Name: 쥐의 고립 된 저항 동맥의 비디오 현미경을 이용 하 여 혈관 제어 메커니즘의 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: 배우세요 쥐의 고립된 저항 동맥에서 혈관 반응성을 평가하는 비디오 현미경법을. 이 기술은 혈관 내피와 평활근 조절 메커니즘을 연구하고 혈관 기능 장애의 진단 및 치료에 활용됩니다.

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저자는 그들의 진실한 케이티 핑크와 린 Dondlinger이이 원고 준비에 그들의 귀중 한 도움에 대 한 표현.
보조금 지원: NIH #R21-OD018309; #R56-HL065289; 그리고 #R01-HL128242입니다.

저자 아무 경쟁 금융 관심사 있다.

이 종이 소개에서 설명 했 듯이, 텔레비전 현미경의 사용에 설명 합니다 및 절연된 저항 동맥 표준 쥐 모델 (비디오에 사용)에 뿐만 아니라 혈관 기능을 평가 하기 위해 접근 하지만 또한 매우 전문화 유전자 소설과 이러한 접근법을 활용 하 여 얻을 수 있는 강력한 통찰력을 보여 조작된 쥐 변종. 활성 톤을 평가 하기 위해 이러한 강력한 방법 사용 하 고 작은 저항 동맥의 수동 기계적 성질 endothelium 종속 규칙을 포함 한 혈관 제어 메커니즘의 넓은 스펙트럼에 관한 중요 한 정보를 제공할 수 있습니다. 저항 동맥에서 활성 톤의 정상 및 병 태 생리 조건, 및 수동 속성 동맥의 혈관 평활 근 기능 혈관 개장에 관련 하 고 혈관 벽 역학에서 변경 됩니다. 내 피 기능 장애 인간 심장 혈관 관련 사망63를 포함 하 여 여러 불리 한 심장 혈관 사건의 강력한 전조 표시기로 표시 되었습니다 그리고 cannulated 저항 동맥 준비에서 특히 귀중 한 내 피 기능 장애를 감지 하 고 내 피 ...

혈관 기능 활용 하는 동맥 도관 동맥, 및 많은의 초기 연구는 대동맥의 경우. 큰 동맥에서 강제로 생성은 일반적으로 조직 목욕; 힘 변환기를 동맥의 링 세그먼트를 연결 하 여 공부 대동맥의 경우 나선형 절단 하 여 스트립 선박의 있도록 부드러운 근육 섬유 첨부 파일의 포인트와 힘 변환기의 수축에 의해 생성 된 힘의 좋은 견적을 제공 하는 경도 방향에서 동쪽으로 향하게 했다 세로 축 따라 부드러운 근육입니다. Aortas의 나선형 스트립을 절단에 대 한 표준 기술 선박의 루멘에 유리 막대를 배치, 원하는 각도에서 혈관 벽에 상처를 만들고 컷은 전체 생산 확장으로 혈관 벽의 노출된 가장자리의 끝에 개최 되었다 그릇의 나선형 스트립입니다. 그 시점에서, 혈관의 내 피 쪽은 일반적으로 선박 스트립 힘 변환기에 연결 하 고 물속에 산소를 준비 하기 전에 파편을 제거 하 얼룩이 및 온도 제어 조직 목욕. 결국, 편안한 인자 (EDRF), 이후에에서 산화 질소로 식별 된 파생 된 접근 생리학의 역사에서 가장 유명 하 고 중요 한 발견 중 하나를 Furchgott와 Zawadski1, 즉 피 내 막의 역할에 의해 주도 혈관 기능을 규제. 그의 발견에 지도 하는 중요 한 이벤트는 조사 외국 표면 동맥의 내 피 쪽의 접촉을 피하 여 그대로 피를 유지 하 고 대동맥 스트립 예상 전시 하지 않았다 발견 상황 이었다 아 세 틸 콜린 (ACh), 대신에 ACh 대응 편안 하지만 수축. 그 관찰을 바탕으로, 조사는 그들은 (그러나 수축 성 힘을 생성할 수 없습니다)는 그대로 피와 대동맥 세그먼트를 연결 하는 "샌드위치" 준비 대동맥의 표준 헬리컬 스트립 개발과 ACh 유도 변환 휴식으로 수축입니다.
광범위 하 게 오늘 사용 되는이 지역에서 두 개의 주요 발전은 작은 저항 동맥2,3 에 활성 수축 성 힘을 측정 하는 준비의 개발 (예:3 장 mesentery )와 cannulated 저항 동맥 준비4,,56. 초기 보고서 중 하나에서 Mulvany 및 Halpern3 와이어 myograph 준비 공부 저절로 고혈압 쥐 (SHR)의 장 mesentery에서 절연된 저항 동맥에 활성 수축 성 힘을를 사용 하 여 설명 하 고 normotensive WKY 제어 합니다. 와이어 myograph 시스템의 개발, 후속 cannulated 저항 동맥 준비 vivo에서 조건4,,56배 가까이의 연구를 허용 하도록 개발 되었다.  두 방법 모두 귀중 한 결과 제공 하는 동안 cannulated 동맥 준비는 더 효과적으로 보존; 동맥에 본질적인 활성 톤의 추가 장점 변화 흐름 율과 내 피 전단 응력 변화에 과거 압력과 배 응답에 활성 조직적 응답 연구 조사를 허용 하 고 (참조 Halpern와 켈리6검토).
현재 종이의 주요 목표에서 이러한 중요 한 활성 톤을 조절 하는 메커니즘에 대 한 정확한 정보를 얻기 위해 절연, cannulated 저항 동맥을 사용 하 여 비디오 현미경의 영광 기술을 채용 하는 방법을 설명 하는 것입니다. 혈관, 신경, 체액, 또는 parenchymal 세포의 독립에 영향을. 이 기본 정보, 고용 표준 쥐 모델 및 예의 우리의 연구에서 새로운 유전자 조작 쥐 긴장, 텔레비전으로 얻을 수 있는 혈관 기능에 대 한 통찰력의 종류의 아이디어로 독자를 제공할 것입니다. 현미경 접근 하 고 있는 모든 제어 및 탐정의 선택, 강력한 새로운 실험 쥐 모델을 포함 한 선택적 근 친 결혼에 의해 생성 하 고 새로 개발 된 유전자의 실험적인 그룹을 포함 하는 연구에서 채택 될 수 있다 엔지니어링 기술입니다.
텔레비전 현미경 방식의 정밀 감사 cannulated 동맥 준비에 직경 변화의 측정 혈관의 내 피-종속 및 endothelium 독립 메커니즘에 관한 매우 귀중 한 정보를 제공할 수 있습니다. 휴식, 뿐만 아니라 고혈압, 높은 소금 다이어트, 그리고 다른 실험 개입으로 발생 하는 혈관 제어 메커니즘에서 중요 한 (그리고 때로는 예기치 않은) 변경. 더하여, 압력-직경 관계의 절연 측정과 cannulated 극대로 Ca2 +치료에 의해 완화 저항 동맥-무료 솔루션 또는 약리학 vasodilator 약물 평가 하기 위해 조사를 수 동맥 동맥 기능에 영향을 미칠 수 있는 동맥의 수동 기계적 특성의 변화에 중요 한 통찰력을 제공할 수 있는 수동 응력-변형 관계7 을 계산 하 고 혈관 개장 때문에 구조적인 변화 독립 (또는 이외에)의 활성 제어 메커니즘에 변경합니다. 그것은 또한 절연된 저항 동맥의 연구에서 얻은 정보 LDF, 전체 동물 레벨8,9 조직 관류를 평가 하기 위한 실용적인 방법을 이용 하 여 얻은 정보에 의해 보완 될 수 있습니다 주의 하는 것이 중요 ,10, microvessel 밀도 붙일 이라는 GS1 lectin를 사용 하 여 평가에서 얻은 정보로는 특히 작은 arterioles, 모세 혈관11 의 지하실 막에 있는 당단백질 moieties에 바인딩합니다 , 12. 후자의 방법을 고전적인 어려움 혈관에서 vivo에서, 예를 들어 비 끼얹는다 누락 계산 하 여 microvessel 밀도 추정에 적용 되지 않습니다 microvessel 밀도의 매우 정확한 견적 제공 선박 어디 혈 arterioles의 활성 폐쇄로 인해 중지. 함께 사용 하는 경우 이러한 접근 기능 변경 수준 microcirculatory; 조직 관류의 변화에 절연된 저항 동맥에 연결 하는 중요 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 그리고 cannulated 동맥 기술와 함께에서 이러한 중요 한 접근 방법의 사용의 몇 가지 예 또한 현재 원고에 제공 됩니다.
현재 종이 outbred Sprague-Dawley 쥐의 동맥에서 혈관 변화를 평가 하기 위해 비디오 현미경 검사 법 기술의 사용에 초점을 맞추고. 그러나, 그것은 중요 이러한 기술을 elucidating 선택적 번 식 또는 유전자 기술을 사용 하 여 편집에 의해 만들어진 고도로 전문화 된 유전자 조작된 쥐 긴장에서 phenotypic 변경에 매우 유용한 것으로 입증 되었습니다. 이 원고를 제공 어떻게 비디오 현미경 검사 법 기술의 예 수 귀중 한 쥐에에서 혈관 기능에 관한 중요 한 정보에서 가장 널리는 Dahl 소금에 민감한 (SS) 타고 난된 쥐 쥐 한 긴장을 포함 한 모델 제공 실험 모델을 사용 하는 소금 민감한 hypertenson18,19,20,21,,2223;의 메커니즘 연구 그리고 consomic 쥐 소금 구분 브라운 노르웨이 (BN) 쥐 긴장 SS 쥐의 선택적인 breeding를 통해 만든. Consomic 쥐 패널에서 갈색 노르웨이 쥐에서 모든 염색체 introgressed Dahl SS24,,2526 유전 배경으로 개별적으로 되었습니다. 혈압 및 혈관 반응성24,25,26 포함 하 여 다른 고기 소금 감도에 기여 하는 특정 염색체에 관한 귀중 한 단서를 제공 하는 consomic 쥐 패널의 사용 ,,2728.
SS 쥐와 개별 BN 염색체를 운반 하는 consomic 쥐를 이용 하 여 선택적 번 식 전략 또한 Dahl SS 유전으로 개별 브라운 노르웨이 염색체 introgressed의 작은 세그먼트와 좁게 congenic 긴장의 생성 활성화 배경22,29 이 제공 하는 매우 귀중 한 입력된에 특정 한 유전자 또는 혈압, 신장 손상, 혈관 반응성22,29등 중요 한 생리 적 변수 영향을 미칠 수 있는 염색체의 지구를 좁힐 수 있습니다. 쥐 유전자 도구 상자에 또 다른 강력한 추가 쥐 유전자 녹아웃 모델 ZFNs, transcriptional 활성 제 같은 이펙터 nucleases (TALENS)를 포함 한 기술을 편집 고급 유전자를 활용 하 여 개발 하 고 가장 최근에 CRISPR-Cas913 ,,1415,,1617. 쥐에 기 절 하는 유전자를 활성화 하는 이러한 강력한 기술의 출현은 대단히 중요 한 발전 날짜에 유전자 녹아웃 학문의 사용 (및 계속 사용) 마우스 때문에 거의 독점적으로. 현재 종이 다른 실험적인 구성 요소 cannulated 동맥 기술 및 녹아웃 쥐 마스터 항 산화 및 세포 보호 전사 부족에 생리 적 제어 메커니즘을 평가 하기 위해 비디오 현미경의 값을 보여 줍니다. 요소, 핵 팩터 (erythroid 파생 2)--2 (NRF2)30,31, Sprague-Dawley 유전 배경17TALEN 기술을 사용 하 여 개발 되었다. 그 실험에서 NRF2 유전자의 손실의 기능 검증을 제공 하 고 잠재적으로 귀중 한 치료 접근을 중재 하는 NRF2 항 산화의 직접 upregulation에 따라 테스트를 비디오 현미경 기술은 생체 외에서 사용 되었다 방어입니다. NRF-2는 항 산화 비타민 C와 E32등의 직접적인 관리를 포함 하는 임상 시험의 실망 스러운 결과 비추어 인간에서 혈관 산화 스트레스를 싸우는에 상당한 치료 중요 합니다.

<table><tbody><tr><td>SS Rat</td><td>Medical College of Wisconsin</td><td>SS/JHsd/Mcwi strain</td><td>Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)</td></tr><tr><td>SS.5BN Consomic Rat</td><td>Medical College of Wisconsin</td><td>SS-Chr 5BN/Mcwi strain</td><td>Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)</td></tr><tr><td>SS.13BN Consomic Rat</td><td>Medical College of Wisconsin</td><td>SS-Chr 13BN/Mcwi 균주</td><td>Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)</td></tr><tr><td>Ren1-BN Congenic Rat</td><td>Medical College of Wisconsin SS에게</td> 문의하십시오<td>. BN- (D13HMGC41-D13) HMGC23 / MCWI 균주</td><td>Aron Geurts 박사에게 문의 (ageurts@mcw.edu)</td></tr> <tr><td>Ren1-SSA 위스콘신 SS 선천성 쥐</td><td>의과 대학</td><td>. BN- (D13RAT77-D13RAT105 / MCWI 균주</td><td>연락처 Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)</td></tr> <tr><td>Ren1-SSB 위스콘신 SS 선천성 쥐</td><td>의과 대학</td><td>. BN-(D13rat124-D13rat101/Mcwi 균주</td><td>연락처 Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)</td></tr><tr><td>Nrf2(-/-) 녹아웃 쥐 및 야생형 Littermates</td><td>위스콘신 의과 대학</td><td>SD-Nfe212em1Mcwi 균주</td><td>연락처 Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)</td></tr><tr><td>저염 쥐 차우(0.4% NaCl)-AIN-76A</td><td>Dyets, Inc.</td><td></td><td></td>113755</tr><tr><td>고 염 쥐 차우 (4 % NaCl) -AIN-76A</td><td>Dyets, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>113756 콜로라도 비디오 캘리퍼스</td><td>콜로라도 비디오, Inc.</td><td>모델 308</td><td></td></tr><tr><td>비디오 카메라</td><td>Hitachi</td><td>KPM1AN</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>올림푸스 생명 과학</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>텔레비전 모니터</td><td>Panasonic</td><td>WVBM1410</td><td></td></tr><tr><td>압력 변환기</td><td>스톨팅</td><td>56360</td><td></td></tr><tr><td>혈압 표시 장치</td><td>스톨팅</td><td>50115</td><td></td></tr><tr><td>캐뉼러 동맥 챔버</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>CH-1</td><td>범용 단일 용기 챔버</td></tr> 단일 <tr><td>챔버 용 온도 컨트롤러</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>TC-09S</td><td></td></tr><tr><td>가스 분산 튜브, 미니어처, 직선</td><td>생활 시스템 계측</td><td>GD-MS</td><td>용기 욕조에서 폭기 제공</td></tr><tr><td>가스 교환 산소 공급기, 소형</td><td>생활 시스템 계측</td><td>OX</td><td>관류액과 가스 교환 가능</td></tr><tr><td>레이저 도플러 유량계</td><td>Perimed</td><td>PeriFlux 5000 LDPM</td><td></td></tr><tr><td>GS1 Lectin</td><td>Vector Labs</td><td>RL-1102</td><td></td></tr><tr><td>마이크로피펫용 유리 모세관</td><td>Fredrich Haer Co.</td><td>27-33-1</td><td>2mm ODX1 mm ID</td></tr><tr><td>수직 피펫 풀러</td><td>David Kopf 기기</td><td>모델 700C</td><td></td></tr><tr><td>나일론 봉합사 재료(10/0)-3 PLY</td><td>Ashaway Line 및 Twine Manufacturing Co.</td><td>114-ANM-10</td><td>선박에 사용하기 위해 조롱된 3겹 나일론 봉합사의 단일 가닥</td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps-Inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Protandim</td><td>Protandim</td><td></td><td>NRF2 유도제: Contact Dr. Joe McCord (JOE.MCCORD@UCDENVER.EDU)</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>피셔 케미컬</td><td>S233-3</td><td></td></tr><tr><td>포도당(d-글루코스) 무수</td><td>피셔 케미컬</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>황산마그네슘(MgSO4-7H2O)</td><td>시그마 알드리치</td><td>M1880-500 G</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘(CaCl2-2 H2O)</td><td>시그마</td><td>C5080-500G</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨-일염기성(NaH2PO4)</td><td>시그마</td><td>S0751-500G</td><td></td></tr><tr><td>염화칼륨(KCl)</td><td>피셔 케미컬</td><td>P217-500G</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산이나트륨염 이수화물(EDTA)</td><td>Sigma</td><td>ED255-500G</td><td></td></tr></tbody></table>

쥐의 고립 된 저항 동맥의 비디오 현미경을 이용 하 여 혈관 제어 메커니즘의 평가

Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats

이 프로토콜 텔레비전 현미경 고립된 대뇌 저항 동맥 (와 다른 배), 혈관 기능을 평가 하기 위해 생체 외에서 의 사용을 설명 하 고 레이저 도플러 Flowmetry (LDF를 사용 하 여 조직 관류를 평가 하기 위한 기술에 설명 합니다. )와 microvessel 밀도 붙일 활용 Griffonia simplicifolia (GS1) lectin를 표시. 현재 공부에 대 한 과거 발생 압력에서 vivo에서 에서 저항 동맥을 분리 방법과 parenchymal 세포 영향의 부재에서 vivo에서 연구와 분자에서 얻은 정보 사이의 중요 한 링크를 제공 전체 동물 수준에서 통합 응답에 제한 된 통찰력을 제공 하는 reductionist 접근. 선택적으로 붙일 레이블 GS1 lectin arterioles, 모세 혈관을 식별 하는 LDF 및 기술 절연된 저항 동맥의 연구에서 얻은 지식을 확장할 수 사관 수 있도록 실용적인 솔루션을 제공 합니다. 이 종이 혈관 생리학과 병리학 일반 실험 모델 쥐에서의 기본적인 지식을 얻기 위해 이러한 기술의 응용 프로그램을 설명 하 고 전문의 다양 한 제공할 수 있는 "디자이너" 쥐 종자를 유전자 조작 중요 한 혈관 고기에 특정 한 유전자의 영향으로 중요 한 통찰력. 녹아웃 마우스 모델에서 개발 된 과학 건물의 엄 함 확장 됩니다 선택적 번 식 전략과 쥐에 유전자 녹아웃 모델 생산을 위한 새로운 기술을 개발한 쥐 긴장에서이 귀중 한 실험적인 접근을 이용 하 고 그 지식을 잘 이해 생리 적 배경 및 그것의 큰 크기 때문에 생리 적 연구에 대 한 적합성과 더 관련 동물 모델을 확장 합니다.

과거 압력 정상 에 vivo에 에서 그리고 parenchymal 세포의 부재에서 cannulated 저항 동맥의 생체 외에서 현미경에 작은 저항 동맥 (큰 arterioles) 활성 톤을 영향을 미치는 요인의 연구에 대 한 허용 영향을 미칩니다. 다양 한 vasodilator 및 vasoconstrictor 자극에 선박과 일반 PSS, 캘리포니아2 +에서 과거 압력 상승에 대 한 조직적 응답의 반응성을 평가 하는 것 외에도-무료 PSS는 perfusate와 superfusate의 끝에 추가할 수 있습니다 최대 선박 직경 및 벽 두께 결정 하는 실험. 후자의 측정은 혈관 개장, 즉, 벽/루멘 비율 변화 혈압 또는 약리 에이전트의 관리에 대 한 응답에서 발생할 수 있는 변화 평가에 매우 중요 합니다. 캘리포니아2 +에서 극대로 동 공이 확장 되어 혈관의 직경의 측정-무료 PSS는...

이 원고는 쥐 대뇌 저항 동맥 혈관 기능을 평가 하기 위한 비디오 현미경 검사 법 프로토콜을 체 외에 설명 합니다. 원고는 또한 레이저 도플러 Flowmetry를 사용 하 여 붙일 레이블된 lectin과 조직 관류와 microvessel 밀도 평가 하기 위한 기법을 설명 합니다.

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other ...

이 절차의 전반적인 목적은 분리된 저항 동맥을 이용하여 혈관 활성 자극에 대한 혈관 반응성을 테스트하는 것입니다. 또한 평활근 조절 기전 및 수동적 기계적 특성의 변화를 평가하는 방법을 보여줄 것입니다. 이 방법은 다양한 조건에서 소저항 동맥의 내피 및 혈관 평활근 조절 기전에 관한 혈관 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 소저항 동맥을 실질 세포 환경으로부터 분리하여 정상 압력을 유지하면서 혈관 활성 자극에 대한 반응을 테스트할 수 있다는 점입니다. 이 기술의 응용 범위는 혈관 기능 장애의 치료 및 진단까지 확장됩니다. 이러한 방식의 조작은 생체 내(in vivo)에서는 불가능합니다.이 방법은 말초혈관 질환에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라 관상동맥 질환에도 적용될 수 있습니다. 미세 캐뉼라 삽입 단계는 절차의 섬세함과 동맥 손상을 방지해야 할 필요성 때문에 습득하기 어려우므로, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 실험 당일, 2L 삼각 플라스크에 2L의 생리식염수를 준비하십시오.20X 완충액 스톡을 추가하는 동안, 용액이 가스 혼합물과 지속적으로 평형을 이루도록 하고 마그네틱 스터러 바를 이용해 교반하십시오. 다음으로, 혼합물에 0.28 g의 인산수소나트륨을 추가하면서 pH를 확인하십시오. pH가 7.4로 유지되도록 필요에 따라 파스퇴르 피펫을 사용하여 6 N 염산 또는 6.5 N 수산화나트륨 용액을 한 방울씩 첨가하여 pH를 조절하십시오.그런 다음 생리식염수에 1.98 g의 glucose를 첨가합니다. 다음으로, 20배 농축 스톡 용액을 탈이온수로 희석하여 500 mL의 칼슘 제거 생리식염수를 준비합니다. 그런 다음, 삼각 플라스크에 20배 농축 버퍼 스톡 25 mL를 넣고, 용액의 pH를 모니터링하고 조절하면서 0.07 g의 monosodium phosphate를 용액에 첨가합니다.적절한 혼합 가스가 들어있는 가스 탱크를 오르간 배스(organ bath)에 연결하기 위해 테트라플루오로에틸렌 튜브를 사용하십시오. 용액이 용기 챔버로 유입될 때 난류가 발생하지 않으면서도 지속적으로 기포가 발생할 수 있는 충분한 속도로 용액에 가스를 계속 주입하십시오. 또한, 생리적 식염수의 가스 조성을 유지하는 데 도움이 되도록 평형 가스 혼합물에 연결된 작은 에어스톤을 용기 챔버 내에 배치하십시오.생리식염수를 2리터 용량의 마리오트 병(Mariotte bottle)에 넣습니다. 스토퍼에 중앙 유리관을 추가하여, 혈관 챔버에 용액을 공급하는 약리학적 장기욕(organ bath)으로 생리식염수를 지속적으로 전달하는 저장조 역할을 하게 합니다. 마리오트 병 내 중앙 유리관의 개구부를 장기욕 내 생리식염수 표면과 동일한 높이에 맞춥니다.이렇게 하면 장기욕(organ bath)으로 생리식염수를 공급할 때 일정한 정수압 수두를 유지할 수 있습니다. 마리오트 병(Mariotte bottle)에서 장기욕으로 생리식염수를 전달하기 위해 J자형 유리관에 연결된 폴리에틸렌 튜브를 사용하십시오. 루멘 관류(lumenal profusion)의 경우, 폴리에틸렌 튜브를 사용하여 유입 피펫을 원하는 유입 압력을 유지할 수 있는 높이로 올린 66-CC 플라스틱 주사기로 구성된 생리식염수 저장조에 연결하십시오.스톱콕을 통해 압력 변환기를 시스템에 연결하여 압력을 모니터링합니다. 그런 다음, 압력 구배에 따라 생리식염수가 용기를 통해 흐를 수 있도록 유출 피펫을 폴리에틸렌 튜브를 통해 유입 저장조와 유사한 저장조에 연결합니다. 또한, 유사한 스톱콕과 압력 변환기 연결을 사용하여 유출 압력을 모니터링합니다.Sprague Dawley 쥐의 뇌를 적출하여 얼음처럼 차가운 생리식염수가 채워진 유리 페트리 접시에 배측이 위로 오도록 놓습니다. 그 다음, 접시를 실체 현미경 아래에 둡니다. Vannas 가위와 Dumont 5번 미세 팁 핀셋을 사용하여 뇌에서 중대뇌동맥을 절제합니다.그런 다음, 포셉을 사용하여 중대뇌동맥에 남아 있는 뇌 조직을 제거합니다. 절단된 분절의 끝부분을 조심스럽게 잡아 동맥을 혈관 챔버로 옮긴 후 챔버 안에 신중하게 배치합니다. 다음으로, 팁이 동맥의 내강 안으로 들어갈 때까지 대뇌동맥을 피펫 기저부 쪽으로 당겨 유입 마이크로피펫에 끼웁니다.10-0 봉합사에서 분리한 단일 섬유로 루프를 만들어 동맥 주위에 묶어 유입 피펫에 동맥을 고정합니다. 그런 다음, 혈관 주위에 두 번째 봉합사 루프를 조여 중대뇌동맥의 반대쪽 끝을 유출 피펫에 고정하고, 유입 피펫 홀더에 연결된 마이크로미터를 사용하여 동맥을 실제 생체 내(in situ) 길이만큼 늘립니다. 동맥 내의 일정한 압력을 유지하기 위해 10-0 봉합사에서 분리한 단일 섬유를 사용하여 모든 측지(side branch)를 묶어 차단합니다.다음으로, 비디오 마이크로미터 및 텔레비전 모니터와 연결된 해부 현미경에 비디오 카메라가 장착된 비디오 현미경을 설정합니다. 이 설정을 사용하여 동맥의 내경을 측정합니다. 실험 전 동맥이 적절한 수준의 능동적 톤(active tone)을 나타내는지 확인하여 근성 톤(myogenic tone)과 혈관 확장 자극에 대한 혈관 반응을 평가합니다.평상시 활성 긴장도가 없는 동맥은 폐기하되, 소장간막동맥과 같이 일반적으로 활성 휴지기 긴장도를 보이지 않는 혈관은 제외하십시오. 그다음, 혈관 챔버에 아세틸콜린 농도를 점진적으로 높여 첨가하고 혈관 직경을 측정하여 캐뉼라가 삽입된 저항 동맥의 내피 세포 의존성 반응성을 테스트합니다. 본 예시에서 동맥은 아세틸콜린에 반응하여 확장되지 않으므로 내피 기능 장애를 나타냅니다.실험 종료 시, 관류액(perfusate)과 외액(superfusate)에 칼슘이 없는 생리식염수를 첨가하여 동맥의 최대 직경을 측정합니다. 이 측정값을 사용하여 능동적 휴지 긴장도 백분율(active resting tone percent)을 계산합니다. 칼슘이 없는 생리식염수에서 최대 확장이 일어남을 입증함으로써, 아세틸콜린에 반응하여 동맥이 확장되지 않은 것이 혈관의 구조적 리모델링으로 인한 이완 불가 능력이 아니라 내피 기능 장애 때문이었음을 확인합니다.이 그림은 세 가지 협착된 동계 계통의 수컷 Dahl Salt Sensitive 쥐에서 분리한 중대뇌동맥의 혈관내피세포 의존성 혈관확장제인 아세틸콜린에 대한 반응을 보여줍니다. 이는 염분 민감성 친계통과 염분 민감성 Renan 대립유전자를 보유한 두 동계 계통 모두에서 아세틸콜린에 의한 혈관내피세포 의존성 확장이 나타나지 않았음을 보여줍니다. 염분 민감성 유전적 배경에 brown Norway Renan 대립유전자를 보유한 동계 계통에서는 정상적인 확장이 회복되었으며, 이는 SS 쥐의 내피세포 기능 장애가 Renan 유전자의 조절 손상으로 인한 것이라는 가설을 뒷받침합니다.본 실험에서는 특정 쥐 계통에서 고염식이가 아세틸콜린에 의한 혈관 내피 세포 의존성 이완을 제거하지 못한 사례를 통해, 식이 염분 섭취 증가 시 혈관 산화 스트레스 및 내피 기능 장애에 기여하는 요인들에 관한 결과를 살펴봅니다. 숙달되면 이 기술은 적절히 수행되었을 때 3시간에서 3시간 30분 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 평활근, 특히 혈관 내피 세포의 손상을 방지하기 위해 분리된 동맥을 매우 조심스럽게 다루는 것이 중요합니다.이 절차를 마친 후, 서로 다른 물질에 대한 혈관 반응성에 영향을 미치는 기전과 혈관에 작용하는 약물 작용 기전 등의 의문을 해결하기 위해 혈관 수축제 및 혈관 확장제 작용제 또는 수용체 길항제를 추가하는 것과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 기술은 개발 이후, 혈관 생물학 및 미세혈류 생리학 분야의 연구자들이 실험 동물 및 인간의 다양한 혈관층에서 유래한 저항 동맥의 평활근 및 내피 기능을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청한 후, 귀하는 다양한 혈관층의 소저항 동맥에서 내피 및 혈관 평활근 조절 기전을 평가하기 위해 이 방법을 사용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

우리는 단계별 절차와 필요한 장비에 대한 설명을 포함 손쥐 spinotrapezius 근육의 소설 동맥 결합 모델을 보여줍니다. 우리는 수술과 intravital 및 공 촛점 현미경을 사용하여 혈관 네트워크 리모델링 및 기능 vasodilation에 관한 관련 결과 측정을 설명합니다.

Microvascular 기능 및 리모델링에 Arteriolar 결합의 영향을 평가하기 위해 손쥐 Spinotrapezius 모델

압력 myography는 가압 할 때 지속적인 수축을 개발하는 작은 동맥의 vasoactivity을 평가하는 데 사용됩니다. 이 원고는 쥐, vasoactivity 혈관 직경에 관내 압력의 영향에서 작은 장간막 동맥의 고립 된 세그먼트에서 평가하기위한 세부 프로토콜을 제공합니다.

압력 Myography를 사용하여 저항 장간막 동맥에서 근육 조직 대응 및 Vasoactivity 평가

modified Landis 기법은 미세관류 기법을 사용하여 통제 및 테스트 조건에서 정상 및 유전자 변형 쥐의 장간막에서 개별 미세혈관의 수압 전도도를 쌍으로 측정할 수 있습니다. 생리학적 조건에서 미세혈관 투과성과 경혈관 교환을 조절하는 메커니즘을 평가하는 편리한 방법을 제공합니다.

Microperfusion 기술은 쥐 장간막에서 미세 혈관 투과성의 규정을 조사하기 위해

Videomicroscopy 시스템은 고립 된 지방 조직 arterioles 생리 및 약리 자극에 대 한 응답에서의 기능 속성을 검사 하는 데 사용 됩니다. 이 기술은 비만 인 간에 있는 다른 지방 조직 도메인에 microvascular 고기 검사를 사용할 수 있습니다.

인간 지방 조직 Microvascular 함수 Videomicroscopy를 사용 하 여 평가

이 원고는 arterioles, electrophysiological 칼슘 이미징 및 압력 myography 연구에 사용 될 수 있는 쥐 망막에서의 격리에 대 한 간단한 프로토콜을 설명 합니다.

Ex Vivo 세포 생리학 연구에 대 한 망막 Arterioles의 절연

이 프로토콜은 마우스에서 분리 된 장 간 막 동맥의 경 벽 등각 장력을 평가 하는 와이어 묘 조 그래피의 사용을 설명 하며, 내 피 세포 및 혈관 주위 지방 조직에서 방출 되는 요인에의 한 변조를 특별히 고려 합니다.

혈관 주위 지방 조직에 의해 변조에 초점을 맞춘 분리 된 장 간 동맥을 사용 하 여 혈관 톤 응답성의 평가

대뇌 실질 세동맥으로부터의 무손상 마우스 대뇌 내피 "튜브"의 집중적 인 준비는 뇌 혈류 조절을 연구하기 위해 예시된다. 또한, 우리는 세포 내 [Ca2+] 및 막 전위의 변화를 포함한 주요 세포 신호 전달 경로의 형광 이미징 및 전기 생리학 측정을위한 내피 연구 모델의 실험 강점을 입증합니다.

마우스 뇌 실질의 동맥 내피의 분리 및 기능 분석

본 프로토콜은 마우스 대동맥 내피 기능의 실험적 생체외 평가에서 다중 챔버 근초음파 시스템을 사용하는 텐소메트릭 근초음파 기술의 개념 및 기술적 적용을 기술한다.

Tensometric Small Volume Chamber Myography 를 이용한 마우스 흉부 대동맥의 내피 의존성 혈관 이완 측정

본 프로토콜은 래트 관상동맥의 혈관 반응성을 측정하기 위한 와이어 근그래프 기술을 기술한다.

표준화 된 쥐 관상 동맥 링 준비 및 용기 직경에 따른 동적 장력 변화의 실시간 기록

트윈 - 투 - 쌍둥이 수혈 증후군과 트윈 빈혈 polycythemia 시퀀스는 perinatal 의학의 두 잠재적으로 치명적인 문제가 있습니다. 두 질환은 monochorionic 쌍둥이와 placental 혈관 anastomoses을 통해 불균형 혈액의 흐름에서 결과 발생합니다. 우리는 정확하게 출산 후 placental 혈관의 색깔 염료의 주입을 사용하여 혈관 anastomoses의 존재를 평가하는 간단한 프로토콜을 제공합니다.

유색 염료를 사용하여 Monochorionic 태반의 혈관 Anastomoses의 정확하고 간단한 평가

배우세요 쥐의 고립된 저항 동맥에서 혈관 반응성을 평가하는 비디오 현미경법을. 이 기술은 혈관 내피와 평활근 조절 메커니즘을 연구하고 혈관 기능 장애의 진단 및 치료에 활용됩니다.

쥐의 고립 된 저항 동맥의 비디오 현미경을 이용 하 여 혈관 제어 메커니즘의 평가

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