Name: 질량 분석 기반 식별 RNA 바인딩 영역에 대 한 샘플 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: 배우세요 생세포에서 UV 광교차결합 및 질량 분석을 이용해 RNA 결합 단백질과 그 결합 영역을 식별하는 방법을. 마우스 배아줄기세포를 활용하여 후성유전학적 조절자와 RNA 상호작용을 연구할 수 있습니다.

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R.B.는 Searle 학자 프로그램, 트 면 스미스 재단 (C1404), 그리고 천 재단 (1-년도-15-344)의 3 월에 의해 지원 되었다. B.A.G는 NIH에서 지원 R01GM110174 및 NIH R01AI118891 국방부 뿐만 아니라 BC123187P1를 부여 부여 인정 합니다. R.W.-T. NIH 훈련 그랜트 T32GM008216에 의해 지원 되었다.

1. 문화 및 mESCs의 확장 참고: 마우스 배아 줄기 세포 문화에 쉽게 하 고 그들의 빠른 사이클 시간 덕분에 생 화 확 적인 실험에 필요한 큰 숫자를 신속 하 게 확장 될 수 있다. 건강 한 mESCs 더블 모든 12 헤
<li>MESC gelatinized 번호판에 원하는 번호를 확장 mESCs <ol>매체 (아래 참조) 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° c, 5% CO 2, 보관 및 &#62; 95% 습도. 
	참고: 3-5에 대 한 생물 학적 복제에 대 한 준비 한다 충분 한 격판덮개는 + 4SU 샘플-4SU 컨트롤. 한 10 cm 플레이트 (즉, 5-10 백만 셀)는 각 생물 복제에 게 충분 한 것 보다 더.</li>
	<li>MESCs에 대 한 매체 Dulbecco의 구성 &#39; s 수정이 글 &#39; s 매체 (DMEM) 보충 15% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), L-글루타민, 2mm 페니실린/스, 1 x 비 본질적인 아미노산, 100 µ M 베타-mercaptoethanol, 1000 U x 0.5 /mL 백혈병 금지 요인 (LIF), 3 µ M CHIR99021, 1 µ M PD0325901.</li>
	<li>뿌리고 mESCs, 전에 준비 10 cm 번호판의 원하는 수.
	<ol><li>확인 접시의 전체 표면을 커버 하 고 물에 0.1% 젤라틴의 4 개 mL를 추가, 실 온 (RT)에서 10 분 동안 품 어, 젤라틴 솔루션 제거.</li>
	</ol></li> <li>통행 셀에 도달할 때 접시, 당 ~ 10 백만 셀 일반적으로 다음 접종 ~ 48 h. 
	참고: mESCs 조밀한 식민지에서 성장, 접시 결코 허용 되어야 한다 monolayers (예: HEK293 또는 3T3 세포)에서 성장 하는 세포 라인에 대 한 관찰로 100 %confluency 도달. ~ 50 %confluent 매체 전에 확실히 노란색 때 mESC 접시를 passaged 해야 합니다.
	<ol>셀을 분리 하려면 <li>1 x 2 mM EDTA, 보충 버퍼링 인산 염 (PBS)에 한 번 밀도 mESC 문화 접시를 씻어 다음 0.05% trypsin DMEM에 녹아 추가 하 고 5 분 동안 인큐베이터에 접시를 반환 (37 ° C, 5% CO 2, 그리고 &#62; 95% 습도).</li>
		<li>인큐베이터에서 플레이트를 제거 하 고 적극적으로 여러 번 위아래로 pipetting으로 DMEM의 동등한 양으로 셀 resuspend.</li>
		<li>Hemocytometer를 사용 하 여 셀 및 셀 단일 세포 현 탁 액을 형성 있도록 (즉, 없음 클러스터), 다음 실 온에서 5 분에 대 한 셀 혼합 500 x g 원심. 상쾌한을 제거 하 고 1-2 ml DMEM 셀 펠 릿 resuspend.</li>
		<li>MESC 매체 (즉 800000 ~ 10 cm 접시 당 세포)에 10, 000 셀/c m 2의 조밀도에 세포를 접종 준비 단계 1.3.1에서에서 젤라틴 코팅 접시를 사용 하 여.</li>
	</ol></li></ol> 2. 단백질 Crosslink &#8211; 라이브 세포 상호 작용 RNA 참고: RNA-단백질 가교는 사진-활성화 ribonucleoside 아날로그 4-thiouridine (4SU)에 의해 중재입니다. 4SU는 내 생 보다 더 흡수도 최대 뉴클레오티드 RNA;로 통합 될 수 있다 고 따라서 중간 파장 UVB는 선택적으로 crosslink RNA 단백질 25 , 26를 사용할 수 있습니다. 4SU 치료 세포의 UVB 치료 리드 화학식 crosslinks에 4SU 포함 된 RNA 및 Tyr에 대 한 보고 선호와 아미노산 사이 Trp, 메트로, 리스, 그리고 Cys 27.
<li>1 단계에 설명 된 필요한 개수의 10 cm 번호판 확장 mESCs <ol>. 
	참고: 3-5에 대 한 생물 학적 복제에 대 한 준비 한다 충분 한 격판덮개는 + 4SU 샘플-4SU 컨트롤. 한 10 cm 플레이트 (즉, 5-10 백만 셀)은 각 생물 복제에 대 한 충분 한.</li>
	<li>판 confluency, 도달 하기 전에 추가 4SU 매체에 직접 500의 최종 농도에 µ M. 남겨 주세요-4SU 제어 요리 치료.</li>
	<li>균질 매체에 걸쳐 4SU 배포를 부드럽게 흔들어 접시. 2 시간에 대 한 동일한 조직 문화 인큐베이터에 그들을 반환 (37 ° C, 5% CO 2, 그리고 &#62; 95% 습도).</li>
	<li>접시 얼음 양동이 전송과 매체 삭제.</li>
	<li>씻어 얼음 처럼 차가운 PBS의 5 mL와 함께 부드럽게 접시. 
	참고: 부드럽게 린스 또는 셀 분리 수 있습니다.</li>
	<li>UVB 방출 전구 장착 crosslinker에 뚜껑 없이 얼음 처럼 차가운 PBS와 장소 격판덮개의 2 개 mL를 추가 (312 nm). 1 J/c m 2의 에너지 설정에서 번호판을 비추는. 
	참고: 그것은 플라스틱 뚜껑 제거 하거나 자외선 으로부터 세포를 보호 하 고 가교를 방지 수 중요.</li>
	<li>셀 옮기는 사용 하 여 셀을 수집 하 고 전송 원뿔 관에 얼음 처럼 차가운 PBS. 5 분, 4 ° c.에 대 한 2000 x g에서 원심 분리기</li>
	<li>는 상쾌한을 제거 하 고 5 mL 2 mM EDTA와 0.2 m m phenylmethylsulfonyl 불 (PMSF)와 얼음 처럼 차가운 PBS에 셀 펠 릿 resuspend.</li>
	<li>수 세포는 hemocytometer를 사용 하 여입니다. 10 cm와 15 cm에서에서 5-10 및 10-20 백만 셀을 각각 기대.</li>
	<li>분리기 2000 x g에서 5 분, 4 ° c. 
	참고: 수송과 세포 수 있습니다 즉시 사용 3 단계 또는 플래시-액체 질소에서 냉동 하 고 무기한-80 ° C에서 저장 수 있습니다. 이것은 잠재적인 정지점.</li>
</ol> 3. 핵의 절연 참고: 핵 세포질 단백질을 제거 하 고 핵 단백질의 범위를 증가에 격리 됩니다. 이 단계는 다른 세포질 격실에서 RBPs 공부 세포 분별 법의 다른 형태와 대체 될 수 있다.
<ol><li>준비 얼음 감기 (10 mM Tris HCl pH 7.9, 4 ° C, 1.5 m m MgCl 2, 10mm KCl) 버퍼. 10 백만 셀 (으로 단계 2.9에서에서 계산) 당 적어도 2.5 mL를 사용 하 여 추출. 
	참고: 버퍼 A의 주식 (예를 들면: 500 mL 병) 미리 준비 고 6 개월 동안 4 ° C에서 저장 될 수 있습니다.
	<li>사용 전에 0.5 m m dithiothreitol (DTT)와 0.2 밀리미터 PMSF 차가운 버퍼 A. 원하는 금액 (2.5 mL 당 10 백만 셀)을 추가</li> 하는 <ol>
	</ol></li> <li>10 백만 셀 당 2 mL 버퍼 A 사용 하 여 셀을 씻어. 4 ° c.에서 5 분 동안 2500 x g에서 회전</li>
	<li>삭제 상쾌한 추가 버퍼 A octyl-phenoxy-polyethoxy-에탄올 등 비, 비 변성 시키기 세제의 0.2%와 보충 (재료의 표 참조), 500 µ L 당 10 백만 셀. 4 ° c.에서 5 분 동안 회전</li>
	<li>5 분에 대 한 2500 x g에서 원심 분리기</li>
	<li>제거는 상쾌한, 세포질 없는 그대로 핵을 구성 하는 펠 릿. 
	참고: 핵 단계 4 또는 플래시-냉동 액체 질소에 대 한 즉시 사용 고 무기한-80 ° C에서 저장 될 수 있습니다. 이것은 잠재적인 정지점.</li>
</ol> 4. 핵의 세포 참고: 가교 된 핵은 단백질 및 단백질 RNA 복합물을 질량 분석 호환 버퍼에서 lysed.
10 백만 셀 당 200 µ L <ol><li>추가 세포의 용 해 버퍼 (9 M 요소, 100 mM Tris HCl pH 8.0, 24 ° C). Chromatin는 1/8를 사용 하 여 기울이려면 sonicate &#34; 5-10 미에 대 한 50% 진폭 설정에서 프로브</li>
	<li>스핀 5 분 g x 12, 000와 수집 175 µ L의 펠 릿을 피하기 위해 상쾌한. 
	참고: 다음 RBR ID 단계 사용 됩니다 100 µ L 고 lysate의 나머지 75 µ L 나중에 사용 및 서쪽 오 점 분석-80 ° C에 저장 될 수 있다.</li>
	<li>측정 단백질 농도 Bradford 분석 실험 또는 유사한 기술 28을 통해. 다른 샘플을 1 mg/mL에서 단백질 농도 또는 세포의 용 해 버퍼의 적절 한 금액을 사용 하 여 낮은 샘플 농도 희석. 
	참고: 10 백만 mESCs의 핵에서 단백질의 100-200 µ g 기대.</li>
</ol> 5. 트립 신 소화 참고: 단백질 펩 티 드 s 생성 하 소화는하단-최대 질량 분석 (MS) 분석에 대 한의 uitable.
<ol><li>실시간에서 1 시간에 대 한 품 어 핵 lysate (5 m m 마지막); DTT 추가 솔루션</li>
	<li>신선한 주식 (최종 14 m m)에서 iodoacetamide를 추가, 어둠 속에서 RT에서 30 분 동안 품 어.</li>
	<li>50mm NH 4 HCO 3의 5 번 볼륨 lysate Dilute</li>
	<li>트립 신 추가 (µ g 단백질: µ g 트립 신 = 200: 1). 37 ° C에서 밤새 품 어.</li>
</ol> 6. 펩 티 드의 담 <ol><li>샘플 당 하나의 맞춤 단계 팁 준비.
	<ol><li>6.1.1. 고체 상 추출 C18 물자의 디스크 200 µ L 피 펫 팁의 하단에 배치.</li>
		<li>추가 50 µ L 올리고 R3의 C18 디스크 위에 수 지 위상 반전. 원심 분리 어댑터 내부 단계 팁과 1.5 mL microfuge 관 내부 어댑터와 장소 팁.</li>
		<li>씻어 팁 추가 100 µ L 100% 이기. 용 매를 제거 하는 1 분에 1000 x g에서 원심 분리기.</li>
		<li>평형 50 µ L 0.1 %trifluoroacetic 산 (TFA). 1 분에 1000 x g에서 원심 분리기</li>
	</ol></li> <li>소화 단백질 샘플 2-3 pH 감소를 100% 포 름 산 추가. 
	참고:이 샘플 희석된 펩 티 드의 1 mL 당 ~ 5 µ L를 필요로 한다 하지만 pH 측정 하 고 더 개미의 산 추가 해야 합니다. 필요한 경우.</li>
	<li>맞춤 단계 팁, 샘플의 모든 때까지 1 분에 1000 x g에서 원심 분리기에 부하 샘플 팁을 통해 간다.</li>
	<li>세척 바인딩된 펩 티 드 50 µ L 0.1 %TFA. 1 분에 1000 x g에서 원심 분리기</li>
	<li>50 µ L 차입 버퍼를 추가 하 여 펩 티 드를 elute (75% 이기, 0.025 %TFA) 단계 팁을 팁에서 차입 버퍼를 1 분 동안 1000 x g에서 원심 분리기.</li>
	<li>건조 150g x 1 헤에 대 한 인민군 제 1-3에서 설정 진공 원심 분리기를 사용 하 여 샘플 
	참고: 말린된 펩 티 드 저장할 수 있습니다-80 ° C에 무기한. 이것은 잠재적인 정지점.</li>
</ol> 7. 가교 된 RNA의 제거 참고: 가교 된 RNA를 제거 하는 nuclease와 펩 티 드를 치료.
<ol><li>Nuclease 버퍼 (100mm NH 4 HCO 3, 4 m m MgCl 2) x 50 µ L 2에서에서 펠 릿 resuspend.</li>
	<li>측정 펩 티 드 농도 280에서 흡 광도 사용 하 여 가정 1 mg/mL 1의 A 280에 대 한 펩 티 드의 nm. 
	참고: 예상된 농도 1 mg/mL.</li>
	<li>모든 샘플 1 mg/mL 또는 nuclease 버퍼 x 2를 사용 하 여 최저 농도 조정.</li>
	<li>50 µ L H 2 O + 1 µ L 고 순도 nuclease 마스터 믹스를 준비 (&#8805; 250 U) (테이블의 자료를 참조) 샘플 당.</li>
	<li>펩 티 드 샘플의 50 µ L 고 추가 50 µ L H 2 O + nuclease 믹스 마스터.</li>
	<li>품 1 h. 질량 분석을 수행 하는 진행에 대 한 37 ° C에서. 
	참고:는 펩 티 드 질량 분석에 대 한 준비가 이제 있습니다. 그들은 즉시 분석 하거나 무기한-80 ° C에서 저장 될 수 있습니다. 이것은 잠재적인 정지점.</li>
</ol> 8. 나노 액체 크로마토그래피, 질량 분석 및 원시 데이터 처리 참고: 4SU 가교는 펩 티 드의 질량 때문에, 그들의 이온 합산 되지 않습니다 비 가교 된 펩타이드의 농도 LC-MS/MS, 중 따라서는 가교에 의해 감소 될 것으로 보인다. 24 각 펩 티 드 단백질-RNA 가교의 정도 반영 하는 정도와이 감소의 일관성.
<ol><li>준비 HPLC 다음과 같이 버퍼: HPLC 급 물 (버퍼 A) 0.1% 포 름 산, HPLC 급 이기 (버퍼 B)에서 0.1% 개미 산.</li>
	<li>나노 HPLC를 사용할 수 있으면 다음 사양 나노 열 연결: 내부 직경 75 µ m; C18-AQ 입자; 포장 길이 20-25 cm. 
	참고: 사용할 수 있는 HPLC 높은 흐름 속도에서 실행 되는 경우 지정 된 유량에 대 한 적절 한 열 크기를 사용 합니다. 높은 흐름 크로마토그래피 감도 감소.</li>
	<li>프로그램 HPLC 방법은 다음과 같습니다: 흐름 속도 250-300 nL/분; 28 다음 5 분 동안 80 %B isocratic 80% B 10 분에서에서 120 분에 28% 버퍼 B에 2에서 그라데이션 
	참고:는 HPLC 자동된 열 평형 사전 샘플 로드 되어 있지 않으면, 시작 프로그램 0% B 10 분 샘플을 로드 하기 전에.</li>
	<li>MS 인수 메서드를 표준 샷건 proteomics 실험으로 데이터 종속 수집 (DDA) 프로그램. 악기 듀티 사이클 탠덤 MS 스캔 (또는 MS/MS)의 가장 강렬한 신호 전체 MS 검사 대체 한다. Proteomics MS 실행에 대 한 최적의 설정을 사용 하 여. 
	참고: 자신감의 결과 대 한 높은 해상도 모드 (예: orbitrap, 비행 시간)에 스캔 전체 MS 이상 수행할 수 있는 사용 악기. 정확한 정량화에 대 한 있는지 확인 전체 MS 검사 간의 간격으로 더 이상 보다 3 s. 더 듀티 사이클 추출된 이온 chromatograms의 정확한 정의 되지 않을 수 없습니다.</li>
	<li>는 HPLC 열에 샘플의 1-2 µ g를 로드 하 고 프로그래밍 HPLC-MS/MS 메서드를 실행 합니다. 각 생물 복제에 대 한 적어도 2 개의 독립적인 실행을 수행 하 고 그들을 치료 기술 복제.</li>
	<li>후 MS, MS/MS 스펙트럼 식별 및 추출 된 이온 크로마토그래피를 통해 펩 티 드 정량화에 대 한 proteomics 소프트웨어 패키지에 원시 파일을 가져올. 좋습니다 여러 컬럼에 맞춤 수행할 수 있는 소프트웨어 패키지 MS 실행 (참조 테이블의 재료) 29 , 30.</li>
	<li>옵션 소프트웨어 제품군에서 사용할 수 있는 경우에, 가능 하 게 &#34; 사이의 일치를 실행 &#34; 데이터 처리를 시작 하기 전에.</li>
	<li>분석 완료 되 면 수출 부 량 값과 함께 펩 티 드 목록.</li>
</ol>

<ol><li>Bonasio, R., Shiekhattar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+transcription+by+long+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Regulation of transcription by long noncoding RNAs.</a> Annu Rev Genet. 48, 433-455 (2014).</li>
<li>Bonasio, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+topics+in+epigenetics%3A+ants%2C+brains%2C+and+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Emerging topics in epigenetics: ants, brains, and noncoding RNAs.</a> Ann N Y Acad Sci. 1260, 14-23 (2012).</li>
<li>Rinn, J. L., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+regulation+by+long+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Genome regulation by long noncoding RNAs.</a> Annu Rev Biochem. 81, 145-166 (2012).</li>
<li>Goff, L. A., Rinn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+RNA+biology+to+lncRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Linking RNA biology to lncRNAs.</a> Genome Res. 25 (10), 1456-1465 (2015).</li>
<li>Holoch, D., Moazed, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-mediated+epigenetic+regulation+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA-mediated epigenetic regulation of gene expression.</a> Nat Rev Genet. 16 (2), 71-84 (2015).</li>
<li>Chu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+discovery+of+Xist+RNA+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic discovery of Xist RNA binding proteins.</a> Cell. 161 (2), 404-416 (2015).</li>
<li>McHugh, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xist+lncRNA+interacts+directly+with+SHARP+to+silence+transcription+through+HDAC3%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3.</a> Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).</li>
<li>Minajigi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomes.+A+comprehensive+Xist+interactome+reveals+cohesin+repulsion+and+an+RNA-directed+chromosome+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation.</a> Science. 349 (6245), (2015).</li>
<li>Lunde, B. M., Moore, C., Varani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins%3A+modular+design+for+efficient+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins: modular design for efficient function.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (6), 479-490 (2007).</li>
<li>Cabili, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+annotation+of+human+large+intergenic+noncoding+RNAs+reveals+global+properties+and+specific+subclasses%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Integrative annotation of human large intergenic noncoding RNAs reveals global properties and specific subclasses.</a> Genes Dev. 25 (18), 1915-1927 (2011).</li>
<li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+RNA+biology+from+an+atlas+of+mammalian+mRNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins.</a> Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).</li>
<li>Baltz, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mRNA-bound+proteome+and+its+global+occupancy+profile+on+protein-coding+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts.</a> Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).</li>
<li>Kwon, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA-binding+protein+repertoire+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells.</a> Nat Struct Mol Biol. 20 (9), 1122-1130 (2013).</li>
<li>Beckmann, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA-binding+proteomes+from+yeast+to+man+harbour+conserved+enigmRBPs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs.</a> Nat Commun. 6, 10127(2015).</li>
<li>Conrad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+interactome+capture+of+the+human+cell+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Serial interactome capture of the human cell nucleus.</a> Nat Commun. 7, 11212(2016).</li>
<li>Wilusz, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+triple+helix+stabilizes+the+3%27+ends+of+long+noncoding+RNAs+that+lack+poly%28A%29+tails%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A triple helix stabilizes the 3' ends of long noncoding RNAs that lack poly(A) tails.</a> Genes Dev. 26 (21), 2392-2407 (2012).</li>
<li>Kim, T. K., Shiekhattar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architectural+and+Functional+Commonalities+between+Enhancers+and+Promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Architectural and Functional Commonalities between Enhancers and Promoters.</a> Cell. 162 (5), 948-959 (2015).</li>
<li>Brannan, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SONAR+Discovers+RNA-Binding+Proteins+from+Analysis+of+Large-Scale+Protein-Protein+Interactomes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">SONAR Discovers RNA-Binding Proteins from Analysis of Large-Scale Protein-Protein Interactomes.</a> Mol Cell. 64 (2), 282-293 (2016).</li>
<li>Bonasio, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+with+RNA+direct+the+Polycomb+group+protein+SCML2+to+chromatin+where+it+represses+target+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Interactions with RNA direct the Polycomb group protein SCML2 to chromatin where it represses target genes.</a> Elife. 3, e02637(2014).</li>
<li>Kaneko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+JARID2+and+noncoding+RNAs+regulate+PRC2+recruitment+to+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Interactions between JARID2 and noncoding RNAs regulate PRC2 recruitment to chromatin.</a> Mol Cell. 53 (2), 290-300 (2014).</li>
<li>Kaneko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+the+PRC2+component+Ezh2+is+cell+cycle-regulated+and+up-regulates+its+binding+to+ncRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of the PRC2 component Ezh2 is cell cycle-regulated and up-regulates its binding to ncRNA.</a> Genes Dev. 24 (23), 2615-2620 (2010).</li>
<li>Saldana-Meyer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTCF+regulates+the+human+p53+gene+through+direct+interaction+with+its+natural+antisense+transcript%2C+Wrap53%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">CTCF regulates the human p53 gene through direct interaction with its natural antisense transcript, Wrap53.</a> Genes Dev. 28 (7), 723-734 (2014).</li>
<li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Identification+of+RNA-Binding+Domains+in+Human+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Identification of RNA-Binding Domains in Human Cells.</a> Mol Cell. 63 (4), 696-710 (2016).</li>
<li>He, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+Mapping+of+RNA-Binding+Regions+in+the+Nuclear+Proteome+of+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">High-Resolution Mapping of RNA-Binding Regions in the Nuclear Proteome of Embryonic Stem Cells.</a> Mol Cell. 64 (2), 416-430 (2016).</li>
<li>Favre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-Thiouridine+photosensitized+RNA-protein+crosslinking+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">4-Thiouridine photosensitized RNA-protein crosslinking in mammalian cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 141 (2), 847-854 (1986).</li>
<li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+identification+of+RNA-binding+protein+and+microRNA+target+sites+by+PAR-CLIP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP.</a> Cell. 141 (1), 129-141 (2010).</li>
<li>Favre, A., Saintome, C., Fourrey, J. L., Clivio, P., Laugaa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thionucleobases+as+intrinsic+photoaffinity+probes+of+nucleic+acid+structure+and+nucleic+acid-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Photochem+Photobiol+B%22%5BJournal%5D)">Thionucleobases as intrinsic photoaffinity probes of nucleic acid structure and nucleic acid-protein interactions.</a> J Photochem Photobiol B. 42 (2), 109-124 (1998).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nat Protoc. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li>
<li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skyline%3A+an+open+source+document+editor+for+creating+and+analyzing+targeted+proteomics+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.</a> Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).</li>
<li>Kondo, Y., Oubridge, C., van Roon, A. M., Nagai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+human+U1+snRNP%2C+a+small+nuclear+ribonucleoprotein+particle%2C+reveals+the+mechanism+of+5%27+splice+site+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of human U1 snRNP, a small nuclear ribonucleoprotein particle, reveals the mechanism of 5' splice site recognition.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAR-CliP--a+method+to+identify+transcriptome-wide+the+binding+sites+of+RNA+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">PAR-CliP--a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins.</a> J Vis Exp. (41), (2010).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

자세한 실험 프로토콜 RBR-ID를 mESCs로 하 고, RNA 4SU를 통합할 수 있는 모든 셀에 적절 한 수정 수행을 설명 합니다. 다른 세포 유형 충분 한 신호 대 잡음 비를 되도록 접근 방법의 최적화가 필요할 수 있습니다. 또한, 프로토콜 설명 여기 핵 RBPs 시험에 초점을 맞추고, 하는 동안 RBR-ID 기술 한다 쉽게 적용할 cytosol 또는 특정 세포와 같은 다른 세포질 구획 다른 분류를 사용 하 여 전략입니다. 최적화 해야 하는 매개 변수 포함 자외선 가교의 에너지로 서 4SU 농도 법인 시간. 이 매개 변수는 RNA-단백질 crosslinks의 효율적인 형성을 보장 하 고 만족 스러운 신호 대 잡음 비를 산출 하는 것이 중요. 우리 312 nm UVB 빛은 가교 단백질 4SU 포함 된 RNAs는 365에 비해 훨씬 더 효율적으로 나타났습니다 nm UVA 파 클립32에서 일반적으로 사용 됩니다. RBR ID의 비교 수행 312 직접 및 365 nm를 시연 312 nm ...

RBR ID 방법의 목적은 새로운 RNA 의무적인 단백질 (RBPs)를 식별 하 여 펩 티 드 수준 해상도 RNA 바인딩 돌연변이의 디자인 및 생물학 및 생 화 확 적인 조사를 촉진 하기 위하여 그들의 RNA 바인딩 영역 (RBRs) 지도 단백질 RNA 상호 작용의 기능입니다.
RNA는 생체 중 고유 수 모두 유전 정보를 운반 하는 메신저 역할을 하 고도 생화학 기능 단백질1,2의 유사 더 많은 복잡 한 3 차원 구조에 접어. 증거의 성장 시체 noncoding RNAs (ncRNAs) 다양 한 유전자 규정 하는 후 성적인 경로3,,45 에 중요 한 역할을, 일반적으로, 이러한 규정 하는 기능 콘서트 중재는 제안 특히 주어진된 RNA와 상호 작용 하는 단백질 특정 한 관련성의 상호 작용 단백질의 집합 최근 심각 하 게 공부 긴 ncRNA (lncRNA) Xist,이 lncRNA 여성 셀6,7 x 염색체 비활성화를 중재 하는 방법에 대 한 값진 통찰력을 제공에 대 한 확인 되었다 ,8. 특히, 이러한 Xist 상호 작용 단백질의 몇 없는 어떤 정식 RNA 바인딩 도메인9, 그리고 그러므로 그들의 RNA 바인딩 작업 수 없습니다 예측 철에서 혼자 그들의 기본 시퀀스에 따라. LncRNAs의 수천 어떤 주어진된 셀10표현 됩니다 고려, 아직 될 RNA 의무적인 단백질 (RBPs) 발견 그들 중 많은와 상호 작용을 통해 행동 수도 있습니다 가정 하는 합리적입니다. 이러한 소설 RBPs 식별 하는 실험적인 전략 것입니다 따라서 크게 용이 하 게 ncRNAs의 생물 학적 기능 해 부의 작업.
RBPs 경험적으로 식별 하는 이전 시도 polyA + RNA 선택 질량 분석 (MS)11,12,13,,1415에 결합에 의존 했습니다. 비록이 실험 상 상속 RBPs의 목록에 많은 단백질을 추가, 디자인에 의해 그들은 감지할 수 단백질 polyadenylated 성적표에 바인딩된. 그러나, 대부분의 작은 RNAs 및 많은 lncRNAs polyadenylated 되지 않습니다. 16 , 17 그리고 그들의 상호 작용 단백질 것 가능성이 되었습니다 놓친이 실험에서. 최근 연구 공동 여러 알려진된 RBPs와 정화 하 고 이러한 재발 RBP 파트너 RNA 바인딩 활동18보유 가능성이 것으로 나타났다 단백질을 식별 하기 위해 단백질-단백질 위하여 데이터베이스에 기계 학습을 적용. 그러나,이 방법은 기존의 큰 상호 작용 데이터베이스 마이닝에 의존 하며만 공동 알려진된 RBPs, 따라서 불용 성, 막 임베디드 및 부족 한 분석에서 제외 된 비 변성 시키기 조건에 순화 될 수 있는 단백질을 확인할 수 있습니다. 단백질입니다.
Id는 단백질의 한 진실 fide RBP로 종종 단백질 RNA 상호 작용의 생물학 및 생 화 확 적인 기능에 대 한 정보를 자동으로 생성 하지 않습니다. 해결 하기 위해이 시점, 그것은 일반적으로 특정 돌연변이 각 소설 RBP19, 의 맥락에서 RNA 바인딩 기능을 테스트 하도록 설계 된 수 수 있도록 단백질 도메인 및 아미노산 잔류물 상호 작용에 관련 된 식별 하는 것이 좋습니다. 20. 우리의 그룹 및 다른 사람에 의해 이전 노력 사용 재조합 형 단백질 파편 삭제 돌연변이 RNA 바인딩 영역 (RBRs)19,20,,2122;을 식별 하 그러나, 이러한 접근은 노동 집약 및 높은 처리량 분석와 호환 되지 않는. 더 많은 최근 연구 질량 분석23;를 사용 하 여 높은 처리량 패션에서 RNA 바인딩 활동을 지도 하는 실험적인 전략 설명 그러나,이 방법은 이중 polyA + RNA 선택에 의존 하 고 따라서 위에서 설명한 RBP 식별 방식으로 동일한 제한 실시.
우리 나 RNA 바인딩 영역 id RBR-, photocrosslinking 단백질-RNA와 단백질 및 단백질 영역 만들기 없이 라이브 세포에서 RNA 상호 작용을 식별 하기 위해 양적 질량 분석을 이용 하는 기술 개발 RNA polyadenylation 상태에 가정, polyA RNAs24에 바인딩된 따라서 RBPs를 포함 한. 또한,이 방법은 가교를 독점적으로 의존 단백질 가용성 또는 액세스 가능성 요구 사항은 없습니다 고 따라서 내 막 (예: 핵 봉투) 또는 가난 하 게 녹는 구획 (RNA 바인딩 활동 지도에 적합 예를 들어 핵 매트릭스)입니다. 마우스 배아 줄기 세포 (mESCs)의 핵에 대 한 RBR-ID를 수행 하는 실험 단계 설명 하지만 사소한 수정이 프로토콜 적합 해야한다 다양 한 세포 유형, 그들은 효율적으로 문화에서 4SU를 통합할 수 있는 중간입니다.

<table><tbody><tr><td>KnockOut DMEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청, 인증, 미국 원산지</td><td>Fisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민 용액 200 mM</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 용액</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>MEM 비필수 아미노산 용액 (100&times;)</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>ESGRO 백혈병 억제 인자 (LIF)</td><td>EMD Millipore</td><td>ESG1106</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Tocris</td><td>4423</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Sigma</td><td>PZ0162</td><td></td></tr><tr><td>젤라틴 용액, 물 중 2%</td><td>Sigma</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>4-thiouridine</td><td>Sigma</td><td>T4509</td><td>50 mM 수중 스톡</td></tr><tr><td>Spectrolinker XL-1500</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-992-90</td><td></td></tr><tr><td>페닐 메탄 설포닐 플루오 라이드</td><td>Sigma</td><td>78830</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CO-630</td><td>Sigma</td><td>542334</td><td>옥틸 페녹시 폴리 에톡시 에탄올 세제의 상업적 형태</td></tr><tr><td>요오드 아세트 아</td>미드 <td>시그마</td><td>I6125</td><td></td></tr><tr><td>트립신, 시퀀싱 등급</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>Empore 고체상 추출 디스크</td><td>3M</td><td>66883</td><td></td></tr><tr><td>OLIGO R3 반전 - 위상 수지</td><td>Fisher Scientific</td><td>1133903</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase</td><td>Sigma</td><td>E8263</td><td>고순도 뉴클레아제</td></tr><tr><td>Sonic Dismembrator 모델 100</td><td>Fisher Scientific</td>은 <td>단종</td>되었으며 <td>FB505110</td></tr><tr><td>와 함께 업데이트되었습니다.HPLC 등급 아세토니트릴</td><td>Fisher Chemical</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>HPLC 등급 물</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6 4</td><td></td></tr><tr><td>TFA</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11650</td><td></td></tr><tr><td>중탄산암모늄</td><td>시그마</td><td>A6141</td><td></td></tr><tr><td>아세트산</td><td>시그마</td><td>49199</td><td></td></tr><tr><td>포름산</td><td>시그마</td><td>F0507</td><td></td></tr><tr><td>ReproSil-Pur 18-AQ</td><td>Dr. Maisch GmbH HPLC</td><td>r13.aq.0003</td><td>HPLC 컬럼용 포장재</td></tr><tr><td>나노 컬럼용 모세관(75 &micro; m)</td><td>Molex</td><td>1068150017</td><td></td></tr><tr><td>MaxQuant 소프트웨어</td><td>Max Planck Institute for Biochemistry</td><td></td> 여러 <td>MS 실행의 크로마토그래피 정렬을 수행할 수 있습니다</td></tr></tbody></table>.

질량 분석 기반 식별 rna 바인딩 영역에 대 한 샘플 준비

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Noncoding RNAs 유전자 발현, chromatin 구조, 및 DNA 복구 통제 등 여러 가지 핵 프로세스에서 중요 한 역할을 재생 합니다. 대부분의 경우에서 noncoding RNAs의 행동은 누구의 기능 차례로 noncoding RNAs와의 이러한 상호 작용에 의해 통제 된다 단백질에 의해 중재 됩니다. 이 일치, 핵 기능에 관련 된 단백질의 증가 RNA를 바인딩할 보고 되었습니다 그리고 몇 가지 경우에이 단백질의 RNA 바인딩 영역 매핑 되었습니다, 자주 힘 드는, 후보 기반 방법을 통해.
여기, 우리는 RNA 의무적인 단백질 및 RNA 바인딩 영역 그들의 높은 처리량, 프로테옴 전체 편견된 식별을 수행 하기 위해 상세한 프로토콜을 보고 합니다. 방법론 photoreactive uridine 아날로그 세포질 RNA, UV 중재 단백질-RNA 가교 및 질량 분석 분석 공개는 프로테옴 내 RNA-가교 된 펩 티 드에서에서의 설립에 의존 합니다. 마우스 배아 줄기 세포에 대 한 절차를 설명 하 고, 비록 배양된 세포의 다양 한 프로토콜을 쉽게 적응 한다.

그림 1 RBR ID 워크플로를 보여 줍니다. 때문에이 기술은 상대적으로 낮은 가교 효율 생물 복제 걸쳐 고갈 수준 및 관찰 된 효과 (P-값)의 일관성을 고려 하는 매우 중요 하다. 그림 2 는 RBR ID 결과의 화산 줄거리. 펩 티 드 RNA 승인 주제 (RRM) 도메인을 겹쳐 높게 일관 된 고갈 수준 표시. RRM 도메인 RBR ID 분석에 대 한 긍정적인 컨트롤로 사용할 수 있습니다.
RBR ID RBRs 라이브 셀에 매핑하는 데 사용할 수 있습니다. RBR ID 점수 RNA 바인딩 잠재력 추정 각 펩 티 드에 대 한 산출 될 수 있다: RBR ID 점수 =-2로그 (정규화 4SU 강도/정규화 +-4SU 강도) x...

우리는 RNA 의무적인 단백질을 확인 하 고 중재 하는 UV photocrosslinking 및 질량 분석을 사용 하 여 라이브 셀에서 그들의 RNA 바인딩 영역 지도를 프로토콜을 설명 합니다.

질량 분석 기반 식별 RNA 바인딩 영역에 대 한 샘플 준비

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

이 절차의 전반적인 목표는 UV 매개 광가교 결합 후 질량 분석법을 사용하여 살아있는 세포 내의 RNA 결합 단백질을 식별하고 이들의 RNA 결합 영역을 매핑하는 것입니다. 이 방법은 어떤 후성유전학적 조절 인자가 RNA에 결합하는지, 그리고 상호작용에 어떤 단백질 영역이 필요한지와 같은 후성유전학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단백질-RNA 복합체의 정제 과정이 필요하지 않으므로 적은 양의 시료로도 가능하며, 모든 유형의 RNA에 결합된 단백질을 식별할 수 있다는 점입니다.본 방법은 연구 목적에 따라 핵 단백질에 집중하여 제시되었으나, 분획 단계에서 약간의 수정을 가하면 다른 세포-핵 구조물 내의 RNA 및 결합 단백질 연구에도 활용할 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 마우스 ESC를 배양 및 증식시킨 후, 필요한 수의 10 centimeter 플레이트에 세포를 확장 배양합니다. 플레이트가 포화 상태에 도달하기 전, 배지에 4-SU를 직접 첨가하여 최종 농도가 500 micro molar가 되도록 합니다.4sU 대조군 디쉬는 처리하지 않은 상태로 둡니다. 플레이트를 가볍게 흔들어 4sU가 배지 전체에 균일하게 분포되도록 한 후, 플레이트를 동일한 조직 배양 인큐베이터에 넣고 2시간 동안 배양합니다. 4sU의 도입 효율은 세포 유형마다 다르므로, 효율적인 가교 결합을 보장하고 독성을 최소화하기 위해 4sU 농도와 배양 시간을 최적화해야 할 수도 있습니다.다음으로, 플레이트를 아이스 버킷으로 옮기고 배지를 제거합니다. 그 후, 5 mL의 차가운 PBS를 사용하여 플레이트를 부드럽게 세척합니다. 차가운 PBS 2 mL를 첨가하고 뚜껑을 연 상태의 플레이트를 UV-B 방출 전구가 장착된 가교 장치(cross-linker)에 넣습니다.1 Joule per square centimeter의 에너지 설정으로 플레이트를 조사합니다. 효율적인 UV 가교 결합이 매우 중요합니다. UV-B 광원 사용을 권장하지만, UV-A 또한 사용할 수 있습니다.어떤 경우든, 사용되는 UV 에너지 양은 최적화되어야 하며 PAR-CLIP 또는 ChIRP를 통해 모니터링할 수 있습니다. 셀 리프터를 사용하여 세포를 수집하고 원추형 튜브에 담긴 얼음처럼 차가운 PBS로 옮깁니다. 그 다음, 세포를 2000 ×g, 4 °C에서 5분 동안 원심분리합니다.상층액을 제거하고 2 millimolar EDTA와 0.2 millimolar PMSF가 포함된 5 mL의 차가운 PBS로 세포 펠렛을 재현탁합니다. 혈구계수기를 사용하여 세포 수를 측정합니다. 10 centimeter 및 15 centimeter 플레이트에서 각각 500만에서 1,000만 개, 1,000만에서 2,000만 개의 세포가 얻어질 것으로 예상됩니다.그런 다음, 세포를 2000 ×g, 4 °C에서 5분 동안 원심분리합니다. 세포에서 핵을 분리하기 위해 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 얼음처럼 차가운 버퍼 A를 준비합니다. 사용 전, 필요한 양의 버퍼 A에 0.5 mM DTT와 0.2 mM PMSF를 첨가합니다. 차가운 버퍼 2 mL를 세포에 넣어 세척한 후, 세포를 2500 ×g, 4 °C에서 5분 동안 원심분리합니다.상층액을 버리고, 0.2%의 비이온성 비변성 계면활성제가 첨가된 buffer A를 넣은 후 샘플을 4 °C에서 5분 동안 회전시킵니다. 세포를 2500 ×g에서 5분 동안 원심분리한 후 상층액을 제거합니다. 펠렛은 세포질이 제거된 온전한 핵으로 구성됩니다.핵을 용해시키기 위해 튜브에 200 µL의 lysis buffer를 추가합니다. 1/8인치 프로브를 사용하여 50% 진폭 설정으로 5~10초 동안 샘플을 소니케이션하여 크로마틴을 전단합니다. 샘플을 12000 ×g에서 5분 동안 원심 분리하고, 펠렛이 섞이지 않도록 상층액만 175 µL 수집합니다.다음으로, Bradford 분석법 또는 유사한 기술을 통해 단백질 농도를 측정합니다. 그 후, 용해 버퍼를 사용하여 각 샘플의 단백질 농도를 1 mg/mL 또는 샘플 중 가장 낮은 농도로 희석합니다. 핵 용해물에 5 mM DTT 용액을 첨가하고 샘플을 상온에서 1시간 동안 배양합니다.그 다음, 신선한 스톡에서 14 millimolar iodoacetamide를 첨가하고 용해물을 실온의 암소에서 30분 동안 배양합니다. 용해물을 50 millimolar ammonium bicarbonate로 5배 부피만큼 희석한 후, trypsin을 첨가합니다. 샘플을 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.샘플당 하나의 맞춤형 스테이지 팁을 준비하려면, 200 µL 피펫 팁 바닥에 고상 추출 C18 재질의 디스크를 넣습니다. C18 디스크 위에 Oligo R3 역상 수지 50 µL를 추가한 다음, 스테이지 팁을 원심분리 어댑터 안에 넣고 이 어댑터를 1.5 mL 마이크로 튜브 안에 넣습니다. 팁을 세척하기 위해 100% acetonitrile 100 µL를 추가합니다.그 다음 팁을 1000 ×g에서 1분 동안 원심분리하여 용매를 제거합니다. 0.1% trifluoroacetic acid 또는 TFA 50 µL로 팁을 평형화합니다. 그런 다음 다시 원심분리합니다.소화된 단백질 시료에 100% formic acid를 첨가하여 pH를 2에서 3까지 낮춥니다. 그다음, 시료를 제작된 stage tip에 로딩하고 시료가 팁을 모두 통과할 때까지 1000 ×g에서 1분 동안 원심분리합니다. 결합된 펩타이드를 50 µL의 0.1% TFA로 세척합니다.그 다음, 샘플을 1000 ×g에서 1분간 원심분리한 후, 스테이지 팁에 50 µL의 용출 버퍼를 첨가하여 펩타이드를 용출시키고 1000 ×g에서 1분간 원심분리하여 팁에서 용출 버퍼가 강제로 나오게 합니다. 150 ×g 및 1~3 kPa로 설정된 진공 원심분리기를 사용하여 1시간 동안 샘플을 건조합니다. 샘플에서 가교 결합된 RNA를 제거하려면 펠릿을 50 µL의 2x 뉴클레아제 버퍼에 다시 현탁합니다.1 mg/mL의 펩타이드 농도에서 A280 값이 1이라고 가정하고 280 nanometers에서 펩타이드 농도를 측정합니다. 2x nuclease buffer를 사용하여 모든 샘플을 1 mg/mL 또는 가장 낮은 농도로 맞춘 다음, 샘플당 50 microliters의 물과 1 microliter의 고순도 nuclease를 포함하는 마스터 믹스를 준비합니다. 50 microliters의 펩타이드 샘플을 50 microliters의 물 및 nuclease 마스터 믹스와 혼합합니다.그 다음, 시료를 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 마지막으로, 텍스트 프로토콜에 따라 나노 액체 크로마토그래피, 질량 분석 및 데이터 처리를 수행합니다. 이 그림은 마우스 ESCs의 RBR id 결과에 대한 볼케이노 플롯을 보여줍니다.RNA 인식 모티프 도메인과 겹치는 펩타이드는 파란색으로 표시되며 매우 일관된 고갈 수준을 보입니다. HNRNPC에서 유래한 RNA 결합 펩타이드는 빨간색으로 강조 표시되었습니다. 여기에는 단백질 영역의 RNA 결합 가능성 추정치로 계산된 RBR id 점수의 히트맵이 나타나 있습니다.점수가 스플라이소좀 소단위체 U1-70k의 표면에 투영되어 있습니다. 결정 구조로 확인된 RNA 접촉 부위 주변의 밝은 빨간색은 단백질-RNA 상호작용이 정확하게 식별되었음을 나타냅니다. 이 그림에서 TET2는 새로운 RBP로 제시되었으며, 단백질의 일차 서열에 따라 RBR id 점수를 도식화하여 RNA 결합 활성이 C 말단 영역에 매핑되었음을 보여줍니다.마지막으로, 야생형 서열을 사용하여 PAR-CLIP을 수행하고 그 신호를 예측된 RBR이 결핍된 돌연변이체의 신호와 비교함으로써 이 새로운 RBR의 필요성을 검증할 수 있습니다. 이 기술을 숙달하면, 적절하게 수행했을 때 이틀에 걸쳐 7~8시간 내에 완료할 수 있습니다. 가교 결합 전, 분화가 어떻게 시작되는지 또는 세포 주기가 RNA-단백질 상호작용을 어떻게 조절하는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 다양한 처리를 통해 세포를 자극할 수 있습니다.이 영상을 시청하신 후에는 질량 분석법을 통해 단백질-RNA 상호작용 부위를 식별하기 위해 가교 결합된 단백질-RNA 복합체를 포함하는 추출물을 생성하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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연구

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RNA-단백질 상호 작용은 많은 세포 과정의 핵심에 있습니다. 여기에서는 특정 RNA를 분리하고 이와 관련된 새로운 단백질을 식별하는 in vivo 방법에 대해 설명합니다. 이것은 RNA가 세포에서 어떻게 조절되는지에 대한 새로운 빛을 비출 수 있습니다.

빠른 방법론에 의해 소설 RNA 결합 단백질 분리

서열 특이성은 유전자 조절에 매우 중요합니다. 특정 서열을 인식하는 조절 단백질은 유전자 조절에 중요합니다. 이러한 단백질에 대한 기능적 결합 부위를 정의하는 것은 어려운 생물학적 문제입니다. RNA 결합 단백질에 대한 결합 부위의 식별을 위한 반복적 접근법은 여기에 기재되어 있으며 모든 RNA 결합 단백질에 적용가능하다.

규제 RNA 결합 단백질에 대한 결합 부위를 식별하기 위한 서열 공간 탐색

우리는 표준 방법 보다는 더 적은 편견을 가진 상세한 작은 RNA 라이브러리 배상 프로토콜 및 2'-O-메틸 RNA를 위한 증가한 감도를 제시합니다. 이 프로토콜은 비용을 절감하기 위해 수제 시약을 사용하거나 편의를 위해 키트를 사용하여 따를 수 있습니다.

작은 RNA-seq 개선: 2'-O-메틸 RNA의 더 적은 편견 및 더 나은 검출

여기에서는 cDNA 중간체 없이 짧은 RNA(실행당 &lt;35nt)를 염기서열분석하는 직접 방법과 단일 염기 정밀도에서 단일 연구에서 다른 뉴클레오티드 변형을 염기서열분석하는 일반적인 방법으로 사용할 수 있는 LC-MS 기반 염기서열분석 방법에 대한 자세한 프로토콜에 대해 설명합니다.

2D-HELS MS 염기서열분석(2D-HELS MS SEQ): 뉴클레오티드 변형이 다른 RNA 혼합물의 직접 및 새로운 염기서열분석을 위한 일반적인 LC-MS 기반 방법

MAPS 기술은 생체 내에서 특정 조절 RNA의 표적을 면밀히 조사하기 위해 개발되었습니다. 관심의 sRNA는 RNA 의 RNA 파트너의 공동 정화및 RNA 시퀀싱에 의한 그들의 식별을 가능하게 하는 MS2 aptamer로 태그됩니다. 이 수정 된 프로토콜은 특히 그램 양성 박테리아에 적합합니다.

그람 양성 박테리아에서 RNA 염기서열분석과 결합된 MS2-선호도 정화

이 프로토콜은 돌연변이 프로파일링 실험을 위해 디메틸 설페이트로 RNA를 변형하기 위한 지침을 제공합니다. 여기에는 두 가지 대체 라이브러리 준비 방법을 사용한 시험관 내 및 생체 내 프로빙이 포함됩니다.

디메틸 설페이트를 사용한 RNA 구조 프로빙 시험관 내 및 세포에서 시퀀싱을 사용한 돌연변이 프로파일링

배우세요 생세포에서 UV 광교차결합 및 질량 분석을 이용해 RNA 결합 단백질과 그 결합 영역을 식별하는 방법을. 마우스 배아줄기세포를 활용하여 후성유전학적 조절자와 RNA 상호작용을 연구할 수 있습니다.

질량 분석 기반 식별 RNA 바인딩 영역에 대 한 샘플 준비

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