Name: 3D 공간 세포 배양을위한 세포 발판으로 생체 적합성 액정 엘라스토머 거품의 합성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 38 s
Description: 학습하세요 생체적합성 액정 엘라스토머를 이용하여 3D 폼 형태의 생분해성 세포 발판을 합성하는 방법을 배우세요. 이 기술은 공간적 세포 상호작용 연구와 조직 공학에 활용됩니다.

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이 프로젝트의 재정 지원을위한 - 저자 켄트 주립 대학 (ReMedIKS 켄트 주에서 재생 의학 이니셔티브에 대한 공동 연구 보조금 및 지원) 감사의 말씀을 전합니다.

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저자가 공개하는 게 없다.

액정 탄성체는 최근 인해 자극에 응답에 생체 세포 골격으로 연구되어왔다. 그들은 세포 골격으로 이상적인 플랫폼으로 입증되었다. 그러나 준비하고 새로운 LCE 발판을 설계 할 때 염두에 두어야 할 중요한 요소는 다공성이다. 침출 고체 (23) 또는 가스의 도입은 항상 균일 한 다공성 또는 완전히 상호 모공 발생하지 않습니다. 식각 할 수있는 금속 템플릿의 사용뿐만 아니라보다 조직적이고 정기적 인 내부 구조를 가질 수있는 기회를 제공뿐만 아니라 기공 크기와 밀도를 선택할 수 있습니다. 이것은 이전에 그래 핀 (22)의 발포체 제조에 사용되는 금속 주형에 직접적으로 관련된다. 금속 템플릿은 일반 다공성 드와 정교하고 복잡한 구조를 만들 가능성의 광대 한 배열을 허용, LCE 가교 전에 모양을 형성 할 수있는 기회를 제공밀접하게 내생 환경을 닮은 서명했다. 거품 LCEs이 방법론을 사용하여 제조 한 전지 재료의 개량 연구 및 더 중요한 있도록 공간적...

세포 연구 및 세포 부착 및 증식 1, 2, 3, 4, 5, 목표 조직 재생을위한 응용 프로그램을 위해 설계된 생물학적 생체 합성 재료의 몇 가지 예들이있다. 6,7 주문 이방성 분자와 외부 자극에 응답 할 수있는 액정 엘라스토머 (LCEs)라고도 생체 적합성 재료의 몇 가지 예,가 있었다. LCEs 광학 기능과 액정 분자 (8)의 순서, 9 엘라스토머의 기계적 성질과 탄성 결합 자극에 반응하는 물질이다. LCEs 외부 STIM에 응답하여 형상 변화, 기계적 변형, 탄성 거동 및 광학 특성을 이용할 수울리 (예., 열 스트레스, 빛 등) 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16. 이전 연구는 액정 LCS (가) 세포 (4), (17)의 성장 방향을 감지 할 수 있음을 보여 주었다. LCEs 셀 목재 및 정렬을 포함한 생물학적으로 중요한 의학적 응용에 적합 할 수 있다고 가정하는 것이 가능하다. 우리는 이전에 &quot;스위스 치즈 유형&quot;다공성 형태 6, 18을 갖춘 스 멕틱 생체 적합성, 생분해 성, 주조 성형, 얇은 LCEs 필름의 준비를보고했다. 우리는 또한 세포 성장 (19) &lt;위한 발판으로 구상 형태와 네마 틱 생체 적합성 LCEs 준비SUP&gt; 20. 우리의 작업은 관심 (21)의 조직과 일치하는 재료의 기계적 특성을 조정하기위한되었다. 또한,이 연구는 탄성 중합체 세포의 상호 작용뿐만 아니라 탄성 중합체가 외부 자극을받습니다 세포 반응을 이해에 초점을 맞 춥니 다. 주요 문제는 탄성 중합체 매트릭스를 통해 세포 부착 및 침투를 허용하는 LCEs의 공극률을 조정하는 부분에 더 잘 질량 운송 하였다. 이러한 박막 (6)의 다공성 매트릭스의 대부분을 통해 세포 투과 허용하지만, 모든 세공이 완전히 상호 연결된 기공했다 또는 (균질)보다 일정한 크기를 가졌다. 우리는 구상 형태학와 생체 적합성 네마 틱 LCE 탄성 중합체 보도했다. 이러한 네마 엘라스토머 부착 세포의 증식을 허용하지만, 기공 크기는 10-30 ㎛의 방지, 또는 원거리 단에서 이들의 사용을 제한세포주 (19), (20)의 폭 넓은 다양한 엘라스토머. 쿵푸 등의 알에 의해 이전 작업. 은 &quot;희생&quot;금속 템플릿을 이용하여 그래 핀 발포체의 형성에 관한 얻어진 그라 발포체 선택된 금속 주형 (22)에 의해 지시 매우 일정한 다공성 형태를 한 것으로 나타났다. 이 방법론은 기공과 기공 크기의 전체 제어를 제공합니다. 다른 템플릿의 형성 발포 조제 전에 모양을 동시에, 금속 템플릿의 가단성 및 유연성을 허용한다. 이러한 재료 침출 23 가스 템플릿 (24) 또는 전기 방사 섬유 (25) 등의 다른 기술은, (26)는 다공질 재료의 제조 가능성을 제공하지만, 더 많은 시간이 어떤 경우에는 구멍 크기는 한정되어 걸리고이다 몇 마이크로 미터. 거품-like 3D LCEs 금속 템플릿 높은 셀 부하를 허용하여 제조; 개선 된 증식 속도; 공동 배양; 와, 적어도 마지막하지만, 더 나은 대중 교통 관리 (즉, 영양소, 가스, 폐기물)은 전체 조직 개발 (27)을 보장합니다. 폼 같은 3D LCEs 또한 셀 정렬을 개선하기 위해 표시; 이것은 세포 증식 및 세포 방향을 감지 LC 펜던트 관련된 대부분이다. LCE 내의 LC 잔기의 존재는 LCE 골격 내의 셀 위치에 대하여 셀의 정렬을 향상 보인다. 스트러트 함께 (접합부) (27)에 가입 여기서 명확한 방향은 관찰되지 동안 세포는 LCE의 스트러트 내에서 정렬. 전반적으로, 세포 지지체로서의 LCE 세포 골격 플랫폼 튜닝 엘라스토머 형태와 탄성 구체적 O 순서, 공간적인 배치를 만들 수 (개별) 세포 유형의 정렬을 지시하는이 기회를 제공한다생명체와 유사한 F 세포. 별개로 유지 장기 세포 성장 및 증식을 유도 할 수있는 발판을 제공하는 것을, 또한 셀 LCEs 방향 및 상호 작용을 실시간으로 수정 될 수 동적 실험을 허용한다.

<table><tbody><tr><td>1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltriethoxysilane</td><td>Alfa Aesar</td><td>L16606</td><td>실란화제</td></tr><tr><td>2-bis(4-hydroxy-cyclohexyl)프로판</td><td>TCI</td><td><a href="http://www.tcichemicals.com/eshop/en/us/commodity/B0928/">B0928</a></td><td>시약</td></tr><tr><td>2-chlorohexanone&nbsp;</td><td>Alfa Aesar</td><td>A18613</td><td>시약</td></tr><tr><td>2-헵타논&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W254401</td><td>솔벤트</td></tr><tr><td>2-프로판올&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>278475</td><td>용매</td></tr><tr><td>3-chloroperbenzoic acid, m-CPBA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>273031</td><td>시약</td></tr><tr><td>4-dimethylaminopyridine</td><td>Alfa Aesar</td><td>A13016</td><td>시약</td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>핵 염색제</td></tr><tr><td>5-헥시노산&nbsp;</td><td>Alfa Aesar</td><td>B25132-06</td><td>시약</td></tr><tr><td>아세트산</td><td>VWR</td><td>36289</td><td>용매</td></tr><tr><td>아세톤</td><td>시그마 Aldrich</td><td>34850</td><td>용매</td></tr><tr><td>알코올 200 proof ACS 등급&nbsp;</td><td>VWR</td><td>71001-866</td><td>시약</td></tr><tr><td>벤젠</td><td>Alfa Aesar</td><td>AA33290</td><td>용매</td></tr><tr><td>&-caprolactone&nbsp;</td><td>Alfa Aesar</td><td>A10299-0E</td><td>시약</td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>VWR</td><td>BDH1109</td><td>용매</td></tr><tr><td>콜레스테롤</td><td>시그마 Aldrich</td><td>C8503</td><td>시약</td></tr><tr><td>크롬(VI) 산화물</td><td>시그마 Aldrich</td><td>232653</td><td>시약</td></tr><tr><td>구리(I) 요오드화물</td><td>Strem Chemicals</td><td>100211-060</td><td>시약</td></tr><tr><td>D,L-L/em-Lactide&nbsp;</td><td>Alfa Aesar</td><td>L09026</td><td>시약</td></tr><tr><td>디클로로메탄</td><td>시그마 Aldrich</td><td>320269</td><td>용매</td></tr><tr><td>Diethyl 에테르&nbsp;</td><td>Emd Millipore</td><td>EX0190</td><td>용매</td></tr><tr><td>N,N-디메틸포름아미드</td><td>시그마 알드리치</td><td>270547</td><td>용매</td></tr><tr><td>Dulbecco' s 수정된 Eagle 매체, DEME&nbsp;</td><td>CORNING Cellgo</td><td>10-013</td><td>세포 매체</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>알파 Aesar</td><td>33361</td><td>용매</td></tr><tr><td>포름알데히드&nbsp;</td><td>SIGMA Life Science</td><td>F8775</td><td>고정</td></tr><tr><td>태아 소 혈청, FBS&nbsp;</td><td>HyClone</td><td>SH30071.01</td><td>미디어 구성</td></tr><tr><td>요소 여과지, 등급 415, 정성, 크레이프</td><td>VWR</td><td>28320</td><td>여과</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td>중앙 노드 (3-암)</td></tr><tr><td>헥사메틸렌 디이소시아네이트, HDI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>52649</td><td>Crosslinker</td></tr><tr><td>철(III) 염화물&nbsp;</td><td>Alfa Aesar</td><td>12357</td><td>에칭제</td></tr><tr><td>이소프로필 알코올</td><td>VWR</td><td>BDH1133</td><td>용매</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Alfa Aesar</td><td>L13255</td><td>용매</td></tr><tr><td>N,N'-dicyclohexylcarbodiimide</td><td>Aldrich</td><td>D80002</td><td>용매</td></tr><tr><td>N,N-Dimethylformamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270547</td><td>용매</td></tr><tr><td>니켈 메탈 템플릿</td><td>American Elements</td><td>Ni-860</td><td>폼 템플릿</td></tr><tr><td>신경모세포종 세포 (SH-SY5Y)</td><td>ATCC</td><td>CRL-2266</td><td>세포주</td></tr><tr><td>페니실린 스트렙토마이신&nbsp;</td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td>15140122</td><td>항생제</td></tr><tr><td>폴리에틸렌 글리콜 2000, PEG</td><td>Alfa Aesar</td><td>B22181</td><td>시약</td></tr><tr><td>아지드나트륨&nbsp;</td><td>VWR</td><td>97064-646</td><td>시약</td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>AMRESCO</td><td>865</td><td>건조염</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>BDH</td><td>BDH9286</td><td>건조염</td></tr> 인<tr><td>산나트륨이염기성 헵타하이드레이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>S-374</td><td>건조염</td></tr><tr><td>인산나트륨 일염기성 일수화물</td><td>시그마 Aldrich</td><td>S9638</td><td>건조염</td></tr> 황<tr><td>산나트륨</td><td>Sigma Aldrich</td><td>239313</td><td>건조염</td></tr><tr><td>테트라하이드로푸란</td><td>Alfa Aesar</td><td>41819</td><td>용매</td></tr><tr><td>티오황산염 de 나트륨</td><td>AMRESCO</td><td>393</td><td>건조염</td></tr><tr><td>주석(II) 2-에틸헥사노에이</td>트 <td>Aldrich</td><td>S3252</td><td>시약</td></tr><tr><td>톨루엔</td><td>Alfa Aesar</td><td>22903</td><td>용매</td></tr><tr><td>트리에틸아민</td><td>Sigma Aldrich</td><td>471283</td><td>시약</td></tr><tr><td>트립신</td><td>HyClone</td><td>SH30042.01</td><td>세포 박리</td></tr><tr><td>Olympus FV1000</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

3d 공간 세포 배양을위한 세포 발판으로 생체 적합성 액정 엘라스토머 거품의 합성

Synthesis of Biocompatible Liquid Crystal Elastomer Foams as Cell Scaffolds for 3D Spatial Cell Cultures

여기서는 3 차원, 생분해 성, 발포 셀 형상 지지체의 단계별 제조를 제시한다. 이러한 골격은 멕틱-A (SMA) 액정 엘라스토머 (LCEs) 결과, 측쇄 부속기로서 콜레스테롤을 갖춘 단위 성 블록 코 폴리머를 가교 결합하여 제조 하였다. 폼과 같은 골격은, 3 차원 세포 배양 지지체로 적합, 금속 템플릿을 이용하여 제조 상호 연결된 마이크로 채널이 있습니다. 금속 발포체의 종래 다공성 템플릿 필름이지만 질량 수송보다 잘 관리 (즉, 영양소, 가스 폐기물 비교뿐만 아니라 높은 세포 증식을 촉진하는 3 차원 세포 지지체의 엘라스토머 결과의 일반적인 구조의 결합 특성 등). 금속 템플릿의 특성상 거품 형상 (즉, 롤 또는 필름)의 간편한 조작을 가능하게하고 다른 세포 연구 다양한 기공 크기의 골격의 제조를위한 interconnec을 유지하면서템플릿의 테드 다공성 성격. 에칭 공정은 생체 적합성 및 생분해 성 특성을 보존, 엘라스토머의 화학적 성질에 영향을주지 않습니다. 우리는 세포의 성장과 증식을 촉진하면서 이러한 멕틱 LCEs는 광범위한 기간에 재배 할 때, 임상 적으로 복잡한 조직 구조의 연구를 수 있음을 보여준다.

이 보고서는 니켈 템플릿을 사용하는 세포 배양 용 지지체로서 다공성 3 차원 LCE의 제조 방법을 도시한다. 얻어진 3D LCE는 쉽게 세포의 침윤을 허용 복잡한 상호 채널 네트워크뿐만 아니라 더 적합 질량 수송 (27)를 보여줍니다. 그것은 세포가 완전히 상호 연결된 채널 네트워크에 침투 할 수 있고 또한 LCE 내에서 정렬 할 수있는 것을 알 수 있었다. 여기서, 금속 니켈 폼 (니켈 99 %, 밀도 860 g / cm 2) 이전 쿵 등에 의해보고 그라 발포체 제조와 유사한 방식 다음에 선택 하였다. (22). 금속 폼 폴리머는 완전히 덮여 모든 금속 스트럿으로, 주조되었다. 그것은 LCE의 최종 형태를 부여하고 관심있는 조직 환경을 모방하는 데 도움 수있는 금속 폼의 크기와 밀도의 선택은 중요하다. <p class="jo...

본 연구는 3D, 생체 측쇄 액정 엘라스토머 (LCEs)에 기초한 생분해 성 발포 셀 형상 지지체를 제조하는 방법을 제공한다. 공 초점 현미경 실험은 거품 같은 LCEs가 세포 부착, 증식 및 C2C12s의 근육 모세포의 자연 정렬 할 수 있음을 보여준다.

3D 공간 세포 배양을위한 세포 발판으로 생체 적합성 액정 엘라스토머 거품의 합성

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block ...

본 절차의 목적은 생체 적합성 측쇄 액정 엘라스토머를 기반으로 한 생분해성 3차원 폼 형태의 세포 스캐폴드를 제작하는 것입니다. 이 방법은 액정 엘라스토머의 특성이 세포 증식 및 정렬에 미치는 영향과 같이 액정 및 생의학 분야의 핵심 질문에 대한 해답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 2차원 세포 스캐폴드 방식과 비교했을 때 이 방법의 주요 장점은 2D 매크로 환경에서는 거의 불가능한 세포 간의 공간적 상호작용 연구가 가능하다는 점입니다.일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 초보자들은 촉각 압축 테스트에 어려움을 겪을 것입니다. 저희는 수백 개의 페트리 접시 내 배지를 교체해야 했던 경험 이후 이 방법에 대한 아이디어를 처음 얻었습니다. 저희는 수많은 페트리 접시의 사용을 줄이기 위해 액정 엘라스토머가 3D 네트워크 상에서 근육 세포를 지지할 수 있을지 궁금했습니다.일부 단계에서 화학 물질의 세심한 조작이 필요하므로, 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 또한, 금속 폼 템플릿을 성형하는 과정이 까다로울 수 있습니다. 먼저, 20 milliliter 앰플에 toluene에 2%by volume로 용해된 PFOTES 용액을 채웁니다.앰풀 내부를 실란화하기 위해 앰풀 안의 용액을 24시간 동안 교반합니다. 실란화된 앰풀을 이소프로필 알코올로 헹구고 140 °C에서 30분 동안 건조합니다. 건조된 앰풀에 증류된 epsilon-caprolactone 3.64 g, alpha-chloro-epsilon-caprolactone 0.5 g, 그리고 glycerol 0.25 mL를 넣습니다.혼합물을 1분 동안 볼텍싱합니다. 그런 다음, 혼합물에 4.90 g의 DL-lactide를 첨가하고, 앰플 내부 분위기를 질소 가스로 1분 동안 퍼지합니다. 앰플 입구를 알루미늄 호일로 덮고, 혼합물을 120 °C에서 약 2시간 동안 가열하여 DL-lactide를 녹입니다.혼합물을 볼텍싱하여 녹지 않은 고형물을 분쇄한 다음, 앰플에 10-2-ethylhexanoate 66 µL를 첨가하고 다시 볼텍싱합니다. 앰플을 알루미늄 호일로 밀봉하고 120 °C에서 10분 동안 가열하여 DL-lactide를 다시 녹입니다. DL-lactide가 다시 녹으면 혼합물을 격렬하게 볼텍싱하고, 앰플 내부 분위기를 질소 가스로 퍼지합니다.앰플을 고무 격막으로 밀봉합니다. 진공 라인에 연결된 바늘을 격막을 통해 삽입하고 진공을 시작합니다. 고무 마개가 녹지 않도록 주의하면서 앰플의 목 부분을 화염 밀봉합니다.목 부분을 밀봉한 후, 반응 혼합물을 140 °C에서 48시간 동안 가열합니다. 그런 다음 혼합물을 실온까지 식힙니다. 앰플을 깨뜨려 점성이 있는 반응 혼합물을 10 mL의 dichloromethane에 용해시킵니다.혼합물을 분액 깔때기로 옮깁니다. 100 milliliters의 메탄올이 담긴 플라스크를 드라이아이스-아세톤 배스에 넣어 메탄올을 약 영하 78 degrees Celsius로 냉각시킵니다. 메탄올이 충분히 냉각되면, 분액 깔때기를 플라스크 위에 고정시킵니다.초당 두 방울의 속도로 반응 혼합물을 차가운 메탄올에 첨가합니다. 생성된 흰색 침전물을 여과지에 수집합니다. 침전물을 50에서 60 °C 사이의 진공 오븐에서 건조하여 3-암 알파-클로로 SBC 생성물을 얻습니다.알파 콜레스테릴 3-암 SBC를 준비하기 위해, 펜던트 염소 원자를 아자이드로 치환합니다. 콜레스테릴 5-헥시노에이트와의 클릭 반응을 통해 액정 부분인 펜던트 콜레스테릴을 생성합니다. 액정 엘라스토머 스캐폴드 준비를 시작하려면, 0.75 g의 알파 콜레스테릴 3-암 SBC를 0.25 mL의 HDI 및 0.24 mL의 증류된 epsilon-caprolactone과 혼합하십시오.여기에 10-2-ethylhexanoate 60 µL를 첨가하고 혼합물을 볼텍싱합니다. 그 다음, 1 cm x 4 cm 크기의 니켈 금속 폼 조각을 자릅니다. 액정 엘라스토머 폼 스캐폴드의 템플릿을 형성하기 위해 니켈 폼을 지름 1 cm, 높이 1 cm의 원통형으로 맙니다.템플릿을 유리 바이알이나 알루미늄 호일 용기에 넣고, 액정 엘라스토머 혼합물을 템플릿이 완전히 덮일 때까지 붓습니다. 템플릿을 액정 엘라스토머 혼합물에 2분 동안 그대로 둔 다음, 피펫을 사용하여 과량의 혼합물을 제거합니다. 혼합물과 템플릿을 80 °C에서 하룻밤 동안 가열합니다.그 후, 알루미늄 호일을 벗겨내거나 유리를 깨뜨립니다. 면도날을 사용하여 과도한 액정 엘라스토머를 제거함으로써 니켈 금속 템플릿을 노출시킵니다. 폼을 플라스크에 넣고 포화 염화 철(III) 수용액 70 milliliters를 첨가합니다.니켈 템플릿을 용해시키기 위해 상온에서 3일 동안 용액 내의 폼을 교반합니다. 24시간마다 탈이온수에서 폼을 30분 동안 교반한 후, 다시 신선한 염화 철(III) 용액에서 교반을 재개합니다. 교반 2일 차 이후에 액정 엘라스토머 폼의 촉각 압축 테스트를 수행합니다.촉각 압축에 대한 저항감은 니켈 템플릿이 폼 내에 여전히 존재함을 나타냅니다. 3일째 이후에는 모든 니켈 템플릿이 제거되어, 결과물인 폼은 매우 부드럽고 완전히 압축하기 쉬운 상태가 됩니다. 니켈 템플릿은 반드시 완전히 제거되어야 합니다.촉각 압축 테스트를 수행했을 때 만졌을 때 부드러워질 때까지 염화철로 액정 엘라스토머 폼을 충분히 헹구는 것이 중요합니다. 이제 액정 엘라스토머 폼 스캐폴드를 특성 분석 및 사용에 활용할 수 있습니다. 액정 엘라스토머 폼이 부드러워지면, 70% ethanol로 헹구어 멸균합니다.세포 파종 절차를 시작하기 위해, 엘라스토머 표면을 멸균하고자 액정 엘라스토머 폼 스캐폴드를 1 mL의 70% ethanol로 두 번 더 세척합니다. 그 다음, 스캐폴드에 10분 동안 UV light를 조사합니다. 스캐폴드를 다시 1 mL의 70% ethanol로 세척합니다.멸균된 물과 인산염 완충 식염수를 각각 1 mL씩 사용하여 스캐폴드를 헹굽니다. 멸균된 액정 엘라스토머 스캐폴드를 24-웰 배양 플레이트에 넣습니다. 페니실린과 스트렙토마이신이 포함된 적절한 세포 성장 배지에서 대상 세포의 현탁액을 준비하고 세포 수를 측정합니다.성장 배지를 사용하여 세포 현탁액을 100 µL당 1.5 × 10⁵ cells가 되도록 희석합니다. 희석된 세포 현탁액 한 방울을 각 액정 엘라스토머 스캐폴드 위에 떨어뜨립니다. 세포가 파종된 액정 엘라스토머 스캐폴드를 5% CO2 분위기의 37 °C에서 2시간 동안 배양합니다.각 스캐폴드에 성장 배지 0.5 milliliters를 추가로 넣고 배양을 계속합니다. 48시간마다 세포가 파종된 스캐폴드를 1 milliliter의 PBS로 세척하고, 신선한 성장 배지를 추가합니다. 세포가 현미경 관찰이 가능한 상태가 될 때까지 스캐폴드 배양을 계속합니다.이러한 smetic LC는 세포의 성장과 증식을 촉진하는 동시에 복잡한 조직 구조물의 연구를 가능하게 합니다. 세포 생존력을 유지하기 위해 폼은 반드시 멸균되어야 하며, 배양물의 청결 상태를 항상 유지해야 합니다. 현미경 관찰을 준비하려면 PBS에 4%paraformaldehyde를 혼합한 용액으로 15분 동안 스캐폴드 위의 세포를 고정하십시오.샘플을 3 mL의 PBS에 5분 동안 세 번 담가 세척합니다. 스캐폴드 샘플 하나를 Eppendorf 튜브에 넣습니다. 500 µL의 PBS에 0.1% DAPI를 희석한 용액으로 샘플을 10분 동안 염색합니다.샘플을 1 mL의 PBS에 5분 동안 두 번 담가 세척합니다. 그 후, 즉시 공초점 현미경으로 샘플을 촬영합니다. 샘플 전체를 아우르는 이미지 스택을 획득하고, 이미지 처리 프로그램에서 데이터를 분석합니다.액정 모이어티를 포함하는 3-암(arm) SBC를 HDI를 가교제로 사용하여 니켈 폼 템플릿 위에 캐스팅하였습니다. 액정 엘라스토머 폼을 얻기 위해 에칭 공정을 통해 니켈 템플릿을 제거하였습니다. 에칭 과정을 모니터링하기 위해 주기적으로 압축 변형 시험을 수행하였습니다.니켈이 완전히 용해된 후, 압축 변형 테스트 결과 압축 시 크기가 70% 감소하는 것으로 나타났습니다. 압축을 해제하자 액정 엘라스토머 폼은 일관되게 원래의 크기와 모양으로 회복되었습니다. 이러한 거동은 액정 작용기 때문인 것으로 보이며, 콜레스테롤 엡실론-카프로락톤 작용기가 없는 유사한 엘라스토머 폼은 압축 후 회복되지 않았습니다.내부 폼 형태의 SCM 결과, 중공 폼 스트럿(hollow foam struts)이 서로 연결된 네트워크 구조가 확인되었습니다. 이러한 규칙적인 형태는 니켈 폼의 구조에 기인한 것으로, 적절한 금속 템플릿을 선택함으로써 기공 크기와 전체적인 모양을 제어할 수 있음을 나타냅니다. 해당 폼에 신경모세포종 세포를 파종한 결과, 2일 이내에 네트워크 벽면에 세포들이 부착되었습니다.세포 파종 30일 후, 공초점 현미경 분석 결과 세포가 액정 엘라스토머 네트워크 전체로 확장되었으며, 엘라스토머 폼 전체에 분산된 다층 구조를 형성했음이 확인되었습니다. 세포핵의 신장이 관찰되었으며, 이는 세포 정렬과 상관관계가 있었습니다. 이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 3~4주 이내에 완료할 수 있습니다.이 영상을 시청한 후, 특정 기공 크기와 형태를 가진 액정 엘라스토머 세포 스캐폴드를 설계하고 제작하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 수행할 때는 각 생성물을 완전히 특성화하고 세포 생존율과 증식을 모니터링하는 것이 중요합니다. 또한, 공초점 현미경 이미지를 쉽게 얻기 위해서는 적절한 염색 기술이 중요합니다.이 절차에 따라, 액정 엘라스토머의 이방성 분자 배열이 세포 반응에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 추가적인 의문을 해결하기 위해 응력이나 자기장 및 전기장과 같은 외부 자극에 액정 엘라스토머를 노출시킬 수 있습니다. 이 기술의 함의는 질병 과정 연구에 적용될 수 있는데, 이는 모사된 질병 활성과 그에 따른 회복 과정에 외부 인자가 미치는 영향을 동적으로 연구할 수 있는 플랫폼을 제공하기 때문입니다. 이러한 스멕틱 액정 엘라스토머 폼은 세포 간 상호작용에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 반도체나 금속 나노구조와 같은 다른 재료와 함께 사용될 수도 있습니다.이 기술의 개발 이후, 생의학 분야의 연구자들은 생체 시스템을 모사하는 장기 실험 플랫폼을 설계할 수 있는 길을 열게 되었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

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3D 공간 세포 배양을위한 세포 발판으로 생체 적합성 액정 엘라스토머 거품의 합성

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