Name: 저항 동맥의 세포 문화 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: 배우세요 저항 동맥의 근내피세포 접합부 연구를 위한 세포 공배양 기법을 사용하여 심혈관 신호전달 경로를 분석하는 방법을. 이 모델은 단백질 국소화와 세포 간 상호작용을 효과적으로 연구할 수 있는 귀중한 도구를 제공합니다.

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이 작품은 국가 심 혼에 의해 지원 되었다, 폐 및 혈액 학회 R01088554, T32HL007284 및 미국 심 혼 협회 predoctoral 친목 14PRE20420024 부여 합니다. 우리는 특히 세인트 주드 세포 이미징 공유 연구 핵심, 랜달 웨이크필드와 전자 현미경 이미지에 대 한 린다 Horner, 아담 스트로브를 통해 대표적인 면역 형광 이미지, 및 그녀에 대 한 Pooneh Bagher를 포함 하 여 감사 합니다. 원고 프로토콜에 귀중 한 피드백입니다.

1. 도금 셀은 VCCC <ol><li>문화 큰 225 cm 2 플라스 크 EC 및 SMC의 70-90% 합칠 때까지 37 ° C에서 살 균 조건 하에서. SMC 보다 더 많은 EC는 사용; 기본 인간 EC 및 SMC, SMC의 1 큰 플라스 크를 EC의 일반적으로 3 큰 플라스 크를 사용 하 여 경우.
	<ol><li>낮은 구절에서 1 차 셀을 사용 하 고 통로 10 과거 사용 하지 마십시오. 문화 미디어 기반 공동 경작 될 셀을 선택 하십시오. 기본 인간 관상 동맥 EC, EGM2 MV 성장 요인으로 EBM-2 EC 기저 미디어를 사용 합니다. 기본 인간 관상 SMC, SmGM-2 성장 요소와 SmBM SMC 기저 미디어를 사용 합니다. 배양된 세포와 함께 사용, 이전을 미디어 성장 요인 추가.</li>
	</ol></li> <li>VCCC 주 1의 건설: 살 균 제 (예, Cavicide)와 큰 (150 m m) 접시와 뚜껑을 스프레이 종이 타월 또는 보풀 물티슈로 닦아. 그런 다음 70% 에탄올 (EtOH) 페 트리 접시를 살포 하 고 건조 공기를 후드에 배치.</li>
	<li>무 균 조건 하에서 필터 삽입 (재료의 표 참조)의 접시 열고 코트 fibronectin 솔루션 삽입의 SMC 측면 (필터의 밑바닥 측). 확인 하단의 필터의 절반은 (더 이상 1 mL)을 적용 하 고, 접시의 바닥에 슬릿 피펫으로 측면을 통해 fibronectin 솔루션 제공된 6 잘 플레이트에 삽입을 유지,.</li>
	<li>실내 온도 셀 문화 후드에 fibronectin 솔루션 치료 후 30 분 접시에서 삽입, 진공 모든 초과 솔루션 및 반전, 깨끗 한 페 트리 접시의 절반을 하단에 배치. 따로 설정 합니다. 초과 솔루션; suctioning 때 필터 삽입 멤브레인을 방해 하지 않도록 주의 하십시오 이 부드럽게 접시, 기울이기 및 삽입의 가장자리에서 솔루션을 진공 청소기로 청소 하 여 방지할 수 있습니다.</li>
	<li>Trypsinize 225 cm 2 플라스 크의 SMC 미리 데워 2 X 트립 신-EDTA 솔루션, 그리고 일단 세포가 접시를 낸 3 mL와 함께 9 mL SMC 미디어 트립 신 (3:1, 미디어: trypsin) 중화를 추가 합니다. 원뿔 튜브에 전송, 잘, 그리고 핸드폰 번호를 확인 하려면 hemocytometer에 피펫으로 10 µ L.
	<ol><li>수 5 x 5 셀의 수 상자 (즉, 18), 1 ml (180000) 셀의 수를 10, 000을 곱하면이 됩니다. 다음 12 mL (총 볼륨 세포 현 탁 액, 2.16 백만 SMC의)를 곱하십시오. 충분 한 SMC 접시 우물의 원하는 번호를 확인 하십시오. 
		참고: 예를 들어 1 잘 75000 SMC 있고 따라서 18 우물 1.35 백만 총 SMC 했. 1.35 백만 세포 1 mL 당 180000 셀에 필요한 분할 하 고 도금 하는 데 필요한 세포 현 탁 액의 7.5 mL에이 결과. 다음 계산 필요 마지막 볼륨 (18 우물 x 750 µ L = 13.5 mL). 따라서, 세포 현 탁 액의 7.5 mL, 볼륨을가지고 미리 따뜻하게 SMC 미디어와 잘 혼합 최대 13.5 mL.</li>
	</ol></li> <li>약 75000 SMC 각 필터의 아래쪽 면에 미디어와 셀 솔루션의 유출 하지 않도록 주의 되 고 포함 된 셀 서 스 펜 션의 플레이트 750 µ L. 뚜껑 위에 놓고 신중 하 게 삽입 된 페 트리 접시에 전송 37 ° C에서 인큐베이터 하룻밤. 
	참고: 다른 셀 형식에 대 한 최적의 셀 밀도 경험적으로 결정 해야 합니다.</li>
	<li>하루에 2, 채워 깨끗 한 6 잘 요리 신선한, 미리 데워 진 SMC 미디어의 2 mL. 인큐베이터에서 플레이트를 제거 합니다. 삽입 한 번에 하나를와 미디어 흡입, 다음 SMC 미디어 6-잘 접시에 놓습니다.</li>
	<li>37에서 적어도 30 분 동안 0.5% 소 젤라틴 해결책의 1 mL로 필터 (EC 측)의 반대편 코트 ° c.</li>
	<li>미리 데워 2의 3 mL와 EC의 225 cm 2 flask(s) trypsinize X 트립 신-EDTA (10 x 메 마른 Dulbecco에 희석 &#39; s PBS) 솔루션, 접시에서 셀 리프트 위해 플라스 크의 부드러운 도청. 
	참고: 그것은 다시 1-3 분 동안 37 ° C에서 인큐베이터에 플라스 크를 필요할 수 있습니다.
	<ol>한 번 <li>셀 접시를 낸는 9 mL EC 미디어 트립 신 (3:1) 중화를 추가 합니다. 원뿔 튜브, 수영장을 함께 전송, 잘, 그리고 핸드폰 번호를 확인 하려면 hemocytometer에 피펫으로 10 µ L를 혼합.
		<ol><li>수 5 x 5 셀의 수 상자 (즉, 60), 1 ml (600000) 셀의 수를 10, 000을 곱하면이 됩니다. 다음 12 mL (총 볼륨 세포 현 탁 액, 7.2 백만 EC의)를 곱하십시오. 충분 한 EC 격판덮개 우물의 원하는 번호를 확인 하십시오. 
			참고: 약 360000 EC는 잘 당 필요. 예를 들어 18 우물 6.48 백만 적 필요 1 mL 당 600000 EC에 필요한 6.48 백만 셀 분할 하 고 도금 하는 데 필요한 세포 현 탁 액의 10.8 mL에이 결과. 다음 계산 필요 마지막 볼륨 (18 우물 1 mL = 18 mL x). 따라서, 세포 현 탁 액의 10.8 mL, 최대 볼륨을가지고 18 mL와 함께 미리 EC 미디어를 예 열 하 고 부드럽게 resuspend.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>각 삽입 필터의 상단 측면에 360000 EC의 1 mL 접시. 셀 4 일에 24 h. 대체 매체에 대 한 37 ° C에서 그대로 품 어 보자. 5 당일 수확.</li>
</ol> 2. 분수는 VCCC에서 수확 <ol><li>4 ° C 방에 격리를 수행 하 고 얼음에 모든 악기를 유지</li>
	<li>마음에 고립 되 고 개별 삽입의 수를 유지 하 고 (격리 된 필터)에 대 한 MEJ 분류 50 mL 튜브에 세포의 용 해 버퍼를 추가. 다음 레이블 두 10mm 요리; EC 및 SMC.</li>
	<li>조정 어떻게 집중은 lysate 해야; 15에 대 한 삽입에 따라 세포의 용 해 버퍼의 볼륨, MEJ 튜브에 대 한 세포의 용 해 버퍼의 500 µ L 및 페 트리 접시 당 250 µ L 좋습니다.</li>
	<li>작업 삽입 한 번에의 한 6 잘 플레이트. 셀 문화 후드 그리고 얼음에 차가운 방에 전송 매체에서 흡입 
	참고: 다음 지침은 1 삽입 격리에 대 한 것입니다.</li>
	<li>삽입의 SMC 측에 1 x PBS의 피펫으로 10 µ L.</li>
	<li>셀 삽입의 한쪽 끝을 아래로 밀고 셀 기중 장치를 사용 하 고 그것에 세포의 용 해 버퍼는 SMC 페 트리 접시에 기중에서 셀 전송</li>
	<li>일단 셀 기중 기는 접시에 세포의 용 해 버퍼만 진 되었습니다 때까지 그것은 완전히 닦아 종이 타 올에 건조 삽입 필터를 터치를 허용 하지 않습니다. 반복 하는 근 근이 SMC 필터의 적어도 1을 2 번 나머지 SMC 세포 파편을 완전히 제거 하.</li>
	<li>삽입 필터의 위/EC 쪽에 삽입 하 고 피펫으로 10 µ L 1 x PBS의 켜십시오. 셀 스 크레이 퍼와 EC 페 트리 접시 2.6 및 2.7 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>세포의 용 해 버퍼와 EC 페 트리 접시에 피 펫 및 전송 필터의 EC 측에서 나머지 셀 및 PBS 슬러리를 수집합니다. MEJ 분수에 두고 최소한의 EC/SMC 오염으로 필터의 양쪽 모두에서 세포를 근 근이 살아가고에 아주 철저 하 게.</li>
	<li>에서는 신중 하 게 메스를 사용 하 여 플라스틱 삽입에서 필터를 잘라. 플라스틱에서 그것의 절단 70-80%에 의해이 작업을 수행 하 고 집게 플라스틱 삽입 구조에서 완전히 필터를 사용 하 여. 세포의 용 해 버퍼, MEJ 표시 50 mL 원뿔 튜브에 필터를 넣고 세포의 용 해 버퍼에 앉아서 젖은 남아 보장.</li>
	<li>삽입의 모든 처리 될 때까지 6, 그룹의 격리 단계 반복.</li>
	<li>다른 치료 그룹 별도 튜브와 요리에 보관 됩니다 확인 하십시오.</li>
	<li>소용돌이 15 전체 강도에 50 mL MEJ 원뿔 튜브 s 또는 잘 혼합 때까지. 집게, 튜브에서 단백질 및 액체의 최대 금액을 떠나로 튜브의 측면 벽을 따라 끌어와 원뿔 MEJ에서 필터를 제거 합니다. 이 시점 후 필터 삭제.</li>
	<li>모든 필터 MEJ 원뿔 튜브에서 제거 되었습니다 일단 할 한 튜브의 하단에 모든 액체와 단백질을 뽑아 원심 분리기에 빠른 스핀 (최대 속도 ~ 16000 x g에서 10-15 s). 별도, 더 작은 원심 분리기 튜브로 MEJ 튜브와 EC 및 SMC 페 트리 접시의 내용을 전송.</li>
	<li>옵션: MEJ/SMC/EC 튜브의 내용을 Sonicate에 얼음에 4 세 10의 펄스에 대 한 설정 또는 손으로 부드럽게 균질.</li>
	<li>4 시 15 분 최대 속도 (~ 16000 x g)에서 원심 ° C. 피펫으로 상쾌한 고 시험의 bicinchoninic 분석 결과 메서드를 사용 하 여 단백질 함량에 대 한 lysate.</li>
</ol> 3. En 얼굴 면역 형광에 있는 VCCC 수확 <ol><li>에 하루 5의 VCCC 인큐베이션, 인큐베이터에서 삽입을 제거. 각 삽입 필터와 린스 1 x PBS와 두 번의 낮은 우물의 SMC 미디어에서 흡입 세포 문화 후드에서 working. EC 측을 가진 반복.</li>
	<li>부드러운 통에 있는 도보 4 ° C 룸에 10-20 분 동안 4 %paraformaldehyde (PFA) 추가 및 접시에 그대로 삽입을 유지. 5 분에 대 한 1 x PBS와 삽입 필터의 양쪽 모두를 세척 하 고 두 번 반복. 
	주의: PFA 독성 이며 신중 하 게 처리 해야 합니다.</li>
	<li>접시는 항 체에는 필터의 양쪽 모두를 유지 + 차단 솔루션 차단, 1 차 및 이차 항 체 외피를 수행 (9 mL PBS, 25 µ L 트리톤 X100, 50 mg 소 혈 청 알 부 민, 500 µ L 정상 혈 청)</li>
	<li>메스와 플라스틱 삽입에서 필터를 잘라 슬라이드에 필터를 탑재 하는 핸들에 장착 매체와 현미경 슬라이드에 탑재.</li>
</ol> 4. VCCC 가로 면역 형광 검사에 대 한 수확 <ol><li>에 하루 5의 VCCC 인큐베이션, 인큐베이터에서 삽입을 제거. 셀 문화 후드에 삽입 필터의 양쪽에서 미디어에서 흡입 하 고 두 번 1 x PBS와 필터의 각 측면을 린스.</li>
	<li>그대로 삽입 유지 6 잘 플레이트에 추가 4 %PFA 부드러운 통에 있는 도보 4 ° C 룸에서 밤새 품 어. 
	주의: PFA 독성 이며 신중 하 게 처리 해야 합니다.</li>
</ol> 5. VCCC 가로 면역 형광 검사에 대 한 포함 <ol><li>필터 후 삽입 약 4%에 24 h에 대 한 해결 되었습니다 PFA, 전송 70 %EtOH 적어도 24 시간, 하지만 몇 주까지.</li>
	<li>긴 자동된 조직 프로세서에서 실행 (하룻밤)에 필터를 처리 합니다. 다음과 같이 프로그램을 사용 하 여: 70% EtOH 30 분, 85% EtOH 30 분, 95% EtOH 30 분, 100% EtOH 30 분, 100% EtOH 45 분, 100% EtOH 45 분, 크 실 렌 30 분, 크 실 렌 30 분, 크 실 렌 45 분, 60 ° C 파라핀 30 분, 60 ° C 파라핀 30 분 60 ° C 파라핀 45 분</li>
	<li>액체 파라핀, 카세트에는 필터를 유지로 전송 수확된 필터 포함 역으로 처리 후.</li>
	<li>는 가장자리에 그냥 잡고 집게를 사용 하 여 신중 하 게 카세트에서 필터를 제거 합니다. 가 위, 반, 필터를 잘라 반쪽 모양의 두 세미 원형 형성. 그냥 오래 포함 채우기 위해 충분히 액체 파라핀과 금형 포함 역의 차가운 접시 부분에 2 반쪽의 각 위치.</li>
	<li>한번 액체 파라핀으로 가득 찬 격판덮개를 포함 형 터치 매우 간략하게 다음 필터의 각 반 형 (측면 줄이려고)를 포함에 포함; 그러면는, 단면 중 하나 절단 됩니다 가장자리 쪽으로 필터의 중심에서 .</li>
	<li>포함, 하는 동안를 사용 하 여 집게는 파라핀 혼자 서 서 그들을 위해 충분히 차갑게 될 때까지 서로 떨어지는 반쪽을 방지 하기 위해에서 필터를 잡아. 완전히 경화 될 때까지 차가운 접시 포함 형 이동. 
	참고: 얼음 쟁반에 블록을 냉각 주름된 섹션을 방지 하는 데 도움이 됩니다.</li>
</ol> 6. 단면화 및 가로 면역 형광 검사에 대 한는 VCCC 얼룩 <ol><li>파라핀 블록에 대 한 단면 및 장착 슬라이드: 5 µ m 섹션 잘라내기, 42 ° C 물 욕조에 섹션을 배치 및 충전 된를 사용 하 여 섹션을 선택 슬라이드입니다. 다음 슬라이드를 건조 42 ° C 오븐에 하룻밤 유지.</li>
	<li>재 단계를 시작 하기 전에 빵을 60 ° C에 파라핀을 녹기에서 슬라이드와 슬라이드에 VCCC 섹션을 준수 하는 데 도움이. 짧게, 냉각 후 크 실 렌, 100%의 두 가지 변화를 통해 슬라이드를 rehydrate EtOH, 95 %EtOH, 70%의 한 변화 EtOH, 2의 그리고 변화 증류수.</li>
	<li>Microwaving 또는 난방 섹션 수 있습니다 슬라이드에서가로 포함 하는 항 원 검색 방법을 방지.</li>
	<li>수행 세척 단계 및 이차 항 체 1 시간 실 온에서 다음 4 ° C에서 1 차적인 항 체를 가진 다음 하룻밤 외피, 실내 온도에 1 시간에 대 한 표준 차단. 설치 미디어와 coverslip 탑재.</li>
</ol>

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저자는 공개 없다.

VCCC는 다양 한 MEJs에서 생체 외에서업과 측면에서 이점 하지만 토론의 경우는 VCCC 특정 응용 프로그램에 대 한 이용 될 수 있다 결정할 때. 예를 들어 다른 세포 유형이이 모델 사용할 수 있다면, 그것은 최적화가 필요 합니다. 우리는 기본 인간 세포 사용 하지만 소 aortas24또는 wildtype 또는 녹아웃 쥐에서 세포를 분리 하 여 사용 VCCC1,5,14에서.
VCCC MEJ 격리를 사용 하는 경우 마스터에 가장 중요 한 기술은 MEJ 분수의 순도 초과 내 피 또는 부드러운 근육 세포에 의해 변경 되지 않도록 하는 필터의 철저 한 스크 이다. 우리 나타났습니다 부 럽을 통해 알파 헤모글로빈은 "순수한" MEJ 격리<sup class="x...

작은 직경 저항 동맥, 얇은 내부 탄력 있는 lamina (IEL) 내 피 (EC)와 평활 근 세포 (SMC)를 분리합니다. 셀이 탄성 매트릭스에 구멍을 통해 프로젝트 하 고 갭 정션 채널1,2를 통해 직접 세포질 연결을 만들 수 있습니다. 이 독특한 구조는 myoendothelial 접합 (MEJ) 이라고 불린다. MEJ 작은 (약 0.5 µ m 혈관 침대에 따라 0.5 µ m x), 셀룰러 투영 하지만 내 피 세포의 주로 구성3,4뿐만 아니라 부드러운 근육에서 발생 한 수 있습니다. 수 사관의 수 신호 그것은 피와 부드러운 근육5 사이의 양방향 신호 촉진을 위한 특히 중요 한 위치를 렌더링 MEJ에 선택적으로 발생 하는 네트워크의 엄청난 복잡성을 증명 하고있다 ,6,,78,,910.
그러나,는 MEJ에 신호 통로의 기계 해 부 그대로 동맥에서 어렵습니다. MEJ 셀룰러 프로젝션 때문에 그것 불가능 현재는 비보에 MEJ 혈관 벽에서 분리 합니다. 이러한 이유로 VCCC 모델1 개발 되었다. VCCC 생리 내 피 형태11 와 양극 화는 꼭대기 사이 신호를 복제 하는 중요 한 것은, 셀12MEJ 부분. 그것을 발견 알파 헤모글로빈에에서 있는 내 피 세포는 MEJ에 편광이 독특한 모델 이었습니다. 이것은 알파 헤모글로빈13를 표현 하지 않는 전통적으로 교양된 내 피 세포와 달리 이다. Microvascular 내 피에 관심이 연구원에 대 한 더 작은 직경 저항 동맥에서 발생 하는 신호 경로 해 부 하는 것입니다 의도 하는 경우에 특히 VCCC에서 경작 된 내 피 세포를 사용 하 여 적절 한 수 있습니다.
공동 문화 2 가지 종류를 튼튼한 플라스틱 삽입을 포함 하는 직경이 작은 숨 구멍 (직경에서 0.4 µ m)와 필터를 사용 하 여 계층 간의 마이그레이션에서 세포를 방지 합니다. 그것은 크게 비보, 보다 긴 하지만 여전히 많은 MEJs, 단백질 지 방화, 두 번째 메신저1 신호 등의 비보에 특성의 복제 세포 사이의 10 µ m 거리에서 결과 , 14. 또한는 VCCC 셀 주 작동 근 또는 특정 세포 구획에 적의 추가 통해 신호 유형 특정의 대상에 대 한 수. 예를 들어 BAPTA-킬레이트 칼슘, 오전으로 EC를 로드 하 고 phenylephrine14SMC를 자극. 이 제공 하는 공동 문화 모델15,,1617,18,19,20,21의 다른 설명, 달리 지침에 mRNA와 단백질, 필터 모 공 내의 별개 MEJ 분수를 포함 하 여 독특한 분수를 분리. VCCC에이 기술 추가 mRNA 현지화 또는 전사22,23, 단백질의 인 산화12,및 단백질 활동12변화의 특정 조사 수 있습니다. 이 기사 다른 conformations11,,1824두 세포 유형 문화 수도 있지만 아래에 필터와 SMC EC의 도금 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>24mm 직경, 0.4 &마이크로; m Transwell 폴리에스테 막 여과기 삽입</td><td>Corning</td><td>3450</td> 이것은 삽입 225 cm 플라스크 Corning 431082 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> 6개의 구멍 판의 1개의 6개의 <tr><td>구멍 판덮개 (여과기 삽입 없이)</td><td>입니다Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>1 차적인 인간적인 관상 동맥 내피 세포</td><td>Lonza</td><td>CC-2585</td><td></td></tr><tr><td>1 차적인 인간적인 관상 동맥 평활근 세포</td><td>Lonza</td><td>CC-2583</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 EC 기초 배지</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>EC 성장 인자 (EGM2 MV 단일 인용)</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td>사용 전 기초 배지에 추가</td></tr><tr><td>SmBM SMC 기초 배지</td><td>Lonza</td><td>CC-3181</td><td></td></tr><tr><td>SMC 성장 인자 (SmGM-2 SingleQuot)</td><td>Lonza</td><td>CC-4149</td><td>사용 전 기초 배지에 추가</td></tr><tr><td>0.5% Trypsin-EDTA 10X</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td>멸균 dPBS 혈구계로 2X로 희석</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>15170-208</td><td></td></tr><tr><td>SMC 도금용 대형 페트리 접시(150mm)</td> <td>Corning</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>소 젤라틴</td><td>Sigma</td><td>G-9382</td><td></td></tr><tr><td>인간 피브로넥틴</td><td>Corning</td><td>356008</td><td>5&micro; 피브로넥틴 g/ml 및 -20에 보관</td></tr><tr><td>10x Hanks' Buffered Salt solution (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14065-056</td><td>멸균수로 1x로 희석</td></tr><tr><td>10x Dulbecco의 인산염 완충 식염수(dPBS)</td><td>Gibco</td><td>14200-075</td><td>멸균수로 1x로 희석</td></tr><tr><td>손잡이가 있는 일회용 곡선형 메스(30mm 절삭날)</td><td>Amazon</td><td>MDS15210</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fisher</td><td>17-467-201</td><td></td></tr><tr><td>셀 리프터</td><td>코닝</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>셀 스크레이퍼</td><td>BD 팔콘</td><td>353085</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 원뿔형 튜브</td><td>코닝</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>10 mm 페트리 접시</td><td>팔콘</td><td>35-1008</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy 미니 키트</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>RNA 용해 시약</td><td>Qiagen</td><td>79306</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Sigma</td><td>158127</td> dPBS 70% 에탄올<td>로 4% 용액 만들기</td></tr><tr><td></td><td>Fisher</td><td>04-355-305</td><td></td></tr><tr><td>Cavicide 소독제</td><td>Fisher</td><td>131000</td><td></td></tr><tr><td>RIPA 단백질 용해 완충액</td><td>Sigma</td><td>R0278</td><td></td></tr><tr><td>Sonic dismembranator</td><td>Fisher</td><td>Model 50</td><td></td></tr><tr><td>EC/SMC 및 수확용 1x PBS 면역세포화학</td>: <td>Gibco</td><td>10010023</td>는 <td>멸균</td></tr><tr><td>Name</strong</td><td>>Company<</td><td>strong>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Embedding/Sectioning/Staining</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Fisher</td><td>P31-500</td><td></td></tr><tr><td>자동 조직 처리기</td><td>Excelsior</td><td>ES</td><td></td></tr><tr><td>임베딩 스테이션 + 냉각판</td><td>Leica</td><td>HistoCore Arcadia</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Tek Accu-Edge Microtome blade</td><td>VWR</td><td>25608-961 또는 25608-964</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>Thermo Fisher</td><td>22-230-900</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Thermo Fisher</td><td>12-548-5E</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold mounting medium</td><td>Thermo Fisher</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Other Solutions</td><td></td><td></td><td>**live cells</strong에 솔루션을 사용하는 경우 멸균 상태에서 모든 단계를 수행하십시오></td></tr><tr><td>멸균 dPBS</td><td></td><td></td><td>멸균 할 수있는 오토 클레이브 물. 멸균수를 사용하여 DPBS (450mL 멸균수: 50mL 10X DPBS)를 만들고, 혼합 및 여과하여 살균합니다 (0.2&micro; m filter). 최종 농도: 살균할 1X</td></tr><tr><td>멸균 HBSS</td><td></td><td></td><td>오토클레이브 물. 멸균수를 사용하여 HBSS (450mL 멸균수 : 50mL 10X HBSS)를 만들고 혼합 및 여과 살균 (0.2 &micro; m filter). 최종 농도: 1X</td></tr><tr><td>피브로넥틴 원료 용액</td><td></td><td></td><td>50mL의 멸균수를 피브로넥틴에 사용하여 1mL 분취액을 만든 다음 필요할 때까지 동결 최종 농도: 100&micro; g/mL</td></tr><tr><td>피브로넥틴을 사용하여 VCCC</td><td></td><td></td>의 SMC 측을 코팅하고 <td>분취액 1개를 해동하고 1mL의 피브로넥틴(100&micro; g/mL)를 1X HBSS의 19mL로 변환하여 5&micro의 최종 농도에 도달합니다. g/mL. 최종 농도: 5&micro; g/mL</td></tr><tr><td>2x 트립신 EDTA 용액</td><td></td><td></td><td>10X 0.5% 트립신-EDTA를 1X dPBS(40mL DPBS: 10mL 10X 트립신)로 2X로 희석합니다. 최종 농도: 2X</td></tr><tr><td>차단/항체 용액</td><td></td><td></td><td>(9mL 1X PBS, 25mL Triton X100, 50mg 소 혈청 알부민, 500mL 일반 혈청</td></tr>)<tr><td>EC VCCC</td><td></td><td></td><td>를 코팅하는 소 젤라틴소 젤라틴 0.5g을 증류수 100mL에 섞습니다. 처음 사용하기 전에 오토클레이브하고 실온에서 보관하십시오. 멸균 상태로 유지하십시오. 최종 농도:</td></tr> <tr>세포 <td></td><td></td> 수확을 위한 0.50%<td>1x PBS</td><td>는 멸균될 필요가 없습니다.</td></tr></tbody></table>

저항 동맥의 세포 문화 모델

A Cell Culture Model of Resistance Arteries 

Myoendothelial 접합 (MEJ), 작은 직경 저항 동맥에 독특한 신호 microdomain 특정 단백질과 혈관 음색 및 혈압을 제어할 수 있는 신호 프로세스의 지역화를 전시 한다. 그것에서 프로젝션 내 피 또는 부드러운 근육 세포와 그것의 작은 때문에 MEJ (평균에, ~ 1 µ m2의 영역), 크기 격리에서 공부 하기 어렵습니다. 그러나, 우리는 MEJ 대형 생체 외에서 내 피 세포의 양극 화, 그리고 신호 단백질 및 프로세스의 저항 혈관 벽에의 해 부에 대 한 있도록 혈관 세포 공동 문화 (VCCC) 라는 세포 문화 모델 개발 동맥입니다. VCCC 다양 한 응용 프로그램 있으며 서로 다른 세포 유형에 맞게 적용할 수 있습니다. 0.4 µ m 모 공에는 생체 외에서 MEJs를 형성할 수 있습니다와 필터의 반대 측에 2 개의 세포 유형 모델에 의하여 이루어져 있다. 여기 우리가 설명 셀의 도금 및 절연의 내 피, 통해 VCCC 만드는 방법을 MEJ, 및 단백질 격리 또는 활동에 사용할 수 있습니다 부드러운 근육 분수 분석 실험. 포함 된, 그리고 immunofluorescent 분석 sectioned에 그대로 셀 레이어 필터를 해결할 수 있습니다. 중요 한 것은,이 모델에서 발견의 많은 생리 적인 관련성을 강조 하는 그대로 저항 동맥을 사용 하 여 확인 되었습니다.

필터 삽입 사용 VCCC는 있다 작은, 0.4 µ m 구멍. 그림 1A, VCCC 필터 삽입의 en 얼굴 보기는 MEJ 생체 외에서형성할 수 있다 숨 구멍을 보여줍니다. 회로도 1 일 내 피 세포는 반대 측 (그림 1B)에 도금 하기 전에 필터의 더 낮은 측에 도금 하는 평활 근 세포를 묘사 한다. 일단 세포는 도금 EC, MEJ, 및 SMC 분수 3 일 후에 격리 될 수 있습니다. 이 예제는 그림 2A, 플라스 미노 겐 활성 제 억제 물 1 (파이-1) 또한 MEJs25 vivo에서 에서 볼 수 있는 EC의 나머지 부분에 상대적으로 MEJ 분수 표현 매우에 표시 됩니다. 이러한 데이터에 그대로 arteriolar 혈관 벽...

저항 동맥의 세포 문화 모델, 신호 경로 내 피, 평활 근, 또는 피와 부드러운 근육 (myoendothelial 교차점) 사이 해 부에 대 한 수 있도록 설명 되어 있습니다. 이 셀 문화 모델을 사용 하 여 면역 형광 검사, 전자 현미경, 또는 단백질 격리, 촉진제의 선택적 응용 프로그램을 활용할 수 있습니다.

The myoendothelial junction (MEJ), a unique signaling microdomain in small diameter resistance arteries, exhibits localization of specific proteins and ...

이 기술의 전반적인 목표는 내피세포와 평활근세포를 체외에서 함께 배양하여 소경성 저항 동맥에서 발생하는 근내피 접합부를 생성하는 것입니다. 이 방법은 동맥벽 내의 단백질 국소화 및 신호 전달 폭포의 활성화와 같이 심혈관 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 실제 동맥을 사용해서는 불가능한 내피 및 평활근으로부터의 근내피 접합부 분획을 특이적으로 분리할 수 있다는 점입니다.파라핀 매립 과정은 직접 보지 않고는 배우기 어려울 수 있으므로, 이에 대한 시각적 시연이 특히 중요합니다. 먼저 소독제를 150 millimeter 페트리 접시와 뚜껑에 뿌린 후 종이 타월이나 보푸라기가 없는 와이프로 닦아내어 혈관 세포 공동 배양 또는 VCCC 구축을 시작합니다. 그 다음, 페트리 접시에 70% ethanol을 뿌리고 후드 안에 두어 자연 건조시킵니다.멸균 조건 하에서 필터 인서트 플레이트를 엽니다. 플레이트 하단의 측면 슬릿을 통해 fiberactin 용액을 최대 1mL까지 피펫팅하여 필터의 바닥면을 코팅합니다. 필터의 하단 절반이 완전히 덮였는지 확인하고, 플레이트 커버를 덮은 상태로 인서트를 후드 안에 둡니다.fiberaction 용액으로 30분 동안 처리한 후, 필터 인서트가 움직이지 않도록 주의하며 남은 용액을 진공 흡입하여 제거합니다. 그런 다음 플레이트를 뒤집어 필터가 깨끗한 페트리 접시의 바닥 부분에 닿게 합니다. 225 cm² 플라스크의 평활근 세포를 3 mL의 예열된 trypsin EDTA 용액으로 트립신 처리합니다.세포가 완전히 떨어져 나오면, trypsin을 중화시키기 위해 9 mL의 SMC 배지를 첨가합니다. 원심분리관(conical tube)으로 옮겨 잘 섞어줍니다. 그 후, 세포 수를 측정하기 위해 hemocytometer에 10 µL를 피펫으로 분주합니다.세포 수를 측정한 후, 약 75,000개의 평활근 세포가 포함된 세포 현탁액 750 µL를 각 필터의 바닥면에 조심스럽게 분주합니다. 플레이트를 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 이튿날, 깨끗한 6-well 플레이트의 각 웰에 미리 데워둔 신선한 SMC 배지 2 mL를 채웁니다.흡입기로 인서트에서 배지를 제거하고 SMC 배지가 들어있는 6웰 플레이트로 옮깁니다. 인서트 윗면에 0.5% bovine gelatin 용액 1 mL를 넣고 37 °C에서 최소 30분 동안 둡니다. 37 °C로 예열

a-cell-culture-model-of-resistance-arteries

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

혈관 세포 기능은 세포 내 메신저의 활성에 따라 달라집니다.  여기에 설명된 것은 고립된 대동맥의 개별 내피 및 평활근 세포에서 생리학적 및 약리학적 자극에 반응하여 세포 내 칼슘 및 산화질소 수준을 측정할 수 있는 생체 외 이광자 이미징 방법입니다.

세포 내 칼슘의 두 광자 이미징<sup&gt; 2 +</sup&gt; 고립 된 쥐 대동맥의 취급 및 내피 세포에서 산화 질소 생산과 부드러운 근육 세포

혈관 내피 세포는 많은 중요한 심혈관 질환에서 중요한 역할을 합니다. 이 기사에서는 특별한 장비를 사용하지 않고 쥐 대동맥에서 내피 세포를 분리하고 확장하는 간단한 방법을 설명합니다. 당사의 프로토콜은 내피 세포 생리병리학에서 메커니즘을 식별하는 효과적인 수단을 제공합니다.

분리 및 마우스 대동맥 내피 세포의 차 문화

이 프로토콜은 질환 병상의 세포 응답을 결정하는 데에 도움이 시험관 내에서 생리 학적 또는 병리학 적 혈류를 복제. 혈액 펌프의 하류 챔버 압력 감쇠를 도입하여, 맥관 걸쳐 혈류량 효과적으로 요약 될 수 있고, 혈관 내피 또는 유사체 공동 배양 단층 부과.

혈관 세포 리모델링의 조사에 생리의 체외 모델 및 응용 프로그램과 함께 병리학 혈액 흐름

혈관 석회화는 인간의 심혈관 질환을 예측하는 중요한 인자이자 기여자입니다. 이 프로토콜은 근적외선 형광 이미징을 사용하여 배양된 1차 혈관 평활근 세포의 석회화를 유도하고 동물 대동맥의 석회화 및 대식세포 부담을 정량화하는 방법을 설명합니다.

대동맥 석회화와 염증의 혈관 평활근 세포 및 이미지의 석회화

심혈관 수술 (바이 패스 수술, 혈관 성형술 또는 스텐트 삽입) 후의 재 협착은 이러한 과정의 내구성을 감소시키는 중요한 문제입니다. 이상적인 치료법은 내피 세포의 재생을 촉진시키면서 평활근 세포 (VSMC)의 증식을 억제합니다. 우리는 생체 내에서 VSMC의 증식과 내피 기능의 동시 평가를위한 모델을 설명합니다.

소뇌 대동맥 파열 상해 : 효율적<em&gt; In Vivo</em&gt; 평활근 세포 증식과 내피 기능 모델

여기, 선물이 대동맥 반지 분석 결과의 새로운 응용 프로그램 prelabelled 중간 엽 세포는 쥐 대동맥 파생 내 피 네트워크와 공동 경작. 이 새로운 메서드 Mesenchymal Stromal 세포 (MSCs) 유도 및 내 피 네트워크와 통합의 시각화, 네트워크 속성의 정량화 및 MSC immunophenotypes 고 진 식의 평가 수 있습니다.

대동맥 반지 공동 문화 분석 결과: Mesenchymal Stromal 세포에 생체 외에서 의 신생 잠재력을 평가 하는 편리한 도구

이 원고는 쥐 대뇌 저항 동맥 혈관 기능을 평가 하기 위한 비디오 현미경 검사 법 프로토콜을 체 외에 설명 합니다. 원고는 또한 레이저 도플러 Flowmetry를 사용 하 여 붙일 레이블된 lectin과 조직 관류와 microvessel 밀도 평가 하기 위한 기법을 설명 합니다.

쥐의 고립 된 저항 동맥의 비디오 현미경을 이용 하 여 혈관 제어 메커니즘의 평가

관상 동맥 혈관신생의 시험관내 모델은 관상 동맥 혈관신생의 세포 및 분자 기전의 발견을 위해 이용될 수 있다. 부비동 및 심내막 조직의 체외 배원 배양은 VEGF-A에 반응하여 견고한 성장을 나타내고 생체 내에서와 같이 COUP-TFII 발현의 유사한 패턴을 표시한다.

관상 동맥 혈관 신생의 체외 모델

여기서, 우리는 생리적 흐름하에서 제조된 실제 크기의 3차원 인간 동맥 모델에서 내피 세포에 약물 운반대의 표적 증착을 연구하고 매핑하는 새로운 프로토콜을 제시한다. 제시된 방법은 혈관 시스템 내의 약운반체를 표적으로 하는 새로운 플랫폼역할을 할 수 있다.

유동 하에서 혈관 약물 표적화 연구를 위한 체외 3D 세포 배양 동맥 모델

여기에서는 인간 대동맥 벽에서 평활근 세포의 생체 내 생체 역학적 변형을 복제하기 위해 인간 대동맥 평활근 세포 장기 온 칩 모델을 개발했습니다.

대동맥 벽의 생체 역학적 변형을 요약하기 위한 인간 대동맥 평활근 세포 장기 온 칩 모델 구축

여기에서는 분자 또는 조직병리학적 분석을 위해 절편하기 전에 조직 안정화 젤을 혈관 내강에 주입하여 인간 동맥 구조를 보존하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

체외 내강내 젤 주입: 인간 저항 동맥의 현미경 분석을 위한 고급 접근 방식

배우세요 저항 동맥의 근내피세포 접합부 연구를 위한 세포 공배양 기법을 사용하여 심혈관 신호전달 경로를 분석하는 방법을. 이 모델은 단백질 국소화와 세포 간 상호작용을 효과적으로 연구할 수 있는 귀중한 도구를 제공합니다.

저항 동맥의 세포 문화 모델

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