Xenopus의 난 모세포 : 미세 주입을위한 최적화 방법, 여포 세포 레이어의 제거 및 전기 생리 실험에서 빠른 해결 방법 변경

이 절차의 전반적인 목표는 Xenopus 난모세포의 이온 채널과 같은 새로운 단백질을 발현하는 것입니다. 이 방법은 기능적 발현 시스템이 필요한 모든 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기법 변형의 주요 장점은 난모세포의 속도, 신뢰성 및 생존율 향상입니다.

이 방법은 이온 채널의 기능에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 다른 단백질의 연구에 적용할 수 있습니다. 이 방법에 대한 아이디어는 고전적인 방법이 난모세포 생존율이 낮다는 것을 깨달았을 때 처음 떠올랐습니다.

텍스트 프로토콜에 따라 암컷 개구리의 난소엽을 제거한 후, 페니실린과 스트렙토마이신이 보충된 멸균 변형 바르트 용액(Sterile Modified Barth's Solution)에 엽을 넣습니다. 조직이 산소에 접근할 수 있도록 엽을 잘라냅니다. 5-6단계의 난포를 골라내려면 집게를 사용하여 난소를 잡은 다음 난포 위로 백금 고리를 내리고 고리를 부드럽게 빼내어 난소 조직에서 난포와 결합 조직을 파괴합니다.

백금 고리를 사용하여 건강해 보이는 난모세포를 분류합니다. 팁이 1.5mm 직경으로 절단된 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 선택한 난포를 35mm 직경의 페트리 접시로 옮깁니다. 텍스트 프로토콜에 따라 GABA A 수용체 및 마이크로 주입 피펫에 대한 cRNA를 준비한 후 파라핀 오일과 얇은 바늘이 있는 10ml 주사기를 사용하여 마이크로 주입 피펫을 다시 채웁니다.

그런 다음 집에서 만든 마이크로 분사 장치에 피펫을 장착합니다. 멸균 플라스틱 팁이 있는 피펫을 사용하여 mRNA 용액 한 방울을 방습 열가소성 수지 조각의 깨끗한 면에 놓습니다. 그런 다음 주입 피펫의 끝을 액적에 담그고 모터를 켜서 플런저를 후퇴시킵니다.

mRNA 용액은 피펫에 들어가 오일과 가시적인 계면을 형성해야 합니다. 다음으로, 물방울에서 피펫 끝을 집어넣고 주입 피펫 내부에 양압을 가합니다. mRNA 용액 방울이 주입 피펫 끝에 형성되어야 합니다.

바닥에 나일론 메쉬를 붙이고 주사를 위해 MBS로 덮은 60mm 페트리 접시를 사용하여 식물 기둥이 위쪽을 향하도록 난포를 정렬합니다. micromanipulator를 사용하여 주입 피펫을 개별 모낭 위에 놓습니다. 주사 바늘을 식물 기둥 중앙에 삽입하고 피펫 내부에 양압을 가하여 분당 0.6마이크로리터의 유속으로 50나노리터의 mRNA를 주입합니다.

메신저 RNA가 빠져나가는 것을 방지하기 위해 여포에서 주입 피펫 팁을 제거하기 전에 5-10초 동안 기다립니다. 주입된 난포를 2밀리리터의 MBS로 채워진 새 페트리 접시로 옮깁니다. 접시를 섭씨 18도로 설정된 와인 쿨러에 넣습니다.

새로 발현된 단백질의 정체에 따라 기록하기 1일에서 7일 전에 주입된 여포를 배양합니다. 여포를 제거하기 위해 주입된 10개의 난포를 0.5ml의 MBS, 1ml당 1mg의 콜라겐분해효소, 0.1ml/ml의 트립신 억제제가 들어 있는 붕규산 유리관에 옮깁니다. 튜브를 섭씨 36도의 수조에 담그고 20분 동안 난포를 배양합니다.

이곳의 온도는 1도 이상 난모세포를 죽일 수 있기 때문에 매우 중요합니다. 실온에서 1ml의 MBS가 들어 있는 두 번째 튜브로 난포를 옮겨 헹구고 약 10초 동안 튜브에 그대로 둡니다. 그런 다음 4밀리몰 EGTA가 포함된 0.5ml의 이중 농도 MBS가 들어 있는 세 번째 튜브로 여포를 옮기고 실온에서 4분 동안 샘플을 배양하면서 때때로 튜브를 흔듭니다.

4분의 배양 시간은 난포층이 난모세포에서 분리되도록 하는 데 중요합니다. 실온에서 MBS 1ml가 들어 있는 다른 튜브로 모낭을 옮겨 헹구고 약 10초 동안 튜브에 그대로 둡니다. 난모세포를 2밀리리터의 MBS가 들어 있는 35mm 페트리 접시로 옮깁니다.

그런 다음 실체 현미경으로 백금 루프를 사용하여 벌거벗은 난모세포를 밀어내기만 하면 난포에서 바깥쪽 외피를 분리합니다. 탈락된 난모세포는 사용할 때까지 보관하십시오. 이 실험에서는 기계적으로 선별된 제노푸스 난모세포에 GABA A 수용체 서브유닛을 위한 mRNA 코팅을 미세 주입했습니다.

그런 다음 여포 세포층을 제거했습니다. 난모세포는 음의 80밀리볼트에서 전압 클램핑되고 GABA 농도 증가와 GABA A 수용체의 강력한 양성 알로스테릭 조절제인 THDOC의 존재에 노출되었습니다. 이 패널은 GABA 농도에 따라 유도된 전류 진폭을 표시하며, 이는 GABA에 대한 이 하위 장치 조합의 민감도를 나타냅니다.

사용된 방정식은 I(c)Imax/n)이며, 여기서 c는 GABA의 농도이고, EC50은 1마이크로몰 THDOC가 존재할 때 GABA의 농도로 절반의 최대 전류 진폭을 이끌어냅니다. Imax는 최대 전류 진폭입니다. I는 현재 진폭이고 n은 Hill 계수입니다.

알파 4 베타 2 델타 GABA A 수용체의 EC50은 0.41 0.12 마이크로 몰에 달했고 n은 0.76 0.04 일단 숙달되면 적절하게 수행하면 30 분 안에 모낭 세포층을 제거 할 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 연구자들이 제노푸스 난모세포에서 단백질 발현 절차를 개선할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 여포 세포층으로 둘러싸인 Xenopus 난모세포를 분리하고 mRNA를 미세 주입한 후 여포 세포층을 제거하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.