Name: 마이크로 웰 어레이 플랫폼 내 미생물 공동체 개발의 구성 및 추적 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-06T15:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: 학습하세요 실리콘 마이크로 웰 어레이를 활용한 고처리량 미생물 공동체 분석 방법을. 이 기술은 산업 및 의학 분야에서 미생물 상호작용을 추적하는 데 활용됩니다.

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Microwell 배열은 미국 에너지 부 기본 에너지 과학 사무실의 Nanophase Materials Sciences 사용자 시설 부문 센터에서 제조 및 특성 분석되었습니다. 이 연구에 대한 재정 지원은 Oak Ridge 국립 연구소의 연구 개발 기금을 통해 제공되었습니다. 저자들은 또한이 연구에 사용 된 P. aeruginosa 균주의 공급에 대해 J. Mougous Laboratory (Washington, Seattle, WA)에 감사 드리고자 합니다.

<ol><li>Zhou, J., Deng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochasticity%2C+succession%2C+and+environmental+perturbations+in+a+fluidic+ecosystem%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Stochasticity, succession, and environmental perturbations in a fluidic ecosystem.</a> Proc Natl Acad Sci. 111, E836-E845 (2014).</li>
<li>Valm, A. M., Welch, J. L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems-level+analysis+of+microbial+community+organization+through+combinatorial+labeling+and+spectral+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Systems-level analysis of microbial community organization through combinatorial labeling and spectral imaging.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (10), 4152-4157 (2011).</li>
<li>Satoh, H., Miura, Y., Tsushima, I., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layered+structure+of+bacterial+and+archaeal+communities+and+their+in+situ+activities+in+anaerobic+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Layered structure of bacterial and archaeal communities and their in situ activities in anaerobic granules.</a> Appl Environ Microbiol. 73 (22), 7300-7307 (2007).</li>
<li>Kim, H. J., Boedicker, J. Q., Choi, J. W., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defined+spatial+structure+stabilizes+a+synthetic+multispecies+bacterial+community%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Defined spatial structure stabilizes a synthetic multispecies bacterial community.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105 (47), 18188-18193 (2008).</li>
<li>Nunan, N., Wu, K., Young, I. M., Crawford, J. W., Ritz, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+distribution+of+bacterial+communities+and+their+relationships+with+the+micro-architecture+of+soil%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Ecol%22%5BJournal%5D)">Spatial distribution of bacterial communities and their relationships with the micro-architecture of soil.</a> FEMS Microbiol Ecol. 44, 203-215 (2003).</li>
<li>Grundmann, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+scales+of+soil+bacterial+diversity+-+The+size+of+a+clone%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Ecol%22%5BJournal%5D)">Spatial scales of soil bacterial diversity - The size of a clone.</a> FEMS Microbiol Ecol. 48, 119-127 (2004).</li>
<li>Langenheder, S., Lindstrom, E. S., Tranvik, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+Function+of+Bacterial+Communities+Emerging+from+Different+Sources+under+Identical+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Structure and Function of Bacterial Communities Emerging from Different Sources under Identical Conditions.</a> Appl Environ Microbiol. 72 (1), 212-220 (2006).</li>
<li>Camp, J. G., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+and+Scales+in+Gastrointestinal+Microbial+Ecology%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Patterns and Scales in Gastrointestinal Microbial Ecology.</a> Gastroenterology. 136 (6), 1989-2002 (2009).</li>
<li>Renner, L. D., Weibel, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physicochemical+regulation+of+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22MRS+Bull%22%5BJournal%5D)">Physicochemical regulation of biofilm formation.</a> MRS Bull. 36 (5), 347-355 (2011).</li>
<li>Wessel, A. K., Hmelo, L., Parsek, M. R., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Going+local%3A+technologies+for+exploring+bacterial+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Going local: technologies for exploring bacterial microenvironments.</a> Nat Rev Microbiol. 11 (5), 337-348 (2013).</li>
<li>Stacy, A., McNally, L., Darch, S. E., Brown, S. P., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biogeography+of+polymicrobial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The biogeography of polymicrobial infection.</a> Nat Rev Microbiol. 14 (2), 93-105 (2015).</li>
<li>Hansen, R. R., Shubert, K. R., Morrell-Falvey, J. L., Lokitz, B. S., Doktycz, M. J., Retterer, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microstructured+block+copolymer+surfaces+for+control+of+microbe+adhesion+and+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors%22%5BJournal%5D)">Microstructured block copolymer surfaces for control of microbe adhesion and aggregation.</a> Biosensors. 4 (1), 63-75 (2014).</li>
<li>Hansen, R. R., Hinestrosa, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lectin-functionalized+poly%28glycidyl+methacrylate%29-+block+-poly%28vinyldimethyl+azlactone%29+surface+scaffolds+for+high+avidity+microbial+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Lectin-functionalized poly(glycidyl methacrylate)- block -poly(vinyldimethyl azlactone) surface scaffolds for high avidity microbial capture.</a> Biomacromolecules. 14 (10), 3742-3748 (2013).</li>
<li>Timm, C. M., Hansen, R. R., Doktycz, M. J., Retterer, S. T., Pelletier, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microstencils+to+generate+defined%2C+multi-species+patterns+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Microstencils to generate defined, multi-species patterns of bacteria.</a> Biomicrofluidics. 9 (6), (2015).</li>
<li>Keymer, J. E., Galajda, P., Muldoon, C., Park, S., Austin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+metapopulations+in+nanofabricated+landscapes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Bacterial metapopulations in nanofabricated landscapes.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103 (46), 17290-17295 (2006).</li>
<li>Zhang, Q., Lambert, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acceleration+of+Emergence+of+Bacterial+Antibiotic+Resistance+in+Connected+Microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Acceleration of Emergence of Bacterial Antibiotic Resistance in Connected Microenvironments.</a> Science. 333 (6050), 1764-1767 (2011).</li>
<li>Friedlander, R. S., Vlamakis, H., Kim, P., Khan, M., Kolter, R., Aizenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+flagella+explore+microscale+hummocks+and+hollows+to+increase+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Bacterial flagella explore microscale hummocks and hollows to increase adhesion.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110 (14), 5624-5629 (2013).</li>
<li>Zhou, J., Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+Assembly+Leads+to+Alternative+Communities+with+Distinct+Functions+in+a+Bioreactor+Microbial+Community%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Stochastic Assembly Leads to Alternative Communities with Distinct Functions in a Bioreactor Microbial Community.</a> MBio. 4 (2), 1-8 (2013).</li>
<li>van Vliet, S., Hol, F. J., Weenink, T., Galajda, P., Keymer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+chemical+interactions+and+culture+history+on+the+colonization+of+structured+habitats+by+competing+bacterial+populations%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The effects of chemical interactions and culture history on the colonization of structured habitats by competing bacterial populations.</a> BMC Microbiol. 14 (1), 116(2014).</li>
<li>Niepa, T. H. R., Hou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+Nanoculture+as+an+Artificial+Microniche%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Microbial Nanoculture as an Artificial Microniche.</a> Sci Rep. 6, 30578(2016).</li>
<li>Hansen, R. H., Timm, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+Assembly+of+Bacteria+in+Microwell+Arrays+Reveals+the+Importance+of+Confinement+in+Community+Development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Stochastic Assembly of Bacteria in Microwell Arrays Reveals the Importance of Confinement in Community Development.</a> PLoS ONE. 11 (5), e0155080(2016).</li>
<li>Hood, R. D., Singh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Type+VI+Secretion+System+of+Pseudomonas+aeruginosa+Targets+a+Toxin+to+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">A Type VI Secretion System of Pseudomonas aeruginosa Targets a Toxin to Bacteria.</a> Cell Host Microbe. 7 (1), 25-37 (2010).</li>
<li>LeRoux, M., Ja De Leon,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+single-cell+characterization+of+bacterial+interactions+reveals+type+VI+secretion+is+a+double-edged+sword%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Quantitative single-cell characterization of bacterial interactions reveals type VI secretion is a double-edged sword.</a> Proc Natl Acad Sci. 109 (48), 19804-19809 (2012).</li>
<li>Whitney, J. C., Beck, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+distinct+pathways+guide+effector+export+through+the+type+VI+secretion+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genetically distinct pathways guide effector export through the type VI secretion system.</a> Mol Microbiol. 92 (3), 529-542 (2014).</li>
<li>Warrick, J. W., Timm, A., Swick, A., Yin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+Single-Cell+Kinetic+Analysis+of+Virus-Host+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Tools for Single-Cell Kinetic Analysis of Virus-Host Interactions.</a> PLoS ONE. 11 (1), e0145081(2016).</li>
<li>Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., Van't Riet, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16348228">Modeling of the Bacterial Growth Curve.</a> Appl Environ Microbiol. 56 (6), 1875-1881 (1990).</li>
<li>Halsted, M., Wilmoth, J. L., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/308753041_Development_of_transparent_microwell_arrays_for_optical_monitoring_and_dissection_of_microbial_communities">Development of transparent microwell arrays for optical monitoring and dissection of microbial communities.</a> J Vac Sci Technol B Nanotechnol Microelectron. 34 (6), 06KI03(2016).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

이 기사에서는 박테리아 공동체 개발에 대한 높은 처리량 및 고감도 생체 이미징 기반 분석을 가능하게하도록 설계된 마이크로 웰 어레이 장치 및 실험 프로토콜을 발표했습니다. 여기 시위의 초점은 지역 사회 개발에 접촉 매개 형 VI 형 분비의 효과를 연구하는 것이었지만, 배열은 유연하고 다양한 미생물 군집 및 미생물 - 미생물 상호 작용에 대한 연구를 수용하도록 설계되었습니다. 여기에서의 작업은 구성원의 풍부함과 위치를 쉽게 추적 할 수 있도록 형광성 마커를 구성 적으로 표현하는 박테리아의 사용에만 초점을 맞추고 있습니다. 그러나 화학 환경을 변화시킴으로써 성장 또는 섭동 후에 개별 우물에서 생물학적 물질을 샘플링 할 수있는 기회는 원칙적으로 지역 사회 조성 및 유전자 발현을 확인하는데 사용될 수있다. 각 실리콘 장치는 다양한 웰이있는 마이크로 웰을 포함하는 수십 개의 어레이로 구성됩니다.직경은 2x, 3x 또는 4x 직경 피치로 구성되며 3 &amp; 3.5μm 사이의 깊이로 ...

미생물 군집은 환경의 구조, 세포 사멸, 분열, 단백질 농도, 세포 소기관 수 및 돌연변이와 관련된 확률 적 과정과 같은 결정 론적 요인에 의해 형성된다. 자연 환경에서 이러한 영향이 지역 사회의 구성과 활동에 미치는 영향을 분석하는 것은 거의 불가능합니다. 자연 구조에 의해 가려지고 화학 및 생물학적 환경에 묻혀 지역 공동체 구성원을 확인하고 자연 환경 내에서 시공간적 분포를 해결하는 것은 매우 어렵습니다. 그럼에도 불구하고 최근의 노력은 지역 사회 기능에 대한 공간 조직의 중요성을 강조하고 진행중인 연구 2 , 3 , 4 에서 회원 수와 조직 모두를 설명 할 필요성을 지적했다. 그것( 예 : 토양 구조, 식물 뿌리, 해양 입자 또는 장 미세 덩어리), 산소의 존재 또는 부재, 그리고 미생물의 도입과 같은 화학적 환경 ( 즉 , 영양소와 이차 대사 산물의 이용 가능성) 병원성 종은 모두 미생물 군집의 구성, 구조 및 기능에 영향을 미친다. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . 그럼에도 불구하고 이러한 요소를 포착하는 것을 게을리하는 전통 문화 기술은 계속해서 널리 퍼집니다. 공동체 구성 ( 예 : 공존하는 종의 존재), 물리적 부착, 신호 분자 농도 및 직접 세포 - 세포 접촉은 모두 미생물 군집 형성에 중요한 요소이며 c예방 적 문화 조건. 이러한 특성은 대량 액체 배양 또는 한천 플레이트에서 복제하기가 어렵습니다. 그러나 자연 환경의 주요 물리적 및 화학적 특성을 복제 할 수있는 미세 유체, 미세 패터닝 및 나노 제작 기술을 이용할 수있게 됨으로써 많은 연구자들이 박테리아 공동체를 구축하여 상호 작용을 연구하고 상호 작용을 연구하고 합성 환경을 개발할 수있었습니다. 자연 조건 4 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20을 모방한다. 이 프로토콜은 microwell 배열 장치를 조작하는 방법을 설명하고 th 기능화하는 데 사용할 수있는 자세한 실험 절차를 제공합니다e 웰을 배열하고 박테리아를 단일 종의 식민지와 다중 구성원 공동체로 성장시킬 수 있습니다. 이 연구는 또한 형광 리포터 단백질을 생산하기 위해 변형 된 박테리아가 시간이 지남에 따라 웰 내의 박테리아 성장을 모니터링하는 데 어떻게 사용될 수 있는지를 보여줍니다. 유사한 배열이 이전에 제시되었고 마이크로 웰에서 녹농균 ( Pseudomonas aeruginosa) ( P. aeruginosa) 의 단일 종 콜로니의 성장을 추적하는 것이 가능하다는 것을 보여 주었다. 웰 크기와 파종 밀도를 조절함으로써 초기 접종 조건이 박테리아의 성장 능력에 어떻게 영향을 주는지를 결정하기 위해 수 천 번의 성장 실험의 시작 조건을 병렬로 변화시킬 수 있습니다 21 . 현재 연구는 다중 배열의 동시 비교를 가능하게하고보다 견고한 실험 프로토콜을 사용함으로써 이전 연구를 기반으로하는 마이크로 웰 어레이의 약간 수정 된 버전을 사용합니다. 이 저작물에 사용 된 배열은 여러 개의 하위 배열 또는 배열 ensem을 포함합니다.(직경 2x, 3x 및 4x의 우물 직경)로 배열 된 직경이 15 - 100 μm 인 다양한 크기의 우물을 포함하고 있습니다. 어레이는 실리콘으로 에칭되고, 실리콘 어레이에 시드 된 박테리아의 증식은 매체 주입 아가로 오스 겔로 코팅 된 커버 슬립으로 어레이를 밀봉함으로써 가능해진다. Type Ⅵ 분비 시스템을 연구하기 위해 설계된 P. aeruginosa 돌연변이 체는이 시연에서 사용됩니다. 여기에 제시된 결과는 마이크로 웰 어레이 내에서 다중 구성원 커뮤니티를 분석하는 궁극적 인 목표를 향해 만들어졌으며 연구원은 화학 환경을 제어 및 프로빙하면서 현장 에서 박테리아의 풍부 성과 조직을 모니터링 할 수있었습니다. 이것은 궁극적으로 지역 사회 개발과 승계를 지배하는 &quot;규칙&quot;에 대한 통찰력을 제공해야합니다.

<table><tbody><tr><td>Parylene N</td><td>특수 코팅 시스템</td><td>CAS NO.:1633-22-3</td><td></td></tr><tr><td>Parylene coater</td><td>특수 코팅 시스템</td><td>Labcoter 2 Parylene 증착 장치 PDS2010</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 웨이퍼</td><td>WRS 재료</td><td>100mm 직경, 500-550&mu; m 두께, 프라임, 10-20 저항률, N / Phos< 100>,</td><td></td></tr><tr><td>접착 촉진제</td>, <td>Shin-Etsu, Microsci, MicroPrime</td>, <td>P20, 접착 촉진제</td><td></td></tr>, <tr><td>포지티브 톤 포토레지</td>스트, <td>Rohm and Haas Electronics Materials LLC(Dow 소유)</td><td>Microposit S1818, 포지티브 포토레지스트(코드 10018357)</td><td></td></tr><tr><td>Quintel Contact Aligner</td>, <td>Neutronix, Quintel Corp</td><td>NXQ 7500 마스크 Aligner,</td><td></td></tr><tr><td>반응성 이온 에칭 도구</td><td>, Oxford 악기</td><td>Plasmalab 시스템 100 반응성 이온 에칭기</td><td></td></tr><tr><td>R2A 육수</td><td>TEKnova</td><td>R0005</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>시그마</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>다중 모드 플레이트 리더</td><td>Perkin Elmer</td><td>Enspire, 2300-0000</td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti-U</td><td></td></tr><tr><td>자동 스테이지</td><td>이전</td><td>ProScan III</td><td></td></tr><tr><td>CCD 카메라</td><td>Nikon</td><td>DS-QiMc</td><td></td></tr><tr><td>스테이지 탑 환경 제어 챔버</td><td>In Vivo Scientific</td><td>STEV ECU-HOC</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>25 x 75 mm No. 1.5 coverslip</td><td>Nexterion</td><td>고성능 #1.5H 커버슬립</td><td></td></tr><tr><td>형광 참조 슬라이드</td><td>Ted Pella</td><td>2273</td><td></td></tr><tr><td>물리적 스타일러스 프로필로 KLA</td><td>Tencor</td><td>P-6</td><td></td></tr><tr><td>실험실 와이프</td><td>Kimberly Clark</td><td>Kimipe KIMTECH SCIENCE 브랜드, 34155</td><td></td></tr><tr><td>상용 소프트웨어</td><td>Nikon</td><td>NIS Elements</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss 710 컨포칼 현미경</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>필터 큐브</td><td>니콘</td><td>니콘 FITC (96311), 니콘 텍사스 레드(96313)</td><td></td></tr></tbody></table>

마이크로 웰 어레이 플랫폼 내 미생물 공동체 개발의 구성 및 추적

Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform

미생물 군집의 개발은 공동체 구성원의 공간 분포와 활동을 극적으로 바꿀 수있는 복잡한 결정 론적 요인과 확률 론적 요인의 조합에 달려있다. 우리는 수천 개의 세균 공동체를 신속하게 조립하고 추적하는 데 사용할 수있는 마이크로 웰 어레이 플랫폼을 개발했습니다. 이 프로토콜은 플랫폼의 유용성을 강조하고 플랫폼 내의 배열 앙상블 내에서 간단한 2 인 커뮤니티의 개발을 광학적으로 모니터링하기위한 용도를 설명합니다. 이 시연은 유형 VI 분비 병원성을 연구하기 위해 개발 된 일련의 돌연변이 체의 일부인 Pseudomonas aeruginosa 의 두 가지 돌연변이 체를 사용합니다. mCherry 또는 GFP 유전자의 염색체 삽입물은 각 마이크로 웰 내에서 커뮤니티 구성원의 풍부 성과 위치를 모니터링하는 데 사용할 수있는 별개의 방출 파장을 지닌 형광 단백질의 구성 적 발현을 촉진합니다. 이 프로토콜은 상세한 메토d 어레이의 우물에 박테리아의 혼합물을 조립하고 시간 경과에 따른 각 구성원의 상대적 성장을 측정하기 위해 시간 경과 형광 이미징 및 정량적 이미지 분석을 사용합니다. 마이크로 웰 플랫폼의 파종 및 조립, 어레이 내 미생물 군집의 정량 분석에 필요한 이미징 절차 및 모두 논의 된 미생물 종간의 상호 작용을 밝힐 수있는 방법.

여기에 제시된 실험 플랫폼은 박테리아 공동체에 대한 높은 처리량과 높은 함량의 연구를 위해 고안되었습니다. 이 설계로 인해 다양한 크기의 우물에서 자라는 수천 개의 공동체를 동시에 분석 할 수 있습니다. 이 마이크로 웰 어레이 디자인을 사용하면 초기 종자 밀도, 우물 크기 및 화학적 환경에 대한 최종 커뮤니티 구성의 의존성을 결정할 수 있습니다. 이 작업은 마이크로 웰 어레이에서 2 인 커뮤니티의 성장을 보여주고 커뮤니티 구성 및 조직을 분석하는 방법을 제시합니다. 모델 시스템은 P. aeruginosa의 VI 형 분비를 연구하기 위해 Mougous 실험실에서 설계되었습니다. 이 시스템은 GFP 또는 mCherry 형광 기자를 포함하는 몇 가지 돌연변이 균주로 구성됩니다. 이 작품에서는 2 가지 다른 변형을 사용했습니다. 첫 번째는 GFP로 표...

미생물 군집의 개발은 환경 구조, 구성원의 풍부 성, 형질 및 상호 작용을 포함하는 여러 요소의 조합에 달려있다. 이 프로토콜은 틈새 크기 및 감금과 같은 핵심 요소가 근사 될 수있는 femtoliter 우물에 포함 된 수천 개의 공동체를 동시에 추적하기위한 합성, 미세 제작 환경을 설명합니다.

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial ...

이 방법의 전반적인 목표는 실리콘 마이크로 웰 어레이를 사용하여 제한된 환경 내 다수 구성원의 미생물 군집을 고처리량 병렬 분석하는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 산업, 의학 및 환경 분야에서 중요한, 정밀하게 국소화된 미생물 상호작용을 고처리량의 고병렬 스크리닝으로 분석할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 미세 규모에서 고유하게 나타나는 공간적 제약이 군집 발달의 결정론적 및 확률적 매개변수를 어떻게 유도하는지, 그리고 미생물 구성원의 풍부도와 조직화에 미치는 주요 영향은 무엇인지와 같은 생의학 및 미생물 생태학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.마이크로 웰 어레이를 준비하는 것으로 시작합니다. 먼저, 다이아몬드 스크라이버를 사용하여 여러 개의 어레이가 프린트된 실리콘 웨이퍼에서 개별 마이크로 웰 어레이 칩을 절단합니다. 각 개별 칩은 세 가지 서로 다른 간격 밀도로 5에서 100 µm 범위의 직경을 가진 웰의 서브 어레이를 포함하고 있습니다.각 칩에는 웰의 전체 모티프가 4회 반복되어 있습니다. 다음으로, 피펫 팁 박스와 PBS를 적신 와이프를 사용하여 습윤 챔버를 만듭니다. 그런 다음 각 칩에 BSA 용액 150 microliter 방울을 떨어뜨리고, 칩을 박스 안에서 실온으로 1시간 동안 배양합니다.그동안 박테리아를 준비합니다. 배양액을 원심 분리한 후 2% glycerol이 포함된 500 µL의 신선한 R2A 배지에 재현탁합니다. 그런 다음 600 nm에서 배양액 밀도를 측정하고 농도를 광학 밀도(optical density) 0.02로 조정합니다.칩 배양 후, BSA 용액을 제거하고 PBS로 칩을 3회 세척합니다. 세척 후, 질소 가스로 칩을 건조시키고 가습 챔버로 다시 옮깁니다. 다음으로, 건조된 각 칩에 150 µL의 배양 현탁액을 첨가하고 4 °C에서 1시간 동안 배양하여, 박테리아가 웰에 부착될 시간을 확보하는 동시에 잠재적인 오염균의 세포 분열은 억제합니다.이미징을 위해 칩을 준비하려면, 먼저 각 칩에 사용할 아가로스 코팅 커버슬립을 제작합니다. 소량의 아가로스를 액상화하며, 커버슬립 하나당 약 5 mL가 필요합니다. 그다음, 커버슬립의 한쪽 면을 에탄올로 세척하고, 세척한 면이 위로 향하도록 하여 유리 슬라이드 중앙에 놓습니다.그 다음, 커버슬립의 긴 모서리를 따라 1mm 두께의 PDMS 스페이서 두 개를 배치하고, 커버슬립의 1mm 부분이 슬라이드 밖으로 나오도록 이동시킵니다. 이제 커버슬립이 완전히 덮일 정도로 충분한 양의 아가로스를 붓습니다. 그런 다음 두 번째 유리 슬라이드를 사용하여 아가로스를 균일한 두께로 평평하게 폅니다.이와 같은 슬라이드 어셈블리를 여러 개 병렬로 준비합니다. 아가로스가 응고되기 시작하면 어셈블리를 4°C로 옮깁니다. 15분 동안 냉각시킨 후, 커버 슬립 주변의 과잉 아가로스를 잘라냅니다.그런 다음, 조립체를 페트리 접시에 넣고 4°C에서 보관하십시오. 칩을 박테리아와 함께 배양한 후, 칩을 초순수에 하나씩 10초 동안 담그십시오. 그다음 액체가 대부분 빠질 때까지 젖은 칩을 티슈 위에 세워서 올려두십시오.이제 웰 내부로 가라앉지 않은 박테리아를 제거합니다. 실리콘 칩의 길이와 동일하게 테이프를 잘라 실리콘 위의 파릴렌 코팅 부분에 부착합니다. 그런 다음 테이프를 떼어내어 파릴렌 코팅을 제거하고, 즉시 칩을 뒤집을 준비를 합니다.이제 마이크로웰이 아가로스와 접촉하도록 칩을 슬라이드 어셈블리에 놓으십시오. 아가로스와 접촉한 후에는 칩이 움직이거나 밀리지 않도록 주의해야 합니다. 이제 전체 어셈블리를 스테이지탑 환경 제어 챔버의 슬라이드 홀더로 옮기고, 원하는 간격으로 10배 배율에서 향후 24시간 동안 타임랩스 이미지를 획득하십시오.일반적으로 사용할 수 있는 무료 소프트웨어를 사용하여 이미지 스택을 처리하십시오. 먼저, 이미지 시퀀스를 가져옵니다. 평균화를 위해 보정 이미지 또는 다크 필드 이미지를 로드하십시오.그 다음 배경 감산을 수행합니다. 반지름 값으로 135 pixels와 같은 값을 입력하고 sliding paraboloid를 선택하십시오. 이어서, 두 이미지를 선택하고 subtract 연산을 사용하여 평균 조명 필드 이미지에서 평균 암시야 이미지를 제거합니다.이제 다음과 같이 조명 보정을 적용합니다. 연산(operation)을 divide로 설정하고, i1을 웰 이미지로, i2를 보정 이미지로, k1을 보정 이미지의 평균값으로, k2를 0으로 설정하십시오. 그런 다음 Create New Window를 클릭합니다.마이크로 웰 내의 박테리아 성장을 정량화하려면, 먼저 마이크로 어레이 플러그인을 사용하여 관심 영역을 선택하십시오. 맵 메뉴에서 그리드 재설정(reset grid)을 클릭하고 행, 열 및 웰 직경을 지정합니다. 그런 다음 ROI 모양 메뉴에서 원형(circle)을 선택하십시오.ROI 배열을 이미지에 맞게 조정하려면 ALT 또는 ALT+SHIFT 키를 누른 상태에서 마우스로 왼쪽 상단 ROI를 선택하여 배열을 이동할 수 있습니다. ROI 크기를 변경하려면 Shift 키를 누른 상태에서 ROI 배열의 오른쪽 하단을 선택하십시오. ROI 사이의 간격을 조정하려면 Shift 키를 누른 상태에서 배열의 상단 또는 하단 측면을 드래그하십시오.ROI 어레이가 이미지의 웰에 맞게 배치되면 Measure RT를 클릭하십시오. 그러면 각 이미지 또는 시간점에 대한 모든 측정값이 포함된 표가 출력되며, 이를 분석을 위해 스프레드시트로 복사할 수 있습니다. 두 종류의 Pseudomonas aeruginosa 균주의 성장을 비교하였습니다. 한 균주는 6형 분비 시스템과 관련된 독성 이펙터 단백질을 상시 발현합니다.나머지 하나는 기능 상실로 인해 6형 병원성에 취약합니다. 두 세포 모두 서로 다른 형광 단백질을 발현합니다. 공동 배양은 종단적으로 그리고 다양한 웰 크기에서 연구되었습니다.박테리아를 단독 배양 및 공동 배양하였습니다. 20시간의 성장 과정을 30분 간격으로 촬영하였습니다. 이미지 데이터에 대한 소프트웨어 보정을 수행한 후, 정량적인 성장 궤적을 도식화하였습니다.공동 배양에서 데이터는 성장에 큰 변화가 없음을 시사합니다. 분석을 진행하기 위해, 각 성장 궤적을 최대 신호, 최대 속도 및 지연 시간의 세 가지 매개변수를 가진 수정된 로지스틱 함수에 맞추어 피팅하였습니다. 이 분석은 이들 종의 공동 배양이 전반적인 성장에 미치는 영향이 미미했으며, 성장 곡선에서 나타난 변동성은 환경적 요인으로 인한 것일 가능성이 가장 높음을 시사합니다.숙달되면, 적절하게 수행할 경우 칩 어셈블리 내의 오거 층을 균일하게 형성하기 위해 최종 세포 OD 값을 정확하게 조정할 수 있도록 활발하게 성장하는 세포를 확보하고, 파릴렌 박리 단계에서 주의를 기울이는 것이 중요하며, 전체 설정은 단 몇 시간 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행한 후, 유전 물질 분석을 통해 각 커뮤니티 내의 유전자 발현이 커뮤니티 조성 및 조직의 함수로 어떻게 변화하는지와 같은 질문에 답할 수 있습니다.Pseudomonas aeruginosa를 다루는 것은 잠재적으로 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 장갑, 가운, 고글 착용 및 적절한 무균 조작법과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

온 - 칩 photopolymerization 기술을 사용하여 폴리머 microarray의 형성에 대한 설명입니다. 원자 힘 현미경, 물 접촉 각도 측정, X-선 광전자 분광법 및 비행 차 이온 질량 분광법과 세포 부착 분석 시간을 사용하여 높은 처리량 표면 특성도 설명되어 있습니다.

Biomaterials 높은 처리량 발견을위한 폴리머 Microarrays

세포 기능에 microenvironments의 분자 구성의 영향에 통찰력을 얻기위한 조합 기능 검사 방법을 설명합니다. 방법은 세포 접착 및 기능 분석을 지원하는 정의 조합 microenvironments의 배열을 생성하기 위해 기존의 microarray 기반 기술을 활용합니다.

제조 및 MicroEnvironment의 microArrays의 사용 (MEArrays)

출처: Fattahi, N., et al. 박테리아 스크리닝, 선택 및 분리를 위한 광분해성 하이드로겔 인터페이스. J. Vis. 경험. (2021년)이 비디오는 실리콘 마이크로웰 어레이 내에서 박테리아 콜로니를 분리하기 위해 광분해성 하이드로겔을 사용하는 방법을 보여줍니다. 박테리아 세포는 먼저 마이크로웰에 로드되고 가교 하이드로겔에 캡슐화되고 별개의 콜로니로 배양됩니다. 자외선에 노출되면 하이드로겔의 표적 분해를 통해 개별 콜로니를 선택적으로 추출할 수 있습니다.

마이크로웰 어레이에서 박테리아 콜로니의 광분해성 하이드로겔 기반 분리

출처: Pioli, R., et al., 순차적 모세관 보조 조립을 통한 미생물 및 미립자의 패턴화. J. Vis. 경험. (2021년)이 비디오는 무탄소 현탁액 및 제어된 흐름을 사용하여 미세유체 트랩에서 단일 형광 태그가 지정된 대장균(E. coli) 세포를 캡처한 다음 영양분을 첨가하여 미세 콜로니의 성장 및 형광 이미징을 유발하는 방법을 보여줍니다.

단일 세포 박테리아 성장의 미세유체 패터닝 및 형광 기반 추적

출처: 케이빈, M. T. 외 Bacillus subtilis의 단세포 미세유체 분석. J. Vis. Exp. (2018)이 영상은 단일 세포 수준에서 박테리아 성장을 관찰하기 위해 마이크로플루이딕 장치를 사용하는 방법을 시연합니다. 이 연구는 미세한 도랑 내에 갇힌 비운동성 박테리아 세포가 형광 현미경 아래에서 지속적으로 영양을 공급받고 영상화되는 과정을 보여줍니다. 이 장치는 여러 세대에 걸친 세포 분열 및 계통 추적의 실시간 시각화를 가능하게 합니다.

마이크로플루이딕 시스템에서 단일 세포 해상도로 박테리아 성장 추적

Described는 부착 세포와 미세 구조 기질 사이의 기계적 상호 작용을 정량화하기 위한 프로토콜입니다. 이러한 상호 작용은 이동, 증식, 분화 및 세포사멸을 포함한 필수 세포 행동과 밀접하게 연결되어 있습니다. 이 프로토콜은 MechProfiler라는 오픈 소스 이미지 분석 소프트웨어를 제공하며, 이를 통해 각 마이크로포스트에 관련된 힘을 결정할 수 있습니다.

Micropost 배열에 쉽고 정확한 - 기계 프로파일

여기에서는 고효율 단세포 분리 및 장기 클론 배양을 가능하게 하는 새로운 마이크로웰 설계 개념을 활용하는 미세유체 플랫폼으로 단일 세포를 분리 및 배양하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

높은 처리량 단일 세포의 분리 및 문화를위한 미세 유체 플랫폼

세포 분화를 모두 매트릭스 조성물과 기판의 재료 특성을 포함한 미세 환경 요인의 호스트에 의해 조절된다. 우리는 여기에 세포 분화 및 미세 환경 콘텍스트의 함수로서 생체 역학적 세포 기질 상호 작용 모두를 평가 견인력 현미경과 함께 세포의 마이크로 어레이를 이용하는 방법을 설명한다.

세포 분화 및 견인 힘의 상관 관계 분석을위한 높은 처리량 세포 마이크로 어레이 플랫폼

이 문서에서는 물리와 화학의 높은 처리량 조작 신호 세포 microenvironments vivo에서 흉내 낸 고을 다중화 인공 세포 MicroEnvironment (MACME) 배열 준비 하 상세한 방법론 단일 셀 프로 파일링 인간 만능 줄기 세포 (hPSCs)를 위한 최적의 휴대폰 환경을 식별 합니다.

멀티플렉스 인공 세포 MicroEnvironment 배열의 제작

우리는 미세 유체 플랫폼에서 모세혈관 보조 어셈블리를 사용하여 박테리아 및 콜로이드와 같은 액체에 매달려있는 미세 크기의 물체를 폴리디메틸실록산 기판에 규정 된 배열로 패턴화하는 기술을 제시합니다.

순차모세혈관 보조 어셈블리를 통한 미생물 및 미생물 입자의 패터닝

MBRA(Minibioreactor Array)는 복잡한 미생물 군집의 배양을 가능하게 하는 고처리량, 맞춤형 연속 흐름 배양 시스템으로, 마이크로바이옴 역학, 치료 상호 작용 및 환경 요인에 대한 미생물 반응을 연구하기 위한 병렬 실험을 지원합니다.

Minibioreactor Array(MBRA)의 조립 및 사용을 위한 업데이트된 프로토콜

학습하세요 실리콘 마이크로 웰 어레이를 활용한 고처리량 미생물 공동체 분석 방법을. 이 기술은 산업 및 의학 분야에서 미생물 상호작용을 추적하는 데 활용됩니다.

마이크로 웰 어레이 플랫폼 내 미생물 공동체 개발의 구성 및 추적

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