June 6th, 2017
미생물 군집의 개발은 환경 구조, 구성원의 풍부 성, 형질 및 상호 작용을 포함하는 여러 요소의 조합에 달려있다. 이 프로토콜은 틈새 크기 및 감금과 같은 핵심 요소가 근사 될 수있는 femtoliter 우물에 포함 된 수천 개의 공동체를 동시에 추적하기위한 합성, 미세 제작 환경을 설명합니다.
이 방법의 전반적인 목표는 실리콘 마이크로 웰 어레이를 사용하여 제한된 환경에서 다중 구성원 미생물 군집의 고처리량 병렬 분석입니다. 이 기술의 주요 장점은 산업, 의학 및 환경에 중요한 미세하게 국소화된 미생물 상호 작용에 대한 높은 처리량의 고도의 병렬 스크리닝이 가능하다는 것입니다. 이 방법은 생물의학 및 미생물 생태학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다: 예를 들어 미세한 규모에 내재된 공간적 제약이 어떻게 군집 개발의 결정론적 및 확률론적 매개변수를 주도하는지, 그리고 미생물 구성원의 풍부함과 조직에 대한 주요 영향은 무엇입니까?
마이크로 웰 어레이를 준비하는 것으로 시작합니다. 먼저, 다이아몬드 스크라이브를 사용하여 여러 어레이로 인쇄된 실리콘 웨이퍼에서 개별 마이크로 웰 어레이 칩을 절단합니다. 각 개별 칩에는 세 가지 서로 다른 간격 밀도에서 직경이 5에서 100미크론 사이인 웰의 하위 어레이가 포함되어 있습니다.
각 칩에서 우물의 완전한 모티프도 네 번 반복됩니다. 다음으로, 피펫 팁 상자와 PBS에 적신 물티슈를 사용하여 가습 챔버를 만듭니다. 그런 다음 각 칩에 150마이크로리터의 BSA 용액 방울을 바르고 상자 안의 칩을 실온에서 한 시간 동안 배양합니다.
한편 박테리아를 준비하십시오. 배양액을 스핀다운하고 2% 글리세롤이 함유된 500마이크로리터의 신선한 R2A 배지에 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 600나노미터에서 배양 밀도를 측정하고 농도를 광학 밀도 0.02로 조정합니다.
칩 배양 후 BSA 용액을 제거하고 PBS로 칩을 세 번 헹굽니다. 헹굼 후 칩을 질소 가스로 건조시키고 가습실로 되돌립니다. 다음으로, 각 건조 칩에 150마이크로리터의 배양 현탁액을 추가하고 섭씨 4도에서 한 시간 동안 칩을 배양하여 박테리아가 웰에 부착할 시간을 갖도록 하지만 가능한 오염 물질의 세포 분열은 느립니다.
이미징을 위한 칩을 준비하려면 먼저 각 칩에 대해 아가로스 코팅된 커버를 슬립합니다. 소량의 아가로스를 액화하면 각 커버 슬립에 약 5밀리리터가 필요합니다. 다음으로, 커버 슬립의 한쪽 면을 에탄올로 씻고 세탁한 면이 위로 향하게 하여 유리 슬라이드의 중앙에 놓습니다.
그런 다음 커버 슬립의 긴 가장자리를 따라 1mm 두께의 PDMS 스페이서 2개를 배치하고 커버 슬립을 이동하여 슬라이드에서 1mm가 매달리도록 합니다. 이제 커버 슬립에 아가로스를 충분히 부어 완전히 덮습니다. 그런 다음 두 번째 유리 슬라이드를 사용하여 아가로스를 균일한 두께로 평평하게 만듭니다.
이러한 여러 슬라이드 어셈블리를 병렬로 준비합니다. 아가로스가 응고되기 시작하면 어셈블리를 섭씨 4도로 옮깁니다. 15분 동안 식힌 후 커버 슬립 주변의 여분의 아가로스를 잘라냅니다.
그런 다음 어셈블리를 페트리 접시에 넣고 섭씨 4도에서 보관하십시오. 칩이 박테리아와 함께 배양된 후, 칩을 초순수에 한 번에 하나씩 10초 동안 담그십시오. 그런 다음 대부분의 액체가 배출될 때까지 젖은 칩을 티슈 위의 가장자리에 놓습니다.
이제 우물에 정착하지 않은 박테리아를 제거하십시오. 실리콘 칩 길이만큼 테이프 조각을 자르고 실리콘의 파릴렌 코트에 부착합니다. 그런 다음 테이프를 벗겨내어 파릴렌 코트를 제거하고 즉시 칩을 뒤집을 준비를 합니다.
이제 마이크로 웰이 아가로스와 접촉하도록 칩을 슬라이드 어셈블리에 놓습니다. 아가로스와 접촉한 후 칩을 움직이거나 이동하지 않도록 각별히 주의하십시오. 이제 전체 어셈블리를 스테이지 탑 환경 제어 챔버의 슬라이드 홀더로 옮기고 다음 24시간 동안 원하는 간격으로 10배 배율로 타임랩스 이미지를 획득합니다.
무료로 사용할 수 있는 기존 소프트웨어를 사용하여 이미지 스택을 처리합니다. 먼저 이미지 시퀀스를 가져옵니다. 평균화를 위해 보정 이미지 또는 암시야 이미지를 로드합니다.
그런 다음 배경 빼기를 수행합니다. 135픽셀과 같은 반경 값을 제공하고 슬라이딩 포물면을 선택합니다. 다음으로, 두 이미지를 선택하고 빼기 연산을 사용하여 평균 조명 필드 이미지에서 평균 암시야 이미지를 제거합니다.
이제 다음과 같이 조명 보정을 적용합니다. 작업을 분할로 설정하고, i1을 웰 이미지로, i2를 보정 이미지로, k1을 보정 이미지 평균으로, k2를 0으로 설정합니다. 그런 다음 새 창 만들기를 클릭합니다.
마이크로 웰의 박테리아 성장을 정량화하려면 먼저 마이크로 어레이 플러그인으로 관심 영역을 선택합니다. 맵 메뉴에서 Reset grid를 클릭하고 행, 열 및 웰 지름을 지정합니다. 그런 다음 ROI 모양 메뉴에서 원을 선택합니다.
ROI 배열을 이미지에 맞게 조정하려면 ALT 또는 ALT+SHIFT 키를 누르고 마우스로 왼쪽 상단 ROI를 선택하여 ROI 배열을 이동할 수 있습니다. ROI의 크기를 조정하려면 Shift 키를 누른 상태에서 ROI 배열의 오른쪽 하단을 선택하십시오. ROI 사이의 간격을 조정하려면 Shift 키를 누른 상태에서 배열의 위쪽 또는 아래쪽을 드래그합니다.
ROI 배열이 이미지의 웰에 맞았으면 RT 측정을 클릭합니다. 그런 다음 각 이미지 또는 시점에 대한 모든 측정값이 포함된 테이블이 출력되고 분석을 위해 스프레드시트에 복사할 수 있습니다. 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 두 균주의 성장을 비교하였다. 한 균주는 6형 분비물과 관련된 독성 효과기 단백질을 구성적으로 발현합니다.
다른 하나는 기능 상실로 인해 6형 발병에 취약합니다. 둘 다 다른 형광 단백질을 발현합니다. 공동 배양은 종단적으로 그리고 다른 우물 크기로 연구되었습니다.
박테리아는 개별적으로 배양하고 공동 배양으로 배양했습니다.20시간의 성장은 30분 간격으로 이미지화되었습니다. 이미징 데이터에 대한 소프트웨어 수정을 수행한 후 정량적 성장 궤적을 표시했습니다.
공동 문화에서 데이터는 성장에 큰 변화를 시사하지 않습니다. 분석을 진행하기 위해 각 궤적은 최대 신호, 최대 속도 및 지연 시간의 세 가지 매개변수가 있는 수정된 로지스틱 함수에 맞춰졌습니다. 이 분석은 이러한 종의 공동 배양이 전체 성장에 무시할 수 있는 영향을 미쳤으며 성장 곡선에서 볼 수 있는 변동성은 환경적 요인에 기인할 가능성이 가장 높다는 것을 시사합니다.
일단 마스터하면 설정이 제대로 수행되면 몇 시간 만에 실행할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안에는 최종 셀 OD 값을 적절하게 조정하여 칩 어셈블리에 균일한 오거 층을 갖도록 세포가 견고하게 성장하는 것이 중요하며, 파릴렌 박리 단계에서 주의해야 합니다. 이 절차에 따라 각 군집 내의 유전자 발현이 군집 구성 및 조직의 기능으로서 어떻게 변화하는지와 같은 질문은 유전 물질 분석을 통해 해결할 수 있습니다.
녹농균으로 작업하는 것은 잠재적으로 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 장갑, 재킷, 고글 및 적절한 무균 기술과 같은 예방 조치를 사용해야 한다는 것을 잊지 마십시오.
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이 프로토콜은 실리콘 마이크로 웰 어레이를 사용하여 제한된 환경에서 미생물 군집의 고처리량 분석 방법을 설명합니다. 이는 산업 및 의학을 포함한 다양한 분야에서 중요한 미생물 상호작용을 추적할 수 있게 합니다.
This microwell array platform enables high-throughput parallel analysis of microbial community development in confined environments, supporting mechanistic de-risking in early discovery by quantifying spatial and interaction effects on microbial growth. The method provides predictive confidence in target validation by revealing how fine-scale spatial constraints influence deterministic and stochastic parameters of community dynamics, directly informing translational biomarker and preclinical model relevance. Its scalability and reproducibility support enterprise R&D workflows in antimicrobial target screening and phenotypic screening applications.
The method fits within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, providing quantitative interaction data that informs go/no-go decisions in antimicrobial target programs.