Name: 초음파 유도 Intracardiac 주입 실험 선 동적인 장 질병의 Murine 모델에 사용 하기 위해 내장을 추적 증가 인간 중간 엽 줄기 세포의 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: 배우세요 초음파 유도 심장내 주사법을 사용하여 크론병 마우스 모델에서 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포의 장으로의 이동을 극대화하는 방법을. 이 기술은 염증성 장 질환 연구에서 세포 치료 효율을 높이는 데 기여합니다.

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Maneesh 데이브는 국방부의 그랜트 PR141774와 크 론 및 Colitis 재단의 미국 경력 개발 수상에 의해 지원 됩니다. 파비오 Cominelli 연구실 NIH에 의해 지원 됩니다 DK042191 (F.C.), DK055812 (F.C.), DK091222 (F.C.) 및 DK07948 (F.C.) 부여. 아놀드 캐 플 란의 실험실 L. 데이비드 E. 버지니아 볼드윈 재단에 의해 부분에서 지원 됩니다. 자금 지원 기관 연구 분석 또는 원고 쓰기에 아무 역할을 했다. 그 내용을 전적으로 저자의 책임입니다.

모든 쥐 실험에서에서 및 절차 연구 케이스 서쪽 예비 대학에 의해 승인 되었다 &#39; 기관 동물 관리 및 사용 위원회. 절차는 평가 대 한 협회에서 실시 됐다 그리고 실험실 동물 배려 (AAALAC)의 인증 인증 시설. BM 동의 후 케이스 서쪽 예비 대학에서 줄기 세포 핵심 시설에서 대학 병원 기관 검토 위원회 승인 프로토콜에서 발음 되었다.
 1. 문화와 변환 인간 골 수 유래 중간 엽 줄기 세포 (hMSCs) 참고: hMSCs의 이전 간행물 15에서 자세히 설명 되어 , 20.
<li>문화 <ol>절연 Dulbecco에서 hMSCs &#39; s이 글 수정 낮음 포도 (DMEM-LG) 매체 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 보충. 37 ° C, 95% 습도, 그리고 성장 매체의 25 mL로 플라스 크 T175에서에서 5% CO 2 셀 문화. 매체를 3-4 일 마다 교체 합니다. 14 일에 hMSCs의 주 통로 수행 합니다.
	<ol><li>때 셀 80% 합류에 도달, 완전히 제거 하는 오래 된 매체 및 멸 균 인산 염 버퍼 식 염 수의 5 mL로 세포를 부드럽게 씻어 (PBS, 75 cm 조직 배양 플라스 크).</li>
		<li>는 플라스 크에서 PBS를 제거 하 고 0.25% trypsin ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)의 4 개 mL를 추가 합니다. 장소 플라스 크 5-10 분에 대 한 37 ° c 배양 기에 다시 노출의 시간을 최대한 간단한 유지.</li>
		<li>셀의 대다수 다방면 되고있다 또는 문화 접시에서 분리는 때 소 송아지 혈 청 크거나 trypsin의 절반 볼륨의 볼륨을 추가 하 여 반응을 중지.</li>
		<li>적절 한 크기 원심 분리기 튜브에 세포 현 탁 액을 전송. 5 분에 대 한 400 x g에서 세포를 원심과 상쾌한을 조심 스럽게 제거.</li>
		<li>Resuspend 매체의 5 mL에 셀 (DMEM LG + 10 %FBS)과 hemocytometer 가진 셀. 
		참고:이 시점에서 셀 수 subcultured 또는 트리플 기자와 불리고.</li>
	</ol></li> <li>트리플 기자와 hMSCs의 변환 수행.
	<li>하나 T175 씨 1.5 x 10 6 셀 <ol>플라스 크. 37 ° C, 95%, 습도, 5% CO 2 성장 매체의 25 mL에 셀 문화. 연결할 셀에 대 한 24 시간을 기다립니다.</li>
		<li>참조 18에 설명 된 대로 바이러스를 15 mL 튜브에 칵테일으로 확인 합니다.
		<ol>는 물에서 37 ° C에서 녹여 lentivirus <li>목욕. Dulbecco에 5 mg/mL proteamine 황산 솔루션의 160 µ L를 추가 &#39; s 문화 매체의 8 mL를 수정이 글 매체 (DMEM) (DMEM LG + 10 %FBS) 100 µ g/mL의 최종 농도 대 한. 3 미 추가 5의 감염 (MOI)의 바이러스 다양성에 대 한 소용돌이 (1 시간 해 동) .</li>
		</ol></li> <li>셀 문화 플라스 크 (1.2.1 단계)에서 매체를 제거 하 고 세포에 바이러스 칵테일을 추가. 10 h 37 ° C, 습도 95%, 5% CO 2에서 품 어.</li>
	</ol></li> <li>DMEM LG + 10%의 4 mL에서 100 µ g/mL proteamine 황산의 4 개 mL를 추가 FBS 및 추가 14 헤에 대 한 품 어</li>
	<li>매체의 25 mL를 대체 하 여 24 시간 후 변환 중지 (DMEM LG + 10 %FBS).</li>
	<li>흐름 cytometry 18 여 mRFP 식을 계산 하 여 확인 변환 효율. 
	참고: 여기, 불리고 했다 hMSCs 65% 이상 효율 이용 되었다.</li>
	<li>25 mL 신선한 매체의 교체에 의해 셀 확장 (DMEM LG + 10 %FBS) 일주일에 두 번. 37 ° C, 95%, 습도, 5% CO 2 셀 문화. 그들은 도달 80% 합류 후 셀 통로.</li>
	<li>원하는 셀 개수에 도달 하면 수행 단계 1.1.2-1.1.4 당 trypsinization.</li>
	<li>셀을 계산 하 고 메 마른 PBS에서 그들을 중단 (1x) 1 x 10의 최종 농도에 6 셀/75 µ L. 계속 전송에 대 한 얼음에 셀 초음파 기계에. 실험에 대 한 사용 통로 번호 2-5에서에서 hMSCs.</li>
</ol> 2. 왼쪽 심 실에 hMSCs의 Intracardiac 주입 초음파 유도 참고: 설립된 작은 창 자 염증 및 나이 및 성별 일치 AKR/J 쥐 실험에 대 한 함께 사용 하 여 SAMP1/YitFc. 특정 병원 체 자유로운 조건에서 SAMP와 AKR 마우스를 유지 하 고 그들을 먹 여 표준 실험실 차 우, 명암 주기 12 h에 그들을 유지. 여기, 살 균 제와 함께 소 각 되었고 70% 알코올로 씻어 서 CWRU 동물 연구 시설에 위치한 전용된 병원 무료 심장 초음파 실에서 초음파-유도 심장 주사 수행 했다. 실험실 연구 요원 intracardiac 주사 중 가운, 얼굴 마스크와 눈 방패와 멸 균 장갑 등 개인 보호 장비를 착용 해야 합니다. 절차 동안 마우스의 체온을 유지 해야 한다.
<ol><li>마우스 마비 전에 이미징 시스템 초음파를 설정 합니다. 이 프로토콜에 대 한 마우스 echocardiogram 위한 초음파 기계를 사용 합니다.
	<ol><li>새로운 연구를 설정 파워와 초기화 변환기 (30 MHz).</li>
	</ol></li> <li>0.2의 비율로 100% 산소에 3-4 %isoflurane 사용 하 여 유도 실에서 마우스 anesthetize-0.5 L/분 유지 코 콘을 통해 100% 산소에서 2 %isoflurane 전체 절차에 대 한 동물. 이미지를 수행 하기 전에 적절 한 anesthetization 확인 발가락 곤란 하 여 마우스를 압 연 하 고 운동의 부재 관찰. 
	참고: 안과 연 고 각 막 건조 방지 하기 위해 마 취의 유도 따라 눈에 적용 되어야 한다. 전송 마 취 쥐 이미징 기계 (즉, 생물 발광 영상 시스템 및 초음파), 그들은 마 취 isoflurane의 유지 보수 복용량을 받게 됩니다. 꼬리에 pinches 반응의 부족을 관찰 하 여 마 취 시작 시간 및 마 취의 깊이 발 패드를 마 취의 전체 기간에 대 한 모든 10 분 확인.</li>
	<li>37 이미징 테이블 및 초음파 젤의 온도 설정 ° c.</li>
	<li>완전히 제거 하는 모피 머리 제거 크림을 사용 하 여 마 취 마우스의 가슴 영역.</li>
	<li>부정사 위치에 이미징 테이블에 마우스 놓고 절차 동안 몸 움직임을 피하기 위해 접착 테이프를 가진 위와 더 낮은 사지를 확보 합니다. 절차 동안 심전도 모니터를 사용 하 여 모든 마우스.</li>
	<li>70% 에탄올 면봉 뒤 10 %povidone / 요오드 면봉을 사용 하 여 가슴의 피부를 청소. 마우스의 가슴 영역에 젤의 두꺼운 층을 적용.</li>
	<li>홀더에 트랜스듀서를 탑재 하 고 좌 심 실 명확 하 게 보기의 필드에 표시 될 때까지 그것의 위치를 조정.</li>
	<li>불리고 hMSC 세포 현 탁 액 (멸 균 PBS의 150 µ L에 2 x 10 6 hMSCs) 28 g 1 mL 주사기로의 부하 150 µ L 바늘 하 고 적절 한 소유자에 게 주사기를 확보. Pulsating 혈액을 시각화, 주사기에 작은 공기 열을 유지 합니다. 응집을 방지 하려면 일시 주사 하기 전에 셀.</li>
	<li>마우스 흉부 쪽으로 주사기, 바늘 궤적 초음파 지도 사용 하 여 조정 고 왼쪽된 심 실 입력.</li>
	<li>초음파 이미징의 지도 따라 침투 및 마우스의 좌 심 실에 있는 공간을 통해 주사기 바늘. 
	참고: 주사기 바늘 팁 ultrasonographic 이미지에 좌 심 실에 명확 하 게 볼 수 있어야 합니다. 적절 한 배치는 주사기에 신선한 동맥 혈액 유출에 의해 더 확인 한다. 이들은 성공적인 삽입의 흔적.</li>
	<li>주사 hMSC 세포 현 탁 액 매우 느리게 2 분 이상, 부드러운 사전 적용ssure.</li>
	<li>정지 세포의 주입, 다음 부드럽게 초음파 젤에서 깨끗 한 바늘, 철회 및 테이프 억제에서 마우스를 놓습니다.</li>
	<li>Preheated 패드와 함께 새로운, 깨끗 한 장에 동물 장소. 
	참고: 절차 완료 후 따뜻한 환경 제공 되어야 한다 쥐에 복구 될 때까지. 주변 혈관 손상 복구 이후 과열을 피해 야 한다. 쥐를 밀접 하 게 모니터링 및 sternal recumbency를 유지 하는 그들의 기능에 의해 표시 된 그들의 전체 복구까지 다른 마우스에서 격리 보관 한다.</li>
	<li>마 취와 실험의 끝까지 매일의 완전 한 복구를 얻을 때까지 동물을 모니터링.</li>
</ol> 3. HMSCs의 생물 (BLI) 발광 영상 <ol><li>이미징 시스템 생물 발광 intracardiac 주사 후 24 h 마우스 이미지. vivo에서 화상 진 찰 소프트웨어 시작. 이미징 시스템을 초기화 하 고 새로운 연구를 엽니다.
	<ol><li>[컨트롤] 패널에서 클릭 하 여 이미지 매개 변수를 설정 &#34; 시퀀스 설정. &#34; 이미징 모드에서 선택 &#34; 발광 &#34; 및 &#34; 사진. &#34; 0.5에서 노출 시간을 설정 10 분 s 설정에서 binning &#34; 매체 &#34; 및 F 중지/&#34; 1. &#34; 여기 필터를 설정 &#34; 블록 &#34; 및 방출 필터를 &#34; 오픈. &#34; 보기의 필드를 설정 &#34; C &#34; 두 마우스. 수집 컨트롤 패널을 클릭 하 여 이미지 마법사 시퀀스 설정 추가.</li>
	</ol></li> <li>유도 챔버와 컴퓨터 내부 원뿔에 2.5% 산소 펌프 세트는 isoflurane에 스위치.</li>
	<li>마우스 i.p. 300 µ L D-소 (12.5 mg/mL)의 주입.</li>
	<li>마 취 유도 실에서 마우스를 놓습니다.
	<ol><li>2-3 분 후는 vivo에서 이미징 챔버, 마 취 매니폴드에 원뿔에 그것의 머리에 마우스를 전송. 광 연 고 이미징 동안 눈을 보호 하기 위해 적용 됩니다. 여러 마우스를 이미지를 사용 하 여 검은 빛 배플 인접 한 쥐에 빛의 반사를 방지 하기 위해.</li>
	</ol></li> <li>클릭는 &#34; 취득 &#34; D 소 주사 후 이미지 수집 10 분 시작 하는 버튼.</li>
	<li>3.3-3.5 이미지 더 많은 쥐를 단계를 반복.</li>
	<li>Vivo에서 이미지 수집 후 CO 2 흡입 뒤에 자 궁 경부 전위, 죽음을 확인 하 여 쥐를 안락사. Ex vivo 분석을 수행 합니다.
	<ol><li>쥐; 희생 하기 전에 소 주입 (3.3 단계)를 반복 하는 20 분 후 비보 전 분석을 수행한 경우 라스 신호 소 주사 후 20 분을 저하 될 수 있습니다.</li>
	</ol></li> <li>전체 위장 (즉, 위에서 항문에), mesenteric 림프 노드 (MLN), 폐, 비장, 그리고 간 제거 하 쥐를 해 부. 집게와가 위 2 , 4를 사용 하 여 접시에 그들을 배치.</li>
	<li>이미징 챔버에 explanted 장기를 포함 하는 배양 접시를 놓고 단계 3.1-3.6 당 씨 이미지.</li>
	<li>이미지 수집 후 최적의 절삭 온도 (10 월) 화합물을 포함 하는 견본 금형 explanted 장기 전송. Cryofreeze-80 ° c에서 드라이 아이스를 사용 하 여 금형. Immunohistochemistry hMSCs 16의 존재를 확인 하기 위해 냉동된 섹션에 안티 luciferase 항 체를 사용 하 여 수행.</li>
	<li>빛의 강도의 정량화에 대 한 관심 (ROI) 도구를 도구 팔레트 16 , 19의 영역을 사용. 투자 수익 프레임 선택한 이미지에 관심 영역을 이동 합니다. 클릭 &#34; ROI 측정 &#34; SEQ 파일 형식에서 데이터를 저장. .Txt 파일로 데이터를 내보내고 통계 소프트웨어를 사용 하 여 정량화 16에 대 한 기본 통계 시험을 수행.</li>
</ol>

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저자는 공개 없다.

이 연구는 hMSCs 실험 CD의 작은 장 마우스 모델에서의 초음파 유도 intracardiac 주입에 대 한 소설 기법을 설명합니다. 이 기술은 매우 높은 비율의 생존과 성공, 바늘의 궤적을 마우스 좌 심 실, 초음파에 의해 제공의 실시간, 고해상도 이미지에 따라 조정 될 수 있다 있다. 좌 심 실에 배달의 장점은 hMSCs intra-arterially 배포 다음 하 고 우회 정 맥 순환, 폐에 있는 셀의 집계를 피할. 이전에 간 동맥 배달에 대 한 경 동맥 도관 법 주사 MSCs16,21을 사용 되었다. 경 동맥 도관 법 방법은 동맥 내 카 테 터를 두기 위하여 경 동맥을 노출 하는 수술을 포함 한다. 카 테 터 셀의 수혈에 대 한 대동맥 아치 쪽으로 고급입니다. 카 테 터 제거 후 되 고 경 동맥 출혈. 이 새로운 기술은 경 동맥 도관 법에 비해 좌 심 실에서 MSCs의 초음파 유도 주입은 보다 적게 침략 적, 훨씬 ...

Crohn의 질병 (CD) 작은의 일반적인 만성 염증 성 질환 이며 대형 창 고 장내 미생물7,8호스트 면역 시스템의 부적 절 한 응답 결과로 생각 된다. 최근 연구 murine와 인간 중간 엽 줄기 세포 (MSCs) 창 자 염증1,3,,45의 마우스 모델에서 염증 억제 수 있습니다 나타났습니다. 선 동적인 장 질병 (IBD), CD9를 포함 하는 환자를 치료 하 골 또는 지방이 많은 직물에서 파생 된 인간의 MSCs를 사용 하는 여러 지속적인 임상 시험이 있다. MSC 치료에 대 한 두 개의 노선이 임상 시험에 사용 되었습니다: 하나 체계적 주입을 포함 한다 (즉, 정 맥) luminal IBD (CD 포함), 및 다른 MSCs의 지역화 된 응용 프로그램/는 누 관에 줄기 세포의 주입을 포함 한다. 항문 주위의 CD 환자의 요 로입니다. 최근 메타-분석에서 MSC IBD, 조직에 대 한 치료의 (즉, 정 맥) MSC luminal IBD (CD 포함)에 대 한 치료는 최대 40%에 효능 (95 %CI: 7-79%)의 환자, 효능은 61%에 훨씬 더 높은 반면 (95 %CI: 36-85%) 때 MSCs 병에 걸린 CD 누9에 로컬로 주입 했다. 최근 단계 III multicenter 무작위 위약 제어 재판 음부 fistulae, 치유의 통계적으로 중요 한 임상 및 방사선 증거를 보여주었다 CD 환자의 항문 주위 누 관에 직접 주입 하는 수용자 지방 줄기 세포의 10메타 분석 결과 확실 한지 알아보는. MSC 치료 정 맥 luminal CD에 대 한 주어진 낮은 효능에 대 한 이유는 부적당 하 게 조사 되었습니다, 하지만 이유 중 하나는 염증의 사이트에 MSCs의 불 충 분 한 수단은 될 수 있습니다. 장 염증의 모델에서 murine 연구만 MSCs (1-5%) 정 맥 주입의 작은 비율 도달 염증이 콜론과; 나머지 MSCs는 폐 (1 차 통과 효과)1,2에 의해 필터링 됩니다 증명 ,5,,1112. 여러 murine 연구 결과 따라서 MSC 관리4대 장 염 동물 모델에서 복 경로 (i.p.) 사용. 그러나, 그들은 또한 그만 셀의 극히 일부에 도달 하 고 콜론을 engraft와 효능은 관련이 녹는 paracrine 요인, 종양 괴 사 인자를 유도할 수 있는 유전자 6 단백질의 분 비 (TSG-6)2시연 했습니다. 면역 억제와 치유의 MSC 메커니즘 포함 paracrine;를 포함 하는 multipronged 접근 셀 근접에 독립적인 요인, TSG-6; 근접-종속 요소를 같은 세포 죽음-ligand (PD-L1); 1 프로그램 또는 가변 1입니다. 따라서, 염증의 사이트에 MSC 지역화 증가 효능9,13발생할 수 있습니다. 사실, 최근 연구는 저 승 상해의 사이트에 직접 이식 하는 MSCs 결과 신생 촉진 혈관 내 피 성장 인자 (VEGF)를 은닉 하 여 치유에 나타났다. 다른 한편으로, 최소한의 치료 효과 주사5후 지적 했다. (즉, SAMP 쥐에서 소장) 염증의 사이트에 그들의 지 방화를 증가, 좌 심 실에 MSC 관리용이 intracardiac 주입 초음파 기반 기술 개발 되었습니다. 이미지 유도 주입 정확한 주입, 성공의 더 높은 속도로 리드 하 고 병 적 상태와 사망률 감소를 보장 합니다. 또한, 좌 심 실에 MSCs 주입 동맥 순환, 폐에서 덫을 놓아 되기 전에 염증이 소장 도달할 수 어디에 그들을 제공 합니다.
이 연구에서는 인간의 골 수 파생 된 MSCs (hMSCs) CD14SAMP-1/YitFc (SAMP) murine 모델에 주입을 위해 사용 되었다. SAMP 개발 거의 100% penetrance14작은 창 자 염증 만성 염증의 특징이 잘 자발적인 murine 모델 이다. 염증은 microflora 화학, 면역, 또는 유전 조작의 부재에서에 대 한 응답에서 개발 하 고 밀접 하 게 인간의 CD11. 성별 및 나이 일치 염증 무료 AKR/J (AKR) 쥐, SAMP, 보호자 제어 쥐가이 연구에 사용 되었다.
HMSCs는 고립 되었고 후 동의 사용 하 여 유효성을 검사 하 고 이전 프로토콜15,16게시 일반, 미확인 기증자 로부터 얻은 골 수 (BM) 샘플에서 실험실에서 확장. 격리 및 확장, MSC 능력 후에 osteogenic, adipogenic, chondrogenic 차별화는 여러 분석15실험실에서 평가 했다. Osteogenic 기능 분석 결과 피하 immunocompromised CB17-Prkdc SCID 쥐17에 hMSCs를 포함 하는 hydroxyapatite/tricalcium 인산 행렬의 세라믹 큐브를 이식 하 여 수행 되었다. 큐브 분석 결과 골 및 잠재적인 chondrogenesis 및 고 개별 MSC 준비17를 평가 하기 위한 궁극적인 시험으로 간주 됩니다. 주입 후 hMSCs에서 vivo에서 시각화 하기 lentivirus transduce 반딧불 luciferase (플로리다), 단위체 빨간 형광 성 단백질 (mRFP), 그리고 포진 심 플렉스 바이러스 성 티 미 딘 키 니 아 제 (ttk의 구성 된 트리플 리포터 유전자 구조와 hMSCs를 사용 되었다 ), 수정된 myeloproliferative 육 종 바이러스 (국방부) 발기인18에 의해 구동. 트리플 기자에 반딧불 luciferase 효소 hMSCs에서 oxyluciferin로 변환 하 여 주입된 소 그 고 광자/화이트 빛을 생성 한다. 이는 vivo에서 광학 이미징 시스템, 마우스에서 라이브 hMSCs의 시각화를 사용에 민감한 전 하 결합 소자 (CCD) 카메라 (생물 발광)에 의해 감지 됩니다. 생물 발광 영상 (BLI)는 셀을 추적 및 분석 비보 전 직렬로 사용 될 수 있는 중요 한 기술입니다. 강력한 국방부 발기인의 사용 트리플 퓨전 기자 유전자 구성의 연속 식 구동 하 고 16 주19이상 주입 된 hMSCs의 이미징에 대 한 수 있습니다. hMSCs는 transduce 고 낮은 변환 효율성에 어렵다. 최적화 된 프로토콜을 사용 하 여, hMSCs 변환 효율 향상 되었다 고 transgene 식 향상 된18살. Cytometry에 mRFP 식 (트리플 리포터 유전자 중 하나)를 사용 하 여, 최대 83%의 높은 효율으로 hMSCs transduce 능력 시연 했다. 차별화 분석 실험 및 큐브 분석 vivo에서 chondrocytes, adipocytes, 및 osteocytes17로 분화 transduced hMSCs의 능력을 설명 했다.

<table><tbody><tr><td>DMEM-LG&nbsp; &nbsp;</td><td>Gibco</td><td>31600-091</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 트립신-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25-200-072</td><td></td></tr><tr><td>Proteamine Sulfate</td><td>시그마 Aldrich</td><td>P4020-1G</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferin</td><td>Goldbio</td><td>luck-500</td><td></td></tr><tr><td>태아 Bobine 혈청</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>항생제-항진균제</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>HyClone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>175 cm 조직 커틀루어 플라스크</td><td>Corning</td><td>431080</td><td></td></tr><tr><td>75 cm 조직 커틀루어 플라스크</td><td>Corning</td><td>430720</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 튜브</td><td>Crysalgen</td><td>23-2265</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Plus O.C.T. 컴파운드</td><td>Fisher HealthCare</td><td>4585</td><td></td></tr><tr><td>Cryomold Standard</td><td>Tissue-Tek&nbsp;</td><td>4557</td><td></td></tr><tr><td>Lenti-Pac HIV 발현 패키징 시스템</td><td>GeneCopoeia</td><td>HPK-LvTR-20&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Povidone Ionidine 면봉</td><td>Medline</td><td>MDS093901</td><td></td></tr><tr><td>제모 크림</td><td>Nair</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane&nbsp;</td><td>피라말 헬라스케어&nbsp;</td><td>NDC 66794 013 25</td><td></td></tr><tr><td>펜치&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11200-33</td><td></td></tr><tr><td>해부 가위 (Wagner)</td><td>Fine Science Tools</td><td>Wagner 14068-12</td><td></td></tr><tr><td>Puralube vet ointment</td><td>Puralube</td><td>NDC 17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>Aquasonic 100 초음파 투과 젤</td><td>Parker laboratories</td><td>01 08</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875711A</td><td></td></tr><tr><td>SAMP 마우스</td><td>클리블랜드 소화기 질환 연구 핵심 센터</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AKR 마우스</td><td>클리블랜드 소화기 질환 연구 핵심 센터</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vevo 770 이미징 시스템</td><td>&nbsp; Visual Sonics, 토론토, 캐나다</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; IVIS 스펙트럼 시리즈 시스템&nbsp;</td><td>PerkinElmer, 매사추세츠</td><td></td><td></td>주 월섬</tr><tr><td>리빙 이미지 소프트웨어&nbsp;</td><td>CaliperLifeSciences, PerkinElmer, Waltham, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>트리플 리포터</td><td>친절하게 제공 : Dr. Zheng- Hong Lee, CWRU, (인용 19)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

초음파 유도 intracardiac 주입 실험 선 동적인 장 질병의 murine 모델에 사용 하기 위해 내장을 추적 증가 인간 중간 엽 줄기 세포의

Ultrasound-guided Intracardiac Injection of Human Mesenchymal Stem Cells to Increase Homing to the Intestine for Use in Murine Models of Experimental Inflammatory Bowel Diseases

Crohn의 질병 (CD) 작은의 일반적인 만성 염증 성 질환 이며 큰 창 자. Murine와 인간 중간 엽 줄기 세포 (MSCs) 면역 잠재력 있고 비록 관리의 그들의 추적 및 효과 1 를 제한할 수 있습니다 마우스 모델 장 염증, 염증 억제를 보였다 , 3 , 4 , 5. 저 승 부상 모델 MSCs의 로컬 응용 프로그램 장황 결에 염증에 큰 효능을 보이고 있다. 그러나, 인간 골 수 유래 MSCs (hMSCs) 소장, SAMP-1/YitFc (SAMP) 모델 실험 Crohn의 질병의 염증의 사이트에의 현지화를 강화 하는 기술에 대 한 데이터의 부족이입니다. 이 작품 hMSCs SAMP 쥐에 만성 장 염증의 특징이 잘 자발적인 모델의 초음파 유도 intracardiac 주입에 대 한 새로운 기술을 설명합니다. 성별 및 나이-일치, 염증 없는 AKR/J (AKR) 마우스 컨트롤으로 사용 되었다. biodistribution와 지역화를 분석 하려면 hMSCs lentivirus 트리플 기자 포함으로 불리고 있었다. 트리플 기자 발광 영상; 대 한 반딧불 luciferase (fl)의 구성 단위체 빨간 형광 성 단백질 (mrfp), 셀 정렬; 그리고 잘린된 포진 심 플렉스 바이러스 티 미 딘 키 니 아 제 (ttk), 양전자 방출 단층 촬영 (애완 동물)에 대 한 이미징. 이 연구의 결과 hMSCs 염증 무료 AKR 마우스 반대 SAMP 쥐의 소장에 지역화 intracardiac 관리 후 그 24 시간을 보여줍니다. 이 소설, SAMP 쥐의 좌 심 실에서 hMSCs의 주입 초음파 유도 세포 배달, 최소한의 병 적 상태와 사망률 쥐의 급속 한 회복에 대 한 수의 높은 성공률을 보장 합니다. 이 기술은 TNFΔRE6등 작은 창 자 염증의 다른 모델에서 MSCs의 향상 된 지역화에 대 한 유용한 방법을 수 있습니다. 미래 연구는 간 동맥 배달에 의해 hMSCs의 증가 지역화 증가 치료 효능으로 이어질 수 있습니다 경우 결정 됩니다.

그림 1 에서는 그들의 줄기 세포 특성을 유지 하는 높은 효율에서 트리플 기자와 hMSCs를 불리고 있습니다. 불리고 hMSCs 씨 (그림 1C, 그림 3)에 의해 실시간으로 구상 될 수 있다. 이 소설, SAMP 쥐의 좌 심 실에 hMSCs의 초음파 유도 주입 주입, 최소한의 병 적 상태와 사망률 (그림 2) 쥐의 빠른 복구에 대 한 수의 매우 높은 성공률을 보장 합니다. HMSCs 한 마우스 주입에 대 한 평균 시간은 약 10 분, 그리고 8-9% 병 적 상태와 사망률 보다이 기술 관찰 했다. 사망률에 대 한 주요 이유는 뇌졸중과 출혈 pericardial 유출에서 심장 tamponade 이다. Ex vivo 분석 수행 24 h hMSC의 ...

장 염증의 모델에서 murine 연구 중간 엽 줄기 세포 (MSC)의 작은 비율 (1 ~ 5%) 또는 정 맥 주입 intraperitoneally 집 염증이 콜론과1,2에 설명 했다. 이 연구는 MSCs의 초음파 유도 intracardiac 주사 소장을 증가 지역화 될 보여줍니다.

초음파 유도 Intracardiac 주입 실험 선 동적인 장 질병의 Murine 모델에 사용 하기 위해 내장을 추적 증가 인간 중간 엽 줄기 세포의

Crohn&#39;s disease (CD) is a common chronic inflammatory disease of the small and large intestines. Murine and human mesenchymal stem cells (MSCs) have ...

본 절차의 전반적인 목표는 실험적 크론병 마우스 모델에서 초음파 유도 하 심장 내 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포(HMSC) 주입법을 사용하여, 장으로 향하는 HMSC의 호밍(homing) 현상을 관찰하는 것입니다. 이 방법은 염증 발생 시 소장으로의 HMSC 국소 집적 증가 필요성에 관한 염증성 장질환 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 마우스의 움직임과 사망률을 최소화하면서도 높은 HMSC 전달 성공률을 가능하게 한다는 점입니다.일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 개인은 여러 변수가 실험 결과에 영향을 미칠 수 있기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 따라서 교육생이 인간 중간엽 줄기세포 생물학에 대해 충분히 이해하고 있어야 합니다. 실험 절차 시연은 저희 연구실의 박사후 연구원인 Paola Menghini가 진행하겠습니다.특정 병원균 부재(SPF) 시설에서 마우스 심초음파 영상 시스템 프로토콜을 설정하고 30 megahertz 트랜스듀서를 초기화합니다. 다음으로, 발가락 꼬집기(toe pinch)를 통해 적절한 진정 수준을 확인하고 동물의 눈에 연고를 도포합니다. 제모 크림을 사용하여 흉부의 털을 제거하고 동물을 37 degree celsius 영상 테이블 위에 배와 윗면이 위로 오도록(supine position) 배치합니다.시술 중 움직임을 방지하기 위해 사지를 테이프로 고정하고, 흉부의 노출된 피부를 10% povidone iodine과 70% ethanol로 소독합니다. 피부에 37 °C 초음파 젤을 두껍게 도포하고 트랜스듀서를 홀더에 장착한 후, 시야에 좌심실이 명확하게 보일 때까지 트랜스듀서의 위치를 조정합니다. 다음으로, 2 x 10⁶ 개의 형질전환된 인간 중간엽 줄기세포를 150 µL의 멸균 PBS에 살짝 재부유시켜 균질한 세포 현탁액을 만들고, 이를 28 gauge 바늘이 장착된 1 mL 주사기에 주입합니다.부피 과부하 및 폐사를 방지하기 위해 마우스 한 마리당 150 µL 미만의 세포 현탁액을 주입하십시오. 시린지를 시린지 홀더에 고정합니다. 그런 다음 초음파 가이드를 사용하여 필요에 따라 바늘의 궤적을 조정하며 시린지를 마우스 흉부 쪽으로 전진시키고, 갈비뼈 사이 공간을 통해 바늘 끝을 좌심실로 삽입합니다.초음파 영상에서 바늘을 적절하게 시각화하는 것은 바늘이 좌심실로 정확한 궤적을 따라 삽입되도록 하고, 성공적인 주입을 달성하며, 심장 억제

ultrasound-guided-intracardiac-injection-human-mesenchymal-stem-cells

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

고혈압이나 심근 경색 등의 심혈관 질환의 생쥐 모델에서 심근 내 세포 전달은 널리 재생 연구에서 서로 다른 종류의 세포 치료 가능성을 테스트하는 데 사용됩니다. 그러므로, 상세한 설명이 수술의 명확한 시각화가 작은 설치류의 혈관 세포 치료 분석의 한계와 이점을 정의하는 것을 도울 것이다.

심근 내 휴대 납품 : 쥐과 마음의 관찰

심장 초음파 유도 경피적 심근 주입 뮤린 마음에 유전자 전달 제 또는 세포의 전달을위한 효율적인 신뢰성 있고 타겟팅 양상을 나타낸다. 이 프로토콜에 설명 된 단계에 따라, 운전자는 신속하게이 다재 다능 한, 최소 침습 기술에서 경쟁력이 될 수 있습니다.

마우스의 초음파 유도 경 흉부 심근 내 주입

심장 재생 의학에 새로운 치료 전략 인 간에 있는 사용에 대 한 간주 될 수 있습니다 전에 큰 전 임상 동물 모델에서 광범위 하 고 상세한 연구를 요구 한다. 여기, 우리는 같은 소설 치료의 효능을 시험 하는 가설에 대 한 귀중 한 토끼, 경 피 적인 대비 심장 초음파-가이드 intramyocardial 주입 기술을 보여줍니다.

경 피 적인 대비 심장 초음파-가이드 Intramyocardial 주입 및 큰 전 임상 모델에서 셀 배달

우리는 좌측 경부 동맥 막힘과 세포 기반 치료를 위한 줄기 세포의 심혈 투여의 효과 및 안전성 을 테스트하기 위해 신속한 속도에 의해 유도된 심부전의 돼지 모델을 확립하고자 했습니다.

줄기 세포 치료를위한 심근 경색 심부전의 돼지 모델 설립

줄기 세포는 심근 손상을 가진 개별을 위한 잠재적인 처리로 지속적으로 조사됩니다, 그러나, 부상당한 조직 내의 그들의 감소된 생존및 보존은 그들의 장기 효험에 영향을 미칠 수 있습니다. 이 원고에서 우리는 허혈 재관전 손상의 뮤린 모델에서 줄기 세포 전달을위한 대체 방법을 설명합니다.

뮤린 모델에서 허혈혈 재관류 부상 후 줄기 세포의 지연 된 자궁 내 납품

줄기 세포 기지를 둔 치료는 심근 경색 후에 부상당한 심장 조직을 복구하는 능률적인 전략으로 부상했습니다. 우리는 효소적으로 교차 연결 될 수있는 젤라틴 하이드로 겔을 사용하여 줄기 세포 이식에 대한 최적의 생체 내 응용 프로그램을 제공합니다.

Murine 모델에서 심근 경색 후 MSC 로딩 주사용 하이드로겔의 자궁 내 이식

생쥐의 심근 경색 부위 주변의 초음파 유도 세포 전달은 안전하고 효과적이며 편리한 세포 이식 방법입니다.

심근 경색 마우스에서 초음파 유도 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포 이식

대퇴골 내 주사는 세포를 골수강에 직접 배치하여 소수의 조혈모세포 및 전구세포(HSPC)를 생착할 수 있습니다. 여기에서는 면역 결핍 마우스에 인간 HSPC를 대퇴골 내 주사하는 실험 프로토콜에 대해 설명합니다.

면역저하 마우스에 인간 조혈모세포와 전구세포의 대퇴골내 주입 

이 논문은 혈관 줄기세포를 대동맥 혈관 벽으로 정밀하게 초음파 유도하여 전달하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 기술은 혈관 벽을 효과적으로 표적으로 삼고 대동맥류 및 박리에서 혈관 복구를 촉진합니다.

대동맥 질환의 혈관 복구를 위한 정밀 초음파 유도 줄기세포 전달

이 기사에서는 29G x 88mm 바늘을 사용하여 심근경색의 쥐 모델에서 심초음파 유도 심근내 주사를 위한 최적화된 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 이 기술은 경색 주위 부위에 직접 치료제를 강력하고 정확하며 재현 가능한 전달을 보장합니다.

심근경색의 쥐 모델에서 표적적이고 신뢰할 수 있는 심근내 줄기세포 전달을 위한 심초음파 유도 주사

배우세요 초음파 유도 심장내 주사법을 사용하여 크론병 마우스 모델에서 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포의 장으로의 이동을 극대화하는 방법을. 이 기술은 염증성 장 질환 연구에서 세포 치료 효율을 높이는 데 기여합니다.

초음파 유도 Intracardiac 주입 실험 선 동적인 장 질병의 Murine 모델에 사용 하기 위해 내장을 추적 증가 인간 중간 엽 줄기 세포의

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