces diastatochromogenes를 이용하여. 이 기법은 새로운 항생제 발견에 필수적입니다.

에서 Polyketomycin를 사용하여 데모 : 그 생합성 유전자 클러스터에 천연 제품에서 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces)의 diastatochromogenes Tü6028

더 많은 동영상 탐색