초음파 유도 Intracardiac 주입 실험 선 동적인 장 질병의 Murine 모델에 사용 하기 위해 내장을 추적 증가 인간 중간 엽 줄기 세포의

장 염증의 모델에서 murine 연구 중간 엽 줄기 세포 (MSC)의 작은 비율 (1 ~ 5%) 또는 정 맥 주입 intraperitoneally 집 염증이 콜론과^1,2에 설명 했다. 이 연구는 MSCs의 초음파 유도 intracardiac 주사 소장을 증가 지역화 될 보여줍니다.

이 절차의 전반적인 목표는 실험용 크론병의 마우스 모델에서 초음파 유도 심장내 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포 또는 HMSC 주사를 사용하여 HMSC가 장으로 귀환하는 것을 관찰하는 것입니다. 이 방법은 염증성 장 질환 분야의 주요 질문, 즉 염증 중 소장에 대한 HMSC의 국소화 증가의 필요성에 대한 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 최소한의 마우스 이동성과 사망률로 높은 HMSC 전달 성공률을 촉진한다는 것입니다.

일반적으로 이 방법을 처음 사용하는 개인은 여러 변수가 절차 결과에 영향을 줄 수 있기 때문에 문제를 겪을 수 있습니다. 인간 중간엽 줄기세포 생물학에 대한 많은 교육생의 이해가 필요합니다. 절차를 시연하는 사람은 우리 실험실의 박사후 연구원인 Paola Menghini입니다.

특정 병원체가 없는 시설에서 마우스 심초음파 초음파 이미징 시스템 프로토콜을 설정하고 30MHz 변환기를 초기화합니다. 다음으로, 발가락 꼬집기로 적절한 진정 수준을 확인하고 동물의 눈에 연고를 바릅니다. 제모 크림을 사용하여 흉부 위의 털을 제거하고 동물을 섭씨 37도 영상 테이블에 누운 자세로 놓습니다.

시술 중 움직임을 방지하기 위해 팔다리에 테이프를 붙이고 노출된 흉부 피부를 10% 포비돈 요오드와 70% 에탄올로 소독합니다. 섭씨 37도의 초음파 젤을 피부에 두껍게 바르고 트랜스듀서를 홀더에 장착하여 좌심실이 시야에서 명확하게 보일 때까지 트랜스듀서의 위치를 조정합니다. 다음으로, 150 마이크로리터의 멸균 PBS에 2 x 10에서 6번째 형질주입된 인간 중간엽 줄기 세포를 부드럽게 재현탁하여 균질한 세포 현탁액을 생성하고 세포를 28 게이지 바늘이 장착된 1ml 주사기에 로드합니다.

마우스당 150마이크로리터 미만의 세포 현탁액을 주입하여 부피 과부하 및 사멸을 방지합니다. 주사기 홀더에 주사기를 고정합니다. 그런 다음 초음파 유도를 사용하여 주사기를 마우스 흉부 쪽으로 전진시켜 필요에 따라 바늘 궤적을 조정하고 바늘 끝을 늑간 공간을 통해 좌심실로 관통합니다.

초음파 영상에서 바늘을 적절하게 시각화하는 것은 바늘의 적절한 궤적과 좌심실 삽입, 성공적인 주입 및 심장 감쇠 및 사망을 방지하는 데 중요합니다. 팁은 좌심실 내에서 명확하게 볼 수 있어야 하며 주사기로 신선한 동맥혈이 유출되어 적절한 위치를 추가로 확인할 수 있습니다. 플런저에 부드러운 압력을 가하여 2분에 걸쳐 HMSC 현탁액을 천천히 주입합니다.

모든 세포가 주입되면 바늘을 부드럽게 빼내고 완전히 회복될 때까지 모니터링하면서 예열된 패드의 깨끗한 케이지에 동물을 놓습니다.주사 후 24시간이 지나면 생물 발광 이미징 시스템을 초기화하고 생체 내 이미징 소프트웨어에서 새로운 연구를 엽니다. 제어판에서 이미징 매개변수를 설정하려면 설정된 순서를 클릭합니다.

이미징 모드에서 발광과 사진을 선택합니다. 노출 시간을 0.5초에서 10분으로, bidding을 medium으로, f/stop을 1로 설정합니다. 여기 필터를 블록으로, 방출 필터를 열기로, 시야를 두 마우스에 대해 볼 수 있도록 설정합니다.

그런 다음 획득 제어판을 클릭하여 이미지 마법사에 시퀀스 설정을 추가합니다. 다음으로, 첫 번째 마우스에 300마이크로리터의 d-루시페린을 주입합니다. 동물의 눈에 연고를 바르고 마우스를 생체 내 이미징 챔버로 옮깁니다.

D-Luciferin 주입 10분 후 Acquire를 클릭하여 이미지 획득을 시작합니다. 모든 생쥐를 이미지화한 후 각 동물에서 전체 위장관, 장간막 림프절, 폐, 비장 및 간을 수확합니다. 그런 다음 전체 동물의 생물 발광 이미징을 위해 방금 시연한 대로 장기를 이미지

HMSC는 트리플 리포터를 통해 높은 효율로 트랜스듀션될 수 있으며, 줄기 세포의 특성을 보존하고 생물 발광 이미징을 통해 실시간으로 시각화할 수 있습니다. 심장 내 전달 줄기 세포의 생체 외 분석을 통해 이 투여 뿌리가 실험용 크론병 마우스의 염증이 있는 소장으로의 HMSC 귀환을 용이하게 한다는 것을 확인했습니다. HMSC는 조절에 주입되지만 염증이 없는 동물은 소장에 축적되지 않습니다.

이 기술을 마스터하면 제대로 수행되면 마우스당 15분 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 초음파 이미지를 사용하여 바늘 궤적을 조정하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 잘못된 기술과 잘못된 궤적은 출혈성 심낭 삼출로 인한 심장 압출 및 사망으로 이어질 수 있습니다.

이 절차에 따라 조직학 및 3D 스튜디오 현미경과 같은 다른 방법을 수행하여 HMSC의 소장 호밍(homing)을 증가시키면 치료 효능이 증가하는지 등의 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술을 통해 실험 IBD 분야의 연구원들은 TNF 궤적과 같은 모든 마우스 모델을 탐색하고 HMSC를 주입하여 소장으로의 귀환을 향상시킬 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 마우스에서 HMSC의 초음파 유도 심장 내 주사를 수행하는 방법과 생물 발광 이미징을 사용하여 잘못된 분포 및 원점 복귀를 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

인간 MSC로 작업하는 것은 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 장갑과 방패가 있는 안면 마스크를 사용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.