유도 성 T7 RNA 중합 효소 매개 멀티젠 발현 시스템, pMGX

본 절차의 전반적인 목표는 여러 단백질을 동시에 발현시키기 위해 유도성 T7 RNA polymerase의 제어 하에 있는 다중 유전자 합성 오페론을 구축하는 것입니다. 이 방법은 합성 생물학 및 생화학 분야의 연구자들이 다중 단백질 경로를 구축하거나 공동 발현에 의존하는 단백질 복합체를 연구하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단일 플라스미드로부터 Escherichia coli 내에서 여러 유전자가 동시에 발현될 수 있도록 한다는 점입니다.

저희 실험실의 절차를 시연할 분들은 박사 과정 학생인 Mohamed Hassan과 코옵(Co-op) 학생인 Angela Thompson입니다. 텍스트 프로토콜에 따라 관심 유전자를 획득하고 증폭시킨 후, 첫 번째 관심 유전자와 pMGX 벡터에 대한 제한효소 처리 반응을 준비하십시오. 0.5~1.5마이크로그램(µg)의 DNA가 포함된 40마이크로리터(µl) 반응액에 제한효소를 첨가하십시오.

반응물을 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 그다음 EcoRI을 첨가하고 1시간 더 소화(digest)되도록 둡니다. NdeI이 효과적으로 소화되도록 하기 위해 EcoRI보다 먼저 첨가합니다.

NdeI은 제한 효소 인식 부위 양측의 이중 가닥 DNA 길이에 민감합니다. NdeI을 먼저 첨가하면 전체 길이의 원형 플라스미드가 확실하게 절단됩니다. 제한 효소 처리 반응물을 0.7% agarose 겔에 로딩하고 100V에서 55분 동안 전기영동합니다.

그런 다음, 깨끗한 메스나 면도날을 사용하여 삽입물 및 벡터 밴드를 절제하고, 절제된 겔 조각을 1.5 밀리리터 튜브에 넣습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 겔 추출 키트를 사용하여 DNA를 정제합니다. 0.15~0.5 마이크로그램의 벡터 DNA와 유전자 크기에 따른 적절한 양의 삽입물, 그리고 1 마이크로리터의 T4 DNA ligase를 포함하는 20 마이크로리터의 라이게이션 반응액을 준비합니다.

무균 조건 하에서, 화학적 역능을 가진 XL1-Blue E.coli 세포 100 µL 분주액을 얼음 위에서 5분 동안 해동합니다. 그 후, 목적 유전자가 포함된 라이게이션 반응액 5 µL를 세포에 첨가합니다. 형질전환 혼합물을 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.

다음으로, 42 °C 항온수조에서 세포를 45초 동안 열충격 처리합니다. 그 후, 형질전환물을 얼음에 두고 200 µL의 차가운 LB 배지를 첨가합니다. 세포를 2분 동안 배양합니다.

세포를 37 °C에서 220 rpm으로 1시간 동안 배양한 후, 적절한 선택 마커가 포함된 LB agar 플레이트에 100 µL를 도말합니다. 형질전환 가능성이 있는 콜로니를 선별하기 위해, 음성 대조군 플레이트와 리게이션 플레이트의 콜로니 수를 비교하십시오. 콜로니 수의 비율이 1:2가 되는 것이 이상적입니다.

각 라이게이션 반응에서 4~8개의 단일 콜로니를 선택하여 적절한 항생제가 포함된 4 mL의 LB 배지에 접종합니다. 배양물을 37 °C, 220 rpm에서 하룻밤 동안 배양합니다. 플라스미드 DNA 분리 키트를 사용하여 텍스트 프로토콜에 따라 플라스미드 DNA를 정제하고, 150~500 ng의 DNA와 NdeI 및 EcoRI를 각각 1 µL씩 사용하여 20 µL 규모의 제한효소 절단 반응을 준비합니다.

소화 반응을 37 °C에서 2시간 동안 배양합니다. 유전자 1이 포함된 pMGX 벡터에 유전자 2를 삽입하려면, 관심 대상인 첫 번째 유전자가 포함된 벡터 DNA 0.5~1.5 µg과 AVR2 1 µL를 포함하는 40 µL 소화 반응액을 준비합니다. 반응액을 37 °C에서 1.5시간 동안 배양한 후 Calf-intestinal phosphatase 1.5 µL를 첨가합니다.

30분 동안 추가로 배양합니다. 다음으로, 두 번째 표적 유전자가 포함된 pMGX 벡터 0.5~1.5 µg을 포함하는 40 µL 분량의 소화 반응액을 준비합니다. 이때 AVR2 1 µL와 xpol을 사용합니다.

반응물을 37 °C에서 2시간 동안 배양합니다. 제한 효소 절단물을 0.7% 아가로스 겔에서 전기영동합니다. 그리고 앞서 시연한 대로 깨끗한 메스 칼날을 사용하여 삽입물과 벡터 밴드를 절제합니다.

텍스트 프로토콜에 따라 플라스미드 DNA를 추출하고 샘플을 정량한 후, gene 2와 pMGX-yfg1을 3:1의 insert 대 vector 비율로 사용하여 라이게이션 반응을 설정하십시오. pMGX-yfg1만 사용한 음성 대조군을 포함하십시오. 앞서 시연한 대로 각 반응물 5 µL를 XL1-Blue 세포에 형질전환하십시오.

그런 다음 음성 대조군 플레이트와 라이게이션 플레이트의 콜로니 수를 비교하십시오. 음성 대조군 플레이트에 다수의 콜로니가 나타난다면 CIP 처리를 재검토하십시오. 라이게이션 반응 결과물에서 4~8개의 개별 콜로니를 선택하여, 각 콜로니를 적절한 항생제가 포함된 LB 배지 4 µL에 접종하십시오.

37 °C, 220 rpm에서 하룻밤 동안 배양합니다. 이전과 동일하게 플라스미드 DNA를 분리하고 정량한 후, 150~500 ng의 DNA와 1 μL의 EcoRI를 포함하는 제한효소 절단 반응을 설정하여 두 번째 유전자가 효과적으로 삽입되었는지 확인합니다. 반응물을 37 °C에서 2시간 동안 배양합니다.

스크리닝 목적으로는 EcoRI이 권장되지만, 일부 경우에는 EcoRI이 크기가 비슷하여 겔 상에서 구분이 어려운 두 개 이상의 삽입물을 생성할 수 있습니다. 성공 가능성을 높이기 위해 NdeI과 같은 대체 제한 효소를 사용해야 합니다. 제한 효소 처리 반응물을 아가로스 겔에서 분리하여 삽입된 유전자 2의 크기에 해당하는 밴드를 확인하십시오.

텍스트 프로토콜에 따라 추가 유전자를 플라스미드에 클로닝하십시오. 폴리시스트로닉(polycistronic) 플라스미드를 생성하기 위해, 먼저 5개의 유전자를 적절한 플라스미드인 pMGX A에 클로닝하였습니다. 이 그림은 pMGX A 플라스미드 내의 pCR-Blunt-yfg1 및 pCR-Blunt-yfg2와 indel 및 EcoRI로 제한효소 처리된 pMGX A를 보여줍니다. 처음 두 유전자를 pMGX A에 클로닝하기 위해, 플라스미드를 indel 및 EcoRI로 제한효소 처리하였습니다.

클로닝 후, 성공적인 클론이 얻어졌는지 확인하기 위해 pMGX-yfg1 및 pMGX-yfg2를 AVR2와 xpol로 제한효소 처리하였습니다. 이 그림은 AVR2로 처리한 pMGXyfg1 벡터와, 관심 유전자 2를 분리하기 위해 AVR2 및 xpol로 처리한 pMGX-yfg2 벡터를 보여줍니다. 이렇게 얻은 삽입 유전자를 pMGX-yfg1에 클로닝하여 pMGX-yfg1 two 벡터를 제작하였습니다.

여기에서 보는 바와 같이, EcoRI를 이용한 pMGX-yfg1의 제한효소 절단으로 목적 유전자 2번이 pMGX-yfg1에 성공적으로 클로닝되었음을 확인하였습니다. 이 젤 이미지는 삽입물이 정방향으로 삽입된 소화된 플라스미드와 역방향으로 삽입된 경우의 차이를 보여줍니다. 삽입물이 역방향으로 삽입되면 두 개의 EcoRI 부위가 서로 가깝게 위치하게 되어, 결과적으로 절단된 50 bp 크기의 단편은 젤에서 검출되지 않고 백본의 크기만 더 크게 나타나게 됩니다.

마지막으로, 5개 유전자의 폴리시스트로닉(polycistronic) 발현 벡터를 제작한 후, 발현된 단백질의 웨스턴 블롯(western blot) 분석을 통해 5가지 단백질 모두가 단일 벡터로부터 발현되었음을 확인합니다. yfg5에 의해 생성된 단백질은 yfg1과 크기가 동일하여 겔 상에서 분리되지 않는다는 점에 유의하십시오. 이 기술을 숙달하면, 정확하게 수행했을 때 pMGX 백본에 삽입되는 유전자당 3~4일 만에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 수행할 때, Calf-intestinal phosphatase와 같은 탈인산화효소로 벡터를 처리하고 선형화하여 벡터를 탈인산화시키는 것이 중요하다. 이 절차 이후, 천연물 생산을 위한 생합성 경로를 특성화하고 활용하거나 단백질-단백질 복합체를 연구하기 위해 in vivo 다중 유전자 발현과 같은 추가 실험을 수행할 수 있다. 이 기술은 합성생물학 분야의 연구자들이 복잡한 탄수화물을 생산하고 유전적으로 변형된 E.Coli를 제작할 수 있는 길을 열어주었다.

이 영상을 시청한 후에는 E.coli에서 다중 유전자 발현 시스템을 구현하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.