형광 항체를 사용하여 마우스 표피의 파라핀 섹션에 Immunohistochemistry

표피 내에서. 면역조직화학법은 특정 단백질이 발현되는 구획을 국소화하는 효율적인 수단입니다. 본 영상에서는 저희 실험실에서 일상적으로 사용하는 표피 내 단백질 면역 국소화의 신뢰할 수 있는 방법을 선보입니다.

안녕하세요, 저는 오타와 보건 연구소(Ottawa Health Research Institute) 만성 질환 프로그램의 저층 건물에 위치한 Turin 박사 연구실의 Tammy입니다. 오늘은 마우스 표피의 파라핀 매립 조직 절편을 사용하여 형광 항체를 이용한 면역 조직 화학 염색 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 BO'S 고정 조직을 사용하여 표피 분화 마커의 면역 국소화를 위한 프로토콜을 최적화하였습니다.

최적화 과정의 일환으로, 고정 전 피부를 종이 타월 위에 펼쳐 평평하게 유지합니다. 이 절차에는 표피의 해부 및 고정, 탈수, 파라핀 임베딩, 섹션 절단, 탈파라핀, 재수화, 항원 마스킹 제거, 항체 표지, 그리고 마지막으로 에피 형광을 이용한 마운팅 및 시각화 과정이 포함됩니다. 그럼 시작하겠습니다.

신생 생쥐를 사용할 때는 등 피부를 제모할 필요가 없습니다. 하지만 털이 있는 성체 생쥐의 경우에는 절편 제작 시 방해가 되지 않도록 등 피부를 제모해야 합니다. 해부 시에는 분석에 사용할 피부 부위에 핀셋이 닿지 않도록 매우 주의하십시오.

따라서 포셉으로 절개할 가장자리 부분을 잡은 다음, 매우 조심스럽게 들어 올려 표피를 절개합니다. 이때 실험에 사용할 부위는 건드리지 않도록 주의하십시오. 피부를 고정할 때 피부가 말려 튜브 안에 들어가지 않도록 해야 하며, 평평하게 펴진 상태를 유지해야 합니다.

이를 돕기 위해, 고정되는 동안 피부가 평평하게 유지되도록 종이 타월 위에 피부를 놓습니다. 이제 피부를 종이 타월 위에 평평하게 놓았으므로, 포셉으로 인해 손상되었을 수 있는 부분을 제거하기 위해 가장자리를 잘라내거나 다듬습니다. 그런 다음 피부를 약 2mm x 2mm 크기의 매우 작은 조각으로 자릅니다.

이제 조직을 고정하겠습니다. 피부를 다루기 쉬운 크기로 자른 후, 보인(boin) 용액에 담급니다. 튜브의 캡을 닫고 파라필름(perfil)으로 감싼 뒤 로커(rocker) 위에 올려둡니다.

하룻밤 동안 배양할 때는 boin 용액에서 16~18시간 동안만 배양하는 것이 중요합니다. 고정 시간이 이보다 짧거나 길어지면 조직이 손상됩니다. 배양이 완료되었습니다.

조직을 PBS로 헹군 다음, 30%, 50%, 70% 에탄올을 이용해 일련의 에탄올 세척 과정을 거칩니다. BO는 황색을 띠며, 세척을 진행함에 따라 BO가 희석되어 세척액의 황색이 점점 옅어지는 것을 확인할 수 있습니다. 각 단계에서 30분씩 2회 세척합니다.

에탄올로 마지막 세척을 마친 후, 시료를 새로운 70% ethanol에 넣고 추가 공정을 진행하기 전까지 4 °C에서 보관할 수 있습니다. 파라핀 매립(Paraffin embedding) 과정이 이어집니다. 냉동 조직을 사용하는 이유는 조직의 무결성이 더 우수하며 시료를 장기간 보관할 수 있기 때문입니다. 일반적으로 코어 시설(core facilities)을 이용하면 더 재현성 있는 결과를 얻을 수 있습니다.

하지만 적절한 시설과 전문 지식을 갖춘 전담 운영자가 있다면, 기관 내에서 직접 절편을 제작할 수 있습니다. 양질의 절편을 제작하는 법을 익히는 것은 일종의 숙련된 기술이 필요합니다. 따라서 저희는 코어 시설(core facility)을 이용합니다.

코어 시설(Core facility)로부터 슬라이드를 돌려받으면 슬라이드 위에 파라핀이 있는 것을 확인할 수 있습니다. 슬라이드를 얇은 막 형태로 구운 감자처럼 알루미늄 호일로 감싼 랙에 넣고 55 °C에서 5분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 빠르게 슬라이드의 호일을 벗기고 톨루엔에 넣어 5분씩 3회 세척합니다.

이 5분 세척 과정은 시간을 정확히 맞추는 것이 매우 중요하며, 너무 오래 배양할 경우 톨루엔이 시료에 악영향을 줄 수 있다는 점을 반드시 기억해야 합니다. 세 차례의 세척과 톨루엔 처리를 마친 후, 100% 에탄올로 빠르게 헹구십시오. 에탄올과 톨루엔이 만나면 실험을 방해하는 침전물이 형성되므로, 이 단계는 매우 중요한 주의 사항입니다.

다음으로, 슬라이드를 95% ethanol에서 5분, 70% ethanol에서 5분, 그리고 물에서 5분씩 두 번 처리하여 샘플을 재수화합니다. 이 단계에서 조직은 h and e 염색을 위한 처리 과정으로 넘어갈 수 있습니다. 저희는 이 목적으로 코어 시설(core facility)을 이용하기도 합니다.

항원 마스킹 해제를 위해 1회용 시트르산 완충액 500 mL를 1리터 플라스틱 비커에 붓고 슬라이드를 담급니다. 금속 손잡이를 제거하고 비커를 전자레인지에 넣으십시오. 고출력으로 5분씩 2회 가열합니다.

두 번의 인큐베이션 사이에 전자레인지의 열을 식히기 위해 문을 열어두는 것을 잊지 마십시오. 전자레인지 가열이 완료되면 슬라이드를 끓는 시트르산 완충액에서 꺼내 따뜻한 물이 담긴 염색 접시에 넣으십시오. 여기서는 단순히 따뜻한 수돗물을 사용하며, 이는 슬라이드를 끓는 온도에서 실온까지 천천히 식히기 위함입니다.

이제 슬라이드를 PBS로 5분씩 3회 세척하면 면역조직화학 염색을 시작할 준비가 됩니다. 면역 염색을 시작하기 위해 가장 먼저 해야 할 일은 티슈 페이퍼로 시료 주변 영역의 물기를 제거하는 것입니다. 항체의 교차 오염을 방지하기 위해 액체 블로커(liquid blocker)로 시료 주변 영역을 구획합니다.

페트리 접시에 거름종이를 넣어 습윤 챔버를 준비합니다. 거름종이를 물로 적신 후 과도한 물을 제거하고 슬라이드를 넣습니다. 습윤 챔버를 사용하는 이유는 배양 기간 동안 슬라이드가 마르지 않도록 하기 위함입니다.

드로잉 시 배경 신호가 증가할 수 있으므로 슬라이드가 마르지 않게 하는 것이 매우 중요합니다. 이때 슬라이드를 인큐베이션 버퍼로 30분 동안 블로킹합니다. 블로킹 후 슬라이드를 다시 슬라이드 랙으로 옮겨 세척 버퍼에서 인큐베이션합니다.

이전과 동일하게 과량의 완충액을 제거합니다. 슬라이드를 습윤 챔버에 다시 넣고 1차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 배양합니다.

1시간의 배양 시간이 지나면 슬라이드를 슬라이드 랙에 다시 넣고 세척 버퍼로 10분씩 3회 세척합니다. 세척 후, 티슈 페이퍼를 사용하여 시료 주변의 과잉 세척 버퍼를 제거합니다. 슬라이드를 가습 챔버에 다시 넣고 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 2차 항체 배양 후, 세척 버퍼를 3회 교체하며 각각 15분 동안 세척합니다.

다음으로, 5분씩 3회 세척합니다. PBS를 사용하여 시료 주변의 과잉 액체를 제거하고, 슬라이드 뒷면의 PBS를 닦아내어 슬라이드에 커버슬립을 부착합니다. 2.5% DAB 용액을 사용하여 염색합니다.

퇴색을 줄이기 위해, 슬라이드 위에 80 µL를 한 방울씩 천천히 가합니다. 이때 기포가 생기지 않도록 주의하십시오. 그다음 커버슬립을 매우 천천히 덮습니다.

기포가 남지 않도록 주의하십시오. 기포는 슬라이드가 건조된 후 사진을 촬영하려는 표본 바로 위에 위치하는 경우가 많아 좋지 않습니다. 이제 준비가 되었으므로 슬라이드를 확인하십시오.

FITC 필터를 사용하여 염색에 성공한 모습입니다. 20배 대물렌즈로 관찰하면, 표피의 모든 기저 상층(super basal layers)과 연관된 Claudin-6를 확인할 수 있습니다. 저희 연구실은 표피 내 claudin의 발현 및 국소화에 깊은 관심을 가지고 있습니다.

밀착 연접과 표피 투과성 장벽의 형성과 관련하여, 마우스 피부에 대한 면역조직화학 염색 수행 방법을 살펴보았습니다. 이 실험 절차를 수행할 때, 조직 절편이 평평하게 유지되어야 하며 배양 단계 사이에 슬라이드가 마르지 않도록 주의하는 것이 중요합니다. 이상으로 마치겠습니다.

시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.