Name: 인산화 부위 결정을위한 올리고 펩타이드 경쟁 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 배우세요 올리고 펩타이드 경쟁 키나아제 분석법을 활용하여 인산화 부위를 선별하고 검증하는 방법을. 이 기법은 생화학 및 세포생물학 연구에서 비용 효율적인 예비 스크리닝을 가능하게 합니다.

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이 연구는 한국 정부가 후원하는 한국 연구 재단 (National Research Foundation for Korea) (No. 2015R1A2A1A10052663 및 No. 2014M1A3A3A02034698)의 지원을 받았다.

1. 안전 주의 :이 프로토콜은 [γ- 32 P] -ATP를 사용하여 AMPK의 활성을 평가합니다. Phosphorus-32는 방사성 동위 원소로 주로 베타 방사선을 방출합니다. 베타 입자의 크기가 매우 작기 때문에 쉽게 의류와 피부에 침투 할 수 있습니다. 베타 방사선에 대한 외부 및 내부 노출은 피부 화상과 조직 손상을 유발하는 것을 포함하여 인체 건강에 해로울 수 있습니다. <ol><li> 아크릴 차폐와 같은 적절한 보호 장치를 사용하여 [γ- 32 P] -ATP를 사용해야하는 모든 단계를 수행하십시오. </li><li> 모든 작업자가 모든 절차에서 유해한 방사선에 노출되는 정도를 모니터링하기 위해 전자 개인 선량계 (EPD)를 갖추고 있는지 확인하십시오. </li><li> 적절한 교육 및 규제 승인을받은 후에 만 ​​오픈 소스 방사선을 다루십시오. 참고 : 여기에서 모든 실험은 서울 대학교에서 오픈 소스 방사선 사용 교육을 마친 후에 수행되었습니다.한국 정부의 승인 및 승인 (nssc.go.kr/nssc/en). </li><li> 지역 규정에 따라 방사성 폐기물을 폐기하십시오. 참고 : 여기서는 서울 대학교 환경 안전 안전 연구소의 지침을 따랐습니다. 다음은 미국 및 유럽 국가의 규제 기관 목록입니다 : 미국, 미국 원자력 규제위원회 (http://www.nrc.gov/); 영국, 건강 및 안전 집행부 (HSE) (http://www.hse.gov.uk); 프랑스, Autorité de sûreté nucléaire (https://www.asn.fr/); 독일, 연방 환경부, 자연 보전, 건물 및 핵 안전국 (BMU) (http://www.bmu.de). </li></ol> 2. 생체 외 경쟁적 키니 아제 분석법 <ol><li> 경쟁 펩타이드의 구축 <ol><li> AMPK에 의해 인산화 된 컨센서스 모티프를 결정합니다. 참고 : AMPK는 컨센서스 모티프,- [X, β] -XX-Ser / Thr-XXX-Φ이다. 컨센서스 순서에서 Φ는 소수성 아미노산 (valine [V], leucine [L], methionine [M], isoleucine [I])을 나타내며 β는 염기성 아미노산 ( 즉 라이신 [K], 아르기닌 [ R] 및 히스티딘 [H]) 1 . </li><li> 상기 컨센서스 모티프에 따라 표적 서열로부터 세린 또는 트레오닌 잔기를 선택한다. 인간 Nrf2 (Ser153을 포함하는 # 1, 148-157; Ser335를 포함하는 # 2, 330-339 및 Ser558을 포함하는 # 3, 553-562)의 3 개의 추정 사이트를 사용한다. </li><li> 추정 사이트를 모방 한 10 잔기의 펩타이드를 상업적으로 합성합니다. 합성 된 생성물을 각 펩티드에 대해 98 % 이상의 순도를 갖는 동결 건조 된 분말로서 수득한다. </li><li> 키나제 완충액을 사용하여 펩타이드를 용해시켜 71.667 g / L의 농도를 얻습니다. 펩타이드가 키나아제 완충액에 용해되지 않으면 20 % DMSO에 용해시킵니다. 그것이 불용성으로 남아 있다면, 펩티드를 모방 한 펩티드활성 부위가 용해도를 증가시키기 위해 확장 될 수있다. </li></ol></li></ol><ol start="2"><li> 생체 외 경쟁 AMPK 키나아제 분석법 <ol><li> 다음과 같이 5 × 키나아제 버퍼를 준비 : 100 MM HEPES, 산도 7.4; 25 mM MgCl2; 5 mM EGTA; 5 mM DTT; 125 mM β- 글리세로 포스페이트 (세린 / 트레오닌 포스파타제 억제제); 5 mM Na3 VO4 (티로신 포스 파타 아제 억제제); 0.5 % (v / v) 프로테아제 저해제 칵테일 세트 III, 1 mM 차가운 ATP; 및 500 μM AMP. 참고 : AMP는 AMPK 활동을 시험하기 위해 키나제 완충제의 필수 구성 요소입니다. 상기 완충액은 세린 / 트레오닌 키나아제 및 티로신 키나아제의 활성을 측정하는데 사용될 수있다. </li><li> 얼음에서 다음의 재조합 단백질과 합성 펩타이드를 녹입니다 : AMPK; Nrf2; 올리고 펩타이드 # 1, # 2 및 # 3을 포함한다. </li><li> 얼음에 반응 완충액을 준비하십시오 : AMPK 0.15 μg, Nrf2 (~ 4 pmol) 0.4 μg, 올리고 펩티드 (~ 300 nmol) 0.43 mg, 5 x 키나아제 완충액 6 μL. 에이멸균 증류수 (DW)로 최종 부피를 30 μL로 맞 춥니 다. 참고 : 반응 완충액을 준비한 후 [γ- 32 P] -ATP를 첨가하면 키나제자가 인산화로 인한 방사성 신호가 감소 될 수 있습니다. </li></ol></li><li> 반응물 실행하기 참고 : 아래의 모든 공정은 아크릴 보호막, 랙 또는 블록뿐만 아니라 적절한 개인 보호 장비로 보호해야합니다. <ol><li> 실험을 시작하기 전에 가열 블록을 30 ° C로 설정하십시오. </li><li> 얼음 상에 반응 튜브에 [γ- 32 P] -ATP (1 μCi) 1 μL를 넣는다. 여러 번 위아래로 pipetting하여 반응 버퍼를 섞는다. 참고 : 32 P의 방사능은 약 14 일의 짧은 반감기를 갖는다. 반감기를 고려하여 부피를 조절하십시오 ( 예 : [γ- 32 P] -ATP의 생산으로부터 한 달 후 [γ- 32 P] -ATP 4 μL 첨가)-ATP로 1 μCi). </li><li> 샘플을 가열 블록에서 30 ° C로 15-30 분 동안 품어 낸다. 이 단계에서 7.5 % sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) 겔을 준비하십시오. 표적 단백질의 크기에 따라 겔의 비율을 조정하십시오. </li><li> 10 % SDS 샘플 버퍼 (10 % (V / V) 글리세롤, 20 % (W / V) SDS, 15.42 % (W / V) 디티 오 트레이 톨, 90 % (V / V) 0.5 M 트리스 -HCl (pH 6.8), 및 0.02 % (w / v) 브로 모 페놀 블루). 여러 번 위아래로 pipetting하여 반응 버퍼를 섞는다. </li><li> 샘플을 7.5 % SDS-PAGE 겔에서 70V에서 20 분간, 140V에서 1 시간 동안 연속적으로 시험한다. 참고 : 겔의 끝에있는 브로 모 페놀 블루 라인은 매우 높은 방사성 신호를 포함합니다. 배경 신호를 줄이기 위해 다음 단계로 진행하기 전에 파란색 선 아래 젤을 제거하는 것이 좋습니다. </li><li> SDS-PAGE 후 캐스터에서 젤을 부드럽게 제거하십시오. 젤을 유리에 넣으십시오.다음 단계를 위해 ube. </li><li> 고정 버퍼와 20 분 (50 % 메탄올과 10 % 빙하 아세트산)에 대한 젤을 고정. </li><li> 부드럽게 젤을 여과지 위로 옮기고 투명한 포장지로 덮으십시오. 이 단계에서 젤이 쉽게 찢어 질 수 있습니다. 진공 젤 건조기로 80 ℃에서 1 시간 동안 겔을 건조시킨다. </li></ol></li><li> 심상 <ol><li> 형광체 화면이나 X- 선 필름에 밤새 젤을 노출 시키십시오 (대개 약 16 시간 동안). 참고 : 형광체 화면은 매우 밝은 빛에 노출 된 후 다시 사용할 수 있습니다. X- 레이 필름을 사용하는 경우 젤을 2 일 동안 노출 시키십시오. X 선 필름은 형광체 스크린보다 낮은 감도를 가지고 있습니다. </li><li> 형광체 이미 저로 형광체 화면을 스캔하십시오. 이미지를 고해상도 TIFF 또는 비트 맵 파일로 내 보냅니다. </li><li> 시각화 후 젤을 유리 또는 플라스틱 용기에 옮겨 쿠마시 브릴리언트 블루 (CBB) 염색을하십시오. </li><li> DW로 젤을 씻으십시오. DW를 버리고 th를 그어라.e 겔을 염색 시약과 1 시간 동안 섞는다. </li><li> 시약을 버리고 DW로 1 시간 또는 밤새 겔을 처치하십시오. 사무실 스캐너로 스캔하려면 투명 플라스틱 필름 (또는 동등한 것) 사이에 젤을 놓습니다. </li></ol></li></ol> 3. 사이트 특정 돌연변이를 사용 하여 체외 키나아제 분석 <ol><li> pGEX-Nrf2의 부위 유도 돌연변이 유발 <ol><li> 돌연변이 유발 프라이머 디자인 참고 : 적절한 돌연변이 유발 프라이머를 설계하는 것은 돌연변이 유발의 성공적인 결과에 중요합니다. 다음은 돌연변이 유발 프라이머를 설계하기위한 몇 가지 고려 사항입니다. 프라이머 중간에 원하는 돌연변이와 25 ~ 45 염기로 구성된 프라이머를 만듭니다. 프라이머는 40-60 % GC 함량을 가져야하며 하나 이상의 G 또는 C 염기로 종결되어야합니다. 프라이머의 Tm이 [Tm = 81.5 + 0.41 (% GC) - (675 / 염기 길이) - % 불일치]에 따라 78 ° C 이상인지 확인하십시오. 참고 :프라이머는 그 순도가 돌연변이 효율에 중요하기 때문이다. 돌연변이 유발 프라이머를 디자인하기위한 몇 가지 웹 사이트가 있습니다. <ol><li> &quot;사이트 지정 돌연변이 유발을위한 프라이머 디자인&quot;(http://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp)을위한 프라이머 디자인 프로그램을 엽니 다. </li><li> 인간 Nrf2 DNA 서열 (Access No. NM_006164.4)을 붙이고 &quot;번역 된 번역 업로드&quot;버튼을 선택하십시오. </li><li> 알라닌으로 변환 될 번역 된 아미노산 서열로부터의 세린 558 잔기를 선택한다. 돌연변이 유발 프라이머를 사용하여 알라닌에 대해 agc에서 gcc까지의 세린을 코돈으로 대체하십시오. </li><li> 프라이머 길이, Tm 및 GC 함량을 고려하십시오. 참고 : 돌연변이 유발 프라이머는 최종적으로 5&#39;-ctactgaaaaaacaactc gccaccttatatctcgaag-3 &#39;로 설계됩니다. </li></ol></li><li> 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)을 이용한 돌 연변이 합성 반응 <ol><li> 얼음에 PCR 반응 혼합물을 준비하십시오 : 10X 반응 완충액, 50ngpGEX-GST-Nrf2, 정방향 프라이머 125 ng, 리버스 프라이머 125 ng, dNTP 믹스 (각각 10 mM) 1 μL, Pfu DNA 폴리머 라 아제 2.5 U 및 멸균 DW를 50 μL로 첨가 하였다. </li><li> 다음 순환 프로그램으로 pGEX-GST-Nrf2 돌연변이 가닥 합성을위한 PCR을 실행하십시오 : 95 ℃에서 30 초 동안 1 사이클; 95 ℃에서 30 초, 55 ℃에서 1 분, 및 68 ℃에서 90 초의 18 사이클; 68 ℃에서 5 분 동안 1 사이클. 참고 : 플라스미드 길이에 따라 순환 매개 변수가 변경 될 수 있습니다. </li><li> 다음 단계를 위해 반응물을 식히기 위해 2 분 동안 얼음 위에 놓습니다. 또는 4 ° C에서 밤새 보관하십시오. </li></ol></li><li> Dpn I 소화 및 변이 형 플라스미드의 선택 <ol><li> Dpn I 제한 효소 (10 U / μL) 1 μL를 냉각 후 반응물 각각에 첨가한다. 피펫 팅하고 1 분간 원심 분리하여 철저히 섞는다. </li><li> 37 ℃에서 2 시간 동안 배양하여 부모를 소화시킨다 pGEX-GST-Nrf2 double-가닥 DNA. </li><li> DH5 α supercompetent 세포를 얼음 위에서 부드럽게 녹입니다. </li><li> 미리 냉각 DH5 α supercompetent 세포 150 μL에 반응물 50 μL를 추가하고 적어도 30 분 동안 얼음에 품어. </li><li> 42 ° C로 예열 된 가열 블록에 튜브를 옮기고 90 초 동안 그대로 두십시오. 그들을 얼음에 2 분 동안 놓습니다. </li><li> 형질 전환 된 DH5α 세포에 예열 된 용 영돈 배양액 (LB)을 첨가하고 180 rpm으로 흔들어 주면서 37 ° C에서 1 시간 동안 배양한다. </li><li> LB - 암피실린 한천 플레이트에 변형 세포를 퍼 뜨리고 37 ° C에서 밤새 품어. 참고 : 플라스미드 GEX-GST-Nrf2는 암피실린 내성 마커를 가지고 있기 때문에 암피실린은 선택에 사용됩니다. mutagenized 플라스미드의 저항 마커에 따라 적절한 항생제를 사용하십시오. </li><li> 접시에서 단일 식민지를 선택, 5 ML의 LB - 암피실린에 전송하고, 180 rpm으로 떨고와 함께 37에서 하룻밤 그것을 품어.돌연변이 유발 서열의 확인을 위해 적어도 세 개의 콜로니를 평가하십시오. </li><li> DNA 서열 분석을 위해 DNA miniprep kit를 사용하여 DNA를 추출합니다. 제조업체의 프로토콜을 따르십시오. </li><li> 제조자의 프로토콜에 따라 자동 DNA 서열 분석기를 사용하여 돌연변이 유발 DNA 서열을 확인한다. 돌연변이 체 시퀀스의 확인을 위해 최소한 200 ng의 DNA 구조체를 사용하십시오. </li></ol></li></ol></li><li> 재조합 GST-Nrf2 단백질의 정제 <ol><li> 대장균에서 돌연변이 유발 GST-Nrf2 융합 단백질의 발현 <ol><li> mutagenic pGEX-GST-Nrf2 플라스미드를 BL21 세포로 형질 전환시킨다. 암피실린 (100 μg / ML)가 들어있는 LB 배지 25 mL에 단일 식민지를 접종하고 밤새 37 ℃에서 배양하십시오. </li><li> 배양 된 세포를 1 : 100 희석 비율로 암피실린 (100 μg / mL)을 함유 한 LB 브로 쓰 100 mL에 접종한다. </li><li> 37 ℃에서 배양하십시오.또는 600 nm에서 흡광도가 0.4-0.8 (약 4 시간)에 도달 할 때까지. </li><li> 1 MM IPTG의 최종 농도를 준비하기 위해 100 ML의 배양 세포에 1 M IPTG 100 μL를 추가합니다. </li><li> 단백질을 발현시키기 위해 6 시간 동안 또는 밤새 로테 리터에서 30 ° C로 세포를 인큐하십시오. </li><li> 20 분 동안 5,000 xg에서 세포를 원심 분리하고 세균 용해 버퍼 (25 MM HEPES, 5 MM EDTA, 2 MM DTT, 0.1 % CHAPS, 1 μg / ML pepstatin, 0.5 μg / ML leupeptin의 1 ML로 세포 알약을 resuspend, 및 1 mM PMSF)를 첨가 하였다. </li><li> 최대 전력 출력의 50 %에서 2 분 간격으로 초음파 호 모지 나이저를 사용하여 세포 펠릿을 녹입니다. </li><li> 4 분 15 분 12,000 × g에서 세포를 원심 분리기와 뜨는를 수집합니다. </li></ol></li><li> 재조합 GST-Nrf2 단백질의 정제 <ol><li> 50 % (V / V) 글루타티온 - 아가로 오스 비즈 200 μL를 준비하고 1 ML PBS (산도 7.3; 140 MM NaCl, 2.7 MM KCl, 10 MM Na 2 </sub&gt; HPO 4 및 1.8 mM KH 2 PO 4 ). 500 × g에서 1 분간 원심 분리하여 비드를 수집합니다. 세 번 씻으십시오. </li><li> 50 % (브이 / 브이) 글루타티온 - 아가로 오스 구슬의 준비 200 μL에 세포 lysate를 추가하고 4에서 품어 ° C 2 H를위한 끝 오버 회전 장치. </li><li> 500 xg에서 1 분간 원심 분리하여 GST-Nrf2 단백질과 결합 된 glutathione-agarose beads를 수집합니다. 31G 바늘과 1 ML 주사기를 사용하여 뜨는을 제거합니다. </li><li> 1 단계에서와 같이 구슬을 PBS (산도 7.3) 1 ML로 씻으십시오. </li><li> GST - Nrf2와 결합 glutathione - 아가로 오스 구슬에 용리 버퍼 (50 MM 트리스 - HCl 및 10 MM 감소 글루타티온, 산도 8.0) 500 μL를 추가합니다. 30 분 동안 끝 오버 로테이터에서 4 ° C로 품어 낸다. </li><li> 1 분 500 XG에서 원심 분리기 및 뜨는를 수집합니다. </li><li> 다시 구슬에 용리 버퍼 300 μL를 추가하고 3.2.2.5-3.2.2.6 단계를 두 번 반복하십시오. </li></ol></li><li> 정제 된 GST-Nrf2 단백질의 확인 <ol><li> 표준 단백질 BSA 0.5 μg로 단백질 양의 시각화를 위해 시료 5 μL를 준비하십시오. </li><li> 샘플을 7.5 % SDS-PAGE 겔에서 70V에서 20 분간,이어서 140V에서 60 분간 실시한다. </li><li> 겔을 2 시간 동안 0.1 % CBB 염색 용액 (CBB R250 0.1g, 99 % 메탄올 40mL, 빙초산 10mL 및 증류수 50mL)로 염색하고 탈염시킨다 (메탄올 30mL, 10 mL의 빙초산, 60 mL의 증류수)로 뚜껑을 덮는다. </li><li> destained 젤을 필터 용지에 놓고 투명한 래퍼로 덮습니다. 진공 젤 건조기로 80 ℃에서 1 시간 동안 겔을 건조시킨다. </li><li> 시험 관내 AMPK 키나아제 분석을 위해 농도계로 돌연변이 GST-Nrf2 단백질의 양을 결정하십시오. </li></ol></li></ol></li><li> 사이트 특이 돌연변이 체를 이용한 In Vitro AMPK Activity Assay 아니E : 시험 관내 AMPK 키나아제 분석은 정제 된 야생형 GST-Nrf2 또는 펩타이드 억제제가없는 GST-Nrf2-S558A 돌연변이 체 0.4 μg을 사용하여 단계 2.2 내지 2.4에 따라 수행 하였다. 1 단계에서 설명한 모든 방사선 안전 지침을 따르십시오. <ol><li> 0.15 μg의 AMPK, 0.4 μg의 돌연변이 체 또는 야생형 GST-Nrf2 및 5 개의 키나아제 완충액 6 μL로 얼음 상에 반응 완충액을 준비한다. 멸균 DW로 최대 30 μL를 채 웁니다. </li><li> 얼음 위에서 반응 튜브에 [γ- 32 P] -ATP (1 μCi / μL) 1 μL를 넣는다. 여러 번 위아래로 pipetting하여 반응 버퍼를 혼합하고 원심 분리기. </li><li> 30 분 30 ° C 가열 블록에서 샘플을 품어. </li><li> 10 × SDS 샘플 버퍼 3 μL를 추가하여 키나아제 반응을 중지하십시오. </li><li> 70 % V에서 20 분 동안 7.5 % SDS-PAGE 젤에서 실행하고 1 시간 동안 140V에서 실행하십시오. </li><li> 고정 버퍼와 겔을 20 분간 고정하고, 여과지 위로 옮기고, 투명 젤로 덮는다.ent 포장지. </li><li> 진공 젤 건조기로 80 ° C에서 1 시간 동안 젤을 건조시킨 다음 형광 막 또는 X 선 필름에 밤새 노출시킵니다. </li><li> 형광 물질 이미 저로 형광체 화면을 스캔하고 2.4 단계에 따라 시각화 후 CBB 염색을위한 유리 튜브로 젤을 이동합니다. </li></ol></li></ol>

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AMPK에 의해 매개되는 예측 된 인산화 부위의 신뢰성을 평가할 수있는 간단하고 편리한 방법으로 경쟁 펩타이드를 사용하여 특정 인산화 부위를 발견하고 부위 특이 적 돌연변이 체를 사용하여이를 검증 할 수있는 in vitro 키나아제 분석 에 대해 설명합니다 . 시험관 내 경쟁 AMPK 활성 분석 에서 얻은 대표적인 데이터는 펩타이드 경쟁 분석이 인산화 부위를 결정하는 유용한 도구임을 나타내는 사이트 지정 돌연변이 단백질을 사용하여 분석의 결과와 일치. 이 방법은 세린 40 3 에서 Nrf2를 인산화시키는 PKCδ에 의해 인산화 된 특정 부위를 확인하는 연구에서도 사용되었다. 펩타이드는 단백질과 경쟁적으로 결합하기 때문에이 원리는 결합 모티프 10 , 11 을 확인하기위한 시험관 내 GST 풀다운 분석에...

특정 잔기에서의 단백질 인산화는 광범위한 세포 과정에서 중요한 역할을합니다. 따라서, 신호 전달 네트워크의 이해는 특정 인산화 부위의 확인을 필요로한다. 또한, 인산화 부위는 단백질 내의 개별 도메인이 상이한 구조 및 기능을 보유하기 때문에 단백질 기능에 대한 효과를 결정한다. 주요 항산화 인자 인 핵 인자 적혈구 2 관련 인자 2 (Nrf2)의 활성은 다른 부위의 인산화를 통해 양방향으로 조절된다. 우리의 연구는 Nrf2의 인산화를 촉매하는 키나아제에 초점을 맞추었다. 산화 적 공격에 대한 Nrf2의 스트레스 반응은 주로 세린 40에서의 인산화와 Nrf2를 활성화시키는 protein kinase C (PKC) -δ를 통해 빠르게 일어난다. 반대로, Fyn은 티로신 5에서 Nrf2의 억제 성 인산화를 촉매한다활동의 긴밀한 통제를 위해 68. 인산화 부위를 발견하는 데 가장 일반적으로 사용되는 방법은 액체 크로마토 그래피 / 질량 분석 (LC / MS) 분석입니다. 신속하고 매우 민감한 인산화 부위 맵핑 데이터는 이러한 방식으로 생성 될 수있다. 그러나 몇 가지 기술적 인 한계가 있으며 가끔 잘못된 신호를 생성합니다. 열악한 서열 범위는 종종 LC / MS 분석에서 발생합니다. 인산화 부위를 확인하기 위해서는 단백질의 최대 아미노산 범위에 대한 정보가 필요합니다 6 . 소화 단계에서 여러 단백질 분해 효소로 단백질을 단백질 분해하면 서열 범위를 개선하는 데 도움이 될 수 있습니다. 인산화 잔기의 확인에 대한 또 다른 장애는 세린 및 트레오닌 인산화 된 펩타이드 6 , 7에서 자주 관찰되는 인산의 손 상 손실입니다. 불안정한 인산염 잔기는 종종단편화 과정에서 인산 펩타이드로부터 방출된다. 인산화 부위를 검색 할 때 두 번째 옵션은 펩타이드 마이크로 어레이 방법을 사용하는 것입니다. 목적 단백질로부터 유래 된 펩티드 단편을 함유하는 마이크로 어레이 칩을 사용하여 키나아제 표적 부위를 스크리닝하는 것이 가능하다. 그러나, 마이크로 어레이 칩의 생산 및 검출을위한 장비 요건으로 인해, 펩타이드 마이크로 어레이 방법은 시간 소모적이고 고비용으로 고려된다. 이러한 과제를 극복하기 위해, 시험 관내 올리고 펩티드 - 경쟁 키나아제 분석은 공지 된 인식 모티프를 갖는 단백질 키나아제에 사용될 수있다. 키나아제의 공통 인식 모티프가 확립되면, 후보 기질의 추정 인산화 부위가 예측 될 수 있고, 그 부위의 진위가 확인 될 수있다. 이 과정에서 가장 설득력있는 방법은 돌연변이 단백질에서 인산화의 폐지를 보여주는 것이다.d 잔기는 비 - 인산화 가능한 아미노산 ( 즉, 세린 또는 트레오닌 내지 알라닌; 티로신 내지 페닐알라닌)으로 치환된다. 그러나, 돌연변이 단백질의 생산 및 분리는 시간 소모적이다. 연구 초기 단계의 대안으로 경쟁 펩타이드 키나아제 분석은 간단하고 편리합니다. 여기, 우리 는 체외 펩티드 경쟁 분석 및 인산화 사이트의 검증을위한 프로토콜을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>208337</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-글리세로인산</td>염 <td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>Na3VO4<</td><td>/sub> Aldrich, St. Louis, MO</td><td>450243</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일</td><td>Calbiochem, Nottingham, UK</td><td>539134</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>AMP</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A1752</td><td></td></tr><tr><td></td><td>AMPK Upstate Biotechnology, 호수 Placid, NY</td><td>14-840</td><td></td></tr><tr><td>Nrf2 (WT)</td><td>Abnova, Taipei City, Taiwan</td><td>H00004780-P01</td><td></td></tr><tr><td>[&gamma;-32P]-ATP</td><td>PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA</td><td>NEG502A</td><td></td></tr><tr><td>EZblue 염색 시약</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>G1041</td><td></td></tr><tr><td>Pfu 터보 DNA 중합효소</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, CA</td><td>600250</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, CA</td><td>200415-51</td><td>다중 해동 및 동결 주기 피하기</td></tr><tr><td>DpnI</td><td>New England Biolabs, Ipswich, MA</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>LB broth</td><td>Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Netherlands</td><td>L1704</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Affymetrix, Santa Clara, CA</td><td>11259</td><td></td></tr><tr><td>Agarose LE</td><td>iNtRON Biotechnology, Sungnam, South</td><td>Korea 32034</td><td></td></tr><tr><td>HiYield Plus Gel/PCR Mini Kit</td><td>Real Biotech Corporation, Taipei, Taiwan</td><td>QDF100</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td><td>161-0400</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Bovogen Biologicals, Victoria, Australia</td><td>BSA100</td><td></td></tr><tr><td>글루타티온 세파로스 4B</td><td>GE 헬스케어, 말보로, MA</td><td>17-0756-01</td><td></td></tr><tr><td>아세트산 빙하</td><td>덕산 순수 화학물질, 안산, 한국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>메틸 알코올 &nbsp; &nbsp;</td><td>대정화학&(주) Metals, Siheung, South Korea</td><td>5558-4410</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Typhoon FLA 7000</td><td>GE Healthcare, Marlborough, MA</td><td>28-9558-09</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE kit</td><td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td><td>1658001FC</td><td></td></tr><tr><td>진공 펌프</td><td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td><td>165-178</td><td></td></tr><tr><td>겔 건조기</td><td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td><td>165-1746</td><td></td></tr><tr><td>Dancing shaker</td><td>FINEPCR, 서울, 한국</td><td>CR300</td><td>The machine is needed for washing</td></tr><tr><td>step PCR machine</td><td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td><td>T100</td><td></td></tr><tr><td>Incubator/shakers</td><td>N-BIOTEK, 경기도, 한국</td><td>NB-205L</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기</td><td>LABOGENE, 서울, 한국</td><td>1730R</td><td></td></tr><tr><td>크로마토그래피 컬럼</td><td>Bio-Rad Laboratories, 헤라클레스, CA</td><td>732-1010</td><td></td></tr></tbody></table>

인산화 부위 결정을위한 올리고 펩타이드 경쟁 분석

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

특정 부위의 단백질 인산화가 다른 분자와의 형태 및 상호 작용을 결정합니다. 따라서 단백질 인산화는 세포의 생물학적 기능과 특성에 영향을 미친다. 현재, 인산화 부위를 발견하는 가장 일반적인 방법은 신속하고 민감한 방법 인 액체 크로마토 그래피 / 질량 분석 (LC / MS) 분석입니다. 그러나, 상대적으로 불안정한 인산염 잔기는 단편화 단계에서 종종 포스 포 펩타이드로부터 방출되며, 이는 종종 거짓 음성 신호를 생성한다. 그러한 경우, 부위 특이 적 돌연변이 체를 이용한 전통적인 in vitro 키나아제 분석이 더 정확할 수 있지만,이 방법은 힘들고 시간 소모적이다. 따라서, 펩티드 경쟁을 이용하는 대안적인 방법이 유리할 수있다. 5 &#39;아데노신 모노 포스페이트 - 활성화 단백질 키나아제 (AMPK)의 컨센서스 인식 모티프가 확립되었고, 위치 스캐닝 펩타이드 라이브러리 엉덩이를 사용하여 확인되었다ay 2 . 따라서, 새로운 기질에 대한 AMPK 인산화 부위는 펩티드 경쟁 분석에 의해 예측되고 확인 될 수있다. 이 보고서에서 우리는 AMPK 매개 핵 인자 적혈구 2 관련 인자 2 (Nrf2) 인산화를 설명함으로써 시험 관내 올리고 펩타이드 경쟁 키나아제 분석을위한 상세한 단계 및 절차를 기술한다. 인산화 부위를 인증하기 위해, 우리는 부위 특이 적 돌연변이 체를 사용하여 순차적 인 in vitro 키나아제 분석을 수행했다. 전반적으로, 펩티드 경쟁 분석은 다수의 잠재적 인 인산화 부위를 스크리닝하고 인산화 부위 돌연변이 체에 의한 확인을위한 부위를 확인하는 방법을 제공한다.

그림 1 과 그림 2 는 이전에보고 된 논문 8 에서 반복 된 실험 결과를 보여줍니다. 상응하는 AMPK 표적 부위를 모방 한 3 개의 상이한 10 잔기 올리고 펩타이드 (Ser153을 포함하는 # 1, 148-157; Ser335를 포함하는 # 2, 330 내지 339 및 Ser558을 포함하는 # 3, 553 내지 562)가 합성되어 in 시험 관내 키나아제 분석. AMPK에 의한 Nrf2의 인산화는 올리고 펩타이드 # 3 ( 그림 1 )의 존재 하에서 크게 감소했다. 다음으로, 부위 특이 적 돌연변이 유발 분석을 수행하여 펩티 도미넴 실험의 결과를 확인 하였다. Nrf2의 AMPK 매개 인산화에 대한 올리고 펩타이드 # 3의 억제 효과를 감안할 때...

펩타이드 경쟁 분석은 다양한 분자 및 면역 학적 실험에 널리 사용됩니다. 이 논문은 in vitro 올리고 펩티드 - 경쟁 키나아제 분석 및 특정 인산화 부위를 찾는 데 유용한 관련 검증 절차에 대한 상세한 방법을 기술한다.

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

이 절차의 전반적인 목표는 여러 잠재적 인산화 부위를 동시에 평가하고, 이후 인산화 부위 돌연변이체를 통해 검증할 부위를 식별하는 것입니다. 이 방법은 세포 신호 전달에서 번역 후 변형의 역할에 관한 생화학 및 세포 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술을 통해 관심 단백질과 인산화 부위에 대해 예산 효율적인 예비 스크리닝을 쉽게 수행할 수 있습니다.인산화는 인간 질병의 신호 전달 경로에서 중요한 생화학적 사건이므로, 이 기술의 활용 가능성은 염증 및 암을 포함한 질병의 진단과 치료로 확장되었습니다. 시연을 돕기 위해 제 연구실의 대학원생인 신솔비가 부위 특이적 돌연변이 유발법을 수행하겠습니다. 먼저 50 ng의 플라스미드 pGEX JST NRF2, 125 ng의 정방향 프라이머, 125 ng의 역방향 프라이머, 1 µL의 DNTP 믹스, 2.5 units의 PFU DNA polymerase 및 10x 반응 버퍼를 얼음 위에서 혼합합니다.멸균 증류수를 추가하여 최종 부피를 50 µL로 맞춥니다. PCR을 수행하여 돌연변이 가닥을 통합한 다음, 샘플을 얼음 위에서 2분 동안 냉각합니다. 냉각된 샘플에 DPNI 제한 효소 1 µL를 추가합니다.피펫팅으로 샘플을 부드럽게 혼합한 후 13,000 ×g에서 1분 동안 원심분리합니다. 부모의 이중 가닥 DNA를 소화시키기 위해 샘플을 37 °C에서 2시간 동안 배양합니다. 그다음 endA1 및 RACA1 돌연변이가 있는 초고효율 E.coli 세포를 얼음 위에 둡니다. 냉각된 세포에 반응 혼합물 50 µL를 첨가하고 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.그동안 가열 블록을 42 °C로 예열합니다. 배양(incubation)이 완료되면, 혼합물을 42 °C에서 90초 동안 가열한 후 얼음 위에서 2분 동안 냉각합니다. 형질전환된 세포에 미리 데워둔 Lysogeny broth를 첨가합니다.혼합물을 180 RPM으로 흔들어주며 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 그 후 세포를 LB ampicillin 한천 배지에 도말하고 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 단일 콜로니를 ampicillin이 포함된 5 mL의 Lysogeny broth로 옮깁니다.샘플을 37 °C에서 180 RPM으로 흔들어주며 하룻밤 동안 배양합니다. DNA 서열 분석을 위해 표준 mini prep 키트를 사용하여 샘플 DNA를 추출합니다. 변이 서열을 확인하기 위해 최소 200 ng의 HDNA construct를 DNA 분석기에서 실행합니다.검증된 돌연변이 NRF2 단백질을 발현시키고 정제하십시오. 키나아제 분석을 진행하기 전에 생성된 돌연변이 NRF2의 양을 측정하십시오. 펩타이드 경쟁 분석을 시작하려면, 아데노신 일인산 농도가 500 micromolar인 5X 키나아제 완충액을 준비하십시오.그런 다음 냉동된 AMPK 야생형 인간 NRF2 샘플과 NRF2의 AMPK 인산화 부위를 모방한 세 가지 올리고펩타이드 샘플을 해동합니다. 각 펩타이드에 대해, 얼음 위에서 펩타이드 0.43 mg, AMPK 0.15 µg, NRF2 0.4 µg 및 5X Kinase Buffer 6 µL를 혼합합니다. 멸균 증류수를 첨가하여 최종 부피를 30 µL로 맞춥니다.그런 다음 차폐 구역에서 가열 블록을 30 °C로 설정합니다. 각 튜브에 1 µCi의 $\gamma^{32}\text{P}$ ATP를 첨가하고, 피펫팅을 통해 각 용액을 충분히 혼합합니다. 반응 혼합물을 30 °C에서 15~30분 동안 배양합니다.배양 중에 7.5% STS PAGE 겔을 준비합니다. 그다음 각 튜브에 10X STS 샘플 버퍼 3 µL를 넣고 충분히 섞어 키나아제 반응을 중단시킵니다. 샘플을 겔에서 70 V로 20분 동안, 이어서 140 V로 1시간 동안 전기영동합니다.젤 전기영동을 마친 후, 브로모페놀 블루(bromophenol blue) 선 아래의 방사능 수치가 높은 젤 부분을 조심스럽게 제거합니다. 젤을 캐스터에서 유리관으로 조심스럽게 옮깁니다. 50% methanol, 40% water, 10% acetic acid 용액에 20분 동안 젤을 고정합니다.그 후 겔을 여과지에 조심스럽게 올리고 투명 랩으로 덮습니다. 진공 겔 건조기를 사용하여 80 °C에서 1시간 동안 겔을 건조합니다. 건조된 겔을 인광 스크린 또는 X선 필름에 각각 약 16시간 동안 이틀간 노출시킵니다.Phosphorimager를 사용하여 스크린의 고해상도 TIFF 또는 Bitmap 파일을 생성합니다. AMPK 활성 분석을 시작하려면, AMPK 샘플과 돌연변이 및 야생형 GST NRF2 샘플을 얼음 위에서 해동합니다. 0.4 µg의 돌연변이 GST NRF2를 0.15 µg의 AMPK 및 6 µL의 5X Kinase buffer와 혼합합니다.부피가 30 µL가 되도록 멸균 증류수를 추가합니다. 이와 동일한 방식으로 0.4 µg의 야생형 GST NRF2가 포함된 또 다른 반응 혼합물을 준비합니다. 각 반응 바이알에 1 µCi의 gamma 32P ATP를 추가합니다.피펫으로 혼합물을 여러 번 파이펫팅한 후, 짧게 원심 분리합니다. 차광된 구역에서 30 °C로 30분 동안 혼합물을 배양한 다음, 3 µL의 10X STS 샘플 버퍼를 첨가하여 키나아제 반응을 종결시킵니다. 경쟁적 키나아제 분석과 동일한 조건으로 STS PAGE를 수행하고, 젤을 고정시킨 후 건조합니다.겔을 인광 스크린에 하룻밤 동안 노출시킨 후 Phosphorimager로 스캔합니다. 인간 NRF2의 AMPK 인산화 부위를 모방한 10개 잔기의 올리고펩타이드 3종이 존재하는 상태에서 인 비트로(in vitro) AMPK 분석을 수행하였습니다. Serine 558 부위를 모방한 올리고펩타이드가 AMPK 인산화에 대해 가장 강력한 경쟁력을 보였습니다.이후 Serine 558을 alanine으로 대체한 NRF2 돌연변이체를 합성하여 인 비트로(in vitro) 활성 분석으로 평가하였습니다. S558 A 돌연변이체에서는 AMPK 인산화가 거의 관찰되지 않았으며, 이는 AMPK가 인간 NRF2의 Serine 558 부위를 직접 인산화한다는 것을 나타냅니다. 펩타이드가 단백질에 경쟁적으로 결합하므로, 이 방법의 원리는 아세틸화 및 라이신 잔기와 같은 다른 번역 후 변형 및 단백질-단백질 상호작용을 식별하는 데에도 적용될 수 있습니다.방사성 동위원체를 다루는 것은 매우 위험할 수 있다는 점을 잊지 마십시오. 이 절차를 수행하기 전에 방사성 동위원체 안전 교육을 반드시 이수해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 동영상은 단일 분자 풀다운 분석을 사용한 단백질 인산화의 민감한 정량화 기술을 보여줍니다. 폴리에틸렌 글리콜-비오틴의 기능화와 표지된 항체의 사용은 특이성을 가진 인산화 티로신의 검출을 증가시킵니다.

단백질 인산화 분석을 위한 Single-molecule pull-down assay: 세포 용해물에서 단백질 인산화를 정량화하기 위한 고처리량 기법

우리는 여기에서 식물 단백질 복합체의 정제 및 특성에 대한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 단지 내에 하나의 단백질을 immunoprecipitating에 의해, 그래서 우리는 그것의 번역 후 변형과 상호 작용하는 파트너를 식별 할 수있는 것을 보여줍니다.

식물 단백질 복합체의 번역 후 변형의 확인

단백질 인산화는 세포가 세포 외 환경에서 정보를 해석하고 반응하는 방법의 핵심 기능입니다. 여기에서는 포유류 세포에서 정제된 kinase를 사용하여 관심 기질을 인산화하는 kinase를 신속하게 식별하는 고처리량 스크리닝 프로토콜을 제시합니다.

높은 처리량 검열을 사용 키나제 기판 쌍의 식별

이 프로토콜은 Rac1을 포함한 Rho-family GTPase에 대한 결합 파트너의 상대적 친화도를 비교합니다. 생체 내에서 Rac1 결합 단백질은 단일 결합 계면을 놓고 경쟁하며, 그 형태는 결합된 뉴클레오티드에 의해 결정됩니다. 뉴클레오티드는 중요하면서도 높은 가수분해 속도로 인해 실험적으로 제어하기 어렵습니다.

경쟁 분석법을 이용는 GTPase - 결합 단백질의 친화 비교

 종속 키 1 (Cdk1) 세포 주기의 g 2 단계에서 활성화 되 고 많은 세포 경로 조절. 여기, Cdk1, Cdk1-특정 한 인 산화 위치의 식별이 중요 한 키의 셀룰러 목표 설정에 대 한 수와 함께 체 외에 니 분석 결과 대 한 프로토콜 선물이.

 종속 키 1의 시험관에서 키에 의해 인 산화 특정 사이트 분석 결과

여기, 우리는 공동 immunoprecipitation과 동시에 효소 모집 및 효소 활동에 원형질 막 수용 체의 특정 단백질 도메인의 기여를 연구에 구슬 효소 활동 분석 결과 대 한 프로토콜을 제시.

수용 체와 효소 간의 기능 상호 작용을 공부에 대 한 분석 결과 Co-immunoprecipitation

우리는 강력한 생화확적인 접근을 사용하여 새로운 키나아제 단백질을 특징으로 했습니다: 다른 세포주 및 조직에 있는 전용적인 항체를 가진 서쪽 얼룩 분석, coimmunocipation 실험에 의하여 상호 작용, 서쪽에 의해 검출된 키나아제 활동 인광 특이적 항체를 사용하여 블롯[32 P] ATP 라벨링에 의해.

새로운 키나제 단백질의 강력한 생화학 적 접근법을 사용하여 분자 수준에서특성화

이 프로토콜은 작은 DNA와 RNA 기판에 폴리 뉴클레오티드 키나아제 (PNKs)의 키나아제 활성을 측정하는 비 방사성 분석기를 설명합니다.

작은 뉴클레오티드 기판의 폴리뉴클레오티드 인산화를 측정하는 비방사성 분석

본 프로토콜은 개선된 단일 분자 풀다운(SiMPull) 분석을 사용하여 단백질 인산화를 정량화하기 위한 샘플 준비 및 데이터 분석을 기술한다.

단백질 인산화의 정량화를 위한 최적화된 단일 분자 풀다운 분석

여기에서는 효소 변형 분석을 위해 효모 표면 표시 기질을 사용하기 위한 프로토콜을 소개합니다. 이 플랫폼은 대표적인 효소 변형 분석법으로 기질 중 하나에 대한 티로신 인산가수분해효소 SHP-2의 탈인산화 활성 분석을 사용하여 시연되었습니다.

효모 표면에 표시된 단백질의 Enzymatic modification and flow cytometry assessment (효소 변형 및 유세포 분석 평가)

배우세요 올리고 펩타이드 경쟁 키나아제 분석법을 활용하여 인산화 부위를 선별하고 검증하는 방법을. 이 기법은 생화학 및 세포생물학 연구에서 비용 효율적인 예비 스크리닝을 가능하게 합니다.

인산화 부위 결정을위한 올리고 펩타이드 경쟁 분석

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