2017년 5월 18일
펩타이드 경쟁 분석은 다양한 분자 및 면역 학적 실험에 널리 사용됩니다. 이 논문은 in vitro 올리고 펩티드 - 경쟁 키나아제 분석 및 특정 인산화 부위를 찾는 데 유용한 관련 검증 절차에 대한 상세한 방법을 기술한다.
이 절차의 전반적인 목표는 여러 잠재적인 인산화 부위를 동시에 평가하고 인산화 부위 돌연변이에 의한 후속 검증을 위한 부위를 식별하는 것입니다. 이 방법은 세포 신호전달에서 번역 후 변형의 역할에 대한 생화학 및 세포 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술을 사용하면 인산화 부위와 관심 단백질에 대한 예산 친화적인 예비 스크리닝을 쉽게 수행할 수 있습니다.
이 기술의 의미는 염증 및 암을 포함한 질병의 진단 및 치료로 확장되었는데, 이는 인산화가 인간 질병의 신호 경로에서 중요한 생화학적 사건이기 때문입니다. 시연을 돕는 것은 제 연구실의 대학원생인 Sol-Bi Shin이 맡았는데, 그는 현장에서 돌연변이 유발을 지시했습니다. 먼저 50나노그램의 혈장 pGEX JST NRF2, 125나노그램의 포워드 프라이머, 125나노그램의 리버스 프라이머, 1마이크로리터의 DNTP 혼합물, 2.5단위의 PFU DNA 중합효소 및 10x 반응 완충액을 얼음 위에서 혼합합니다.
멸균 증류수를 추가하여 부피를 50마이크로리터로 가져옵니다. PCR을 수행하여 돌연변이 가닥을 통합한 다음 샘플을 얼음에서 2분 동안 냉각합니다. 냉각된 샘플에 1마이크로리터의 DPNI 제한 효소를 추가합니다.
온화한 피펫팅으로 표본을 섞고 그 후에 13, 000 시간 G.Incubate에 1 분 동안 표본을 부모 두 배 좌초 DNA를 소화하기 위하여 2 시간 동안 37 섭씨 온도에 표본을 원심분리하십시오. 그런 다음 endA1 및 RACA1 돌연변이가 있는 초능력 대장균 세포를 얼음 위에 던집니다. 냉각된 세포에 반응 혼합물 50마이크로리터를 추가하고 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.
한편, 가열 블록을 섭씨 42도로 예열합니다. 배양이 완료되면 혼합물을 섭씨 42도에서 90초 동안 가열한 다음 얼음에서 2분 동안 혼합물을 식힙니다. 형질전환된 세포에 미리 데워진 용원성 육수를 추가합니다.
180 RPM으로 흔드는 동안 섭씨 37도에서 1시간 동안 혼합물을 배양합니다. 그런 다음 LB 암피실린 한천 플레이트에 세포를 펴고 섭씨 37도에서 밤새 플레이트를 배양합니다. 단일 콜로니를 암피실린이 함유된 5ml의 Lysogeny 육수로 옮깁니다.
섭씨 37도에서 하룻밤 동안 180RPM으로 흔들면서 샘플을 배양합니다. DNA 염기서열 분석을 위한 표준 미니 전처리 키트를 사용하여 샘플 DNA를 추출합니다. DNA 분석기에서 최소 200나노그램의 HDNA 구조를 실행하여 돌연변이 염기서열을 확인합니다.
검증된 돌연변이 NRF2 단백질을 발현하고 정제합니다. kinase assay를 진행하기 전에 생성된 돌연변이 NRF2의 양을 확인합니다. 펩타이드 경쟁 분석을 시작하려면 아데노신 일인산 농도가 500마이크로몰인 5X 키나아제 완충 용액을 준비합니다.
그런 다음 AMPK 야생형 인간 NRF2의 냉동 샘플과 NRF2의 AMPK 인산화 부위를 모방한 3개의 올리오고펩티드를 해동합니다. 얼음 위에서 각 펩타이드에 대해 0.43mg의 펩타이드와 0.15μg의 AMPK, 0.4μg의 NRF2 및 6μl의 5X Kinase Buffer를 결합합니다. 멸균 증류수를 추가하여 최종 부피 30마이크로리터를 얻습니다.
그런 다음 차폐 된 영역에서 가열 블록을 섭씨 30도로 설정하십시오. 각 튜브에 감마 32P ATP 마이크로큐리 1개를 첨가하고 위아래로 피펫팅하여 각 용액을 철저히 혼합합니다. 반응 혼합물을 섭씨 30도에서 15-30분 동안 배양합니다.
배양 중에 7.5%STS PAGE 젤을 준비합니다. 그런 다음 각 튜브에 3마이크로리터의 10X STS 샘플 버퍼를 추가하고 완전히 혼합하여 키나아제 반응을 중지합니다. 젤의 샘플을 70볼트에서 20분 동안 실행한 다음 140볼트에서 1시간 동안 실행합니다.
겔 전기영동이 완료되면 브로모페놀 블루 라인 아래의 고방사성 겔을 조심스럽게 제거합니다. 캐스터에서 유리관으로 젤을 부드럽게 옮깁니다. 50%메탄올, 40%물 및 10%아세트산의 용액에 20분 동안 젤을 고정합니다.
그런 다음 젤을 여과지에 부드럽게 놓고 투명 랩으로 덮습니다. 진공 젤 건조기로 젤을 섭씨 80도에서 1시간 동안 건조시킵니다. 건조 젤을 인 스크린 또는 X선 필름에 각각 2일 동안 약 16시간 동안 노출시킵니다.
PhosphorImager를 사용하여 화면의 고해상도 TIFF 또는 비트맵 파일을 생성합니다. AMPK 활성 분석을 시작하려면 AMPK와 돌연변이 및 야생형 GST NRF2 샘플을 얼음에서 해동합니다. 0.4마이크로그램의 돌연변이 GST NRF2와 0.15마이크로그램의 AMPK 및 6마이크로리터의 5X 키나아제 완충액을 결합합니다.
멸균 증류수를 추가하여 부피를 30마이크로리터로 가져옵니다. 이러한 방식으로 0.4 마이크로 그램의 야생형 GST NRF2와 다른 반응 혼합물을 준비합니다. 각 반응 바이알에 감마 32P ATP 마이크로큐리 1개를 추가합니다.
혼합물을 위아래로 여러 번 피펫팅한 다음 혼합물을 간단히 원심분리합니다. 차폐된 영역에서 섭씨 30도의 온도에서 30분 동안 혼합물을 배양한 다음 3마이크로리터의 10X STS 샘플 버퍼로 키나아제 반응을 종료합니다. STS PAGE를 실행하고 겔을 고정한 후 경쟁사 키나아제 분석과 동일한 조건으로 겔을 건조시킵니다.
젤을 밤새 인 스크린에 노출시키고 인광영상기로 스크린을 스캔합니다. 인간 NRF2에서 AMPK 인산화 부위를 모방한 3개의 10 잔기 올리고펩타이드가 있는 상태에서 시험관 내 AMPK 분석을 수행했습니다. Serine 558 부위를 모방한 올리고펩타이드는 AMPK 인산화에 대한 가장 큰 경쟁을 제공했습니다.
그런 다음 Serine 558을 알라닌으로 대체하는 NRF2 돌연변이를 합성하고 in vitro 활성 분석에서 평가했습니다. S558 A 돌연변이의 AMPK 인산화는 거의 관찰되지 않았는데, 이는 AMPK가 Serine 558에서 인간 NRF2를 직접 인산화한다는 것을 나타냅니다. 펩타이드는 단백질에 경쟁적으로 결합하기 때문에 이 방법의 원리는 아세틸화(acetylization) 및 라이신(lysine) 잔기 및 단백질 단백질 상호 작용과 같은 다른 번역 후 및 변형을 식별하는 데에도 적용될 수 있습니다.
방사성 동위원소로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 이 절차를 수행하기 전에 전파 동위원소 안전 교육을 이미 받아야 합니다.
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이 기사는 특정 인산화 부위를 식별하기 위한 시험관 내 올리고펩티드 경합 키나아제 분석을 실시하는 방법을 제시합니다. 이 기술은 생화학 및 세포 생물학 연구의 예비 선별에 유용합니다.
This method enables early-stage screening of phosphorylation sites to support target validation and mechanistic de-risking in drug discovery. By identifying functional phosphorylation sites through peptide competition, it provides predictive confidence for downstream assay development and lead identification efforts. The approach reduces reliance on low-throughput mutagenesis, accelerating hypothesis testing in signaling pathway research relevant to oncology and inflammatory disease targets.
The method fits within the discovery continuum from target engagement to lead identification, particularly for kinases and signaling pathways.