Name: 마우스 혈관의 얼굴 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: 배우세요 마우스 대동맥과 경동맥의 얼굴 면역형광 표본 제작법을. 좌측 경동맥 결찰 후 혈관벽 내 단백질 국소화와 세포 유형 식별을 공초점 현미경으로 분석하는 방법입니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

저자의 연구 활동은 국립 보건원 (National Institute of Health)의 Dr. Abe (HL-130193, HL-123346, HL-118462, HL-108551)의 보조금으로 지원됩니다.

안면 면역 염색을위한 마우스 부분 경동맥 결찰 및 마우스 대동맥 및 경동맥의 분리에 대한 프로토콜은 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IBT 2014-9231)의 승인을 받았습니다. 1. 좌 경부 동맥 결찰술 <ol><li> 테이블에 12 인치 x 14 인치의 가열 패드를 놓고 외과 공간을 준비하고 패드와 테이블 위에 큰 깨끗한 수술 용 드레이프를 덮으십시오. 실체 현미경의 시야가 가열 패드의 가운데 부분에 오도록 붐 스탠드의 암을 조정하십시오. </li><li> 테이블의 히팅 패드를 켜고 3 단계 조절 다이얼을 중간 열 수준으로 설정합니다. 이 온도 설정에서 수술 보드 표면 (1.6.1 참조)은 38-40 ° C가됩니다. <ol><li> 다른 가열 패드 위에 깨끗한 케이지를 놓습니다. 위와 같이 가열 패드를 켜십시오. 이 케이지는 수술 후 회복 (1.16 참조)과 주거에 사용됩니다. </li></ol></li&gt; <li> 수술 테이블 위에 홍채 가위 (1 쌍), 조직 집게 (1 쌍), 수퍼 그립 집게 (2 쌍), 스프링 가위 (1 쌍), 둔기 견인기 (1 쌍, 2.5mm 폭)가있는 고압 가압 멸균 주머니를 넣고, , 라운드 처리 바늘 홀더 (1), 살균 6-0 실크 봉합사, 면화 팁 응용 프로그램, 미니 면화 팁 애플 리케이션, 수술 커튼, 2 &quot;X 2&quot;거즈 스폰지. 또한 70 % 에탄올이 들어있는 짜내는 병과 수술 용 테이블에 chlorhexidine 외과 용 스크루본을 넣은 병을 넣으십시오. </li><li> 마우스의 무게를 잰다. 체중은 수술 직전에 투여 될 진통제의 적절한 양을 결정하는 데 필요합니다. </li><li> 유도 챔버에 마우스를 놓으십시오. </li><li> 유도 챔버에서 마우스를 마취하기 위해 산소 탱크와 마취 기화기를 켜십시오. 이소 플루 란 수준을 2 %로 유지하십시오. 마우스가 움직이기 전에 3-5 분이 걸린다. <ol><li> 마우스가 마취되고있는 동안입체 현미경 아래에 멸균 수술 용 드레이프 (24 인치 x 24 인치)의 작은 조각을 놓고 수술 표면을 만듭니다. 그런 다음 드레이프 된 표면에 아크릴 외과 용 보드 (70 % 알콜로 세척 됨)를 놓습니다. 따라서 외과 용 보드는 가열 패드 위에 있어야하지만 외과 용 드레이프의 두 층으로 분리되어야합니다. </li></ol></li><li> 마우스가 유도 챔버에서 움직이는 것을 멈 추면 마우스를 수술 전 준비 구역으로 옮기고 기화기 (2 % isoflurane)에 연결된 코 콘에 코를 놓습니다. 전기 트리머 또는 헤어 제거제 로션을 사용하여 자궁 경부 주위의 모발을 제거하십시오. 이 방법으로는 수술 부위에서 완전히 제거하기 어려운 털 조각이 생기지 않으므로 로션을 제거하는 것이 좋습니다. </li><li> 코 콘을 제 위치에 놓고 마우스를 수술 용 보드로 옮깁니다. <ol><li> 오른쪽 및 왼쪽 앞다리를 외과 용 보드에 테이프로 감아 넣으십시오. 양쪽 뒷다리를 아래로 테이프로 감아 서ther 마우스 오른쪽에. 이것은 마우스의 목 부위의 좌측이 수술을 위해보다 양호하게 배치되도록 마우스 몸체의 약간의 회전을 야기한다. </li></ol></li><li> 절개 부위를 70 % 알코올, 클로르헥시딘 외과 수술 용 스크럽 및 다시 70 % 알코올로 소독합니다. 자궁 절개 부위를 제외하고 멸균 된 수술 용 드레이프로 마우스를가립니다. </li><li> 마우스를 완전히 마취하고 intraperitoneal 또는 피하 주사 를 통해 진통 (카로 펜 3-5 mg / kg) 을 주는 발가락 핀치로 확인하십시오. </li><li> 해부 현미경으로, 메스 또는 홍채 가위를 사용하여 자궁 경부 주위에 복부 중간 선 절개를하십시오. 참고 : 입체 현미경의 작동 거리가 제한되어 있기 때문에 가위를 사용하기 때문에 메스를 사용하기가 어렵습니다. </li><li> 왼쪽 총 경동맥 (LCCA)을 옆으로 밀고 혈관을 덮고있는 타액선의 위치를 ​​왼쪽으로 옮깁니다.nimal. </li><li> 수술 분야의 모든 혈관을 확인하십시오 ( 그림 1 ). LCCA는 왼쪽 내 경동맥 (ICA)과 왼쪽 외 경동맥 (ECA)으로 분기됩니다. 표재성 갑상선 동맥 (STA)은 내측의 ECA에서 발생합니다. 후두 동맥 (OA)은 일반적으로 ECA에서 발생하지만 일부 마우스에서는 ICA에서 발생합니다. </li><li> 멸균 된 6-0 실크 봉합사를 사용하여 OA 기기를 제외한 모든 동맥 가지를 라이 게이션하십시오. 이를 위해 다음 두 가지 연결을 만드십시오. <ol><li> 부드럽게 왼쪽 내 경동맥 (ICA) 주위와 아래에 결합 조직을 제거합니다. 포 셉터로 precut 6-0 실크 봉합 (~ 2.5cm)의 조각을 잡고 동맥 아래에 전달하십시오. 다른 한 쌍의 포셉을 사용하여 봉합사를 길이의 1/3 정도로 잡아 당겨 동맥을 결찰하십시오. </li><li> 위에 설명 된 것과 같은 방식으로 왼쪽 외부 경동맥 (ECA) 주위의 결합 조직을 제거하고 왼쪽 상 티로이 근위에 결찰을하십시오d 동맥 (STA) ( 그림 1 ). 수술 분야에서 움직이는 신경 섬유를 손상시키지 않도록주의하십시오. </li></ol></li><li> 이러한 결찰이 이루어지면 타액선을 원래의 위치로 돌려 놓고 멸균 된 생리 식염수 2 ~ 3 방울을 넣어 수술 부위를 수분을 공급하십시오. 6-0 코팅 된 vicryl 봉합사를 사용하여 피부를 닫습니다. </li><li> 수술 후 예열 된 케이지 (1.2.1 참조)에 마우스를 놓습니다. 마우스는 5 분 안에 일어나야하며 주변을 걷기 시작해야합니다. 마우스가 정상적으로 작동하는지 확인한 후 새장을 동물 방에 가져 오십시오. </li><li> 회복 첫 3 일 동안 매일 마우스를 관찰하십시오. 마우스는 실험 프로토콜이 요구하는 다양한 조건 하에서 실험이 요구하는 한 오래 유지 될 수 있습니다. 얼굴 수술 준비는 수술 후 언제든지 가능합니다. </li></ol> 2. 엉덩이 면역 면역 <ol><li> 흡입 과다에 의해 CO 2 로 마우스를 안락사하십시오. </li><li>해부 보드에 누름 (배꼽이 위를 향한) 위치에 마우스를 테이프. </li><li> 홍채 가위를 사용하여 정중선 절개를하여 복강을 노출시킵니다. </li><li> 갈비를 옆으로 흉골로 절단하여 흉강을 노출시킵니다. </li><li> 대정맥에서 딱지를 만들거나 혈액을 배출하기 위해 대퇴 동맥 중 하나를 자릅니다. </li><li> 중력 관류 설정 (120cm 수압)에 첨부 된 26G 바늘을 왼쪽 심실의 꼭대기에 삽입하고 순환계를 헤파린 (40U / mL)이 들어있는 생리 식염수로 관류하십시오. 상처에서 흐르는 식염수가 명확해질 때까지 재관류를 계속하십시오. </li><li> 관류 시스템을 식염수에서 PBS (인산염 완충 식염수)에 4 % 파라 포름 알데히드를 포함하는 고정 솔루션으로 전환하고 5 분 동안 계속해서 관류합니다. </li><li> 무딘 엔드 가위 및 집게를 사용하여 대동맥과 좌우 경동맥을 수확하고 얼음에 정착액이 들어있는 50 ML 원추형 튜브에 넣으십시오. </li><li&gt; 해부 현미경 아래 PBS가 들어있는 페트리 접시에 혈관을 전송하고 조심스럽게 대동맥과 경동맥에 연결된 지방과 결합 조직을 제거합니다. 대동맥과 경동맥을 분리하여 세로로 내피를 노출시킵니다 ( 그림 2 ). </li><li> 우물 당 permeabilizing 솔루션 (PBS에 0.1 % 트리톤 X - 100) 0.5 ML을 포함하는 12 잘 접시의 우물로 별도로 각 그릇을 전송합니다. 실온 (RT)에서 흔들어 10 분간 혈관을 침투. </li><li> PBS로 간단히 씻으십시오. </li><li> 비특이적 항체 결합 부위를 차단하기 위해 TTBS (2.5 % Tween 20를 함유 한 Tris-buffered saline (TBS))에서 30 분 동안 2 차 항체가 만들어진 동물 종에서 혈청을 10 % 정상 배양한다. RT에서 락. </li><li> 4 ° C에서 흔들어 밤새 정상적인 10 % 혈청 (위에서 설명한)으로 TTBS에 적절히 희석 한 기본 항체와 혈관을 품어. 레벨각 항체에 대해 희석 정도를 결정해야합니다. </li><li> 다음의 컨트롤 얼룩을 수행하십시오. <ol><li> 일차 항체 대신에 TTBS로 혈관을 인큐 베이트 한 후 이차 항체와 함께 항온 처리한다. </li><li> 일차 항체가 만들어진 동일한 동물 (종)의 비 면역 (또는 면역 전) 혈청 또는 Ig를 함유하는 TTBS로 혈관을 인큐 베이트 한 다음, 2 차 항체와 함께 항온 처리한다. </li><li> 이차 항체와 함께 배양을 생략하십시오. 이러한 대조 검체는 특정 항체로 염색 할 때 동일한 방식으로 동시에 취급해야합니다. </li></ol></li><li> TTBS로 혈관을 3 번 씻고 10 분간 RT에서 흔들어 준다. </li><li> TTBS에서 10 % 정상 혈청 (위에서 기술 한)으로 적절하게 희석 된 형광 표지 된 2 차 항체와 함께 항온 처리하고 RT에서 흔들어 주면서 1 시간 동안 항온 처리한다. DAPI (4 &#39;, 6- 디아 미디 노 -2- 페닐 인돌)로 핵 염색을 동시에 수행 할 수있다.H 2 O에 5mg / mL의 DAPI를 함유하는 DAPI 스톡 용액의 1 / 5,000 부피를 첨가함으로써이 단계를 수행 하였다. </li><li> RT에서 흔들어 10 분 동안 TTBS로 3 번 씻으십시오. </li><li> PBS로 가볍게 헹굽니다. </li><li> 커버 유리 (22mm x 50mm)에 항 - 퇴색 시약 1 방울을 놓고 내피가 아래를 향하게하여 커버 유리에 혈관을 놓습니다. </li><li> 혈관에 슬라이드 유리 (22mm x 75mm)를 놓고 거품을 피하십시오. </li><li> 깨끗한 실험실 닦음 ( 예 : Kimwipe)에 슬라이드를 놓고 두 개의 실험실 닦음으로 슬라이드를 덮으십시오. 슬라이드에 최대 3.5 분 동안 체중 3.5 kg ( 예 : 두꺼운 책에 물 한 병 사용)을 넣고 안면 혈관 표본을 평평하게합니다. </li><li> 무게를 제거하고 coverslip 주위에서 과도한 솔루션을 닦아주십시오. </li><li> coverslip의 네 모서리에 매니큐어를 적용 슬라이드 상자에 슬라이드를 놓으십시오, coverslip면을 위로하고 RT에서 어둠에 보관(또는 4 ° C) 하룻밤. 이 과정은 조직을 더욱 평탄하게 만들고 고배율에서 현미경 검사를 더 쉽게합니다. </li><li> 손톱 광택을 사용하여 coverslip을 완전히 봉인하십시오. </li><li> 매니큐어가 건조하자 마자 현미경 검사를 수행하십시오. </li><li> 필요한 경우 -20 ° C에서 슬라이드를 보관하십시오. </li></ol>

<ol><li>Jelev, L., Surchev, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+simple+technique+for+en+face+endothelial+observations+using+water-soluble+media+-%27thinned-wall%27+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">A novel simple technique for en face endothelial observations using water-soluble media -'thinned-wall' preparations.</a> J Anat. 212 (2), 192-197 (2008).</li>
<li>Neill, J. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1803374/">The effect on venous endothelium of alterations in blood flow through the vessels in vein walls, and the possible relation to thrombosis.</a> Ann Surg. 126 (3), 270-288 (1947).</li>
<li>Rogers, K. A., Kalnins, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+examining+the+endothelial+cytoskeleton+in+situ+using+immunofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">A method for examining the endothelial cytoskeleton in situ using immunofluorescence.</a> J Histochem Cytochem. 11 (11), 1317-1320 (1983).</li>
<li>Poole, J. C. F., Sanders, A. G., Florey, H. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/13576293">The regeneration of aortic endothelium.</a> J Pathol Bacteriol. 75, 133-143 (1958).</li>
<li>Sade, R. M., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((En+face+stripping+of+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">En face stripping of vascular endothelium.</a> Microvasc Res. 4, 77-80 (1972).</li>
<li>White, G. E., Gimbrone, M. A. Jr, Fujiwara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+influencing+the+expression+of+stress+fibers+in+vascular+endothelial+cells+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Factors influencing the expression of stress fibers in vascular endothelial cells in situ.</a> J Cell Biol. 97 (2), 416-424 (1983).</li>
<li>Kim, D. W., Gotlieb, A. I., Langille, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+modulation+of+endothelial+F-actin+microfilaments+by+experimental+alterations+in+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclero%22%5BJournal%5D)">In vivo modulation of endothelial F-actin microfilaments by experimental alterations in shear stress.</a> Arteriosclero. 9, 439-445 (1989).</li>
<li>Haka, A., Potteaux, S., Fraser, H., Randolph, G., Maxfield, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+monocyte+subpopulations+in+murine+atherosclerotic+plaques+by+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+ONE%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of monocyte subpopulations in murine atherosclerotic plaques by multiphoton microscopy.</a> Plos ONE. 7 (9), 244823e(2012).</li>
<li>Chèvre, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+imaging+of+intravascular+atherogenic+inflammation+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">High-Resolution imaging of intravascular atherogenic inflammation in live mice.</a> Circ Res. 114, 770-779 (2014).</li>
<li>Heo, K. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disturbed+flow-activated+p90RSK+kinase+accelerates+atherosclerosis+by+inhibiting+SENP2+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Disturbed flow-activated p90RSK kinase accelerates atherosclerosis by inhibiting SENP2 function.</a> J Clin Invest. 125 (3), 1299-1310 (2015).</li>
<li>Le, N. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+crucial+role+for+p90RSK-mediated+reduction+of+ERK5+transcriptional+activity+in+endothelial+dysfunction+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circ%22%5BJournal%5D)">A crucial role for p90RSK-mediated reduction of ERK5 transcriptional activity in endothelial dysfunction and atherosclerosis.</a> Circ. 127, 486-499 (2013).</li>
<li>Kano, Y., Katoh, K., Masuda, M., Fujiwara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+composition+of+stress+fiber-plasma+membrane+attachment+sites+in+endothelial+cells+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Macromolecular composition of stress fiber-plasma membrane attachment sites in endothelial cells in situ.</a> Circ Res. 79, 1000-1006 (1996).</li>
<li>Nigro, P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21173104">Cyclophilin A is an inflammatory mediator that promotes atherosclerosis in apolipoprotein E-dependent mice.</a> J Exp Med. 208 (1), 53-66 (2011).</li>
<li>Mattson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+arterial+blood+pressure+in+different+strains+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hypertens%22%5BJournal%5D)">Comparison of arterial blood pressure in different strains of mice.</a> Am J Hypertens. 14 (5), 405-408 (2001).</li>
<li>Jinguji, Y., Fujiwara, K. <a target="_blank" href="http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.3109/10623329409024632">Stress fiber dependent axial organization of fibronectin fibrils in the basal lamina of the chick and mesenteric artery.</a> Endothelium. 2, 35-47 (1994).</li>
<li>Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Lust, L., Mack, A. F. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/articles/srep34331">Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluations and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure.</a> Sci Rep. 6, 34331(2016).</li>
</ol>

마우스 혈관을 취급 할 때, 내피가 부서지기 쉽고 과도한 기계적 힘이 내피 세포를 손상 시킨다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 혈관이 수동으로 주사기를 사용하여 관류 될 때 쉽게 발생할 수있는 혈관이 너무 강하게 관류되는 경우 혈관벽에서 내피 세포가 깨지거나 분리됩니다. 일정한 관류 압력을 얻기 위해 우리는 120 cm의 수증기압을 갖는 중력 관류 시스템을 사용합니다. 변형에 따라 다른 마우스의 평균 동맥압은 130 ~ 170 cm H 2 O 14의 범위에 이르는 것으로보고되었습니다. 따라서 우리가 사용하는 관류 압력은 측정 된 동맥압보다 약간 낮습니다. 우리가 재관류 고정 쥐 대동맥, 90cm H 2 O 칼럼 압력이 사용되었습니다. 원위치 내피 세포는 수확 중에 배가 늘어나도 손상됩니다, 청소, 세로 분리, 면역 염색 및 장착....

광학 현미경에 의한 조직 병리학 적 연구를 위해, 파라핀 매입 (paraffin embedment) 및 절편 화 및 염색을 위해 생물학적 조직의 3 차원 조각을 통상적으로 처리한다. 파라핀이 묻혀있는 조직 샘플은 3 차원 모두 수 밀리미터가 될 수 있습니다. 그러나, 광학 현미경 검사의 목적을 위해, 빛이 통과 할 수 있도록 먼저 절단되어야하며, 따라서 얇은 부분이 이미징을 위해 충분한 대비를 생성하도록 염색되어야합니다. 절편 된 시편은 일반적으로 두께가 5-10 μm이기 때문에 한 번에 2 차원으로 전체 시편의 매우 작은 부분 만 볼 수 있습니다. 순차적 섹션을 수집하고 각 섹션을 개별적으로 이미징 한 후에 3D 이미지의 컴퓨터를 이용한 재구성을 수행 할 수는 있지만 실제로 지루한 작업입니다. 혈관의 조직 병리학, 특히 죽상 동맥 경화증의 병인 생리를 연구하는 데는 독특한 문제가 있습니다. 죽상 동맥 경화증은 발병하는 집중 질환입니다.혈류가 방해받는 곳에서 국부적으로 또한, 질병은 내막, 큰 동맥의 내피 세포와 세포 외 매트릭스의 단일 층으로 구성된 얇은 조직 내에서 시작됩니다. 이러한 이유 때문에 절개 된 혈관을 사용하여 초기 병변을 찾고 연구하는 것이 쉽지 않기 때문에 병변을 절개하지 못할 수 있습니다. 절에 병이있는 부분이 포함되어 있어도 배지 및 외막에 내피 세포와 기타 혈관벽 세포가 포함 된 5-10 μm 부분 만 보입니다. 전체 마운트 엉 얼굴 (발음 än fäs) 준비는 대동맥 뿌리부터 일반적인 장골 동맥까지 전체 대동맥과 같은 혈관 표면의 넓은 영역을 조사 할 수있게 해줍니다. 특정 항체 및 기타 특정 프로브로 염색 된 그러한 표본을 사용하여, 병변의 위치를 ​​정확하게 지적 할 수 있으며, 또한 다양한 분자 이벤트가 내피 세포에서 발생하는 경우단백질의 발현, 국소화 및 번역 후 변형의 변화와 같은 아테롬 발생 (atherogenesis). atherogenesis를 연구하는 것 외에도 en face preparation에서 관찰 된 내피 세포 모양은 지역 시간 평균 혈류 패턴의 지표로 사용됩니다. 이러한 데이터는 원위치에서 내피 세포의 기계 신호를 연구하는 데 중요합니다. 이러한 목적으로, 일상적인 조직 학적 단면 혈관은 유용하지 않습니다. 따라서 혈관 약과 생물학에있어서 혈관의 표면을 넓게 관찰 할 수있는 혈관 조영 기술을 습득하는 것이 중요합니다. Jelev와 Surchev 1 에 의해 검토 된 바와 같이 혈관 생물 학자들은 혈관의 안면을 관찰하기위한 다양한 방법을 개발했다. 일부 독창적 인 방법은 1940 년대와 1950 년대에 개발되었습니다. 이 방법을 사용하여<html> 혈관의 내부 표면을 줄 지어주는 내피 세포의 기본 구성을 연구 할 수 있습니다. 그러나, 이러한 표면 준비가 준비되는 방법 (Hautchen 방법 2 , 3 , 4 또는 용기 표면 5 의 벗겨짐)과 표본이 염색되는 방식 때문에, 방해받지 않는 형태학을 얻는 것이 항상 가능하지는 않습니다 혈관 벽의 더 깊은 영역으로 혈관 표면의 정보. immunofluorescence 얼룩이 결합 된 전체 마운트 엉 얼굴 선박 준비는 우리뿐만 아니라 혈관 벽의 subendotial 지역에 이러한 연구를 확장 이러한 세포의 내피 세포 형태와 단백질 발현 및 지방화를 연구 할 수있었습니다. immunoflucently 스테인드 혈관 얼굴 준비를 사용하여 초기 연구 1980 년 6 월 에 나타나기 시작 ,f &quot;&gt; 7. 레이저 스캐닝 공 촛점 현미경 검사와 최근 다 광자 현미경 검사의 출현으로 면역 형광 염색 된 안면 혈관 샘플 및 살아있는 동물의 혈관 네트워크에서 혈관 벽 구조의 명확한 초점을 맞출 수 있습니다 이러한 컴퓨터 기반 영상 기법은 인 - 포커스 광학 단면 영상을 생성하고, 이러한 영상을 적층함으로써 조직 내에서 혈관 벽 및 혈관 네트워크의 재구성 된 3D 영상을 얻을 수있다. 또한, 재구성 된 이미지 (12 , 13) 의 Z- 축을 따라 만들어진 섹션의 이미지를 생성 할 수 있습니다. 이 기사에서는 면역 형광 염색을위한 마우스 대동맥과 경동맥의 대면 준비를위한 방법을 설명 할 것입니다. 얼굴 준비이 용기를 실험적으로 조작 한 후에도 만들 수 있습니다. 예를 들어, 경동맥을 부분적으로 결찰 한 다음 수술을 한 후 얼굴을 준비 할 수 있습니다. 이런 이유로 우리는이 기사에서 우리가 경동맥에 부분 연결을 어떻게하는지 설명 할 것입니다. 쥐, 토끼 및 인간과 같은 더 큰 동물에게서 유사한 준비를 만들기와 비교해, 쥐 배는 크기가 작아서 더 부서지기 쉽고, 따라서 혈관의 외과 단절 동안 핸들링과 항체 염색법과 현미경 검사를 위해 그들을 준비 할 필요가있다. 유전자 변형을 위해 가장 일반적으로 사용되는 동물 모델은 마우스이기 때문에 많은 연구자가 마우스 혈관을 손상시키지 않으면 서이를 처리하는 것이 중요합니다. 이 원고에서는 마우스 대동맥과 경동맥의 얼굴을 만들 때 마우스 혈관을 다루는 방법을 설명 할 것입니다. 데모 목적으로 야생형 C57 / b6 마우스를 사용합니다.

<table><tbody><tr><td>0.9% 염화나트륨 주입 용액 USP 500 mL 봉지</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9788429</td><td></td></tr><tr><td>12-웰 플레이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>12556005</td><td></td></tr><tr><td>6-0 코팅 비크릴 봉합사</td><td>Ethicon</td><td>J833G</td><td></td></tr><tr><td>AF488 염소 항쥐 IgG&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>A11006</td><td></td></tr><tr><td>AF546 염소 안티-토끼 IgG&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>A11035</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD144 (Ve-Cad)</td><td>BD Biosciences</td><td>BD555289</td><td></td></tr><tr><td>Anti-VCAM-1 (H-276) 토끼 다클론 IgG</td><td>Santa Cruze 생명공학</td><td>Sc-8304</td><td></td></tr><tr><td>Aoto Flow System</td><td>Braintree Scientific</td><td>EZ-AF9000</td><td></td></tr><tr><td>오토클레이브 랩. 24 인치 x 24 인치</td><td>Cardinal Health</td><td>4024</td><td></td></tr><tr><td>블런트 리트랙터, 2.5 mm 넓이</td><td>의 Fine Science Tools</td><td>18200-10</td><td></td></tr><tr><td>Caprofen (Rimadyl)&nbsp;</td><td>zoetis</td><td>NADA#141-199</td><td></td></tr><tr><td>클로르헥시딘 스크럽, 2%</td><td>Med-Vet International</td><td>RXCHLOR2-PC</td><td></td></tr><tr><td>Curity 거즈 스폰지 2 x 2</td><td>Cardinal Health</td><td>KC2146</td><td></td></tr><tr><td>전기 가열 패드, 12 x 14</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0667724</td><td></td></tr><tr><td>Extra Fine Graefe Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>Iris Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-11</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 커버 유리 22mm x 50mm</td><td>VWR</td><td>48393059</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-18</td><td></td></tr><tr><td>일반 염소 혈청</td><td>Equitech-Bio</td><td>GS05</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드 용액 PBS</td><td>Santa Cruze Biotechnology</td><td>SC-281692</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시 100mm x 15mm</td><td>Fisher 과학적인</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>P-36935</td><td></td></tr><tr><td>청교도 코르톤 면봉</td><td>VWR</td><td>10806-005</td><td></td></tr><tr><td>청교도 미니 코튼 팁 애플리케이터</td><td>VWR</td><td>82004-050</td><td></td></tr><tr><td>원형 핸들 바늘 홀더</td><td>Fine Science Tools</td><td>12076-12</td><td></td></tr><tr><td>실크 봉합사 6/0</td><td>Fine Science 도구</td><td>18020-60</td><td></td></tr><tr><td>스프링 가위</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5601</td><td></td></tr><tr><td>사시 가위</td><td>정밀 과학 도구</td><td>14075-09</td><td></td></tr><tr><td>슈퍼 그립 겸자</td><td>정밀 과학 도구</td><td>00649-11</td><td></td></tr><tr><td>투명 드레싱</td><td>추기경 건강</td><td>TD-26C</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-1000</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>AC327371000</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 혈관의 얼굴 준비

En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

파라핀 내장 조직 섹션은 조직 조직학 및 조직 병리학을 연구하는 데 일상적으로 사용됩니다. 그러나, 3 차원 조직 형태가 그런 절에서 무엇인지 결정하는 것은 어렵습니다. 또한 검사 된 조직의 섹션에는 진행중인 연구의 목적에 필요한 조직 내의 영역이 포함되지 않을 수 있습니다. 이러한 후자의 제한은 혈관 병변이 집중된 방식으로 발달하기 때문에 혈관의 조직 병리학 적 연구를 방해한다. 이것은 우리가 혈관 벽의 넓은 영역을 표면에서 더 깊은 영역까지 조사 할 수있게하는 방법을 필요로합니다. 혈관의 전면적 인 준비가이 요구 사항을 충족시킵니다. 이 기사에서는 마우스 대동맥과 경동맥의 안면 조영 및 공 촛점 현미경 및 형광 기반 이미징의 다른 유형을 면역 형광으로 조제하는 방법을 보여줍니다.

endothelium의 전형적인 얼굴 면역 형광 이미지가 그림 3 에 나와 있습니다. 이 이미지는 늑간 동맥 (큰 어두운 달걀 모양의 영역)의 개통 근처에서 찍은 마우스 대동맥의 단일 광학 섹션을 보여줍니다. 대동맥은 항 -VE- 카데 린 (녹색) 및 항 -VCAM-1 (혈관 세포 접착 분자 -1) (적색)으로 이중 염색되었다. 각 내피 세포는 adherens junction에서 녹색 선형 염색으로 윤곽이 그려져 있습니다. 시편의 미세한 불균일 때문에 일부 광학 접합점은이 광학 섹션 외부에 있습니다. 항문-VCAM-1 염색은 방해받는 혈류가 발생하는 것으로 알려진 늑간 동맥이 열릴 때 더 강합니다. 도 4는 항 -VE- 카데 린 (녹색), 항 -BCAM-1 (적색), 및 DAPI (보라색)를 갖는 경동맥의 엉성한 염색을 도시한다. 좌 경동맥 (LCA)은 부분적으로 결찰되었고 오른쪽 경동맥 (RCA)은 손상되지...

마우스 경동맥 및 대동맥의 얼굴 준비를위한 절차가 설명된다. 특정 항체로 면역 형광으로 염색 될 때 그러한 조제 물은 우리가 공 촛점 현미경으로 전체 혈관 벽 내에서 단백질의 위치 및 세포 유형을 확인하는 것을 가능하게한다.

Sections of paraffin embedded tissues are routinely used for studying tissue histology and histopathology. However, it is difficult to determine what the ...

본 절차의 전반적인 목적은 왼쪽 경동맥 결찰 후 en face 면역 염색을 위해 마우스의 대동맥과 경동맥을 준비하는 것입니다. 이 방법을 통해 면역 염색법으로 심실강 세포 및 기타 혈관 세포의 조직 구성, 개별 단백질 발현 및 가능한 상태를 연구할 수 있습니다. En face 준비법은 혈관 전반의 넓은 영역을 분석할 수 있게 하여, 다양한 정상 및 잠재적 세포 파라미터 발현의 지역적 차이를 평가할 수 있게 합니다.본 절차의 시연은 저희 그룹의 미세외과 의사인 Dr.Quaico가 진행하겠습니다. 먼저 마취된 마우스를 수술대 위에 등으로 누운 자세(supine position)로 놓습니다. 발가락 꼬집기 자극에 반응이 없는 것을 확인한 후, 앞발은 뻗은 상태로 수술대에 고정하고 양 뒷다리는 마우스의 오른쪽으로 고정하여 목의 왼쪽 부위를 노출시킵니다.경부 주변의 털을 제거하고 노출된 피부를 소독합니다. 수술 부위에 구멍이 있는 멸균 수술 포로 마우스를 덮고, 동물의 눈에 연고를 도포합니다. 마우스를 해부 현미경 아래로 옮기고, 경부 주변의 복측 중앙선을 따라 절개합니다.혈관을 덮고 있는 타액선을 동물의 왼쪽으로 옮겨 왼쪽 총경동맥을 노출시키며, 이는 왼쪽 내경동맥과 왼쪽 외경동맥으로 분기됩니다. 왼쪽 내경동맥 주변과 아래의 결합 조직을 조심스럽게 제거하고, 포셉을 사용하여 미리 잘라둔 2.5 centimeter 길이의 6-0 실크 봉합사를 동맥 아래로 통과시킨 후, 두 번째 포셉을 이용해 봉합사의 약 3분의 1 길이를 혈관 반대편으로 끌어당깁니다. 왼쪽 내경동맥을 결찰합니다.그 다음, 방금 시연한 것과 같이 왼쪽 외경동맥 주변의 결합 조직을 제거하고, 왼쪽 상갑상선동맥 근위부를 결찰합니다. 후두동맥을 제외한 모든 동맥의 결찰이 완료되면, 타액선을 원래 위치로 되돌리고 수술 부위에 생리식염수 2~3방울을 떨어뜨려 수분을 공급합니다. 이후 6-0 코팅 Vicryl 봉합사를 사용하여 피부를 봉합하고, 마우스가 완전히 회복될 때까지 모니터링하며 미리 가온된 케이지에 넣습니다.실험 종료 시, 생쥐를 해부판 위에 앙와위로 고정하고 홍채 가위를 사용하여 정중선 절개를 통해 복강을 노출시킵니다. 흉골 측면의 갈비뼈를 절단하여 흉강을 노출합니다. 그 후 대퇴 동맥에 작은 절개창을 내고, 중력 관류 장치에 연결된 26 gauge 바늘을 좌심실 첨부에 삽입하여 헤파린이 첨가된 식염수로 순환계를 관류합니다.절단 부위에서 흘러나오는 식염수

en-face-preparation-of-mouse-blood-vessels

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 문서는 배아 피부와 thymus 혈관을 라벨에 대한 방법을 설명합니다.

배아 마우스에 Vasculature을 라벨링하는 방법

이 비디오는 쥐의 대뇌 실질에서 내피관을 분리하는 방법을 보여줍니다. 효소 분해와 기계적 해리의 조합을 통해 이 과정은 내피 세포가 있는 온전한 튜브를 생성합니다.

Preparing Cerebral Endothelial Tubes from Mouse Parenchymal Arterioles(쥐 실질 세동맥에서 대뇌 내피관 준비)

<em&gt; 생체 내</em혈관 투과율을 테스트하려면&gt; 분석

우리는 암세포가 분비하는 인자 풀의 혈관 형성 가능성을 설명하기 위해 초음파와 내시경이라는 두 가지 상보적인 이미징 방식을 사용하여 마트리겔 플러그 분석을 설명합니다. 세포외 기질(ECM)-모방 겔인 마트리겔(matrigel)은 조건화된 배지(C.M.)로 분비되는 혈관 형성 인자를 숙주(마우스)에 도입하는 데 사용됩니다.

고속 성장하는 종양 생성 세포에 의해 분비 요인에 의해 보충 모니터링 기능 및 혈관의 형태학

우리는 IRF5 억제성 펩타이드로 처리된 C57Bl/6J 대조군 마우스, 타이트-스킨 마우스 및 타이트-스킨 마우스에서 심장 세포외 기질의 분리를 설명합니다. 또한 C57Bl/6J에서 분리된 혈관, IRF5 억제성 펩타이드로 처리된 타이트-스킨 마우스 및 타이트-스킨 마우스에 대한 혈관 확장 연구를 설명합니다.

격리 혈관 혈관 확장 타이트 피부 마우스의 세포 외 기질의 분리

많은 비전을 위협 눈 질병 장애 망막 microvessels와 연결 됩니다. 따라서, 망막 되 응답의 측정은 기본 병 태 생리 기계 장치를 조사 하는 것이 중요. 이 문서에서는 마우스 망막 되 격리와 혈관 직경에 vasoactive 물질의 효과 평가 하기 위해 준비에 대 한 상세한 프로토콜을 설명 합니다.

마우스 망막 Arterioles Ex Vivo 에서 반응의 측정을 위한 준비 단계

여기서, 우리는 마우스 대인의 내피 세포를 직접 관찰하기 위해 면역형광 염색에 대한 프로토콜을 제시한다. 이 기술은 다른 흐름 패턴에서 내피 세포의 세포 및 분자 표현형을 연구하고 동맥 경화증의 발달에 유용합니다.

혈관 내피 세포를 직접 관찰하기 위해 En Face 면역 형광 염색사용

이 프로토콜은 마취마우스에 있는 가까운 혈관에서 백혈구 및 혈류 데이터를 심신하는 두뇌에서 형광 칼슘 심상을 취득하고 분석하는 단계를 제시합니다. 이러한 기술은 벽화 세포 생리학의 연구에 유용하며 모든 세포 유형의 칼슘 과도를 조사하기 위해 적응 할 수 있습니다.

생체 내 트랜스제닉 마우스의 뇌 성 구체 칼슘 및 혈역학 이미징

고전적으로, 마우스 배아 판막 원초의 심내막은 횡단, 관상 또는 시상 절편을 사용하여 분석되었습니다. 판막 형성 영역에서 심내막의 2차원 이미징에 대한 우리의 새로운 접근 방식은 판막 발달 중 심내막의 평면 극성 및 세포 재배열 분석을 가능하게 합니다.

엔 페이스 마우스 배아에서 평면 형태형성 분석을 위한 심내막 쿠션 준비

뇌혈관 기능 장애를 조사하기 위한 모델로 생쥐의 대혈관 확장을 화학적으로 유도하는 것을 시연하고 있으며, 이는 혈관성 치매 및 알츠하이머병 모델링에 사용할 수 있습니다. 또한 실리콘 고무 화합물을 주입하여 혈관 구조를 시각화하고 혈관 크기의 변화를 측정하기 위한 명확한 시각적 지침을 제공하는 방법을 보여줍니다.

A visual approach for inducing dolichoectasia in mice to model large vessel-mediated cerebrovascular dysfunction(대혈관 매개 뇌혈관 기능 장애를 모델링하기 위해 마우스에서 백우절충증을 유도하기 위한 시각적 접근법)

망막 혈관 구조의 주위 세포는 형광 토마토 렉틴의 역궤도 주사 후 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β로 면역 형광 염색으로 검사했습니다. 표지된 망막은 조직 제거 방법으로 추가로 처리되었으며 컨포칼 현미경으로 망막 혈관 구조를 둘러싼 주위 세포의 3차원 보기를 시각화하기 위해 전체적으로 장착되었습니다.

Immunostaining을 통한 마우스의 망막 혈관 주위 세포의 3D 시각화 

배우세요 마우스 대동맥과 경동맥의 얼굴 면역형광 표본 제작법을. 좌측 경동맥 결찰 후 혈관벽 내 단백질 국소화와 세포 유형 식별을 공초점 현미경으로 분석하는 방법입니다.

마우스 혈관의 얼굴 준비

더 많은 동영상 탐색