마이크로 웰 어레이 플랫폼 내 미생물 공동체 개발의 구성 및 추적

이 방법의 전반적인 목표는 실리콘 마이크로 웰 어레이를 사용하여 제한된 환경 내 다수 구성원의 미생물 군집을 고처리량 병렬 분석하는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 산업, 의학 및 환경 분야에서 중요한, 정밀하게 국소화된 미생물 상호작용을 고처리량의 고병렬 스크리닝으로 분석할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 미세 규모에서 고유하게 나타나는 공간적 제약이 군집 발달의 결정론적 및 확률적 매개변수를 어떻게 유도하는지, 그리고 미생물 구성원의 풍부도와 조직화에 미치는 주요 영향은 무엇인지와 같은 생의학 및 미생물 생태학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

마이크로 웰 어레이를 준비하는 것으로 시작합니다. 먼저, 다이아몬드 스크라이버를 사용하여 여러 개의 어레이가 프린트된 실리콘 웨이퍼에서 개별 마이크로 웰 어레이 칩을 절단합니다. 각 개별 칩은 세 가지 서로 다른 간격 밀도로 5에서 100 µm 범위의 직경을 가진 웰의 서브 어레이를 포함하고 있습니다.

각 칩에는 웰의 전체 모티프가 4회 반복되어 있습니다. 다음으로, 피펫 팁 박스와 PBS를 적신 와이프를 사용하여 습윤 챔버를 만듭니다. 그런 다음 각 칩에 BSA 용액 150 microliter 방울을 떨어뜨리고, 칩을 박스 안에서 실온으로 1시간 동안 배양합니다.

그동안 박테리아를 준비합니다. 배양액을 원심 분리한 후 2% glycerol이 포함된 500 µL의 신선한 R2A 배지에 재현탁합니다. 그런 다음 600 nm에서 배양액 밀도를 측정하고 농도를 광학 밀도(optical density) 0.02로 조정합니다.

칩 배양 후, BSA 용액을 제거하고 PBS로 칩을 3회 세척합니다. 세척 후, 질소 가스로 칩을 건조시키고 가습 챔버로 다시 옮깁니다. 다음으로, 건조된 각 칩에 150 µL의 배양 현탁액을 첨가하고 4 °C에서 1시간 동안 배양하여, 박테리아가 웰에 부착될 시간을 확보하는 동시에 잠재적인 오염균의 세포 분열은 억제합니다.

이미징을 위해 칩을 준비하려면, 먼저 각 칩에 사용할 아가로스 코팅 커버슬립을 제작합니다. 소량의 아가로스를 액상화하며, 커버슬립 하나당 약 5 mL가 필요합니다. 그다음, 커버슬립의 한쪽 면을 에탄올로 세척하고, 세척한 면이 위로 향하도록 하여 유리 슬라이드 중앙에 놓습니다.

그 다음, 커버슬립의 긴 모서리를 따라 1mm 두께의 PDMS 스페이서 두 개를 배치하고, 커버슬립의 1mm 부분이 슬라이드 밖으로 나오도록 이동시킵니다. 이제 커버슬립이 완전히 덮일 정도로 충분한 양의 아가로스를 붓습니다. 그런 다음 두 번째 유리 슬라이드를 사용하여 아가로스를 균일한 두께로 평평하게 폅니다.

이와 같은 슬라이드 어셈블리를 여러 개 병렬로 준비합니다. 아가로스가 응고되기 시작하면 어셈블리를 4°C로 옮깁니다. 15분 동안 냉각시킨 후, 커버 슬립 주변의 과잉 아가로스를 잘라냅니다.

그런 다음, 조립체를 페트리 접시에 넣고 4°C에서 보관하십시오. 칩을 박테리아와 함께 배양한 후, 칩을 초순수에 하나씩 10초 동안 담그십시오. 그다음 액체가 대부분 빠질 때까지 젖은 칩을 티슈 위에 세워서 올려두십시오.

이제 웰 내부로 가라앉지 않은 박테리아를 제거합니다. 실리콘 칩의 길이와 동일하게 테이프를 잘라 실리콘 위의 파릴렌 코팅 부분에 부착합니다. 그런 다음 테이프를 떼어내어 파릴렌 코팅을 제거하고, 즉시 칩을 뒤집을 준비를 합니다.

이제 마이크로웰이 아가로스와 접촉하도록 칩을 슬라이드 어셈블리에 놓으십시오. 아가로스와 접촉한 후에는 칩이 움직이거나 밀리지 않도록 주의해야 합니다. 이제 전체 어셈블리를 스테이지탑 환경 제어 챔버의 슬라이드 홀더로 옮기고, 원하는 간격으로 10배 배율에서 향후 24시간 동안 타임랩스 이미지를 획득하십시오.

일반적으로 사용할 수 있는 무료 소프트웨어를 사용하여 이미지 스택을 처리하십시오. 먼저, 이미지 시퀀스를 가져옵니다. 평균화를 위해 보정 이미지 또는 다크 필드 이미지를 로드하십시오.

그 다음 배경 감산을 수행합니다. 반지름 값으로 135 pixels와 같은 값을 입력하고 sliding paraboloid를 선택하십시오. 이어서, 두 이미지를 선택하고 subtract 연산을 사용하여 평균 조명 필드 이미지에서 평균 암시야 이미지를 제거합니다.

이제 다음과 같이 조명 보정을 적용합니다. 연산(operation)을 divide로 설정하고, i1을 웰 이미지로, i2를 보정 이미지로, k1을 보정 이미지의 평균값으로, k2를 0으로 설정하십시오. 그런 다음 Create New Window를 클릭합니다.

마이크로 웰 내의 박테리아 성장을 정량화하려면, 먼저 마이크로 어레이 플러그인을 사용하여 관심 영역을 선택하십시오. 맵 메뉴에서 그리드 재설정(reset grid)을 클릭하고 행, 열 및 웰 직경을 지정합니다. 그런 다음 ROI 모양 메뉴에서 원형(circle)을 선택하십시오.

ROI 배열을 이미지에 맞게 조정하려면 ALT 또는 ALT+SHIFT 키를 누른 상태에서 마우스로 왼쪽 상단 ROI를 선택하여 배열을 이동할 수 있습니다. ROI 크기를 변경하려면 Shift 키를 누른 상태에서 ROI 배열의 오른쪽 하단을 선택하십시오. ROI 사이의 간격을 조정하려면 Shift 키를 누른 상태에서 배열의 상단 또는 하단 측면을 드래그하십시오.

ROI 어레이가 이미지의 웰에 맞게 배치되면 Measure RT를 클릭하십시오. 그러면 각 이미지 또는 시간점에 대한 모든 측정값이 포함된 표가 출력되며, 이를 분석을 위해 스프레드시트로 복사할 수 있습니다. 두 종류의 Pseudomonas aeruginosa 균주의 성장을 비교하였습니다. 한 균주는 6형 분비 시스템과 관련된 독성 이펙터 단백질을 상시 발현합니다.

나머지 하나는 기능 상실로 인해 6형 병원성에 취약합니다. 두 세포 모두 서로 다른 형광 단백질을 발현합니다. 공동 배양은 종단적으로 그리고 다양한 웰 크기에서 연구되었습니다.

박테리아를 단독 배양 및 공동 배양하였습니다. 20시간의 성장 과정을 30분 간격으로 촬영하였습니다. 이미지 데이터에 대한 소프트웨어 보정을 수행한 후, 정량적인 성장 궤적을 도식화하였습니다.

공동 배양에서 데이터는 성장에 큰 변화가 없음을 시사합니다. 분석을 진행하기 위해, 각 성장 궤적을 최대 신호, 최대 속도 및 지연 시간의 세 가지 매개변수를 가진 수정된 로지스틱 함수에 맞추어 피팅하였습니다. 이 분석은 이들 종의 공동 배양이 전반적인 성장에 미치는 영향이 미미했으며, 성장 곡선에서 나타난 변동성은 환경적 요인으로 인한 것일 가능성이 가장 높음을 시사합니다.

숙달되면, 적절하게 수행할 경우 칩 어셈블리 내의 오거 층을 균일하게 형성하기 위해 최종 세포 OD 값을 정확하게 조정할 수 있도록 활발하게 성장하는 세포를 확보하고, 파릴렌 박리 단계에서 주의를 기울이는 것이 중요하며, 전체 설정은 단 몇 시간 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행한 후, 유전 물질 분석을 통해 각 커뮤니티 내의 유전자 발현이 커뮤니티 조성 및 조직의 함수로 어떻게 변화하는지와 같은 질문에 답할 수 있습니다.

Pseudomonas aeruginosa를 다루는 것은 잠재적으로 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 장갑, 가운, 고글 착용 및 적절한 무균 조작법과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.