DNA 콘텐츠 측정에 의한 포유 동물 복제 타이밍의 게놈 전체의 결정

본 절차의 전반적인 목적은 선택한 세포의 게놈 전반에 걸친 복제 타이밍 프로그램을 매핑하는 것입니다. 이 방법은 건강한 상태와 질병 상태에서 게놈 복제 프로그램이 어떻게 변화하는지와 같이, 복제 분야의 핵심적인 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움을 줄 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 다양한 세포와 조건에서 복제 시기를 매핑할 수 있는 빠르고 간단한 방법이라는 점입니다. 이 FACS 절차를 작성한 사람은 의과대학의 FACS 전문가인 Dan Lehmann입니다. 이 절차는 일반적으로 최소 1~2 × 10⁶개의 빠르게 성장하는 비동기화 세포로 시작합니다.

부착 세포의 경우, 칼슘과 마그네슘이 없는 PBS 3 mL로 각 플레이트를 흡입 및 세척합니다. PBS를 제거하고 각 플레이트에 상용 Trypsin-EDTA 1 mL를 첨가합니다. 세포가 떨어져 나올 때까지 37 °C에서 5분 동안 배양합니다.

Trypsin을 중화시키기 위해 배지 3 mL를 첨가하고, 15 mL 원추형 튜브 또는 5 mL 폴리스티렌 튜브에 세포를 수집합니다. 세포를 얼음 위에 보관하십시오. 이 절차를 시작하려면, 4 °C에서 300 x G로 5분 동안 세포를 원심분리합니다.

차가운 PBS 1 mL로 세포를 흡입 및 세척합니다. 그다음, 세포를 원심 분리합니다. 두 번째 세척 후, PBS를 제거하고 차가운 PBS 250 µL에 세포를 재부유시킵니다.

튜브를 가볍게 볼텍싱하면서 -20 °C의 100% 고순도 에탄올 800 µL를 천천히 한 방울씩 첨가합니다. 이를 통해 최종 에탄올 농도가 70~80%가 됩니다. 세포를 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.

고정된 세포를 4°C에서 500 x G로 10분간 원심분리하여 이 절차를 시작합니다. 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거하고, 차가운 PBS 1 mL로 세포를 두 번 세척합니다. 각 세척 단계 후에 원심분리를 수행합니다.

두 번째 세척 후 상층액을 흡입하여 제거하고, 다음과 같은 PI 혼합액으로 각 세포를 재부유시킵니다. 5 µL의 10 mg/mL RNAase와 50 µL의 1 mg/mL propidium iodide가 포함된 1 mL의 PBS를 사용합니다. 샘플을 35 µm 메쉬로 필터링하여 5 mL 폴리스티렌 튜브에 담습니다.

튜브를 파라필름으로 밀봉합니다. 실온에서 15~30분 동안 배양합니다. propidium iodide는 빛에 민감하므로 샘플을 암소에 보관하십시오.

세포는 FACS 기기를 사용하여 분류합니다. 561 nanometer 레이저를 사용하여 propidium iodide 강도에 따라 세포를 구분하십시오. 최적의 결과를 얻으려면 해당 세포 크기에 권장되는 가장 작은 노즐을 사용하십시오.

대부분의 세포의 경우 85 µm입니다. 일정하고 느린 유속을 사용하십시오. 일반적으로 초당 300~500개의 이벤트까지 측정합니다.

게이팅(Gating)을 사용하여 FCS와 SSC를 도식화함으로써 사멸 세포 및 세포하 잔해를 구별합니다. 생존 세포 중에서 SSC width와 SSC height를 도식화하여 더블릿(doublet)을 구별한 다음, FFC width와 FFC height 도식, 그리고 propidium iodide width와 propidium iodide height 도식을 순차적으로 작성합니다. 생존 신호 세포에 대해 세포의 DNA 함량을 나타내는 propidium iodide area intensity의 히스토그램을 그립니다.

저온 조건에서 세포를 G1기와 S기로 분류하십시오. S기 게이팅은 넓게 설정하여 G1기와 G2기에 걸치도록 해야 합니다. 반면, G1기 게이팅은 좁게 설정하고 S기로부터 가능한 한 멀리 떨어뜨려야 합니다.

일부 세포 유형의 경우, 이상적인 세포 주기 분포를 얻기 어려울 수 있습니다. S기 세포가 섞이지 않은 G1기 세포만을 확보하는 것이 가장 중요합니다. FACS 기기에서 분리된 세포가 담긴 튜브를 꺼냅니다.

분리 후 튜브를 얼음에 보관하십시오. 세포 분리 후, 제조사의 지침에 따라 상용 DNA 정제 키트를 사용하여 각 샘플의 DNA를 정제합니다. 다음으로, 집중 초음파 분쇄기를 사용하여 DNA를 평균 목표 피크 크기 250 base pairs가 되도록 전단합니다.

전기영동을 통해 전단된 DNA의 크기를 확인합니다. 권장되는 크기 분포는 200에서 700 base pairs이며, 약 250 base pairs에서 피크가 나타나야 합니다. 이후 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 라이브러리를 제작하고 시퀀싱 및 분석을 수행합니다.

마우스 배아 섬유아세포의 전체 1번 염색체에 대한 복제 시간 지도가 제시되어 있습니다. 약 50 megabases 영역을 확대한 모습입니다. 점은 개별 윈도우의 정규화된 S/G1 비율을 나타내며, 실선은 3차 스플라인 보간법(cubic smoothing interpolation)을 통한 결과물을 나타냅니다.

높은 S/G1 값은 조기 복제에 해당하며, 낮은 값은 후기 복제에 해당합니다. 빨간색 화살표는 복제 시간이 일정한 영역의 예를 가리키며, 녹색 화살표는 시간적 전이 영역을 가리킵니다. 이 그림은 생쥐 1번 염색체의 동일한 18 megabase 영역에서 생쥐 배아 섬유아세포의 3회 반복 실험 간의 복제 시간 맵 재현성을 생쥐 pre-B 세포의 3회 반복 실험과 비교하여 보여줍니다.

주황색 화살표는 세포주 간의 차이가 나타나는 영역의 예시를 가리킵니다. 6개 샘플 간의 Spearman 상관관계 히트맵을 통해 결과를 더욱 확인할 수 있습니다. 세포 수집부터 맵 생성까지의 이 기술을 숙달하면, 적절히 수행했을 때 1주일 안에 완료할 수 있습니다.

이 영상을 시청하고 나면, 성장하는 세포의 복제 시간 게놈 지도를 생성하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.