저항 동맥의 세포 문화 모델

이 기술의 전반적인 목표는 내피 세포와 평활근 세포를 체외에서 함께 배양하여 작은 직경의 저항 동맥에서 발생하는 근내피 접합부를 만드는 것입니다. 이 방법은 단백질 국소화 및 동맥 벽의 신호 폭포 활성화와 같은 심혈관 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 실제 동맥을 사용하여 수행할 수 없는 내피 및 평활근에서 근 접합 분획을 구체적으로 분리할 수 있다는 것입니다.

파라핀 임베딩의 시각적 시연은 프로세스를 않고는 임베딩 단계를 배우기 어려울 수 있으므로 특히 중요합니다. 150mm 페트리 접시와 뚜껑에 소독제를 뿌린 다음 종이 타월이나 보푸라기가 없는 물티슈로 닦아 혈관 세포 공동 배양 또는 VCCC의 구성을 시작합니다. 그런 다음 페트리 접시에 70% 에탄올을 뿌리고 후드에 넣어 자연 건조합니다.

멸균 상태에서 필터 인서트 플레이트를 엽니다. 측면 슬릿을 통해 최대 1ml의 파이버락틴 용액을 플레이트 바닥으로 피펫팅하여 필터의 바닥면을 파이버락틴 용액으로 코팅합니다. 필터의 아래쪽 절반이 덮여 있는지 확인하고 플레이트 덮개를 유지하면서 인서트를 후드에 그대로 두십시오.

fiberaction 용액으로 30분 처리한 후 필터 인서트를 방해하지 않고 과도한 용액을 진공 청소기로 청소합니다. 그런 다음 플레이트를 뒤집어 깨끗한 페트리 접시의 아래쪽 절반에 필터를 놓습니다. 225제곱센티미터 플라스크의 평활근 세포를 3ml의 미리 데워진 트립신 EDTA 용액으로 트립신화합니다.

세포가 제거되면 9ml의 SMC 배지를 첨가하여 트립신을 중화합니다. 원뿔형 튜브로 옮기고 잘 섞습니다. 그런 다음 혈구계에 10마이크로리터를 피펫팅하여 세포 수를 측정합니다.

세포 계수를 실행한 후에, 대략 75, 000의 평활근 세포를 포함하는 세포 현탁액의 750 마이크로리터를 각 여과기의 밑바닥 측에 주의깊게 격판덮개로 끼워넣으십시오. 접시를 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 2일차에는 깨끗한 6웰 플레이트의 각 웰에 2밀리리터의 예열된 신선한 SMC 배지를 채웁니다.

흡입으로 인서트에서 매체를 제거하고 SMC 매체가 있는 6웰 플레이트로 옮깁니다. 인서트의 윗면에 0.5% 소 젤라틴 용액 1ml를 넣고 섭씨 37도에서 최소 30분 동안 놓습니다. 225제곱센티미터 플라스크의 내피 세포를 3ml의 미리 데워진 트립신 EDTA 용액으로 트립신화합니다.

플라스크를 부드럽게 두드려 플레이트에서 세포를 들어 올립니다. EC 배지에서 세포를 다시 현탁시키고 세포 계수를 수행한 후 필터에서 젤라틴을 제거합니다. 그런 다음 360, 000 ECs를 1ml 용량으로 각 필터 인서트의 상단에 플레이트합니다.

세포가 섭씨 37도에서 24시간 동안 방해받지 않고 배양되도록 합니다. 세포 배양 후드에 있는 삽입물의 6웰 플레이트 1개에서 배지를 흡입한 다음 얼음 위의 냉장실로 운반하여 분획을 시작합니다. 냉장실에서 10 마이크로 리터의 PBS를 인서트의 SMC 쪽에 피펫팅합니다.

셀 리프터를 사용하여 SMC를 긁어냅니다. 그런 다음 스크레이퍼에서 용해 완충액이 포함된 라벨링된 페트리 접시로 세포를 옮깁니다. 셀 스크레이퍼가 용해 버퍼에 닿으면 종이 타월로 완전히 닦아내고 건조될 때까지 인서트 필터에 닿지 않도록 하십시오.

SMC 필터 폐기를 한 번 또는 두 번 더 반복하여 남아 있는 SMC 셀 파편을 완전히 제거합니다. 다음으로, 10마이크로리터의 PBS를 인서트 필터의 내피 세포 쪽에 피펫팅합니다. 방금 설명한 것처럼 적절하게 라벨링된 용해 완충액의 페트리 접시에 세포를 긁어냅니다.

피펫을 사용하여 필터의 EC 쪽에서 세포 슬러리를 수집하고 적절하게 라벨링된 페트리 접시로 옮깁니다. 근내피 접합 분획에서 세포 오염을 최소화하기 위해 필터 양쪽에서 세포를 매우 철저하게 긁어내십시오. 그런 다음 메스를 조심스럽게 사용하여 플라스틱 인서트에서 필터를 잘라냅니다.

플라스틱에서 70-80%를 절단하고 집게를 사용하여 필터를 플라스틱 삽입 구조에서 완전히 당겨 빼냅니다. 각 필터를 용해 완충액이 들어 있는 라벨이 부착된 50ml 원뿔형 튜브로 향하게 합니다. 필터가 버퍼에 잠겨 있고 젖은 상태로 유지되는지 확인하십시오.

필터에서 모든 세포를 채취한 후 50ml MEJ 튜브를 15초 동안 또는 잘 혼합될 때까지 최대 강도로 소용돌이칩니다. 집게로 MEJ 원뿔형에서 필터를 제거하고 튜브의 측벽을 따라 드래그하여 튜브에 최대한의 단백질과 액체를 남깁니다. MEJ 원뿔형 튜브에서 모든 필터를 제거한 후 원심분리기에서 빠르게 회전하여 모든 액체와 단백질을 튜브 바닥으로 끌어당깁니다.

스핀 후 MEJ 튜브와 SMC 및 EC 페트리 접시의 내용물을 별도의 작은 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 15분 동안 16, 000 x G에 가까운 튜브를 원심분리합니다. 상층액을 제거합니다.

그런 다음 비인코네틱 분석을 사용하여 단백질 함량에 대해 세포를 용해합니다. VCCC 배양 5일차에 헹궈진 필터 인서트가 포함된 각 웰에 4%PFA를 추가하고 섭씨 4도에서 흔들면서 밤새 배양합니다. 약 24시간 후 인서트를 최소 24시간 동안 70% 에탄올로 옮깁니다.

자동화된 조직 처리기에서 장기간에 걸쳐 필터를 처리합니다. 실행 후 집게를 사용하여 카세트에서 필터를 제거하여 필터를 가장자리에 잡은 다음 가위로 필터를 반으로 자릅니다. 두 반쪽을 각각 냉각판에 놓고 임베딩 몰드에 액체 파라핀을 채웁니다.

채워진 임베딩 몰드를 냉각판에 아주 짧게 터치한 다음 절단면이 아래로 향하게 하여 필터의 각 절반을 임베딩 몰드에 삽입하여 필터가 중앙에서 절단되도록 합니다. 파라핀이 단독으로 설 수 있을 만큼 충분히 식을 때까지 반쪽이 서로 떨어지지 않도록 집게를 사용하여 필터를 제자리에 고정합니다. 그런 다음 완전히 응고될 때까지 매립 금형을 냉각판으로 이동합니다.

필터링된 삽입물을 수직 방향으로 삽입하고 절단합니다. 절편 후 VCCC는 횡방향 면역형광을 위해 면역 염색할 수 있습니다. 이 면역투과 전자 현미경 이미지는 검은 점으로 나타나는 금색 구슬로 표시된 MEJ에서 알파 글로빈이 발현되는 쥐 동맥을 보여줍니다.

이 웨스턴 블롯은 플라스미노겐 활성화 억제제 1 발현이 EC 또는 SMC 분획에 비해 MEJ 분획에서 풍부함을 보여줍니다. 플라스틱 EC는 MEJ를 형성하지 않는 플라스틱 접시에서 자란 EC를 나타냅니다. 면역염색은 VCCC 모델의 긴밀한 구획화를 보여줍니다.

알파-1 아드레날린성 수용체는 평활근 세포층에서만 볼 수 있고, 브래디키닌 수용체는 내피 세포층에서만 볼 수 있습니다. F 액틴 염색은 흰색 화살표로 표시된 것처럼 in-vitro MEJ에서 두 세포 유형 모두에 걸쳐 발생합니다. 이 절차를 시도하는 동안 수확 때까지 모든 것을 멸균 상태로 유지하고 세포를 조심스럽게 도금하고 필터를 철저히 긁어내는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 웨스턴 블로팅(western blotting) 또는 면역형광(immunofluorescence)과 같은 다른 방법을 수행하여 단백질 국소화, 발현 수준 또는 활성화와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.