질량 분석 기반 식별 RNA 바인딩 영역에 대 한 샘플 준비

이 절차의 전반적인 목표는 살아있는 세포에서 RNA 결합 단백질을 식별하고 UV 매개 광 가교 결합 후 질량 분석법을 사용하여 RNA 결합 영역을 매핑하는 것입니다. 이 방법은 어떤 후성유전학적 조절자가 RNA에 결합되어 있는지, 상호 작용에 어떤 단백질 영역이 필요한지와 같은 후성유전학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단백질 RNA 복합체의 정제를 포함하지 않기 때문에 재료가 거의 필요하지 않고 모든 유형의 RNA에 결합된 단백질을 식별한다는 것입니다.

제시된 바와 같이 이 방법은 우리의 과학적 관심이기 때문에 핵 단백질에 초점을 맞추고 있지만, 분획 단계에서 약간의 수정을 가하면 다른 stu-nu-lar 구획의 RNA 및 결합 단백질을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 마우스 ESC를 배양하고 확장한 후 세포를 필요한 10cm 플레이트로 확장합니다. 플레이트가 합류점에 도달하기 전에 4개의 SU를 배지에 직접 추가하여 최종 농도 500 마이크로 어금니를 만듭니다.

4sU 컨트롤 디쉬는 처리하지 않고 그대로 두십시오. 플레이트를 부드럽게 흔들어 배지 전체에 4sU를 균일하게 분포시킨 다음 플레이트를 동일한 조직 배양 인큐베이터에 2시간 동안 다시 넣습니다. 4sU 통합의 효율성은 세포 유형에 따라 다르므로 효율적인 가교를 보장하고 독성을 최소화하기 위해 농도 및 배양 시간을 최적화해야 할 수 있습니다.

다음으로 접시를 얼음 양동이에 옮기고 매체를 버립니다. 그런 다음 얼음처럼 차가운 PBS 5ml를 사용하여 플레이트를 부드럽게 헹굽니다. 얼음처럼 차가운 PBS 2ml를 넣고 뚜껑이 없는 플레이트를 UV-B 방출 전구가 장착된 가교제에 넣습니다.

제곱센티미터당 1줄의 에너지 설정으로 플레이트를 조사합니다. 효율적인 UV 가교가 중요합니다. UV-B 광선 사용을 권장하지만 UV-A도 사용할 수 있습니다.

어쨌든 사용되는 UV 에너지의 양은 최적화되어야 하며 PAR-CLIP 또는 ChIRP로 모니터링할 수 있습니다. 세포 리프터를 사용하여 세포를 수집하고 원뿔형 튜브의 얼음처럼 차가운 PBS로 옮깁니다. 그런 다음 2000 회 g와 섭씨 4도에서 5 분 동안 세포를 원심 분리하십시오.

상층액을 제거하고 2 millimolar EDTA 및 0.2 millimolar PMSF를 사용하여 5 ml의 얼음처럼 차가운 PBS에 세포 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 혈구계로 세포를 세십시오. 10cm와 15cm 플레이트에서 각각 5-10,000,000,000개, 1,000만에서 2,000만 개의 세포가 있을 것으로 예상됩니다.

그런 다음 2000 회 g와 섭씨 4도에서 5 분 동안 세포를 원심 분리하십시오. 세포에서 핵을 분리하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 얼음처럼 차가운 완충액 A를 준비합니다. 사용하기 전에, 완충액 A.의 원하는에 0.5 millimolar DTT 및 0.2 millimolar PMSF를 추가하십시오.그(것)들을 세척하기 위하여 세포에 찬 완충기의 2 밀리리터를 추가하고, 그 후에 5 분 동안 2500 시간 g 그리고 4 섭씨 온도에 세포를 회전

상층액을 버리고 비이온성, 비변성 세제 0.2%가 보충된 완충액 A를 첨가한 다음 샘플을 섭씨 4도에서 5분 동안 회전시킵니다. 2500 회 g에서 5 분 동안 세포를 회전 한 후 상층액을 제거합니다. 펠릿은 세포질이 없는 온전한 핵으로 구성되어 있습니다.

핵을 용해하려면 200마이크로리터의 용해 완충액을 튜브에 추가합니다. 1/8인치 프로브를 사용하여 샘플을 초음파 처리하여 50% 진폭 설정에서 5-10초 동안 염색질을 전단합니다. 샘플을 12000 회 g에서 5 분 동안 회전시키고 펠릿을 피하기 위해 175 마이크로 리터의 상등액 만 수집합니다.

다음으로, Bradford 분석 또는 유사한 기술을 통해 단백질 농도를 측정합니다. 그런 다음 용해 버퍼를 사용하여 다른 샘플의 단백질을 밀리리터당 1mg 또는 가장 낮은 샘플 농도로 희석합니다. 핵 용해물에 5밀리몰 DTT 용액을 첨가하고 샘플을 실온에서 1시간 동안 배양합니다.

그런 다음 신선한 육수에서 14밀리몰의 요오드아세트아미드를 추가하고 실온에서 어두운 곳에서 30분 동안 용해물을 배양합니다. 50 밀리몰 중탄산 암모늄 부피의 5 배로 용해물을 희석 한 다음 트립신을 첨가하십시오. 샘플을 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다.

시료당 하나의 맞춤형 스테이지 팁을 준비하려면 고체상 추출 C18 재료 디스크를 200마이크로리터 피펫 팁 바닥에 놓습니다. C18 디스크 위에 50마이크로리터의 Oligo R3 역상 수지를 추가한 다음 스테이지 팁을 원심분리 어댑터 내부에 놓고 어댑터를 1.5ml 마이크로분리 튜브 내부에 넣습니다. 팁에 100% 아세토니트릴 100마이크로리터를 추가하여 세척합니다.

그런 다음 팁을 1000 회 g에서 1 분 동안 원심 분리하여 용매를 제거합니다. 50마이크로리터의 0.1% 트리플루오로아세트산 또는 TFA로 팁을 평형을 이룹니다. 그런 다음 다시 돌립니다.

분해된 단백질 샘플에 100% 포름산을 첨가하여 PH를 2에서 3으로 줄입니다. 그런 다음 샘플을 맞춤형 스테이지 팁에 로드하고 모든 샘플이 팁을 통과할 때까지 1분 동안 1000회 g으로 샘플을 원심분리합니다. 결합된 펩타이드를 50마이크로리터의 0.1% TFA로 세척합니다.

그런 다음 샘플을 1000 회 g에서 1 분 동안 회전 한 후 스테이지 팁에 50 마이크로 리터의 용리 완충액을 첨가하여 펩타이드를 용리시키고 1 분 동안 1000 회 g에서 원심 분리하여 용리 완충액을 팁에서 강제로 빼냅니다. 150 x g과 1-3 킬로파스칼로 설정된 진공 원심분리기를 1시간 동안 사용하여 샘플을 건조시킵니다. 샘플에서 가교 결합된 RNA를 제거하려면 펠릿을 50마이크로리터의 2x 뉴클레아제 완충액에 다시 현탁시킵니다.

펩타이드 밀리리터당 1밀리그램, A280이 1이라고 가정하여 280나노미터에서 펩타이드 농도를 측정합니다. 2x nuclease buffer를 사용하여 모든 샘플을 ml리터당 1mg 또는 가장 낮은 농도로 조정한 다음 샘플당 50μl의 물과 1microl의 고순도 nuclease의 마스터 믹스를 준비합니다. 50마이크로리터의 펩타이드 샘플과 50마이크로리터의 물과 뉴클레아제 마스터 믹스를 결합합니다.

그런 다음 섭씨 37도에서 1시간 동안 샘플을 배양합니다. 마지막으로 텍스트 프로토콜에 따라 나노 액체 크로마토그래피, 질량 분석 및 데이터 처리를 수행합니다. 이 그림은 마우스 ESC의 RBR id 결과의 화산 플롯을 보여줍니다.

RNA 인식 모티프 도메인과 중첩된 펩타이드는 파란색이며 매우 일관된 고갈 수준을 보여줍니다. HNRNPC의 RNA 결합 펩타이드는 빨간색으로 강조 표시되어 있습니다. 여기에 표시된 것은 단백질 영역의 RNA 결합 가능성의 추정치로 계산된 RBR id 점수의 히트 맵입니다.

점수는 스플라이소좀 소단위 U1-70k의 표면에 투영됩니다. 결정 구조에 의해 결정되는 RNA 접촉 부근의 밝은 빨간색은 단백질 RNA 상호 작용의 정확한 식별을 나타냅니다. 이 그림에서 TET2는 새로운 RBP로 제시되고 RNA 결합 활성은 단백질의 1차 서열을 따라 RBR id 점수를 플로팅하여 C 말단 영역에 매핑됩니다.

마지막으로, 이 새로운 RBR에 대한 요구 사항은 야생형 시퀀스를 사용하여 PAR-CLIP을 수행하고 예측된 RBR이 없는 돌연변이의 신호와 신호를 비교함으로써 검증할 수 있습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행되면 이틀에 걸쳐 7-8시간 안에 완료할 수 있습니다. 가교결합(cross-linking)에 앞서, 분화가 어떻게 시작되는지 또는 세포주기가 RNA 단백질 상호작용을 어떻게 조절하는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 다양한 치료법으로 세포를 자극할 수 있습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 단백질 RNA 복합체를 포함하는 엑스트라를 생성하여 단백질 RNA가 질량 분석법과 상호 작용하는 부위를 식별하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.