마우스 골격 근육 형태와 섬유 형 구성의 반 자동화 된 분석

이 프로토콜의 전반적인 목표는 최첨단 면역조직화학을 사용하여 골격근 섬유 유형을 정확하고 신속하게 식별하는 것입니다. 이 방법은 섬유질 유형 변화가 기능성 단백질의 손실에 의해 촉진되는지 여부와 같은 근육 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 근육 질환의 많은 모델에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 기본 근육 기능에 대한 단일 분자의 더 큰 영향을 밝히기 위해 넉인 및 넉아웃 모델과 같은 시스템에서도 사용할 수 있습니다.

시작하려면 약 30분 동안 충전된 슬라이드에서 쥐 근육의 얼어붙은 부분을 자연 건조합니다. 건조되면 소수성 장벽 PAP 펜을 사용하여 각 슬라이드의 섹션 주위에 테두리를 그립니다. 다음으로, 비특이적 항체 결합을 차단하기 위해 그려진 테두리 내에서 PBS에 약 250마이크로리터의 5%BSA를 로드하고 슬라이드를 실온에서 한 시간 동안 배양합니다.

한편, 5%BSA PBS에서 1차 항체의 1-50 희석을 준비합니다. 슬라이드당 약 250마이크로리터를 만들고 항체 희석액을 얼음에 보관합니다. 차단 기간이 지나면 슬라이드에서 블록 용액을 흡입하고 항체 희석액 250마이크로리터를 추가합니다.

음성 대조군의 경우, 1차 항체가 없는 PBS에 5%BSA를 적용합니다. 다음으로, 페트리 접시에 적신 여과지를 넣고 배양 챔버를 위해 알루미늄 호일로 덮습니다. 그런 다음 챔버 또는 동일한 습도의 유사한 환경에서 24-48시간 동안 섭씨 4도에서 슬라이드를 배양합니다.

1차 항체 배양 후 슬라이드에서 용액을 흡인하고 슬라이드를 세 번 세척합니다. 세척할 때마다 약 250마이크로리터의 5%BSA를 PBS에 약 10분 동안 도포합니다. 슬라이드를 세척하는 동안 정제된 형광단 접합 2차 항체를 1-200회 희석하여 준비합니다.

슬라이드당 최소 250마이크로리터를 준비하고 용액을 어두운 곳과 얼음 위에 보관하십시오. 세 번째 세척 후 250마이크로리터의 2차 항체 희석액을 슬라이드에 추가합니다. 그런 다음 어둡고 습한 환경에서 실온에서 90분 동안 슬라이드를 배양합니다.

배양 후 항체 용액을 흡인하고 이전과 같이 슬라이드를 3회 세척합니다. 여분의 2차 항체를 모두 씻어낸 후 PBS로 슬라이드를 헹구고 10분 동안 자연 건조시킵니다. 마지막으로, 비영구적 저점도 수성 장착 매체를 사용하여 슬라이드를 장착합니다.

매체가 건조된 후 매니큐어로 커버 슬립의 가장자리를 밀봉하고 슬라이드를 불투명한 보관 상자에 옮깁니다. 슬라이드를 이미징하기 전에 70% 에탄올로 커버 슬립을 청소하십시오. 그런 다음 epifluorescence microscope를 사용하여 디지털 이미지를 얻습니다.

저배율에서 1제곱밀리미터 관심 영역을 선택합니다. Alexa 488 접합 항체를 보려면 505 나노미터 장역 통과 필터를 사용하십시오. Alexa 594 접합 항체를 보려면 595 나노미터 장역 통과 필터를 사용하십시오.

필터를 올바르게 설정하면 디지털 이미지 수집을 시작합니다. 후속 분석을 위해 축척 막대를 포함해야 합니다. 분석을 위해 이 출판물과 함께 제공된 매크로에 Fiji를 설치합니다.

매크로 파일을 쉽게 액세스할 수 있는 디렉터리에 저장합니다. 이제 선택한 섹션의 명시야 이미지를 로드하고 훈련 가능한 weka segmentation 옵션으로 이동합니다. 섹션의 세포 영역을 규정하려면 광섬유에 선을 긋고 클래스 1에 추가를 클릭합니다.

그런 다음 세포 외 도메인을 표시하려면 섬유 사이의 공간에 선을 긋고 클래스 2에 추가를 클릭합니다. 각 클래스의 레이블이 5개에서 10개까지 정의될 때까지 이 프로세스를 반복합니다. 전면 광고 경계를 표시하기 어려울 수 있습니다.

확대/축소 기능을 사용하면 이러한 경계를 더 정밀하게 표시할 수 있습니다. 다음으로, train classifier 옵션을 선택합니다. 결과 빨간색 및 녹색 오버레이에서 자동화된 프로세스에 의해 잘못 분할된 이미지 부분에 더 많은 레이블을 수동으로 추가합니다.

빨간색으로 표시된 섬유가 녹색으로 표시된 중간 공간과 적절하게 분리될 때까지 이 작업을 수행합니다. 그런 다음 확률 가져오기를 클릭하고 이미지를 새 파일 폴더에 저장합니다. 이제 동일한 필드에서 가져온 형광 이미지를 사용하여 전체 프로세스를 반복합니다.

면역 염색된 섬유를 1등급으로, 모든 비형광 영역을 2등급으로 표시합니다. 궁극적으로 결과 확률 맵을 처리된 명시야 이미지가 저장된 동일한 폴더에 저장합니다. 이제 피지에서 이전에 저장된 확률 맵 중 하나를 엽니다.

이미징 소프트웨어에서 제공하는 눈금 막대에 직선을 그립니다. set scale을 선택하고 축척 막대에 따라 올바른 값을 입력합니다. 그런 다음 전역 옵션을 전환하여 모든 이미지에 대한 배율을 표준화합니다.

이제 파이버 수량화를 위해 Tyagi 매크로를 실행하면 탐색 창이 나타납니다. 그런 다음 이미지 호스트 폴더를 엽니다. 연결된 대화 상자에서 배경 드롭다운 값을 light로 변경합니다.

set measurements 기능을 사용하여 측정해야 하는 매개변수를 정의할 수 있습니다. CSA 및 피트 직경은 섬유 형태를 정량화하는 데 가장 적합한 측정입니다. 매크로를 실행한 후 폴더는 파이버 윤곽선의 이미지와 잘못된 분석 기능에 의해 수행된 측정값이 포함된 스프레드시트로 채워집니다.

경골 전방 근육과 가자미근은 대부분 빠른 경련 또는 느린 경련 섬유로 구성되어 있기 때문에 설명된 방법을 사용하여 분석했습니다. 여러 가지 다른 미오신 중쇄가 특정 항체를 사용하여 확인되었습니다. 1형 및 2형 A형 미오신 중쇄를 발현하는 가자미근 섬유의 상당 부분이 2형 X.By 대비에 대해 양성이었고, 2형 B형 섬유는 거의 나타나지 않았습니다.

이에 비해 염색된 경골 전방근은 대부분 2형 B형 및 2형 X형 미오신 중쇄 섬유로 구성되었으며, 2형 A형 사슬을 발현하는 섬유의 기여도가 적었고 1형 사슬에서 발현된 섬유는 거의 없었습니다. SC-71 항체가 유형 2 A 미오신 중쇄로 향하는 경골 전방 근육의 형태 측정 분석은 확률 매핑을 만드는 데 사용되는 몇 가지 이미지 변환을 제공했습니다. 이 간편한 자동 분석을 통해 데이터는 훨씬 더 지루한 수동 계산을 사용하여 생성된 데이터와 완전히 유사한 것으로 입증되었습니다.

전부 함께, 분석은 대략 6, 000의 총 개인적인 섬유에서 자료를 산출한다. 높은 데이터 처리량으로 인해 통계 분석이 훨씬 더 실현 가능했습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 근육 절편을 면역 염색하는 방법과 제공된 반자동 소프트웨어를 사용하여 근육 섬유의 유형 및 구성을 쉽게 분석할 수 있는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이 절차를 시도하는 동안 근육은 지역적으로 이질적일 수 있으며 근섬유 유형 및 구성에 대한 엄격한 평가를 위해 많은 근육 영역에 대한 분석이 필요하다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차와 함께 섬유화가 섬유 유형 구성의 변화와 병행하여 발생하는지 여부와 같은 추가 질문에 답하기 위해 Trichome 염색과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.