3D 공간 세포 배양을위한 세포 발판으로 생체 적합성 액정 엘라스토머 거품의 합성

이 절차의 목표는 생체 적합성 측쇄 액정 엘라스토머를 기반으로 생분해성 3차원 폼과 같은 세포 골격을 준비하는 것입니다. 이 방법은 액정 및 생물 의학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 예를 들어 액정 엘라스토머 특성이 세포 증식 및 정렬에 미치는 영향과 같은 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 2차원 세포 스캐폴드 방법의 주요 장점은 2D 매크로 환경에서는 거의 불가능한 공간 세포-세포 상호 작용을 연구할 수 있다는 것입니다.

일반적으로 이 방법을 처음 사용하는 사람들은 촉각 압축 테스트에 어려움을 겪을 것입니다. 우리는 수백 개의 페트리 접시에서 매체를 교체해야 했던 후 이 방법에 대한 아이디어를 처음 얻었습니다. 우리는 액정 엘라스토머가 3D 네트워크에서 근육 세포를 지원하여 많은 페트리 접시를 사용하지 않도록 할 수 있는지 궁금했습니다.

일부 단계에서는 화학 물질의 신중한 조작이 필요하므로 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. 또한 금속 폼 템플릿을 형성하는 것은 어려울 수 있습니다. 먼저 20ml 앰플에 톨루엔에 PFOTES의 2%x 부피 용액을 채웁니다.

앰플의 용액을 24시간 동안 저어 앰플 내부를 실란화합니다. 실란화된 앰플을 이소프로필 알코올로 헹구고 섭씨 140도에서 30분간 건조시킵니다. 증류된 엡실론-카프로락톤 3.64g, 알파-클로로-엡실론-카프로락톤 0.5g, 글리세롤 0.25ml를 건조 앰플에 넣습니다.

혼합물을 1분 동안 소용돌이치십시오. 그런 다음 혼합물에 DL-lactide 4.90g을 첨가하고 앰플 분위기를 질소 가스로 1분 동안 퍼지합니다. 앰플 입구를 알루미늄 호일로 덮고 혼합물을 섭씨 120도에서 약 2시간 동안 가열하여 DL-lactide를 녹입니다.

혼합물을 소용돌이하여 용융되지 않은 고체를 파괴한 다음 앰플에 10-2-에틸헥사노에이트 66마이크로리터를 첨가하고 다시 와류를 일으킵니다. 알루미늄 호일로 앰플을 닫고 혼합물을 섭씨 120도에서 10분 동안 가열하여 DL-lactide를 다시 녹입니다. DL-lactide가 다시 녹으면 혼합물을 격렬하게 와류시키고 질소 가스로 앰플 대기를 퍼지합니다.

고무 격막으로 앰플을 밀봉합니다. 중격을 통해 진공 라인에 연결된 바늘을 삽입하고 진공을 시작합니다. 고무 마개가 녹지 않도록 주의하면서 앰플의 목을 화염 밀봉합니다.

넥이 밀봉되면 반응 혼합물을 섭씨 140도에서 48시간 동안 가열합니다. 그런 다음 혼합물을 실온으로 식히십시오. 앰플을 부수고 점성 반응 혼합물을 10ml의 디클로로메탄에 녹입니다.

혼합물을 분리 깔때기로 옮깁니다. 드라이 아이스와 아세톤 욕조에 100ml의 메탄올이 들어 있는 플라스크를 놓고 메탄올을 약 섭씨 영하 78도까지 식힙니다. 메탄올이 냉각되면 플라스크 위에 분리 깔때기를 고정합니다.

반응 혼합물을 차가운 메탄올에 초당 2방울의 비율로 첨가합니다. 생성된 흰색 침전물을 여과지에 수집합니다. 침전물을 섭씨 50도에서 60도 사이의 진공 오븐에서 건조시켜 3암 알파 클로로 SBC 제품을 얻습니다.

알파 콜레스테릴 3군 SBC를 준비하기 위해 펜던트 염소 원자는 아지드로 대체됩니다. 콜레스테릴 5-헥시노에이트와의 클릭 반응은 액정 부분으로서 펜던트 콜레스테릴을 생성합니다. 액정 엘라스토머 스캐폴드를 준비하려면 0.75g의 알파-콜레스테릴 3암 SBC와 0.25ml의 HDI 및 0.24ml의 증류된 엡실론-카프로락톤을 결합합니다.

여기에 60 마이크로 리터의 10-2- 에틸 헥사 노 에이트를 첨가하고 혼합물을 와류로 만듭니다. 그런 다음 1cm x 4cm 크기의 니켈 금속 폼 조각을 잘라냅니다. 니켈 폼을 직경 1cm, 높이 1cm의 실린더로 굴려 액정 엘라스토머 폼 골격의 템플릿을 형성합니다.

템플릿을 유리 바이알 또는 알루미늄 호일 인클로저에 넣고 액정 엘라스토머 혼합물을 템플릿이 완전히 덮일 때까지 템플릿 위에 붓습니다. 템플릿을 액정 엘라스토머 혼합물에 2분 동안 그대로 두었다가 피펫으로 초과분을 제거합니다. 혼합물과 템플릿을 섭씨 80도에서 밤새 가열합니다.

그런 다음 알루미늄 호일을 벗겨내거나 유리를 깨뜨립니다. 면도날을 사용하여 과도한 액정 엘라스토머를 제거하여 니켈 금속 템플릿을 노출시킵니다. 거품을 플라스크에 넣고 3 염화철의 포화 수용액 70 밀리리터를 넣으십시오.

용액에 거품을 실온에서 3일 동안 저어 니켈 템플릿을 용해시킵니다. 매 24 시간마다, 30 분 동안 탈 이온수에 거품을 저어주고, 그 후에, 신선한 철 3 염화물 해결책에서 약동을 계속하십시오. 교반 2일째 후, 액정 엘라스토머 폼에 대한 촉각 압축 테스트를 수행합니다.

촉각 압축에 대한 저항은 니켈 템플릿이 폼에 여전히 존재한다는 것을 나타냅니다. 3일째가 지나면 모든 니켈 템플릿이 제거되고 생성된 폼이 매우 부드럽고 완전히 압축하기 쉬워 보입니다. 니켈 템플릿을 완전히 제거해야 합니다.

촉각 압박 시험을 수행할 때 만졌을 때 부드러워질 때까지 액정 엘라스토머 폼을 염화철로 철저히 헹구는 것이 중요합니다. 액정 엘라스토머 폼 스캐폴드는 이제 특성화하고 사용할 준비가 되었습니다. 액정 엘라스토머 폼이 부드러워지면 70% 에탄올로 헹구어 살균합니다.

파종 절차를 시작하려면 액정 엘라스토머 폼 스캐폴드를 1밀리리터의 70% 에탄올로 두 번 다시 세척하여 엘라스토머 표면을 살균합니다. 그런 다음 골격에 자외선을 10분 동안 조사합니다. 70% 에탄올의 또 다른 1밀리리터 부분으로 골격을 세척합니다.

멸균수와 인산염 완충 식염수 각각 1ml로 골격을 헹굽니다. 멸균된 액정 엘라스토머 스캐폴드를 24웰 배양 플레이트에 로드합니다. 페니실린(penicillin) 및 스트렙토마이신(streptomycin)을 사용하여 적절한 세포 성장 배지에서 관심 세포의 현탁액을 준비하고 계수합니다.

성장 배지를 사용하여 세포 현탁액을 100 마이크로리터당 5번째 세포로 1.5배 10으로 희석합니다. 각 액정 엘라스토머 골격 위에 희석된 세포 현탁액 한 방울을 떨어뜨립니다. 파종된 액정 엘라스토머 스캐폴드를 섭씨 37도의 5% CO2 분위기에서 2시간 동안 배양합니다.

각 골격에 0.5ml의 성장 배지를 더 추가하고 배양을 계속합니다. 48시간마다 파종된 골격을 PBS 1밀리리터로 세척하고 신선한 성장 배지를 추가합니다. 세포가 현미경 검사를 위해 준비될 때까지 골격을 계속 배양합니다.

이러한 smetic LC는 세포 성장과 증식을 촉진하는 동시에 복잡한 조직 구조를 연구할 수 있습니다. 세포 생존력을 유지하기 위해서는 발포체를 멸균하고 배양물의 청결을 항상 유지해야 합니다. 현미경 검사를 준비하기 위해 PBS에 4%파라포름알데히드 용액을 15분 동안 투여하여 골격에 세포를 고정합니다.

PBS 3밀리리터에 샘플을 5분 동안 3회 담급니다. Eppendorf 튜브에 스캐폴드 샘플 1개를 넣습니다. PBS 500마이크로리터에 0.1% DAPI 용액으로 샘플을 10분 동안 염색합니다.

PBS 1ml에 샘플을 두 번 담가 5분 동안 담그십시오. 그런 다음 즉시 컨포칼 현미경으로 샘플을 이미지화합니다. 샘플에 걸쳐 있는 이미지 스택을 획득하고 이미지 처리 프로그램에서 데이터를 분석합니다.

액정 부분이 있는 3암 SBC는 HDI를 가교제로 사용하는 니켈 폼 템플릿에 주조되었습니다. 니켈 주형은 액정 엘라스토머 폼을 얻기 위해 에칭에 의해 제거되었다. 에칭 공정을 모니터링하기 위해 압축 변형 테스트가 주기적으로 수행되었습니다.

니켈이 완전히 용해되면 압축 변형 테스트에서 압축 시 크기가 70% 감소하는 것으로 나타났습니다. 압축을 해제하면 액정 엘라스토머 폼이 원래 크기와 모양을 일관되게 회복했습니다. 이러한 거동은 액정 부분에 기인하는데, 콜레스테롤 엡실론-카프로락톤 부분이 결핍된 유사한 엘라스토머 폼이 압박에서 회복되지 않았기 때문입니다.

내부 발포 형태의 SCM은 중공 발포 스트럿의 상호 연결된 네트워크를 보여주었습니다. 규칙적인 형태는 니켈 폼의 구조에 기인하며, 이는 기공 크기와 전체 모양이 적절한 금속 주형의 선택에 의해 제어될 수 있음을 나타냅니다. 거품은 신경모세포종 세포로 파종되었고, 이틀 이내에 네트워크의 벽에 부착되었습니다.

파종 30일 후, 컨포칼 현미경 검사는 세포가 액정 엘라스토머 네트워크를 통해 확장되고 엘라스토머 폼 전체에 분산된 여러 층을 형성했음을 밝혔습니다. 세포핵의 신장이 관찰되었으며 세포 정렬과 상관관계가 있었습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 3-4주 이내에 완료할 수 있습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 특정 공극 크기와 형태를 가진 액정 엘라스토머 세포 스캐폴드를 설계하고 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 시도하는 동안 각 산물을 완전히 특성화하고 세포 생존율 및 증식을 모니터링하는 것이 중요합니다. 또한 컨포칼 현미경 이미지를 쉽게 획득하려면 적절한 염색 기술이 중요합니다.

이 절차에 따라 액정 엘라스토머는 응력 또는 자기장 및 전기장과 같은 외부 자극에 노출되어 액정 엘라스토머의 이방성 분자 순서가 세포 반응에 미치는 영향에 대한 추가 질문에 답할 수도 있습니다. 이 기술의 의미는 시뮬레이션된 질병 활동 및 후속 복구 프로세스에 대한 외부 에이전트의 영향을 동적으로 연구할 수 있는 플랫폼을 제공하기 때문에 질병 프로세스 연구에 적용됩니다. 이 스멕틱 액정 엘라스토머 폼은 세포-세포 상호 작용에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 반도체 또는 금속 나노 구조와 같은 다른 재료에도 사용할 수 있습니다.

개발 후 이 기술은 생물 의학 분야의 연구자들이 살아있는 시스템을 미러링하는 장기 실험 플랫폼을 설계할 수 있는 길을 열었습니다.