Name: 마우스 골격 근육 형태와 섬유 형 구성의 반 자동화 된 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: 학습하세요 마우스 골격 근육 섬유 형태와 구성을 반자동 알고리즘으로 분석하는 면역조직화학법을. 이 방법은 근육 생물학 및 질병 연구에 활용됩니다.

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우리는이 연구의 그들의 지원을 위해 Boettcher 재단과 루 경화 증 협회 (#17-II-344)에 감사.

쥐와 관련 된 모든 절차는 콜로라도의 대학-Anschutz 의료 캠퍼스 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었다 (91813(05)1D).
 1. 주 1: 기본 (1 °)와 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 차단 Immunostaining 마우스 hindlimb 근육 (예를 들어, 앞쪽에 tibialis, soleus)의 <ol><li>Air-dry 냉동된 섹션에 대 한 청구 슬라이드에 장착 ~ 30 분 11. 소수 성 장벽을 PAP 펜을 사용 하 여 섹션 주위에 테두리를 그립니다.</li>
	<li>장소 ~ 5 %BSA / 인산 염 버퍼 식 염 수 (BSA/PBS) 일반적인 항 체 바인딩 차단 하 각 슬라이드의 250 µ L. 1 헤에 대 한 실 온에서 슬라이드를 품 어</li>
	<li>차단, 하는 동안 준비 1시 50분의 5%에서 표면에 뜨는 1 ° 항 체 희석 BSA/PBS (모든 마우스 단일 클론 항 체는; 표 1 6 , 12 참조); 250 µ L의 준비 슬라이드 당 솔루션입니다. 얼음에 1 ° 항 체 주식 및 희석 유지</li>
</ol> <img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/56024/56024table1.jpg" /> 표 1: MyHCs를 구별 하는 데 사용 하는 기본 항 체.
<ol start="4"> <li>5 %BSA / PBS 차단 솔루션의 열망에 따라 적절 한 슬라이드에 1 ° 항 체 희석의 250 µ L을 추가. 추가 250 µ L 5 %BSA / PBS 보조 (2 °) 항 체 전용 부정적인 제어 슬라이드.</li>
	<li>품 습 한 환경에서 24-48 h 4 ° C에서. 
	참고: 페 트리 접시 약화 필터 종이와 알루미늄 호 일에 커버 수 있습니다 역할을 적합 한 보육 실.</li>
</ol> 2. 주 2: 2 ° 형광 항 체와 Immunostaining <ol><li>1 ° 항 체 솔루션을 발음 하거나 5 %BSA / PBS 솔루션 제어. 워시 모든 슬라이드 3 번, 5 %BSA 10 분.</li>
	<li>세척, 동안 준비 1: 200의 5%에서 정화, fluorophore 활용 2 ° 항 체 희석 BSA/PBS (표 2 참조 하십시오 모두 염소 반대로 마우스). 슬라이드 당 솔루션의 250 µ L를 준비 합니다. 얼음에 어둠 속에서 2 ° fluorophore 활용 된 항 체를 유지</li>
</ol> <img alt="Table 2" src="/files/ftp_upload/56024/56024table2.jpg" /> 표 2: Fluorophore 활용 된 이차 항 체 MyHCs 하는의 시각화 기본 항 체 인식 하는 데 사용.
<ol start="3"> <li>5 %BSA / PBS 차단 솔루션의 세 번째 응용 프로그램의 포부, 다음 모든 슬라이드에 2 ° 항 체 희석의 250 µ L을 추가. 어두운, 습 한 환경에서 실 온에서 90 분 동안 품 어.</li>
	<li>Aspirate 2 ° 항 체 솔루션입니다. 세척 모든 슬라이드 3 번, 10 분 5 %BSA / PBS.</li>
	<li>린스 PBS입니다. 10 분 동안 건조</li>
	<li>비 영구, 저 점도 수성 장착 매체 coverglass 탑재.</li>
	<li>건조 하면, 매니큐어와 슬라이드 가장자리 물개. 건조 하 고 어두운 slidebox에 저장.</li>
</ol> 3. Epifluorescence 현미경 검사 법으로 슬라이드 이미징 <ol><li>는 작은, 70% 에탄올 배어 연구소-삭제 기능으로 슬라이드를 청소.</li>
	<li>사진 장치 (재료의 표 참조)를 갖춘 epifluorescence 현미경을 사용 하 여 immunostained 근육 섹션의 디지털 이미지를 얻기.
	<ol><li>약 1 m m 2 (10 X 목표, 1.4 나)의 영역을 선택 합니다.</li>
		<li>보기는 505 통해 2 ° 알 렉 사 488 활용 된 항 체 형광 nm 긴 통과 필터. 595 nm 긴-패스 필터를 통해 2 ° 알 렉 사 594 활용 된 항 체의 흥분에 의해 생성 된 형광 볼. 호환 하는 이미징 소프트웨어를 갖춘 PC 컴퓨터와 이미지를 디지털화 합니다. 나중에 분석 소프트웨어 이미징에서 눈금 막대 포함.</li>
	</ol></li></ol> 4. 피지와 이미지의 분석 참고: 분석을 계속 하기 전에 https://imagej.net/Fiji/Downloads를 통해 피지 (는 건강의 국가 학회, 베 데스 다, 메릴랜드에서 자유롭게 사용 가능)를 설치 해야 합니다. 또한,이 과정에서 사용 하는 매크로 추가 파일에 제공 됩니다. 매크로 파일을 쉽게 액세스할 수 있는 디렉터리에 배치.
피지에서 선택한 섹션의 <ol><li>부하는 명시 이미지. 플러그인으로 이동 &#8594; 세분화 &#8594; Trainable Weka 세분화.</li>
	<li>섹션의 세포질 영역을 규정 하기 위해 라인에는 섬유, 그리고 클릭 &#34; 클래스 1에 추가 &#34;. 그런 다음, 섬유, 사이 공간에 선을 그릴을 클릭 &#34; 클래스 2에 추가 &#34; 세포 외 도메인을 표시. 각 클래스에 있는 5-10 레이블이 될 때까지 반복 합니다.
	<ol><li>클릭 기차 분류자입니다. 결과 빨간색과 초록색 오버레이에 추가 더 많은 레이블을 수동으로 (단계 4.2 참조) 이미지, 필요한 경우의 잘못 된 조각. 섬유 (레드) 섬유 (녹색) 사이의 공간에서 적절 하 게 분리 될 때까지 반복.</li>
	</ol></li> <li>클릭 &#34; 얻을 확률 &#34; 새로 레이블이 지정 된 폴더에 이미지를 저장 하 고.</li>
	<li>같은 필드에서 가져온 형광 이미지 (4.2-4.3 단계) 위의 절차를 반복 합니다. 으로 immunostained 섬유 라벨 &#34; 클래스 1 &#34;로 모든 비 형광 지역 &#34; 클래스 2 &#34;. 결과 확률 지도 처리 명시 이미지 저장 된 동일한 폴더에 저장.</li>
	<li>피지에서 이전에 저장 된 확률 지도 중 하나를 엽니다. 이미징 소프트웨어에 의해 제공 눈금 막대에 직선을 그립니다. 이동 분석 &#8594; 규모 설정. 눈금 막대에 의해 주어진 그들의 적절 한 값을 매개 변수 (즉, 알려진된 거리, 길이 단위)를 변경 후 확인은 &#34; 글로벌 &#34; 표준화 각 이미지에 대 한 규모를 상자.</li>
	<li>탐색 플러그인을 &#8594; 매크로 &#8594; 실행 &#8594; Tyagi 외. 섬유 부 량 macro.ijm (보조 파일 참조). 즉시, 탐색 창에 표시 됩니다. 이미지를 열고 &#39; s 호스트 폴더; 대화 상자가 표시 됩니다. 각 대화 상자에 대 한 변경 된 &#34; 배경 &#34; 드롭다운 값을 &#34; 빛. &#34; 참고: 폴더 이제 채워집니다 섬유 윤곽선의 이미지와 스프레드시트 소프트웨어 파일 (체코와 Feret 직경은 가장 관련 된 결과의 측정 섬유 형태; 측정 된 매개 변수를 조정할 수 있습니다 설정 측정 분석). 스프레드시트 소프트웨어 파일에 대 한 두 형광 및 밝은 분야 이미지 피지의 기 공 분석 기능에 의해 생성 하는 섬유 형태 데이터를 자동으로 옮겨질 것 이다.</li>
	<li>계산 하는 필드에 지정 된 MyHC 필드에 해당 필드 밝은 이미지에 총 섬유의 수에 의해 형광 섬유의 수를 분할 하 여 표현 하는 섬유의 분수.</li>
</ol>

<ol><li>Engel, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essentiality+of+histo-+and+cytochemical+studies+of+skeletal+muscle+in+the+investigation+of+neuromuscular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol%22%5BJournal%5D)">The essentiality of histo- and cytochemical studies of skeletal muscle in the investigation of neuromuscular disease.</a> Neurol. 12, 778-784 (1962).</li>
<li>Dobrowolny, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+is+a+primary+target+of+SOD1G93A-mediated+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle is a primary target of SOD1G93A-mediated toxicity.</a> Cell Metab. 8, 425-436 (2008).</li>
<li>Sultana, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restricting+calcium+currents+is+required+for+correct+fiber+type+specification+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Restricting calcium currents is required for correct fiber type specification in skeletal muscle.</a> Development. 143 (9), 1547-1559 (2016).</li>
<li>Guth, L., Samaha, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedure+for+the+histochemical+demonstration+of+actomyosin+ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Procedure for the histochemical demonstration of actomyosin ATPase.</a> Exp Neurol. 28 (2), 365-367 (1970).</li>
<li>Bloemberg, D., Quadrilatero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+determination+of+myosin+heavy+chain+expression+in+rat%2C+mouse%2C+and+human+skeletal+muscle+using+multicolor+immunofluorescence+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis.</a> PLoS One. 7 (4), (2012).</li>
<li>Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monospecific+antibodies+against+the+three+mammalian+fast+limb+myosin+heavy+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains.</a> Biochem Biophys Res Commun. 272 (1), 303-308 (2000).</li>
<li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="https://skeletalmusclejournal.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13395-014-0027-1">Ca2+ permeation and/or binding to Cav1.1 fine-tunes skeletal muscle Ca2+ signaling to sustain muscle function.</a> Skelet Muscle. 5 (4), (2015).</li>
<li>Sawano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one-step+immunostaining+method+to+visualize+rodent+muscle+fiber+type+within+a+single+specimen%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A one-step immunostaining method to visualize rodent muscle fiber type within a single specimen.</a> PLoS One. 11 (11), (2016).</li>
<li>Meunier, B., Picard, B., Astruc, T., Labas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+image+analysis+tool+for+the+classification+of+muscle+fibre+type+using+immunohistochemical+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of image analysis tool for the classification of muscle fibre type using immunohistochemical staining.</a> Histochem Cell Biol. 134 (3), 307-317 (2010).</li>
<li>Kammoun, M., Casser-Malek, I., Meunier, B., Picard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+immunohistochemical+classification+of+skeletal+muscle+fibres+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Histochem%22%5BJournal%5D)">A simplified immunohistochemical classification of skeletal muscle fibres in mouse.</a> Eur J Histochem. 58 (2), 2254(2014).</li>
<li>Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do%27s+and+don%27ts+in+the+preparation+of+muscle+cryosections+for+histological+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis.</a> J Vis Exp. (99), (2015).</li>
<li>Schiaffino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+myosin+heavy+chain+isoforms+in+type+2+skeletal+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22J+Muscle+Res+Cell+Motil%22%5BJournal%5D)">Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres.</a> J Muscle Res Cell Motil. 10 (197), (1989).</li>
<li>Augusto, V., Padovani, C. R., Campos, G. E. R. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/228866300_Skeletal_muscle_fiber_types_in_C57BL6J_mice">Skeletal muscle fiber types in C57Bl6j mice.</a> Braz J Morphol Sci. 21 (2), 89-94 (2004).</li>
<li>Schiaffino, S., Reggiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+types+in+mammalian+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Fiber types in mammalian skeletal muscles.</a> Physiol Rev. 91 (4), 1447-1531 (2011).</li>
<li>Allen, D. L., Harrison, B. C., Maass, A., Bell, M. L., Byrnes, W. C., Leinwand, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+and+skeletal+muscle+adaptations+to+voluntary+wheel+running+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cardiac and skeletal muscle adaptations to voluntary wheel running in the mouse.</a> J Appl Physiol. 90 (5), 1900-1908 (2001).</li>
</ol>

저자는 공개를 전혀 상반 되는 관심사를 있다.

여기, 우리 골격 근육 섬유 종류의 식별에 유용한 방향 제공. 이렇게, 우리는 데이터의 분석을 위한 새로운 알고리즘을 설명 합니다.
때문에 우리의 결과 크게 이전 보고서5,,810 의 확인 하 고 우리 자신의 수동 측정을 반영, 알고리즘은 정확 하 게 나타납니다. 아직도, 우리는 유물 단면에서 결과 불분명 섬유 테두리를 포함 하 여 몇 가지 드문 실험 함정이 발생. 주의 단면화 및 분석 이전에 처리 된 부분의 경계 검사를 통해이 이미지 들의 영향을 최소화할 수 있습니다. 특히, 선명한 대비를 달성 하기 위해 같은 이미지에 재분류의 여러 라운드를 통해 보다 최적의 이미지 세분화를 피할 수 있습니다.
우리의 프로토콜에서 가장 중요 한 단계는 우리 규정 섹션의 세포와 e...

그것은 골격 근육 많은 종류1의 단일 섬유의 구성 된 시간에 대 한 알려져 있다. 처음, 섬유의 2 개 그룹 그들의 수축 성의 속성에 따라 특징 이었다 하 고, 적절 하 게, 느린-트 위치 (유형 I) 및 빠른 트 위치 (유형 II). 이러한 범주 추가 섬유 물질 대사에 바탕으로 구별 했다. 이후 유형 I 섬유는 미토 콘 드리 아에서 풍부 하 고 산화 물질 대사에 의존, 그들은 견고 하 게 긍정적인 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드-tetrazolium 환 원 효소 (NADH-TR) diaphorase2 또는 호박 효소 (SDH)3 에 의해 해명 되었다 얼룩. 대조적으로, 유형 II 섬유 전시 덜 NADH TR diaphorase 또는 SDH의 가변도 얼룩이 지 고 두 빠른 트 위치 하위 그룹으로 분할 되었다 (유형 IIA 및 IIB 입력) 그들의 상대적인 산화 용량에 따라 다소 조잡. 섬유 사이의 이러한 구분 myosin ATPase 얼룩에 의해 보다 효과적으로 시각화 되어 있다 어디 유형 I 섬유는 pH 4.0에서 사전 부 화 후 어두운 얼룩 및 유형 IIB 섬유 흡수 유형 IIA 섬유와 pH 10.0에서 촉진 다음 사전 부 화 4얼룩 판매인.
더 최근에, myosin 무거운 체인 (MyHC) isoforms의 immunohistochemical 얼룩이 섬유 유형5의 미세한 판별자로 떠오르고 있다. 유형 I, IIA를 입력 하 고 유형 IIB 섬유 확인 될 수 있다 모두 그들의 MyHC 프로 파일에 따라 정밀. 또한, 또 다른 빠른 트 위치-중급 metabolically 섬유 종류, IIX, 입력 되었습니다 확인된6. 하나 이상의 MyHC을 표현 하는 하이브리드 섬유도 확인된5,,78있다. 고양이 개 코 원숭이 등 일부 종 표현 유형 IIB MyHCs6하지 알려져 있습니다. MyHC immunostaining는 현재 근육 구성의-의 상태--예술 평가,이 기술을 통해 얻은 데이터의 분석은 복잡 하 고 자동화 된 도움 없이 소모. 이 위해 이러한 데이터를 분석 하는 반자동된 방법의 개발된5,,910되었습니다. 여기, 우리 소설 반자동된 함께 근육 섬유 타입5,,78,10, 의 immunohistochemical 식별에 대 한 상대적으로 표준 프로토콜 제시 섬유 유형 및 섬유 형태학의 분석 정확도와 가속 알고리즘입니다.

<table><tbody><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>시그마 Aldrich</td><td>A9418-100G</td><td>5% PBS</td></tr><tr><td>소수성 장벽 Pap 펜</td><td>과학 장치 실험실</td><td>9804-02</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>글로브 사이언티픽</td><td>1358W</td><td></td></tr><tr><td>커버글래스</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>12-544-E</td><td></td></tr><tr><td>면역마운트</td><td>Thermo Scientific</td><td>9990402</td><td></td></tr><tr><td>매니큐어</td><td>L'Oreal</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, Nikon Eclipse, TE-200 반전 형광 및 명시야 현미경</td><td></td><td>단종</td><td></td></tr>, <tr><td>SPOT, RT/KE</td><td>SPOT 이미징 솔루션</td>, <td>RT940</td><td></td></tr>, <tr><td>Dell Optiplex</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BA-F8, 1차 항체</td><td>발달 연구, 아이오와 대학의 하이브리도마 은행,</td><td></td><td>단클론 마우스 IgG2b; 1:50</td></tr><tr><td>SC-71 일차 항체</td><td>발달 연구 아이오와</td><td></td> 대학의 하이브리도마 <td>은행 단클론 마우스 IgG1; 1:50</td></tr><tr><td>BF-F3 1차 항체</td><td>발달 연구 아이오와</td><td></td> 대학의 하이브리도마 은행 <td>단클론 마우스 IgGM; 1:50</td></tr><tr><td>6H1 일차 항체</td><td>발달 연구 아이오와</td><td></td> 대학의 하이브리도마 <td>은행 단클론 마우스 IgGM; 1:50</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 anti-IgG2b</td><td>Invitrogen</td><td>A21145</td><td>염소 안티 마우스;1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-IgG1</td><td>Invitrogen</td><td>A21121</td><td>염소 안티 마우스; 1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 anti-IgGM</td><td>Invitrogen</td><td>A21044</td><td>염소 안티 마우스; 1:200</td></tr><tr><td>OCT</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>이소펜탄</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3551-4</td><td>냉각 liguid 질소</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP665-1</td><td>10x, 1x</td></tr><tr><td>Kim wipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>06-666A</td><td></td></tr>로 희석</tbody></table>

마우스 골격 근육 형태와 섬유 형 구성의 반 자동화 된 분석

Semi-automated Analysis of Mouse Skeletal Muscle Morphology and Fiber-type Composition

수년간, 골격 근육 섬유 유형 사이 구분 했다 myosin ATPase 얼룩에 의해 최고의 시각 됩니다. 더 최근에, myosin 무거운 체인 (MyHC) isoforms의 immunohistochemical 얼룩이 섬유 타입의 미세한 판별자로 떠오르고 있다. 유형 I, IIA, IIX 입력 입력 하 고 유형 IIB 섬유는 정밀 프로필 기반으로 MyHC; 지금 확인 될 수 있다 그러나, 이러한 데이터의 수동 분석 느리고 다운 오른쪽 수 지루한. 이와 관련, 섬유 형 구성과 형태학의 신속, 정확한 평가 매우 바람직한 도구입니다. 여기, 우리는 최신의 immunohistochemical 마우스 hindlimb 근육 섬유 유형 및 섬유 형태 분석 가속 소설 반자동된 알고리즘으로 콘서트에서에서 얻은 냉동된 섹션에 MyHCs의 얼룩에 대 한 프로토콜을 제시. 표시 soleus 근육 유형 I에 얼룩이 지 고 입력 IIA 섬유, 예상 대로, 하지만 형식 IIX 또는 유형 IIB 섬유. 다른 한편으로, 앞쪽에 tibialis 근육 유형 IIX 및 유형 IIB 섬유, 유형 IIA 섬유의 작은 일부분의 주로 구성 되었고 거의 또는 전혀 유형 I 섬유. 여러 이미지 변환 섬유 형태 (즉, 횡단면 지역 (CSA), 최대 및 최소 Feret 직경)의 다양 한 측면을 측정 하기 위해 확률 지도 생성 하기 위해 사용 되었다. 이러한 매개 변수 값이 수동으로 얻은 다음 비교 했다에 대 한 얻은 값입니다. 체코, 최대 또는 최소 Feret 직경에 관하여 분석의 두 모드 사이의 중요 한 차이가 관찰 되었다 (모든 p &#62; 0.05), 우리의 방법의 정확도 나타내는. 따라서, 우리의 immunostaining 분석 프로토콜 노화와 myopathy의 많은 모델에서 근육 구성에 대 한 효과의 조사에 적용할 수 있습니다.

알 수 없는 나이의 남성 C57BL/6 마우스 해 부 Hindlimb 근육 (즉, 앞쪽에 tibialis, soleus) 액체 질소 냉각 isopentane 화합물 10 월에는 근육을 포함 하는 플라스틱 금형을 침 몰 하 여 냉동 플래시 했다. 그런 다음는 cryotome를 사용 하 여, 8-10 µ m 직렬 섹션-20 ° C에서 잘라 되었고 다른 긍정적으로 위탁 유리 슬라이드12전송.
이 근육은 주로 빠른-및 느린-섬유 트 위치, 각각13,14로 구성 하기 때문에 우리는 앞쪽에 tibialis와 soleus 선택. 개별 유형 I, IIA, IIX 및 IIB MyHCs, 얼룩 immunohistoche...

골격 근육 섬유 타입의 최신의 판별자로 떠오르고 있다 Immunohistochemical myosin 무거운 체인 isoforms의 얼룩 (즉, 유형 I, 유형 IIA, IIX 입력, IIB를 입력). 여기, 우리는 섬유 유형 및 섬유 형태학의 급속 한 평가 용이 하 게 하는 소설 반 자동화 알고리즘 함께 얼룩 프로토콜을 제시.

For years, distinctions between skeletal muscle fiber types were best visualized by myosin-ATPase staining. More recently, immunohistochemical staining of ...

본 프로토콜의 전반적인 목표는 최첨단 면역조직화학법을 사용하여 골격근 섬유 유형을 정확하고 빠르게 식별하는 것입니다. 이 방법은 기능성 단백질의 손실이 섬유 유형의 변화를 유발하는지 여부와 같이 근육 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 다양한 근육 질환 모델에 대한 통찰력을 제공할 뿐만 아니라, knock in 및 knock out 모델과 같은 시스템에서도 사용되어 단일 분자가 기본적인 근육 기능에 미치는 더 큰 영향을 밝혀낼 수 있습니다.먼저, 전하 처리된 슬라이드에 마우스 근육 냉동 절편을 올리고 약 30분 동안 공기 건조합니다. 건조가 완료되면 소수성 배리어 PAP 펜을 사용하여 각 슬라이드의 절편 주변에 경계선을 그립니다. 다음으로, 비특이적 항체 결합을 차단하기 위해 그려진 경계선 내에 5% BSA in PBS 약 250 µL를 넣고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.그동안 primary antibody를 5% BSA PBS에서 1:50으로 희석하여 준비합니다. 슬라이드당 약 250 µL가 되도록 제조하여 희석액을 얼음 위에 보관합니다. 블로킹 단계가 끝나면 슬라이드에서 블로킹 용액을 흡입하여 제거하고, 희석한 항체 용액 250 µL씩을 분주합니다.음성 대조군으로는 1차 항체를 제외하고 PBS에 5% BSA를 희석하여 처리합니다. 다음으로, 페트리 접시에 젖은 여과지를 넣고 알루미늄 호일로 덮어 배양 챔버를 만듭니다. 그 후 슬라이드를 해당 챔버 또는 동일한 습도가 유지되는 유사한 환경에서 4°C로 24~48시간 동안 배양합니다.1차 항체 배양 후, 슬라이드에서 용액을 흡입하여 제거하고 슬라이드를 3회 세척합니다. 각 세척 단계마다 PBS에 희석한 5% BSA 250 µL를 약 10분 동안 처리합니다. 슬라이드를 세척하는 동안, 정제된 형광 표지 2차 항체를 1:200 비율로 희석하여 준비합니다.슬라이드당 최소 250 µL를 준비하고, 용액을 암소의 얼음 위에 보관하십시오. 세 번째 세척 후, 2차 항체 희석액 250 µL를 슬라이드에 첨가합니다. 그다음 슬라이드를 상온의 어둡고 습한 환경에서 90분 동안 배양합니다.배양 후, 항체 용액을 흡입하여 제거하고 이전과 동일하게 슬라이드를 3회 세척합니다. 과량의 2차 항체를 모두 세척해낸 후, 슬라이드를 PBS로 헹구고 10분 동안 자연 건조합니다. 마지막으로, 비영구적 저점도 수성 마운팅 매질을 사용하여 슬라이드를 마운팅합니다.배지가 마른 후, 매니큐어를 사용하여 커버슬립의 가장자리를 밀봉하고 슬라이드를 불투명한 보관함으로 옮깁니다. 슬라이드를 이미징하기 전에 70% ethanol로 커버슬립을 세척하십시오. 그런 다음 형광 현미경을 사용하여 디지털 이미지를 획득합니다.저배율에서 관심 영역인 1 square millimeter 범위를 선택합니다. Alexa 488 결합 항체를 관찰하려면 505 nanometer 롱패스 필터를 사용하십시오. Alexa 594 결합 항체를 관찰하려면 595 nanometer 롱패스 필터를 사용하십시오.필터 설정을 적절히 마친 후, 디지털 이미지 수집을 시작하십시오. 이후 분석을 위해 스케일 바를 반드시 포함해야 합니다. 분석을 위해서는 본 출판물과 함께 제공되는 매크로를 사용하여 Fiji를 설치하십시오.매크로 파일을 액세스하기 쉬운 디렉토리에 저장하십시오. 이제 선택한 절편의 명시야 이미지를 불러온 후 Trainable Weka Segmentation 옵션으로 이동합니다. 절편의 세포 영역을 지정하려면 섬유 위에 선을 그리고 Class 1에 추가를 클릭하십시오.다음으로 세포 외 도메인을 표시하려면, 섬유 사이의 공간에 선을 긋고 class two에 추가를 클릭합니다. 각 클래스에 대해 5~10개의 라벨이 정의될 때까지 이 과정을 반복합니다. 간질 경계를 표시하는 것은 어려울 수 있습니다.확대 기능을 사용하면 이러한 경계선을 더 정밀하게 표시할 수 있습니다. 다음으로, 분류기 학습(train classifier) 옵션을 선택하십시오. 결과로 나타나는 적색 및 녹색 오버레이에서, 자동 프로세스에 의해 잘못 세분화된 이미지 영역에 수동으로 레이블을 추가로 지정하십시오.빨간색으로 표시된 섬유가 초록색으로 표시된 사이 공간으로부터 적절히 분리될 때까지 이 과정을 수행하십시오. 그런 다음 get probability를 클릭하고 이미지를 새 파일 폴더에 저장하십시오. 이제 동일한 시야에서 촬영한 형광 이미지를 사용하여 전체 과정을 반복하십시오.면역 염색된 섬유는 클래스 1로, 모든 비형광 영역은 클래스 2로 라벨링합니다. 최종적으로, 생성된 확률 맵을 처리된 명시야 이미지가 저장된 동일한 폴더에 저장합니다. 이제, 이전에 저장한 확률 맵 중 하나를 Fiji에서 엽니다.이미징 소프트웨어에서 제공하는 스케일 바 위에 직선을 그립니다. 'set scale'을 선택하고 스케일 바를 기준으로 정확한 값을 입력합니다. 그런 다음 글로벌 옵션을 활성화하여 모든 이미지의 스케일을 표준화합니다.이제 섬유 정량화를 위해 Tyagi 매크로를 실행하면 탐색 창이 나타납니다. 그런 다음 이미지 호스트 폴더를 엽니다. 관련 대화 상자에서 배경 드롭다운 값을 light로 변경하십시오.측정 설정 기능을 사용하여 측정할 파라미터를 정의할 수 있습니다. CSA(단면적)와 섬유 직경은 섬유 형태를 정량화하는 데 가장 적절한 측정 항목입니다. 매크로를 실행하면, 해당 폴더에 섬유 외곽선 이미지와 포어 분석(poor analysis) 기능으로 측정된 데이터가 포함된 스프레드시트가 생성됩니다.전경골근과 가자미근은 대부분 속근 또는 지근 섬유로 구성되어 있기 때문에 기술된 방법을 사용하여 분석되었습니다. 특정 항체를 사용하여 여러 종류의 미오신 중쇄를 식별하였습니다. 가자미근 섬유의 상당 부분에서 1형 및 2A형 미오신 중쇄가 발현되었으며, 나머지 섬유 중 적지 않은 양에서 2X형 양성 반응이 나타났습니다. 반면, 2B형 섬유는 거의 관찰되지 않았습니다.이와 대조적으로, 염색된 전경골근은 주로 type two B 및 type two X myosin heavy chain 섬유로 구성되어 있었으며, type two A chain을 발현하는 섬유의 기여도는 더 낮았고 type one chain을 발현하는 섬유는 거의 나타나지 않았습니다. type two A myosin heavy chain을 표적으로 하는 SC-71 항체로 탐침한 전경골근의 형태 측정 분석을 통해 확률 맵을 생성하는 데 사용되는 여러 이미지 변환이 수행되었습니다. 이러한 간편한 자동 분석을 통해, 얻어진 데이터가 훨씬 더 번거로운 수동 계산을 통해 생성된 데이터와 완전히 비교 가능함이 입증되었습니다.종합하면, 이 분석을 통해 총 약 6,000개의 개별 섬유로부터 데이터를 얻었습니다. 이러한 높은 데이터 처리량 덕분에 통계 분석의 실행 가능성이 훨씬 높아졌습니다. 이 영상을 시청하신 후에는 근육 절편을 면역 염색하는 방법과 제공된 반자동 소프트웨어를 사용하여 근섬유 유형 및 구성 분석을 용이하게 하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.이 절차를 수행할 때, 근육은 부위별로 이질적일 수 있으며 근섬유 유형과 구성의 엄격한 평가를 위해서는 많은 근육 영역에 대한 분석이 필요하다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차와 병행하여, 섬유 유형 구성의 변화와 함께 섬유화가 진행되는지 여부와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 Trichrome 염색과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

semi-automated-analysis-mouse-skeletal-muscle-morphology-fiber-type

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

절연 골격근의 묘 - 기계 분석

제브라 피쉬는 골격 근육의 인간의 질환을 모델링하는 새로운 시스템이다. 우리는 배아 및 유충의 제브라 피쉬에서 골격 근육의 근섬유를 분리하는 빠르고 효율적인 방법을 설명합니다. 이 방법은 하나의 골격 근육 섬유 형태의 연구에 적합한 고밀도 근섬유 준비, 단백질 세포 내 현지화, 근육 생리를 얻을 수 있습니다.

해리 된 준비에서 배아와 애벌레 Zebrafish의 골격 근섬유의 분석

여기에서는 개선 된 염색 품질함으로써 자동 취득하고 자유롭게 사용할 수있는 소프트웨어를 사용 ImageJ에 섬유 집단의 정량화를 허용 빠른 근섬유 분석을위한 프로토콜을 제시한다.

마이 오신 중쇄 면역를 사용하여 쥐의 근육 크로스 섹션에서 근육 섬유 인구 분석을위한 신속한 자동화 프로토콜

신경 근육 접합 구성 요소를 정확하게 검출하는 능력은 병리학적 또는 발달 과정으로 인해 아키텍처의 수정을 평가하는 데 중요합니다. 여기서 우리는 정량 적 측정을 수행하는 데 사용할 수있는 전산 신경 근육 접합의 고품질 이미지를 얻기 위해 간단한 방법에 대한 완전한 설명을 제시합니다.

면역형광및 전체산 신경근육 접합의 형태 분석에 대한 단일 골격 근육 섬유의 해부

증가하는 증거는 골격근 내부의 지질의 과도한 침투가 지방 독성과 당뇨병을 초래한다는 것을 나타냅니다. 여기에서, 우리는 조직 처리, Bodipy로 염색, 이미지 획득 및 분석을 포함하는 완전한 프로토콜을 제시하여 섬유 유형 특이적 방식으로 지질 방울의 크기, 밀도 및 세포 내 분포를 정량화한다.

골격근의 지질 액적 함량의 섬유 유형 및 세포내 특이적 분석

이 프로토콜은 동결 건조된 인간 골격근에서 단일 섬유 분리 및 도트 블로팅 기술을 사용하여 미오신 중쇄(MHC) 동형에 따른 섬유 유형 분류를 보여줍니다. 확인된 MHC I 및 II 섬유 샘플은 웨스턴 블로팅을 사용하여 단백질 발현의 섬유 유형별 차이에 대해 추가로 분석할 수 있습니다.

인체 골격근의 섬유 유형 식별

우리는 성인 마우스의 6개 근육에서 다양한 길이와 유형의 효소로 해리된 섬유를 얻기 위한 프로토콜을 설명합니다: 그 중 3개는 이미 설명되었고(flexor digitorum brevis, extensor digitorum longus, soleus) 그 중 3개는 처음으로 성공적으로 해리되었습니다(extensor hallucis longus, peroneus longus, peroneus digiti quarti).

생쥐의 6개 뒷다리 근육의 효소 해리로 얻은 온전한 짧은, 중간 및 긴 골격근 섬유: Beyond Flexor Digitorum Brevis

여기에서는 인간 또는 생쥐 근육의 신선한 투과화된 골격근 섬유에서 미토콘드리아 산화 인산화를 측정하는 포괄적인 방법을 설명합니다. 이 방법을 사용하면 미토콘드리아 호흡을 실시간으로 정량화하고 연료 선호도 및 대사 유연성을 평가하는 동시에 기존 미토콘드리아 네트워크와 멤브레인 무결성을 유지할 수 있습니다.

고분해능 호흡 측정법을 통한 인간 및 생쥐 골격근 섬유의 미토콘드리아 호흡 측정

미토콘드리아 염료 표지 말단 미토콘드리아의 국소 주입 시 생 체 내 공초점 현미경 검사. 이 방법은 건강한 근육을 가진 쥐와 병든 쥐의 골격근 조직에서 입증된 개념 증명을 활용하여 고해상도 미토콘드리아 시각화를 제공합니다.

마우스의 근육 및 말단 슈반 세포에서 미토콘드리아 형태의 현장 정량화 방법

분리 및 골격 근육 표현이 가장 풍부한 단백질의 신원을 확인하는 방법을 똑바로 앞으로 설정할 수 있습니다. 약 800 곳 10 MG 근육에서 2 차원 겔에 분별되며 이것은 성별 특정 단백질 표현의 결정을 허용합니다. 이러한 방법은 대부분의 조직에 상응하는 결과를 제공합니다.

Proteomics에서 골격근 성별 동종 이형

학습하세요 마우스 골격 근육 섬유 형태와 구성을 반자동 알고리즘으로 분석하는 면역조직화학법을. 이 방법은 근육 생물학 및 질병 연구에 활용됩니다.

마우스 골격 근육 형태와 섬유 형 구성의 반 자동화 된 분석

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