Name: Xenopus의 난 모세포 : 미세 주입을위한 최적화 방법, 여포 세포 레이어의 제거 및 전기 생리 실험에서 빠른 해결 방법 변경 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: 배우세요 Xenopus 난 모세포에서 RNA 미세주입 및 여포 세포층 제거 방법을 통해 이온 채널 단백질을 발현하고 생존율을 높이는 최적화된 실험 기술을.

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이 연구는 스위스 국립과학재단(Swiss National Science Foundation)의 보조금 315230_156929/1의 지원을 받았습니다. M.C.M.은 펠로우십(Beca Chile Postdoctorado from CONICYT, Ministerio de Educacion, Chile)의 수혜자입니다.

동물 실험은 광저우 베른 Kantonstierarzt의 지역위원회, Kantonaler Veterinärdienst 베른 (BE85 / 15)에 의해 승인되었습니다. Xenopus의 난 모세포 1. 준비 <ol><li> 엄격하게 20 ° C로 유지되는 물에 12 시간 / 12 시간의 광 / 암주기 개구리 (Xenopus의의 laevis의)을 유지한다. </li><li> 여성 개구리 (9)에서 난소의 로브를 제거합니다. 참고 : 로브의 제거는 재생을위한 자극, 그리고 종종 난자의 질이 수술이 향상됩니다. 난자는 난황 막, 모낭 세포의 층과, 혈관 (21)이 포함하는 결합 조직으로 덮여있다. 전체 구조는 &quot;난포.&quot;불린다 </li><li> 밀도가 페니실린과 스트렙토 마이신 (88 mM의 염화나트륨, 1 ㎜의 KCl, 2.4 mM의 보충 멸균 바스의 식염수 7 (MBS)의 난 모세포를 포함하는 여포로 포장 난소의 로브를 배치의 NaHCO3, 0.82 mM의 황산, 0.41 mM의 CaCl2를 0.33 mM의 칼슘 (NO 3) 2, 10 mM의 4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산; HEPES (pH가 7.5, 수산화 나트륨), 100 μg의 / ㎖ 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신). </li><li> 단일 아웃 스테이지 V-VI (21) 난포. 집게로 난소 로브를 잡습니다. 모공을 통해 백금 (그림 1)을 낮추고 부드럽게 난소 조직에서 뿌리를 포함하는 결합 조직을 방해하는 루프를 철회. 참고 : 스테이지 V-VI (21) 모공이 크기을 특징으로한다 (1.0 - 직경 1.2 mm)와 어두운 색소 동물 반구와 황색 식물 반구 사이의 좋은 반면. </li><li> 플라스틱 파스퇴르 피펫 (1.5 mm의 공경 뒤로 절단)에 의해 35 mm 직경의 페트리 접시 만 건강적인 모낭 (즉, 완벽한 구형 그대로 색소로)를 옮긴다. </li></ol> 참고 : 여기에 설명 된 미세 주입 시스템이 Kressmann과 Birnstiel (22)에 의해보고 그에서 파생됩니다. <ol><li> 시험 관내 전사에 의해 수용체, 폴리 (A +) 꼬리 및 RNA 정량의 첨가를 겔 전기 영동 (23)에 의해 α 4 β 2 δ GABA의 서브 유닛을 코딩하는 cDNA에서 각각 된 cRNA를 준비한다. </li><li> 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 붕규산 유리 모세관 (1.0 mm 외경 (OD), 0.58 mm 내경 (ID), 100mm 길이)에서 미세 주입 피펫을 준비합니다. 경 사진 끝 15㎛ 인 - (12)의 선단부 직경을 만들기 위해 미세 조작기를 사용하고 미사 현미경 유리 모세관의 선단을 끊어. </li><li> 10 ML의 주사기를 사용하여 파라핀 오일과 미세 주입 피펫을 백필, 다음 및 자작 MICR 상에 미세 주입 피펫을 탑재oinjection 장치 (그림 2). 주 : 및 자작 유압 사출 장치는 발 페달 스위치에 의해 제어되는 그릴 모터로 구성되어 있습니다. 추가적인 스위치는 모터의 회전 모드를 변경한다. 이 모터는 전진 또는 10 μL 유리 주사기의 플런저를 후퇴 마이크로 미터 나사 (0.5 mm / 회전)를 구동한다. 주입 약 3 rpm의 속도이며, 0.5 회전은 모낭에 50 내셔널 리그 주입에 해당합니다. 주사기 팁 자체 타이곤 튜브의 짧은 부분으로 주사 바늘에 연결되어 두꺼운 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 관에 연결된다. 주입 모세관은 미세 조작기에 의해 제어되는 드릴 척에 의해 유지된다. 전체 시스템은 파라핀 오일로 채워져있다. 그들은 주입 시스템을 저해하므로 기포는 피해야한다. 설정은 차가운 광원으로 점등됩니다. 실체 현미경은 광학 제어가 필요합니다. 여포는 stereomicr와 차가운 빛 아래 시각화oscope (40X 배율). 사출 설치의 성능은 Xenopus의 난자에 방사성 추적자의 주입에 의해 테스트됩니다. 45의 볼륨 - 55시 NL 주사 당 제공해야합니다. </li><li> 멸균 플라스틱 팁 피펫을 사용하여 내 습성 열가소성 (2 × 2cm)의 깨끗한 내부에 무균의 액체 방울을 배치하여 설치를 테스트한다. 이 물방울에 주입 피펫의 끝을 담그고, 다음 플런저 (주입 피펫 내부에 음압을) 철회 할 수있는 모터를 켭니다. 참고 : 물 피펫을 입력하고 기름 보이는 인터페이스를 형성한다. </li><li> 액적으로부터 피펫 팁을 후퇴 주입 피펫의 내부에 양압을 적용한다. 물방울이 분사 피펫의 선단에 형성한다. </li><li> 페디큐어의 바닥에 붙어 다음 식물 극 나일론 메쉬의 간극 (0.8 mm G)에서 위쪽으로 가리키는 그들을 일렬로하여 모낭의 주입을위한 준비MBS 덮여 트리 접시 (60mm). </li><li> 열가소성의 깨끗한 내부 상 멸균 플라스틱 팁 피펫을 사용하여 mRNA의 2 μL를 분배. 주입 피펫의 내부에 부압을인가에 의해 주입 피펫으로 mRNA를보십시오. </li><li> 미세 조작기를 사용하여 개별 모낭을 통해 주입 피펫을 배치합니다. </li><li> 식물성 극의 중심에 주사 바늘을 삽입하고 피펫의 내부에 정압을인가하여 0.6 μL / 분의 유속으로 50 mRNA의 거리 nL 주입. mRNA의 탈출을 방지하기 위해 난포에서 주입 피펫 팁을 제거하기 전에 10 초 - 5 기다립니다. 참고 : mRNA를 동물 반구에있는 핵에 주입을 방지하기 위해 식물 (황색) 극에 주입한다. </li><li> MBS의 2 mL로 가득 찬 새로운 배양 접시 (35mm)에 주입 된 모공을 전송합니다. 18 ° C로 설정 와인 쿨러에 접시를 놓습니다. 1 주입 된 모공을 품어 -7 일 이내 기록하기 전에, 새롭게 발현 된 단백질의 신원에 따라. </li></ol> 3. 모공의 스트리핑 (그림 3) 주 :으로 알려진, 상기 언급 된 혈관 (24)을 포함하는 난황 층 여포 세포 및 결합 조직에 의해 덮여 난자 같이 &quot;모낭.&quot; 세포 표면에 용액의 접근을 방해하지 않고, 기계적 안정성을 제공 난황 층을 제외한 모든 층들은 전기 생리 학적 실험을하기 전에 제거되어야한다. 주변 세포 층이없는 여포는 이전에 &quot;무 결함&quot;난자 (25)라고하고있다. 이 단계는 일반적으로 전기 생리 학적 실험과 동일한 날에 수행된다. <ol><li> 열 전달은 MBS 0.5 ㎖, 1 ㎎ / ㎖의 콜라게나 제, 및 0.1 ㎎ / ㎖의 트립신 억제제를 함유하는 보로 실리케이트 유리 튜브에 모낭 주입. 36 ° C로 유지 된 수욕 튜브 빠져. 품어20 분 동안 여포와 가끔 튜브를 흔들. </li><li> RT에서 MBS 1 ㎖를 함유하는 제 2 튜브로 전송하여 모낭을 씻어. 약 10 초 동안 튜브를 남겨주세요. </li><li> 4 mM의 에틸렌 글리콜 비스 (2- aminoethylether)를 포함하는 이중 농축 MBS 0.5ml를 함유 제 튜브 모낭 이동 - N은, N, N &#39;, N&#39;- 테트라 아세트산 (EGTA) 및 4 분으로 그들을 부화 RT. 때때로 튜브를 흔들어. 주 : 고장 성 용액 (배로 농축 MBS)를하여 난자로부터 모낭 세포 층을 분리 모낭 세포 내의 난자 층의 수축을 유도하기 위해 사용된다; EGTA은 콜라게나 제 활성을 억제하기 위해 첨가된다. </li><li> RT에서 MBS 1 ㎖를 함유하는 제 2 튜브로 전송하여 모낭을 씻어. 약 10 초 동안 튜브를 남겨주세요. </li><li> MBS 2 용액을 함유하는 페트리 접시 (직경 35mm)에 난자를 옮긴다. 실체 현미경 아래에서 모낭에서 외측 봉투 구분단순히 백금 루프를 사용하여 멀리 벌거 벗은 난자를 밀어. 주 : 난자의 외부 엔벨로프가 배양 접시에 단단히 달라 붙어 용이 난자로부터 분리 될 수있다. 일부 난자는 자발적으로 자신의 외부 봉투를 잃게됩니다 및 무 결함 난자로 복구됩니다. 이 절차는 난자의 구형 모양을 유지하는 상대적으로 안정적인 준비가 발생합니다. </li></ol> 난자의 주위에 4. 빠른 해결 방법 변경 <ol><li> 9,26 바와 같이, 전압 클램프 실험을 수행한다. </li><li> 실험에 의해 요구되는 관류 스위치를 켜서 중력식 관류 시스템 솔루션을 변경한다. <ol><li> 난자 주위 작용제 농도의 빠른 변화를 허용하도록, 난자의 표면으로부터 약 0.4 mm에 배치되는 입 어느 1.35 mm의 내경과 함께 유리 모세관을 6 mL / 분의 관류 액을 적용한다. 참고 : 변화의 속도는 이전에 추정하고있다0.5 미만의 27에서 70 % D 등. </li></ol></li></ol>

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이 문서에서 설명하는 방법은 전통적으로 7-9 사용되는 일탈. 1 내지 2 시간 콜라게나 제 처리 8 난소 로브를 노출하는 표준이다; 손상되지 않은, 무 결함 난 모세포를 분리; mRNA를 상업적 분사 장치를 사용하여 그것들을 주입. 난자게나 고농도로 긴 노출에 의해 손상 될 가능성이있다 1)이 고전 절차는 다음과 같은 단점을 갖는다. 2) 불안정 무 결함 난자가 실험까지 저장해야합니다. 3) 무 결함 난자가 난포보다 미세 주입하는 동안 고통을 가능성이 더 높습니다. 상용 분사 장치 손상의 비교적 높은 비율을 초래할 가능성이 큰 직경 (약 20 μm의) 주입 바늘을 사용한다. - microinjecti 사용 (15 μm의 12) 콜라게나 제에 대한 노출을 20 분에 한정되며, 무 결함 난자 저장할 수 있고, 피펫의 작은 팁 직경 않는다 : 여기에 기술 된 개선 된 방법의 이점은 다음과 같다에는 mRNA의 주입을위한 모공의 사전 &quot;defolliculation&quot;를 필요로하지...

제노 푸스 난 모세포 널리 (- 3, 참조 내부 참조 2) 발현 시스템으로서 사용된다. 이들은 적절히 조합 및 세포막에 기능적 활성 multisubunit 단백질을 포함 할 수있다. 이 시스템을 사용하면, 기능적으로, 단독으로 또는 다른 단백질과 결합 막 단백질을 조사 돌연변이 키메라 또는 연접 단백질의 성질을 연구하기 위해, 잠재적 약물을 스크리닝 할 수있다. 다른 이종 발현 시스템을 통해 난자를 사용 이점은 거대 세포의 간단한 처리 외국 유전 정보, 목욕 관류에 의해 난자의 환경의 간단한 제어를 발현하는 세포의 비율이 높은, 상기 막 전위의 제어를 포함 . 이러한 발현 시스템의 단점은 많은 실험실 17-20에서 관찰 계절 변동이다. 이러한 변화의 원인분명 거리가 멀다. 또한 난자의 품질이 종종 크게 변화하는 것으로 관찰된다. 전통적인 방법 7-9 난소 로브의 분리, 몇 시간 동안 콜라게나 제에 난소 로브의 노출, 무 결함 난자의 선택, 그리고 난자의 미세 주입을 포함했다. 여기서, 대안, 빠른 절차의 수는 우리가 난자의 질에 어떤 계절의 변화와 약간의 변화와 함께 30 년 이상이 발현 시스템에서 작동하도록 허용 한 것을보고됩니다. 난 모세포의 분리, cRNA를 미세 주사로하고, 모낭 세포 층의 제거를 위해 여기에 설명 된 수정 및 개선 방법은 제노 푸스 난 모세포에서 선택한 임의의 단백질의 발현을 위해 사용될 수있다. 난자 주위 매질의 빠른 변화 용액의 아주 간단한 방법은 리간드 개폐 통로와 캐리어들의 연구에 적용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>시그마</td><td>71380</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>시그마</td><td>P-9541</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&nbsp;</td><td>시그마</td><td>M-1880</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&nbsp;</td><td>시그마</td><td>223560</td><td></td></tr><tr><td>Ca(NO3)2&nbsp;</td><td>시그마</td><td>C1396</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140-148</td><td>100 &mu; g 페니실린/mL 및 100 &mu; g 스트렙토마이신/mL</td></tr><tr><td>플래티넘 와이어 루프</td><td>홈메이드</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로피펫 풀러</td><td>Zeitz-Instruments GmBH</td><td>DMZ</td><td></td></tr><tr><td>해밀턴 주사기&nbsp;</td><td>해밀턴</td><td>80300</td><td>10 &mu; L, Type 701N</td></tr><tr><td>두꺼운 벽이 있는 폴리테트라플루오로에틸렌 튜빙</td><td>Labmarket GmBH</td><td></td><td>1.0 mm OD&nbsp;</td></tr><tr><td>파라핀 오일</td><td>Sigma</td><td>18512</td><td></td></tr><tr><td>나일론 넷, G: 0.8 mm&nbsp;</td><td>ZBF Z&uuml; 더 풍부한 Beuteltuchfabrik AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>붕규산 유리관&nbsp;</td><td>Corning</td><td>99445-12</td><td>PYREX</td></tr><tr><td>Collagenase NB 표준 등급</td><td>SERVA</td><td>17454</td><td></td></tr><tr><td>트립신 억제제 유형 I-S</td><td>Sigma</td><td>T-9003</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3389</td><td></td></tr><tr><td>유리 모세관</td><td>Jencons (Scientific ) LTD.</td><td>H15/10</td><td>1.35 ID mm (관류용), 대체 회사: Harvard Apparatus Limited</td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillary</td><td>Harvard Apparatus Limited</td><td>30-0019</td><td>1.0 OD x&nbsp; 0.58 ID x 100 Length mm (microinjection용)&nbsp;</td></tr><tr><td>붕규산 유리 모세관&nbsp;</td><td>Harvard Apparatus Limited</td><td>30-0044</td><td>1.2 OD x 0.69 ID x 100 길이 mm (2전극 전압 클램프용)</td></tr><tr><td>&감마;-아미노부티르산(GABA)</td><td>시그마</td><td>A2129</td><td></td></tr><tr><td>3&알파;,21-디하이드록시-5&알파;-프레그난-20-온(THDOC)</td><td>시그마</td><td>P2016</td><td></td></tr><tr><td>그릴 모터</td><td>Faulhaber&nbsp;</td><td></td><td>DC 마이크로모터 타입 2230 기어 타입 22/2</td></tr><tr><td>마이크로미터 스크류</td><td>Kiener-Wittlin</td><td>10400</td><td>TESA, AR 02.11201</td></tr><tr><td>멸균 플라스틱 이송 피펫</td><td>Saint-Amand&nbsp; Mfg.</td><td>222-20초</td><td></td></tr></tbody></table>

xenopus의 난 모세포 : 미세 주입을위한 최적화 방법, 여포 세포 레이어의 제거 및 전기 생리 실험에서 빠른 해결 방법 변경

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

단백질 이종 발현 시스템으로 제노 푸스 난 모세포는 제 Gurdon 동부 등에 의해 설명되었다. 1 널리 발견부터 사용되었다 (참고 문헌 2-3 및 참조 내부). 외국 채널 식의 난자가 매력적인 만드는 특징은 내생 이온 채널 4의 가난한 풍부하다. 이 발현 시스템은 리간드 게이트 이온 채널 그들 가운데 많은 단백질의 특성에 유용 입증되었습니다. GABA의 아프리카 손톱 개구리의 난모 세포 수용체와 기능적 특성의 발현은 난자, cRNA를, 여포 세포 층의 제거 및 전기 생리학 실험에서 빠른 솔루션 변경 microinjections의 분리를 포함하여, 여기에 설명되어 있습니다. 절차는이 실험 5,6에 최적화되어 있으며 정기적으로 7-9을 사용하는 것 이탈했다. 전통적으로, 무 결함 난자 제조RT에서 난소 로브의 연장 콜라게나 제 처리, 이러한 무 결함 난자와의 mRNA와 미세 주입된다. 최적화 된 방법을 사용하여 다양한 막 단백질은 발현되고 그러한 재조합 GABA A는 수용체 10-12 인간 재조합 클로라이드 채널 (13), 트리파노소마 칼륨 채널 (14), 및 미오의 -inositol 전달체 (15, 16),이 시스템을 연구 하였다. 여기에 설명 된 방법은 한 아프리카 손톱 개구리의 난모 세포의 선택 중의 단백질의 발현에인가 될 수 있고, 신속한 용액 변경은 다른 리간드 관문 이온 채널을 연구하는데 사용될 수있다.

아프리카 손톱 개구리의 난모 세포의 기계적 백금 루프 (도 1)를 이용하여 선발 하였다. 0.5 : 난자는 mRNA의 2, δ, 0.5 β, 수용체의 서브 유닛 4 α GABA 코딩에 미세 주입 된 2.5 fmol / 난 모세포 (그림 2). 4 D 후, 모낭 세포 층 (도 3)을 제거 하였다. 난 모세포 전압 -80 MV에 클램프 1 μM 3α, 21- 히드 록시 5α-레그나 20 온 (THDOC)의 강력한 양성 알로 스테 릭 조절제의 존재하에 γ - 아미노 부티르산 (GABA)의 증가하는 농도에 노출 된 GABA 수용체. 도 4a는 실험에 기록 된 원래 현재의 흔적을 보여줍니다. 도 4b는 GABA의 농도에 따라 유발 된 ...

단일 여포의 분리, 세포질 RNA 미세 주입, 주변 세포층 제거 및 Xenopus 난모세포의 단백질 발현을 위한 최적화된 절차에 대해 설명합니다. 또한 리간드 게이트 이온 채널을 사용한 전기생리학적 실험에서 빠른 용액 변화를 위한 간단한 방법이 제시됩니다.

Xenopus의 난 모세포 : 미세 주입을위한 최적화 방법, 여포 세포 레이어의 제거 및 전기 생리 실험에서 빠른 해결 방법 변경

The Xenopus oocyte as a heterologous expression system for proteins, was first described by Gurdon et al.1 and has been widely used since its discovery ...

이 절차의 전반적인 목표는 Xenopus 난모세포의 이온 채널과 같은 새로운 단백질을 발현하는 것입니다. 이 방법은 기능적 발현 시스템이 필요한 모든 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기법 변형의 주요 장점은 난모세포의 속도, 신뢰성 및 생존율 향상입니다.이 방법은 이온 채널의 기능에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 다른 단백질의 연구에 적용할 수 있습니다. 이 방법에 대한 아이디어는 고전적인 방법이 난모세포 생존율이 낮다는 것을 깨달았을 때 처음 떠올랐습니다.텍스트 프로토콜에 따라 암컷 개구리의 난소엽을 제거한 후, 페니실린과 스트렙토마이신이 보충된 멸균 변형 바르트 용액(Sterile Modified Barth's Solution)에 엽을 넣습니다. 조직이 산소에 접근할 수 있도록 엽을 잘라냅니다. 5-6단계의 난포를 골라내려면 집게를 사용하여 난소를 잡은 다음 난포 위로 백금 고리를 내리고 고리를 부드럽게 빼내어 난소 조직에서 난포와 결합 조직을 파괴합니다.백금 고리를 사용하여 건강해 보이는 난모세포를 분류합니다. 팁이 1.5mm 직경으로 절단된 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 선택한 난포를 35mm 직경의 페트리 접시로 옮깁니다. 텍스트 프로토콜에 따라 GABA A 수용체 및 마이크로 주입 피펫에 대한 cRNA를 준비한 후 파라핀 오일과 얇은 바늘이 있는 10ml 주사기를 사용하여 마이크로 주입 피펫을 다시 채웁니다.그런 다음 집에서 만든 마이크로 분사 장치에 피펫을 장착합니다. 멸균 플라스틱 팁이 있는 피펫을 사용하여 mRNA 용액 한 방울을 방습 열가소성 수지 조각의 깨끗한 면에 놓습니다. 그런 다음 주입 피펫의 끝을 액적에 담그고 모터를 켜서 플런저를 후퇴시킵니다.mRNA 용액은 피펫에 들어가 오일과 가시적인 계면을 형성해야 합니다. 다음으로, 물방울에서 피펫 끝을 집어넣고 주입 피펫 내부에 양압을 가합니다. mRNA 용액 방울이 주입 피펫 끝에 형성되어야 합니다.바닥에 나일론 메쉬를 붙이고 주사를 위해 MBS로 덮은 60mm 페트리 접시를 사용하여 식물 기둥이 위쪽을 향하도록 난포를 정렬합니다. micromanipulator를 사용하여 주입 피펫을 개별 모낭 위에 놓습니다. 주사 바늘을 식물 기둥 중앙에 삽입하고 피펫 내부에 양압을 가하여 분당 0.6마이크로리터의 유속으로 50나노리터의 mRNA를 주입합니다.메신저 RNA가 빠져나가는 것을 방지하기 위해 여포에서 주입 피펫 팁을 제거하기 전에 5-10초 동안 기다립니다. 주입된 난포를 2밀리리터의 MBS로 채워진 새 페트리 접시로 옮깁니다. 접시를 섭씨 18도로 설정된 와인 쿨러에 넣습니다.새로 발현된 단백질의 정체에 따라 기록하기 1일에서 7일 전에 주입된 여포를 배양합니다. 여포를 제거하기 위해 주입된 10개의 난포를 0.5ml의 MBS, 1ml당 1mg의 콜라겐분해효소, 0.1ml/ml의 트립신 억제제가 들어 있는 붕규산 유리관에 옮깁니다. 튜브를 섭씨 36도의 수조에 담그고 20분 동안 난포를 배양합니다.이곳의 온도는 1도 이상 난모세포를 죽일 수 있기 때문에 매우 중요합니다. 실온에서 1ml의 MBS가 들어 있는 두 번째 튜브로 난포를 옮겨 헹구고 약 10초 동안 튜브에 그대로 둡니다. 그런 다음 4밀리몰 EGTA가 포함된 0.5ml의 이중 농도 MBS가 들어 있는 세 번째 튜브로 여포를 옮기고 실온에서 4분 동안 샘플을 배양하면서 때때로 튜브를 흔듭니다.4분의 배양 시간은 난포층이 난모세포에서 분리되도록 하는 데 중요합니다. 실온에서 MBS 1ml가 들어 있는 다른 튜브로 모낭을 옮겨 헹구고 약 10초 동안 튜브에 그대로 둡니다. 난모세포를 2밀리리터의 MBS가 들어 있는 35mm 페트리 접시로 옮깁니다.그런 다음 실체 현미경으로 백금 루프를 사용하여 벌거벗은 난모세포를 밀어내기만 하면 난포에서 바깥쪽 외피를 분리합니다. 탈락된 난모세포는 사용할 때까지 보관하십시오. 이 실험에서는 기계적으로 선별된 제노푸스 난모세포에 GABA A 수용체 서브유닛을 위한 mRNA 코팅을 미세 주입했습니다.그런 다음 여포 세포층을 제거했습니다. 난모세포는 음의 80밀리볼트에서 전압 클램핑되고 GABA 농도 증가와 GABA A 수용체의 강력한 양성 알로스테릭 조절제인 THDOC의 존재에 노출되었습니다. 이 패널은 GABA 농도에 따라 유도된 전류 진폭을 표시하며, 이는 GABA에 대한 이 하위 장치 조합의 민감도를 나타냅니다.사용된 방정식은 I(c)Imax/n)이며, 여기서 c는 GABA의 농도이고, EC50은 1마이크로몰 THDOC가 존재할 때 GABA의 농도로 절반의 최대 전류 진폭을 이끌어냅니다. Imax는 최대 전류 진폭입니다. I는 현재 진폭이고 n은 Hill 계수입니다.알파 4 베타 2 델타 GABA A 수용체의 EC50은 0.41 0.12 마이크로 몰에 달했고 n은 0.76 0.04 일단 숙달되면 적절하게 수행하면 30 분 안에 모낭 세포층을 제거 할 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 연구자들이 제노푸스 난모세포에서 단백질 발현 절차를 개선할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 여포 세포층으로 둘러싸인 Xenopus 난모세포를 분리하고 mRNA를 미세 주입한 후 여포 세포층을 제거하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

xenopus-oocytes-optimized-methods-for-microinjection-removal

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

Xenopus Laevis의 Oocytes의 Microinjection

머릿속 RNA 현지화에서 Xenopus Oocytes

의 수정 Xenopus의 oocytes 호스트 전송 방법을 사용하여

Xenopus 배아 상피 조직은 상피 morphogenesis 동안 극성 개발 및 형태의 변화와 같은 세포 행위를 연구하는 이상적인 모델 시스템입니다. 고정 샘플 전통 조직학 점점 라이브 셀 이미징 공촛점에 의해 보완되고있다. 여기 개구리 조직을 분리 및 라이브 세포 공촛점 현미경을 사용하여 라이브 상피 세포 및 cytoskeleton을 시각화하는 방법을 보여줍니다.

라이브 셀 이미징 및 배아 상피 세포의 정량 분석 Xenopus laevis</em

BK 채널 이온 전류는 패치 클램프 기법을 사용하여 기록됩니다. BK 채널로...

이온 채널 유학을위한 패치 클램프 및 재관류 기법으로 표현 Xenopus oocytes

Xenopus laevis 미성숙 난모세포를 조작하는 방법, 난자에서 난자로의 체외 성숙 및 세포질 내 정자 주입을 설명합니다. 이 프로토콜은 일부 모계 단백질의 분해와 수정 시 관심 유전자의 과발현을 허용하므로 초기 배아 발달에서 특정 요인의 역할을 연구하는 데 가치가 있습니다.

조작 및<em&gt; 체외</em의&gt; 성숙<em&gt; 아프리카 발톱 개구리 laevis의</em세포질 내 정자 주입에 이어&gt; 난 모세포, 배아 발달을 연구하는

단백질 합성 조절은 주로 번역 시작 단계에서 발생하며, 결핍은 다양한 장애와 관련이 있습니다. 이들의 병인을 더 잘 이해하기 위해, 우리는 여기에서 번역 시작 인자 eIF4G1의 돌연변이가 있는 상태에서 mos 전사체의 번역을 평가하는 Xenopus laevis 난모세포를 사용하는 프로토콜에 대해 설명했습니다.

Xenopus의 번역 손상을 식별 할 수있는 모델로 laevis의

원고는 여기 Xenopus의에서 찬란 태그 리간드의 분비 및 확산을 분석하는 방법의 간단한 세트를 제공합니다. 이는 리간드 분포를 수정하는 다른 단백질의 능력을 시험하고 morphogen 기울기 조절 메커니즘에 대한 통찰력을 제공 할 수 있도록 실험을위한 컨텍스트를 제공한다.

공 촛점 분석을 사용하여<em&gt; 아프리카 발톱 개구리 laevis의</em&gt;의 Wnt 및 쉬 Morphogen 그라디언트의 변조기를 조사하기 위해

우리는 유능한 외배엽에서 반응을 유도할 수 있는 유전자의 발현을 위한 Xenopus 난모세포 및 동물 캡 시스템을 설명하고 이러한 유전자의 후속 분석을 위한 기술에 대해 논의합니다. 이 시스템은 광범위한 유전자 산물의 기능적 식별에 유용합니다.

를 사용하여 기능성 복제<em&gt; Xenopus의</em&gt; 난자 발현 시스템

이 기사에서는 이온 채널에서 구조적 재배치를 조사하기 위해 말레이 미드 염료 대신 형광 비정상적인 아미노산 (fUAA)이 사용되는 기존의 VCF (Voltage-Clamp Fluorometry)의 향상에 대해 설명합니다. 이 절차에는 Xenopus oocyte DNA 주입, RNA / fUAA 동시 주입, 동시 전류 및 형광 측정이 포함됩니다.

전압 클램프 형광 측정법<em&gt; Xenopus</em&gt; 형광성 비 자연 아미노산을 이용한 난 모세포

여기서 우리는 Xenopus 난모세포에서 갭 접합 단백질을 발현하고 하이 사이드 전류 측정 모드에서 이중 난모세포 전압 클램프 기록을 위해 설계된 상용 증폭기를 사용하여 두 개의 apposed 난모세포 사이의 접합 전류를 기록하는 프로토콜을 제시합니다.

제노푸스 난모세포로부터의 갭 접합 전류 기록

배우세요 Xenopus 난 모세포에서 RNA 미세주입 및 여포 세포층 제거 방법을 통해 이온 채널 단백질을 발현하고 생존율을 높이는 최적화된 실험 기술을.

Xenopus의 난 모세포 : 미세 주입을위한 최적화 방법, 여포 세포 레이어의 제거 및 전기 생리 실험에서 빠른 해결 방법 변경

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