마우스 혈관의 얼굴 준비

마우스 경동맥 및 대동맥의 얼굴 준비를위한 절차가 설명된다. 특정 항체로 면역 형광으로 염색 될 때 그러한 조제 물은 우리가 공 촛점 현미경으로 전체 혈관 벽 내에서 단백질의 위치 및 세포 유형을 확인하는 것을 가능하게한다.

이 절차의 전반적인 목표는 좌측 경동맥 결찰술 후 안면 면역 염색을 위해 마우스 대동맥과 경동맥을 준비하는 것입니다. 이 방법을 사용하면 면역 염색 방법에서 조직, 각 단백질 발현, 전방 세포 및 기타 혈관 세포의 가능한 상태를 연구할 수 있습니다. En face 제제를 사용하면 다양한 정상 및 가능한 세포 매개변수의 발현에서 지역적 차이를 평가하기 위해 혈관 전체의 넓은 영역을 분석할

절차를 시연하는 것은 우리 그룹의 미세 외과 의사인 Dr.Quaico가 될 것입니다. 마취된 마우스를 앙와위 자세의 수술 보드에 놓는 것으로 시작합니다. 발가락 꼬집음에 대한 반응 부족을 확인한 후, 앞발을 바깥쪽으로 뻗은 자세로 보드에 테이프를 붙이고 양쪽 뒷다리를 마우스 오른쪽에 대고 목 왼쪽에 노출시킵니다.

경추 주변의 털을 제거하고 노출된 피부를 소독합니다. 수술 부위에 구멍이 뚫린 멸균 수술용 드레이프로 마우스를 덮고 동물의 눈에 연고를 바릅니다. 해부 현미경 아래로 마우스를 이동하고 경추 부위 주위를 복부 정중선으로 절개합니다.

혈관을 덮고 있는 타액선을 동물의 왼쪽으로 재배치하여 왼쪽 내부 경동맥과 왼쪽 외부 경동맥으로 분기되는 왼쪽 총경동맥을 노출시킵니다. 왼쪽 내경동맥 주위와 아래의 결합 조직을 부드럽게 제거하고 집게를 사용하여 동맥 아래에 2.5cm 길이의 미리 절단된 6개의 실크 봉합사를 통과시키고 두 번째 집게를 사용하여 길이의 약 1/3을 혈관의 다른 쪽으로 당깁니다. 왼쪽 내부 경동맥을 결찰합니다.

그런 다음 방금 설명한 대로 왼쪽 외부 경동맥 주위의 결합 조직을 제거하고 왼쪽 상갑상선 동맥 근위부에 결찰을 만듭니다. 후두 동맥을 제외한 모든 동맥이 결찰되면 침샘을 원래 위치로 되돌리고 식염수 2-3방울로 수술 부위에 수분을 공급합니다. 그런 다음 6개의 O 코팅된 비크릴 봉합사를 사용하여 피부를 닫고 완전히 누울 때까지 모니터링하면서 미리 예열된 케이지에 마우스를 넣습니다.

실험이 끝나면 쥐를 앙와위 자세로 해부판에 고정하고 홍채 가위를 사용하여 정중선 절개로 복강을 노출시킵니다. 흉강을 노출시키기 위해 갈비뼈를 흉골 옆으로 자릅니다. 그런 다음 대퇴 동맥을 절제하고 좌심실 정점에 설치된 중력 팽창에 부착된 26게이지 바늘을 삽입하여 헤파린이 보충된 식염수로 순환계를 가득 채웁니다.

절단에서 흐르는 식염수가 맑아질 때까지 풍부하게 계속하십시오. 그런 다음 PBS에서 식염수에서 4% 파라포름알데히드로 풍성 시스템을 전환합니다. 5분 후 생쥐를 해부 현미경 아래로 이동하고 뭉툭한 가위와 집게를 사용하여 대동맥과 좌우 경동맥을 채취합니다.

다음으로, 조직을 PBS의 페트리 접시에 옮기고 지방과 결합 조직을 조심스럽게 제거한 다음 대동맥과 경동맥을 분리하고 종방향으로 분리하여 내피를 노출시킵니다. 얼굴 혈관 준비를 할 때 기억해야 할 가장 중요한 것은 내피 세포가 거친 취급에 의해 쉽게 손상된다는 것입니다. 특히 수확 및 세척 단계에서 용기를 늘리지 마십시오.

그런 다음 각 용기를 웰당 0.5밀리리터의 투과율 용액을 포함하는 12웰 플레이트의 개별 웰로 옮깁니다. 실온에서 흔들면서 10분 동안 혈관을 투과시킨 다음 PBS에서 간단히 씻습니다. TTBS에서 계획된 2차 항체와 동일한 종의 10% 정상 혈청에서 30분 배양으로 실온에서 흔들어 비특이적 결합을 차단합니다.

그런 다음 TTBS에 희석된 1차 관심 항체를 하룻밤 동안 10% 정상 혈청으로 표시하고 섭씨 4도에서 흔들립니다. 다음날 아침, 실온에서 흔들면서 TTBS로 10분 동안 3회 세척하여 혈관을 헹구고, TTBS와 10% 정상 혈청으로 희석한 적절한 2차 항체에서 배양합니다. 샘플을 로커에 넣고 빛을 피하기 위해 덮개를 씌우십시오.

실온에서 1시간 동안 흔들며 세척한 후 시연된 대로 새 TTBS로 샘플을 세 번 세척한 다음 PBS에서 간단히 헹구고 용기당 퇴색 방지 시약 한 방울을 개별 22 x 50mm 커버 유리잔에 놓습니다. 현미경으로 내피가 아래를 향하도록 하여 각 시약 방울에 하나의 용기를 넣고 샘플당 22 x 75mm 슬라이드 유리 1개로 혈관을 덮습니다. 슬라이드를 깨끗한 실험실 물티슈에 놓고 실험실용 물티슈 두 개와 3.5kg의 무게로 덮어 혈관을 평평하게 만듭니다.

최대 5분 후 무게를 제거하고 커버 슬립 주변의 여분의 용액을 닦아냅니다. 그런 다음 커버 슬립의 네 모서리에 매니큐어를 바르고 슬라이드 슬립 면이 위로 향하게 하여 슬라이드를 슬라이드 상자에 넣습니다. 다음날 아침에는 매니큐어를 더 사용하여 커버 슬립을 완전히 밀봉하고 매니큐어가 마르는 즉시 혈관을 이미지

여기에서는 항 VE cadherin 및 항 혈관 세포 접착 분자 1 항체로 염색 된 내피 이중의 전형적인 얼굴 면역 형광 이미지와 늑간 동맥 개구부 근처에서 촬영 한 마우스 대동맥의 단일 광학 단면을 보여줍니다. 내피 세포의 부착 접합부에서 녹색 선형 윤곽선 염색과 혈류 교란이 발생하는 것으로 알려진 늑간 동맥 개구부에서 염색되는 강력한 항 혈관 세포 접착 분자에 주목하십시오. 이 이미지에서는 수술 하루 후 부분적으로 결찰된 좌측 경동맥과 대조군 결찰되지 않은 우측 동맥의 안면 염색을 관찰할 수 있으며, 결찰된 혈관에서 명백한 항혈관 세포 접착 분자 1개의 염색이 증가합니다.

이 비디오를 시청한 후에는 부분 좌측 경동맥 결찰을 만드는 방법과 마우스 혈관에 안면 준비를 하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이것을 다른 작은 동물에게 광학적으로 가져 가십시오. en face 제제의 사용은 이제 면역 형광 염색으로 제한되지만, 오리올 염색 후 전체 영역의 연구 또는 생체 외 상대 실험과 같은 다른 방법과 함께 사용할 수도 있습니다.