Name: 애벌레 Zebrafish의 생식소 조직의 해부 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: 배우세요 애벌레 제브라피쉬의 생식소 조직 해부 및 분리 방법을 통해 분자적 특성을 분석하는 기술입니다. 이 프로토콜은 성 분화 연구와 발달생물학 연구에 필수적인 기초를 제공합니다.

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우리는 물고기 케어 C 장 감사합니다. 이 작품은 중국 국가 자연 과학 재단 (GP로 31171074, 31371099 및 31571067)에 의해 그리고 포강 인재 프로젝트 (GP에 09PJ1401900)에 의해 지원되었다.

Zebrafish의 실험은 복단 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. Zebrafish의 표준 절차 (20)에 따라 상승과 사육되었다. 1. 준비 <ol><li> 애벌레 zebrafish의 DPF (17) DPF 25 육성 <ol><li> 교차 전날 늦은 오후에 건너 탱크로 전송이 남성과 두 여성 성인 제브라 피쉬 (건강, 기존 3 개월에서 6 개월, 실험실 앱 스트레인). 장벽으로 남성과 여성을 분리합니다. 다음 날 아침, 탱크의 물을 새로하고 그들이 짝짓기를 할 수 있도록 장벽을 제거합니다. 100mm 배양 접시 수정 후 1 ~ 2 시간에서 계란을 수집합니다. </li><li> 초기 개발 시간 (4 일) 동안 285 ° C에서 40 mL의 배아 매체 (EM)가 100mm의 접시에 약 40 배아를 유지하고 하루 두번 EM을 새로. 1 L 탱크 (300 mL의 시스템 물 (40) 유충)에 유충을 전송하고 5 DPF 후 라이브 로티퍼 (전체 공급, 하루에 두 번)로 공급.10 DPF 후 대신 로티퍼 다이어트의 라이브 소금물 새우 피드. 21 DPF (14)에 다시 물 순환 시스템에 물고기를 전송합니다. </li><li> DPF (17) 또는 DPF (25)까지 다시 순환 시스템 유충 제브라 올리기. 광 / 암 사이클을 보장하는 시스템 물 10분의 14 H하여 pH 값은 약 7.2이다. DPF (17) (5.5 ~ 6.8 mm) 및 DPF (25) 유충 22 (8 mm 내지 11)의 본체의 길이를 측정한다. </li></ol></li><li> 해부 2 % 한천 플레이트를 준비합니다. <ol><li> 200 ㎖의 멸균 수에 4g 한천 추가. 이 투명 될 때까지 전자 레인지에 가열하여 혼합합니다. </li><li> 다음, 직경 60mm 페트리 접시 (플레이트의 약 1/3 부피)에 부어 약 15 분 동안 한천 용액을 냉각. 4 ℃에서 응고 한천 플레이트를 저장합니다. </li></ol></li></ol> 2. 프로토콜 : 1 애벌레 DPF 성선의 (17)의 조직과 25 해부 <ol><li> 17 DPF의 애벌레를 마취 탱크에 얼음 조각을 추가합니다. 전송할30 mL의 차가운 링어의 솔루션 페트리 접시 차게 100 mm의 마취 유충. 완전히 유충을 마취 적어도 15 분 동안 냉각 링거액 배양 물고기를 유지합니다. </li><li> 작은 플라스틱 스푼으로 미리 냉각 된 한천 플레이트에 유충을 전송합니다. 링거액을 차게 10 mL에 전체 물고기의 몸을 담그고 부드럽게 옆으로 누워. </li><li> 25X 스테레오 현미경의 비전 필드에서 다음 작업을 수행합니다. 안정화를위한 핀셋 물고기 몸통을 클램프. 핀셋의 또 다른 쌍의 심장으로 항문에서 길이 방향으로 복부를 추출. 부드럽게 내부 장기를 노출 신체의 한쪽에 피부와 근육을 제거합니다. </li><li> 주의 부레에 복부 장기의 질량을 제거합니다. 부레에 부착 된 생식선의 손상을 방지. </li><li> 수영 방광과 전방 몸 사이의 연결을 잘라. 전체 부레 부드럽게 성선 조직을 잡아 당깁니다. 참고 : 대부분의 경우S는, DPF (17)의 생식선 조직은 상피 조직과 주변 protonephridium 포함한다. 그들은 쉽게 서로 분리되지 않지만, 25 그것은 쉽게 분리 할 수 ​​DPF. 생식소는 항문에 연결되어 있습니다. 항문에서 서로 접속 좌우 생식선과 접합 명확히 표시 될 것이다. </li><li> 주의 부레에서 성선 조직을 분리하고 주변의 지방 조직을 정리 핀셋을 사용합니다. </li><li> 즉시 200 μL 링거액을 함유하는 예냉 1.5 mL의 원심 분리 튜브로 절연 생식선 조직 옮긴다. 모든 성선 조직이 유충에서 분리 될 때까지 얼음에 튜브를 유지합니다. </li><li> 2.7 - 단계 2.1에 설명 된대로 유충 DPF (25)의 생식선을 해부하다. </li></ol> 3. 프로토콜 2 : 절연 성선 조직의 유전자 발현 분석 <ol><li> 애벌레 성선 조직에서 총 RNA를 추출합니다. <ol><li> 새의 RNase없는 일에 고립 된 성선 조직을 전송합니다.5 ㎖의 튜브는 링거액을 제거합니다. 100 μL 용해 솔루션을 추가합니다. 조직까지 소용돌이가 완전히 용해된다. </li><li> 제조업체의 지침에 따라 총 RNA 추출 절차를 수행합니다. </li><li> 내가 버퍼 10 배의 DNase의 1/10 볼륨과 RNA 솔루션의 DNase I의 1 μL를 추가하고 부드럽게 섞는다. 37 ° C에서 20 분 동안 인큐베이션. </li><li> RNA의 솔루션에 1/10 볼륨 DNase의 불 활성화 시약을 추가합니다. 70 ° C에서 10 분 동안 인큐베이션. 분광 광도계를 사용하여 전체 RNA의 농도를 측정한다. -20 ° C에서 보관하십시오. </li></ol></li><li> 첫 번째 가닥 cDNA 합성을 수행 <ol><li> 제조의 프로토콜 다음 첫 번째 가닥 cDNA 합성을 수행 할 올리고 (DT) -linker 프라이머를 사용합니다. 20 μL에 총 반응 볼륨 1 RNA의 μg의 2를 추가합니다. </li><li> 45 ° C에서 90 분 동안 반응 액을 인큐베이션. 5 분 동안 70 ℃에서 가열하여 반응을 정지. </li><li> cDNA를 1 μL의 RNase H를 추가하기 때문에기술인 것 잔류 RNA를 제거합니다. ~ 13,000 X g에서 10 초 동안 부드럽게 원심 분리기 섞는다. 37 ° C에서 20 분 동안 인큐베이션. 20 μL 뉴 클레아없는 물을 추가합니다. -70 ° C에서 보관하십시오. </li></ol></li><li> 형광 정량 PCR을 수행 <ol><li> 형광 염료와 자전거 타는 시스템에 qPCR을 수행합니다. 15 초, 30 초 동안 68 ° C를 들어, 15 초 동안 95 ° C에서 Tm은 -5 ℃로 35주기 다음 PCR 사이클링 조건을 사용한다. (: GTCCTGTTGTCTCCTACTGTCG, REV : FWD CATTTGAGTTGAATATGATGCCCTG), cyp19a1a :; : AMH (GCGGAGAGGTGGAAGAGAGAATG FWD : 회전 GTGGATGGCAGCAGTACGAC)를 다음과 같이 프라이머 시퀀스를 사용 nanos3 (FWD : GCTCGGTGTACGCCAAATCAACAT, REV : CCAAGTGAAAACACAACACCAGTGC), 바사 (FWD : ATCGCATAGGAAGAACTGGACGCT, REV : CCAAGTGAAAACACAACACCAGTGC) 및 β 액틴 (FWD : AGTGCGACGTGGACATCCGTA; REV : GCACTTCCTGTGGACGATGGA) 19. </li></ol></li></ol>

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저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

제브라 피쉬는 강력한 모델이되었다 광범위하게 개발 및 질병 관련 연구에 사용됩니다. 뇌, 심장, 생식선, 신장 등의 성인 제브라 피쉬에서 기관의 분리를위한 방법은,도 23, 24, 25를 기록하고있다. 때문에 작은 크기와 애벌레 제브라 피쉬의 성선 조직의 역동적 인 리모델링에, 성선 조직의 분리가 어려운 작업입니다. 애벌레 생식선 (26)을 조사 EGFP를 기반으로 셀 정렬 및 레이저 미세 절제 : 이전의 연구는 전체 해부 트렁크 조직이나 형질 전환 바사을 사용했다. 순화 동안 4 번 염색체의 변형은 결정 성 들여진 지브라 피쉬의 비밀을 만든다. 여기에 설명 된 우리의 방법은 성 결정 MECH을 탐구하는 것이 도움이 될 수있는 추가적인 형태 학적 및 분자 시험을 상대적으로 깨끗하고 초기 생식선 준비를 제공 할 수 있습니...

야생 제브라 피쉬 염색체 4의 주요 여성 성 결정은 1 (즉, 일반적인 실험실 균주)를 분실하거나 들여진 제브라 피쉬에서 수정됩니다. 대신, 그들은 온도, 저산소증, 식품 가용성 및 인구 밀도 등 환경 요인에 의해 동행 polygenic 성 결정 시스템을 가지고있다. 제브라 피쉬 성 개발의 상세한 메커니즘은 완전히 이해되지 않습니다. 일차 성 판정 신호 (들) / 무엇 이러한 제브라 성 결정이 발생한 경우 등의 근본적인 문제가 있으며, 유전자 생식선 변환의 제 1 단계는, (3) 2 답변 남아 조절한다. 제브라 피쉬 성 개발의 과정에서 몇 가지 중요한 단계로 인식되고있다. 개발의 초기 단계에서, 4 HPF (시간 포스트 수정) 원시 생식 세포 (PGC와) 사양을 받아야에서 시작 생식기 능선 마이그레이션 및분아 증식. PGC 번호와 생식 세포와 체세포 사이의 상호 작용은 생식선 차별화 4 중요하다. 13 DPF (일 포스트 수정)에서, 생식선은 미분화 단계에 있습니다. 17 DPF으로 생식선 미래의 여성과 남성 모두에서 양방향 가능성이 난소로 발전. 난소에서 세포 사멸에 의존 전환은 고환에 21 ~ 25 DPF에서 시작하고 몇 주 동안 계속 사용할 수 있습니다. DPF (35)에 의해 상기 생식선의 성별 결정된 성별 별 생식 생산 7 양쪽 난소에서 진행되고, 6, 5 고환. 지금까지 다양한 후보 유전자 및 성 결정 메커니즘이 제안되었다. 단백질 체학 및 transcriptomic 분석은 성적으로 동종 이형 표현으로 많은 유전자를 격리하고 이들 유전자는 제브라 피쉬 (8)에서 성 차별을 연구하기 위해 사용되어왔다 </sup&gt; 9,10. 예를 들면, 애벌레 제브라에서 cyp19a1a 유전자 특이 아니라 고환 (11), (12) 난소 표현된다. 또한 AMH 유전자 약하게 난소 난포 과립 막 세포에서 발현되지만 강하게 정소 세르 톨리 세포 (13)이다. 반대로, 바사 유전자가 지속적으로 적합한 생식선 마커 (14), (15) 제조, 남녀 모두 지브라 피쉬의 생식 세포에서 발현된다. 생식선 유전자 발현 량을 조사하는 것은, 특히 양방향 전위 난소 단계 3, 9에 결정 성 및 분화의 분자 메커니즘을 이해하는 것이 중요하다. 그러나 애벌레 제브라 피쉬와 상응 작은 생식선의 작은 크기 gonada의 분리를 복잡하게추가로 분자 분석을위한 조직 L. 사용 이전의 연구는 opercula 항문 구멍 (16) 사이에 전체 트렁크 영역을 해부. 이 준비는 포함 생식선 있지만, 여러 조직과 기관으로 구성되어 있습니다. 대안 적으로, 바사 같은 성선 GFP 특이 식 트랜스 제닉 동물 : EGFP는 형광 활성화 세포 분류 (FACS)과 레이저 캡처 마이크로 해부 (17), (18)를 통하여 생식선 조직의 분리를 위해 사용 하였다. 그러나 그들의 광범위한 응용이 제한됩니다. 여기, 우리는 17 DPF 25 DPF에서 애벌레 제브라 피쉬에서 성선 조직을 분리하는 간단한 절차를 설명합니다. 우리는 다른 기관에 대한 생식선의 위치를 ​​보여 주변 조직에서 형태 학적 손상 생식선을 격리 할 것. 우리는 더 높은 정량 PCR을 통해 트렁크 조직 (과 비교 고립 된 생식선로 표현 등 바사와 cyp19a1a과 생식선 특정 유전자를 보여qPCR에) 분석. 본 프로토콜은 이에 생식기 조직 (19)의 연속적인 분자 분석을 가능하게 식별, 분리, 정제 및 RNA 유생 지브라 피쉬의 생식선 특정 유전자의 증폭을 허용한다.

<table><tbody><tr><td>세포 배양 접시 100 mm</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>배아 배양</td></tr><tr><td>20x EM</td><td></td><td></td><td>1 L 필요: 17.5 g NaCl, 0.75 g KCl 및 2.9 g CaCl&#183 추가; 2H2O; 그런 다음 0.41g KH2PO4, 0.412g Na2HPO4 무수 및 4.9g MgSO4&#183을 추가합니다. 7H2O.</td></tr><tr><td>1x EM</td><td></td><td></td><td>증류수에 20x EM 희석</td></tr><tr><td>AGAROSE G-10</td><td>유전자</td><td>121985</td><td>2 % 한천 플레이트 제조</td></tr><tr><td>용 Trizol 시약</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td>RNA 분리</td></tr><tr><td>용 미터 유리</td><td>Shen Bo</td><td>250 ml</td><td>2 % 한천 플레이트 준비</td></tr><tr><td>용 전자 레인지</td><td>Midea M1-211A</td><td>한천</td><td></td></tr> <tr><td>가열 용Tweezer DUMONT#5INOX</td><td>World Precision Instrument</td><td>500341</td><td>For dissectionmicroscope</td></tr><tr><td></td><td>Motic</td><td>SMZ168</td><td>For dispiration</td></tr><tr><td>Pure water equipment</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ringer' s 용액</td><td></td><td></td> 1 <td>L가 필요한 경우 : 6.78 g NaCl, 0.22 g KCl, 0.26 g CaCl2 및 1.19 g Hepes를 추가합니다. 그런 다음 1 L로 채 웁니다. pH를 7.2로 조정합니다. 여과에 의해 살균하고 오토클레이브 처리된 투명한 폴리카보네이트 용기에 보관하십시오.</td></tr><tr><td>트랜스퍼 피펫</td><td>Samco</td><td>202, 204</td><td></td></tr><tr><td>메탈 배스</td><td>QiLinbeier</td><td></td><td>모델 GL-150</td></tr><tr><td>현미경</td><td>Leica&nbsp;</td><td>M205 FA</td><td>현미경 사진용</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>Micro Scale RNA Isolation Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1931</td><td>생식선 조직에서 RNA 분리용</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Sigma</td><td>AMPD1-1KT</td><td>RNA 용액의 DNA 분해용</td></tr><tr><td>RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>#K1631</td><td>first-strand cDNA 합성용</td></tr><tr><td>Rnase H</td><td>Thermo Scientific</td><td>#EN0202</td><td>cDNA 용액의 잔류 RNA를 분해하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>SYBR Green Realtime PCR 마스터 믹스</td><td>TOYOBO</td><td>QPK-201</td><td>이 제품은 Real-Time PCR을 위한 Taq DNA 중합효소 기반 2x 마스터 믹스이며, SYBR Green I을 사용한 삽입 분석에 적용 가능합니다.</td></tr><tr><td>분광 광도계</td><td>Ne Drop</td><td>OD-2000+</td><td>전체 RNA</td></tr><tr><td>Mastercycler</td><td>Eppendorf</td><td>AG 22331 Hamburg</td><td>유전자 발현 프로파일링</td></tr>의 농도 측정</tbody></table>

애벌레 zebrafish의 생식소 조직의 해부

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

야생 제브라 피쉬는 ZZ / ZW 성 결정 시스템을 가지고 있지만, 길 들여진 제브라 피쉬는 성 염색체를 잃었다. 그들은 게놈가 공동으로 개별 물고기의 성 정체성을 결정 전반에 걸쳐 여러 유전자가 분산 polygenic 성 결정 시스템을 활용합니다. 현재 유전자는 생식소의 발달을 조절에 관여하고 작동 방법이 어려운 남아있다. 일반적으로, 성선 조직을 분리하는 것은 성 발달 과정을 조사하기위한 첫 번째 단계입니다. 여기서 우리는 zebrafish의 유충 DPF (17) DPF (일 포스트 수정) 25에서 성선 조직을 분리하는 방법을 제시한다. 분리 된 성선 조직은 연속적 형태 및 유전자 발현 프로파일 링에 의해 조사 할 수있다.

생식기의 해부는 앱 스트레인 애벌레 제브라 피쉬에서 수행되었다. 도 1은 DPF (17)와 DPF (25)에서 유충 지브라 피쉬의 전형적인 생식선의 조직을 보여준다. 첫째, 피부와 복부의 한 쪽의 근육은 내부 장기를 노출 절단한다. 내부 장기의 질량을 제거한 후, 함께 생식소와 부레 트렁크에 남아 있습니다. 생식선은 ( &#39;도 1b에 화살표) 부레의 복부 측면에 부착 하였다. DPF (17)에서, 생식선은 양방향 전위 난소 스테이지였다. 분리 된 생식선은 좌우 생식선을 포함하고 (그림 1C) 반투명했다. 대부분의 경우에서, 상피 조직과 protonephridium (도 1c의 화살표)로 둘러싸여 있었다. 생식선 DPF (2...

여기서 우리는 제브라 피쉬 섹스의 분화 및 유지 보수의 조사를 용이하게 애벌레 제브라 피쉬의 성선 조직을 분리하기위한 프로토콜을 제시한다.

애벌레 Zebrafish의 생식소 조직의 해부

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

이 절차의 전반적인 목표는 제브라피시 유생으로부터 생식선 조직을 분리하고, 분리된 조직의 분자적 특성을 분석하는 것입니다. 이 방법은 생식선 발달을 조절하는 유전자의 보존성 및 제브라피시 성 결정의 분자적 기반과 같이, 제브라피시 성 발달 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 수정 후 이르면 17일 된 제브라피시 유생의 생식선 조직을 적출하여 세포 및 분자 생물학적 상태를 분석할 수 있다는 점입니다.일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자는 제브라피시 유어의 생식샘 조직의 작은 크기와 역동적인 재구성 과정으로 인해 어려움을 겪을 것입니다. 생식샘 적출을 준비하기 위해, 성체 수컷 두 마리와 암컷 두 마리를 분할 교배 탱크의 각 쪽에 배치하십시오. 다음 날 아침에 탱크의 물을 갈아주고 격벽을 제거하여 교배를 시작합니다.수정 후 1~2시간 뒤에 약 40개의 알을 수집하여 40 mL의 배아 배지(EM)가 담긴 100 mm 플레이트로 옮깁니다. 배아를 28.5 °C에서 4일 동안 배양하며, EM은 하루에 두 번 교체합니다. 배양 후 유생을 1 L 수조로 옮깁니다. 수정 후 5일(DPF)이 지나면 물고기에게 살아있는 회전충을 먹입니다.치어가 10 DPF에 도달하면 살아있는 브라인 쉬림프를 먹이로 제공합니다. 그 후 14 DPF에 치어를 재순환 여과 시스템으로 옮깁니다. 제브라피쉬 치어를 17 또는 25 DPF까지 성장시킵니다.그 후 17 DPF와 25 DPF에서 유충의 체장을 측정합니다. 멸균수 200 milliliters에 agar 4 grams를 첨가하여 해부를 위한 2% agar 플레이트를 준비합니다. 혼합물이 투명해질 때까지 전자레인지로 가열합니다.한천을 15분 동안 식힌 다음, 지름 60mm 페트리 접시에 붓습니다. 응고된 한천 플레이트는 4°C에서 보관합니다. 마취된 17 DPF 유어가 들어있는 탱크에 분쇄 얼음을 추가합니다.마취된 유충을 30 mL의 차가운 Ringer 용액이 담긴 100 mm 냉각 페트리 접시에 옮깁니다. 유충을 완전히 마취시키기 위해 냉각된 Ringer 용액에서 최소 15분 동안 배양합니다. 플라스틱 스푼을 사용하여 유충을 미리 냉각시킨 아가 플레이트로 옮깁니다.물고기 몸 전체를 10 mL의 차가운 Ringer's Solution에 담그고 조심스럽게 옆으로 눕힙니다. 실체현미경으로 25배 확대하여 핀셋으로 물고기의 몸통을 고정합니다. 그런 다음, 다른 핀셋을 사용하여 항문에서 심장까지 복부를 세로 방향으로 찢어 엽니다.다음으로, 신체 한쪽의 피부와 근육을 조심스럽게 제거하여 내부 장기를 노출시킵니다. 그런 다음, 부레의 복쪽에 위치한 거대 장기들을 주의 깊게 제거합니다. 이때 부레에 부착된 생식선이 손상되지 않도록 주의하십시오.부레와 체내의 연결 부위를 절단하십시오. 그 후, 부레 전체와 생식선 조직을 조심스럽게 끌어냅니다. 핀셋을 사용하여 부레에서 생식선 조직을 조심스럽게 분리하십시오.주변의 지방 조직을 제거합니다. 분리한 생식샘 조직을 200 µL의 Ringer's Solution이 들어 있고 미리 냉각된 1.5 mL 원심 분리 튜브로 즉시 옮깁니다. 모든 유충에서 생식샘 조직이 분리될 때까지 튜브를 얼음 위에 보관하십시오.유충 생식선 조직에서 총 RNA를 추출하려면 분리된 생식선을 새로운 RNase free 1.5 milliliter 튜브로 옮기고 Ringer's Solution을 제거하십시오. 그런 다음, lysis solution 100 microliters를 첨가합니다. 그리고 조직이 완전히 용해될 때까지 튜브를 vortex 하십시오.제조업체의 지침에 따라 총 RNA 추출을 수행한 후, RNA 용액에 DNase I 버퍼를 부피의 10분의 1만큼, DNase I을 1 µL 첨가하고 튜브의 내용물을 부드럽게 혼합합니다. 샘플을 37 °C에서 20분 동안 배양합니다. 다음으로, RNA 용액에 DNase 불활성화 시약을 부피의 10분의 1만큼 첨가합니다.샘플을 70 °C에서 10분 동안 배양합니다. 그 후, 분광광도계를 사용하여 총 RNA 농도를 측정합니다. 제조사의 프로토콜에 따라 oligo-dT 링커 프라이머와 1~2 µg의 RNA를 사용하여 1차 가닥 cDNA 합성을 수행합니다.반응물을 45 °C에서 90분 동안 배양합니다. 그 후, 시료를 70 °C에서 5분 동안 가열하여 반응을 종료합니다. 잔류 RNA를 제거하기 위해 cDNA 용액에 1 µL의 RNase H를 첨가합니다.튜브의 내용물을 가볍게 섞은 후, 샘플을 약 13,000 ×g에서 10초 동안 원심분리합니다. 튜브를 37 °C에서 20분 동안 배양합니다. 그런 다음, 샘플에 nuclease-free water 20 µL를 첨가합니다.그리고 cDNA를 -70 °C에서 보관하십시오. 마지막으로, 텍스트 프로토콜에 기재된 조건과 프라이머를 사용하여 형광 염료로 qPCR을 수행합니다. 이 그림은 17 DPF 제브라피시 유생의 전형적인 생식샘 조직을 보여줍니다.여기서 볼 수 있듯이, 생식선은 부레의 복측에 부착되어 있습니다. 17 DPF에 유어는 반투명한 좌측 및 우측 생식선을 가지고 있습니다. 대부분의 경우 생식선은 상피 조직과 원신장으로 둘러싸여 있습니다.25 DPF에 생식소는 흔히 지방 조직에 둘러싸여 있으며, 크고 작은 생식소가 관찰될 수 있습니다. 마지막으로, 분리된 생식소 조직의 분자적 특성을 분석하기 위해 gonadal marker인 amh, cyp19a1a, nanos3, vasa의 발현 수준을 QPCR로 확인하였습니다. 분석 결과, 대조군 조직에 비해 생식소 조직에서 marker 유전자들이 유의미하게 증가했음을 보여주었습니다.이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 한 시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 예상되는 결과를 얻기 위해 제브라피쉬 치어에게 일관된 사육 조건을 제공하는 것이 중요하다는 점을 기억해야 합니다. 이 기술의 개발 이후, 성 발달 분야의 연구자들은 제브라피쉬의 성 결정 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열게 되었습니다.이 영상을 시청한 후에는 제브라피시 치어로부터 생식샘 조직을 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

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여기에서는 단세포 RNA 염기서열 분석을 위해 수정 후 5일에 제브라피시 유충에서 장을 분리하는 방법을 설명합니다.

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배우세요 애벌레 제브라피쉬의 생식소 조직 해부 및 분리 방법을 통해 분자적 특성을 분석하는 기술입니다. 이 프로토콜은 성 분화 연구와 발달생물학 연구에 필수적인 기초를 제공합니다.

애벌레 Zebrafish의 생식소 조직의 해부

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