형광 항체를 사용하여 마우스 표피의 파라핀 섹션에 Immunohistochemistry

표피에. 면역조직화학(Immunohistochemistry)은 특정 단백질을 발현 구획에 국소화하는 효율적인 수단입니다. 이 비디오에서는 실험실에서 일상적으로 사용하는 표피 단백질의 면역 국소화를 위한 신뢰할 수 있는 방법을 보여줍니다.

안녕하세요, 저는 만성 질환 프로그램의 오타와 건강 연구소 (Ottawa Health Research Institute)의 낮은 건물에있는 토리노 박사 실험실의 Tammy입니다. 오늘은 마우스 표피의 파라핀 포매 조직 절편에 형광 항체를 사용하여 면역조직화학을 하는 절차를 보여드리겠습니다. 우리 실험실에서는 BO의 고정 조직을 사용하여 표피 분화 마커의 면역 국소화를 위한 프로토콜을 최적화했습니다.

최적화의 일환으로, 우리는 고정하기 전에 종이 타월에 피부를 펼쳐 피부를 평평하게 유지합니다. 이 절차에는 표피 해부, 고정, 탈수, 파라핀 임베딩 및 단면 절단, 왁싱, 재수화, 항원, 마스크 해제, 항체 라벨링, 마지막으로 에피 형광을 사용한 장착 및 시각화가 포함됩니다. 시작하겠습니다.

신생아 마우스를 사용할 때 뒷 피부를 면도할 필요가 없습니다. 그러나 털이 있는 나이가 많은 쥐가 있는 경우 부분을 자르는 데 방해가 되지 않도록 뒷 피부를 면도해야 합니다. 해부를 할 때 분석에 사용하려는 피부 부위에 집게를 넣지 않도록 매우 조심해야 합니다.

그래서 우리가 하는 일은 절단할 부위의 가장자리에 집게를 두르고 매우 조심스럽게 들어 올려 표피를 자르고 실험에 사용하려는 영역을 만지지 않도록 기억하는 것입니다. 피부를 고정할 때 피부가 말려 올라와 튜브 안에 들어가는 것을 원하지 않습니다. 우리는 그것이 멋지고 평평하기를 원합니다.

그래서 그것을 돕기 위해 우리가 하는 일은 종이 타월 위에 피부를 얹어 고정하는 동안 평평하게 유지되도록 하는 것입니다. 이제 종이 타월의 피부가 멋지고 평평해졌으므로 우리가 할 일은 집게로 손상되었을 수 있는 부분을 제거하기 위해 가장자리를 자르거나 다듬는 것입니다. 그런 다음 피부를 2mm x 2mm 크기의 아주 작은 조각으로 자릅니다.

이제 조직이 고정될 것입니다. 껍질을 관리 가능한 조각으로 자른 후 boin 용액에 담그십시오. 튜브에 뚜껑을 씌우고 튜브를 퍼필로 감싼 다음 로커에 올려 놓습니다.

하룻밤 배양의 경우 boin 용액에서 16-18시간만 배양하는 것이 중요합니다. 고정 기간이 짧거나 길면 조직이 손상됩니다. 잠복기는 끝났습니다.

PBS로 조직을 헹군 다음 30%50%와 70%알코올을 사용하여 일련의 에탄올 세척을 합니다. BO의 색상이 노란색이고 세탁을 수행함에 따라 boons가 희석됨에 따라 세척의 색상이 점점 더 노란색이 줄어드는 것을 볼 수 있습니다. 매번 30분씩 두 번 씻습니다.

에탄올을 마지막으로 세척한 후 샘플을 신선한 70% 에탄올에 넣고 파라핀 몇 통풍구를 추가 처리할 때까지 섭씨 4도에서 보관할 수 있습니다. 포함. 냉동 조직을 과도하게 사용하면 조직 무결성이 우수하고 샘플을 장기간 보관할 수 있습니다. 일반적으로 핵심 시설은 더 재현 가능한 결과를 생성합니다.

그러나 시설이 있고 전문 지식을 갖춘 전담 작업자가 있는 경우 사내에서 섹션을 절단할 수 있습니다. 좋은 부분을 자르는 법을 배우는 것은 오히려 예술 형식입니다. 따라서 우리는 핵심 시설을 사용합니다.

Core 시설에서 슬라이드를 다시 받은 후 슬라이드에 파라핀이 있는 것을 볼 수 있습니다. 얇은 필름으로 슬라이드는 구운 감자처럼 알루미늄 호일로 싸인 랙에 놓고 55도에서 5분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 슬라이드의 포장을 빠르게 풀고 슬라이드를 톨루엔에 넣고 5분씩 3회 세척합니다.

이 5분 세척기는 시기가 적절해야 하고 너무 오래 배양해야 하며 톨루엔은 표본에 좋지 않다는 점을 기억하는 것이 매우 중요합니다. 세 번 씻고 톨루엔을 씻은 후 100% 에탄올로 빠르게 헹굽니다. 에탄올과 톨루엔은 실험을 방해하는 침전물을 형성하기 때문에 이것은 기억해야 할 매우 중요한 단계입니다.

다음으로, 샘플은 95% 에탄올에서 5분, 70% 에탄올에서 5분, 그리고 물에서 5분 동안 두 번 슬라이드를 배양하여 재수화합니다. 이 시점에서 h와 e로 염색하기 위해 조직을 처리할 수 있습니다. 이를 위해 핵심 시설도 활용

항원의 경우 500mil의 불량한 구연산염 완충액을 1리터 플라스틱 비커에 넣고 슬라이드를 담그십시오. 금속 손잡이를 제거하고 비커를 전자레인지에 넣는 것을 잊지 마십시오. 전자레인지에 고출력으로 2회 5분 동안 돌립니다.

두 개의 부화 사이에 전자 레인지를 식히기 위해 문을 여는 것을 잊지 마십시오. 전자레인지에 돌리는 것이 끝나면 끓는 구연산염 완충액에서 슬라이드를 꺼내 따뜻한 물이 담긴 염색 접시에 넣습니다. 우리는 따뜻한 수돗물을 사용하며 이것의 목적은 슬라이드를 끓는 상태에서 실온으로 천천히 식히는 것입니다.

이제 PBS에서 5분 동안 슬라이드를 세 번 세척할 수 있으며 면역조직화학을 시작할 준비가 되었습니다. 면역 염색을 시작하기 위해 가장 먼저 해야 할 일은 티슈 페이퍼로 표본 주변을 말리는 것입니다. 항체 교차 오염을 방지하기 위해 당사는 액체 차단제로 검체 주변 영역을 구분합니다.

페트리 접시에 여과지를 넣어 가습 챔버를 준비합니다. 물에 담그고 여분의 물을 제거한 다음 슬라이드를 삽입하십시오. 우리가 가습 챔버를 사용하는 이유는 잠복기 동안 슬라이드가 마르지 않

그림을 그리면 배경이 늘어나기 때문에 슬라이드가 마르지 않는 것이 매우 중요합니다. 이때 슬라이드는 30분 동안 배양 버퍼로 차단됩니다. 블로킹 후 슬라이드를 슬라이드 랙으로 다시 옮기고 세척 버퍼에서 배양합니다.

이전과 마찬가지로 초과 버퍼를 제거합니다. 슬라이드를 가습 챔버에 다시 넣고 1시간 동안 1차 항체로 배양합니다. 실온에서.

1시간 배양이 끝나면 슬라이드를 슬라이드 랙에 다시 넣고 10분 3회 세척 버퍼로 세척합니다. 세척 후 티슈 페이퍼로 표본 주변의 여분의 세척 버퍼를 제거합니다. 슬라이드를 다시 가습 챔버에 넣고 2차 항체로 배양한 후 2차 항체로 실온에서 1시간 동안 배양하고 각각 15분씩 세척 버퍼를 3회 교체하여 세척합니다.

다음으로, 5분 동안 3회 세탁합니다. PBS에서 시편을 둘러싼 여분의 액체를 제거하고 슬라이드 뒷면에서 PBS를 닦아내어 커버 슬립을 슬라이드에 장착합니다. 우리는 2.5%DAB co.와 함께 모바일을 사용합니다.

퇴색을 줄이려면 슬라이드에 80마이크로리터의 dropwise를 추가하십시오. 거품이 생기지 않도록 주의하세요. 그런 다음 커버 슬립을 아주 천천히 내립니다.

거품이 남지 않도록 주의하세요. 거품은 종종 표본, 모바일이 마른 후 사진을 찍고 싶은 바로 거기에 떨어지기 때문에 좋지 않습니다. 이제 슬라이드를 볼 준비가 되었습니다.

다음은 FITC 필터를 사용한 성공적인 염색 방법입니다. 20 x objective에서 우리는 Clain six가 표피의 모든 super basal layer와 연결되어 있음을 볼 수 있습니다. 우리 연구실은 표피에서 클라우딘의 발현과 국소화에 매우 관심이 있습니다.

밀접한 연접부 및 표피 투과성 장벽(epidermal permeability barrier)의 형성과 관련하여, 우리는 방금 마우스 피부에서 면역조직화학을 수행하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때 조직 부분이 평평하기를 원하고 배양 사이에 슬라이드가 마르지 않도록 해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 그게 다야.

시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.