샘플 추출 및 독 소 루비와 미토마이신 C 다음 약물 조합을 전달 나노 입자에 종양 방위 쥐의 동시 크로마 정량
2017년 10월 5일
이 프로토콜에 설명 합니다 샘플 추출의 효율적이 고 편리한 분석 프로세스와 여러 약물, 독 소 루비 (DOX), 미토마이신 C (MMC) 및 심장 독성 DOX 대사 산물, doxorubicinol (DOXol), 생물학에서의 동시 결정 전 임상 유 방 종양 모델에서 샘플 시너지 약물 조합의 나노 제형으로 치료.
이 분석 프로토콜의 전반적인 목표는 간단하고 강력한 역상 고성능 액체 크로마토그래피 방법을 사용하여 생물학적 매트릭스에서 고분자-지질 하이브리드 나노 입자와 독소루비신의 대사 산물인 독소루비시놀에 의해 함께 전달되는 두 가지 항암제인 독소루비신과 미토마이신 C를 동시에 추출하고 정량화하는 것입니다. 이 방법은 약물 조합의 나노 약동학을 기반으로 효과적인 나노 캐리 시스템을 설계하는 방법과 같은 나노 의학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 HPLC의 이동상을 변경할 필요 없이 동일한 생물학적 매트릭스에서 3개의 약물 화합물을 동시에 정량화할 수 있다는 것입니다.
따라서 이 방법은 원발성 유방 종양에서 독소루비신, 미토마이신 C 및 독소루비시놀의 생물학적 행동에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 유사한 약물로 치료하는 다른 암 유형에도 적용할 수 있습니다. 효율적인 시료 전처리 단계를 배우기 어렵기 때문에 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다.
이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 전혈, 주요 장기 및 유방 종양을 수집하고 동결합니다. 얼어붙은 조직의 무게를 빠르게 측정하고 실험실 노트에 무게를 기록합니다. 그런 다음 13ml 둥근 바닥 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
다음으로, 1-5ml의 얼음처럼 차가운 Cell Lysis buffer를 추가합니다. 전기 손 균질화기를 사용하여, 18, 000 분당 회전수에 얼음에 여기저기 치기 동의를 가진 조직을 균질화하십시오. 그런 다음 균질기의 10mm 톱니 발생기 프로브를 증류수 탈이온수로 세척합니다.
프로브를 70% 에탄올로 세척한 다음 증류수 탈이온수로 다시 세척합니다. 50마이크로리터의 조직 균질산염 또는 전혈을 1.5ml 폴리프로필렌 미세원심분리기 튜브로 옮깁니다. 다음, 2의 5 마이크로리터, 밀리리터 내부 기준 4-MethylUmbelliferone 당 000 nanogram를 가진 스파이크.
150마이크로리터의 아세토니트릴과 100마이크로리터의 5밀리몰 암모늄 아세테이트를 함유한 얼음 저온 추출 용매를 추가합니다. 2분 동안 혼합물을 격렬하게 소용돌이치십시오. 3, 000g 및 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리기
.그런 다음 200마이크로리터의 상등액을 미리 냉각된 새 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 질소 가스의 느린 흐름을 사용하여 빛으로부터 보호하면서 섭씨 60도에서 상층액을 증발시킵니다. 다음으로, 건조된 잔류물을 100마이크로리터의 얼음처럼 차가운 메탄올로 재구성합니다.
30초 동안 격렬하게 소용돌이칩니다. 3, 000g 및 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리기. 그런 다음 상층액을 HPLC 바이알 인서트로 옮깁니다.
주입을 위해 샘플 바이알을 자동 시료 주입기 트레이에 넣습니다. 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 HPLC 이동상을 준비합니다. 이동상 조성의 초기 조건을 16.5%H2O 및 83.5%아세토니트릴로 설정합니다.
등용매 유량을 분당 1.0밀리리터로 설정합니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 gradient mobile phase condition을 사용하여 약물을 분리합니다. 다음으로, 2개의 수로에 UV 발견자를 놓으십시오: 내부 기준 4-MethylUmbelliferone를 위한 310 나노미터에 하나와 Mitomycin C.This를 위한 360 나노미터에 다른 사람은, 개광 발견자의 첫번째 수로를 365 나노미터의 여기 파장 및 4-MethylUmbelliferone를 위한 445 나노미터의 방출 파장에 놓으십시오.
두 번째 채널을 480나노미터의 여기 파장으로 설정하고, 독소루비신과 독소루비시놀에 대해 560나노미터의 방출 파장으로 설정합니다. 시작하려면 자동 시료 주입기를 사용하여 15마이크로리터의 시료를 주입합니다. 프로그래밍된 그래디언트 이동상 조성은 0분에서 18분에 걸쳐 아세토니트릴의 조성을 증가시켜 자동으로 변경됩니다.
18분 후 이동상 조건이 초기 조건으로 재설정되고 다음 주입을 위해 다시 평형화됩니다. 각 샘플을 실행한 후 약물 화합물의 피크와 머무름 시간을 기록하십시오. 그런 다음 HPLC 소프트웨어를 사용하여 약물 화합물에 대한 곡선 아래의 피크 면적을 적분합니다.
텍스트 프로토콜에 설명된 대로 약물 회수율과 각 약물 화합물과 내부 표준물질 사이의 곡선 아래 면적 비율을 계산합니다. 이 절차에서는 두 가지 항암제인 독소루비신(Doxorubicin)과 미토마이신 C(Mitomycin C)와 함께 독소루비신(Doxorubicin) 대사산물인 독소루비시놀(Doxorubicinol)을 생물학적 간섭 없이 검출합니다. HPLC 분석은 각 약물이 다른 약물과 잘 분리되어 있음을 보여줍니다.
개발된 HPLC 방법은 전혈 및 다양한 생물학적 매트릭스 모두에서 연구된 각 약물에 대해 하루 중 및 하루 중 정밀도와 정확도가 15% 미만의 차이를 보여 우수한 재현성을 나타냅니다. 그런 다음 Doxorubicin과 Mitomycin C의 긴 순환 또는 페길화된 나노 입자 기반 공동 전달의 약동학 및 생체 분포를 결정합니다. 혈액에서 시간이 지남에 따라 고분자-지질 하이브리드 나노 입자에 의해 전달되는 약물 농도는 동등한 유리 약물 용액보다 최소 6배 높은 것으로 나타났습니다.
정소성 유방 종양에서 고분자-지질 하이브리드 나노입자는 독소루비신과 미토마이신 C를 시너지 약물 비율로 함께 전달할 수 있습니다. 유리 약물 용액과 비교하여 나노 입자는 종양 축적을 증가시키는 것으로 보입니다. 이는 나노 입자가 종양의 향상된 투과성 및 보유 효과를 활용할 수 있도록 하는 장기간의 체계적인 순환 때문입니다.
Enhanced Tumor Apoptosis와 함께 24시간 동안 유방 종양에서 Doxorubicinol의 정량적 형성을 추가로 측정한 것은 약물 생체이용률이 효과적인 나노입자 제형을 설계하는 데 중요하다는 것을 나타냅니다. 이 HPLC 방법을 사용하여 고분자-지질 하이브리드 나노입자가 생체 내 암세포에 시너지 약물 조합을 정확하게 전달하여 화학 요법을 개선할 수 있음을 성공적으로 입증했습니다. 이 기술은 제대로 수행되면 약 2시간 안에 완료할 수 있습니다.
잠재적인 약물 포식을 최소화하려면 이 절차를 시도하는 동안 직사광선을 피하고 샘플을 얼음 위에 보관하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 개발 후 이 기술은 나노의학 분야의 연구자가 약물 조합의 나노약동학을 탐구하고 암 치료를 위한 효과적인 나노 입자 제형을 더 잘 설계할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 약물 조합을 로드한 나노 입자를 포함하는 광범위한 생물학적 샘플에서 독소루비신, 미토마이신 C 및 독소루비신의 대사 산물인 독소루비시놀을 동시에 추출하고 검출하는 방법을 이해해야 합니다.
항암제 및 산을 사용하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 프로토콜을 수행하는 동안 항상 장갑, 고글 및 실험실 가운 착용과 같은 안전 예방 조치를 적용해야 한다는 것을 잊지 마십시오.
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개요
이 프로토콜은 생물학적 샘플에서 독소루비신, 미토마이신 C, 그리고 독소루비시놀의 동시 추출 및 정량화를 위한 튼튼한 방법을 설명합니다. 역상 고성능 액체 크로마토그래피를 활용하는 이 기술은 나노의학 분야의 응용을 위해 설계되었습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 나노의학
- 암 치료학
- 분석 화학
배경
- 독소루비신과 미토마이신 C는 주요 항암 약물입니다.
- 독소루비시놀은 독소루비신의 심장 독성 대사 산물입니다.
- 나노입자 제형은 약물 전달을 향상시킬 수 있습니다.
- 약물 상호작용을 이해하는 것은 효과적인 치료를 위해 매우 중요합니다.
연구 목적
- 여러 약물의 동시 정량화 방법을 개발하기 위해.
- 나노약물동태학 연구를 촉진하기 위해.
- 유방암 종양에서의 약물 행동에 대한 통찰력을 제공하기 위해.
사용된 방법
- 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC).
- 생물학적 매트릭스로부터의 샘플 추출.
- 세 가지 약물 화합물의 동시 분석.
- 분석 중 모바일 페이즈 변경이 필요하지 않습니다.
주요 결과
- 독소루비신, 미토마이신 C, 그리고 독소루비시놀의 성공적인 정량화.
- 샘플 준비의 효율성을 입증한 방법.
- 1차 유방암 종양에서의 약물 상호작용에 대한 통찰력.
- 다른 암 유형에 대한 잠재적 적용 가능성.
결론
- 이 방법은 약물 조합을 분석하는 데 효과적입니다.
- 시각적 시연은 샘플 준비 학습을 향상시킵니다.
- 이 접근 방식은 나노캐리어 시스템 설계에 정보를 제공할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
This analytical method enables precise quantification of doxorubicin, mitomycin C, and doxorubicinol in biological matrices, supporting preclinical evaluation of nanoparticle-based drug combinations. By providing synchronized pharmacokinetic data, it informs the design of nanocarrier systems that enhance tumor accumulation and reduce systemic toxicity. The method addresses a critical gap in nanomedicine R&D by allowing direct comparison of free versus nanoparticle-delivered drug combinations in vivo.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying drug metabolites and parent compounds in tumor tissue.
- Operational Value: Supports mechanistic de-risking through simultaneous detection of efficacy and toxicity markers.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers standardized, reproducible quantitative outputs for compound screening in complex biological matrices.
- Operational Value: Eliminates mobile phase changes during HPLC analysis, increasing throughput and reducing method variability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates translational biomarker alignment by measuring drug exposure in tumors and cardiotoxic metabolites in heart tissue.
- Operational Value: Enables risk-adjusted advancement decisions via comparative pharmacokinetic profiling of nanoparticle versus free drug formulations.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through preclinical validation, providing quantitative bioanalytical support for nanopharmacokinetic studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying drug accumulation and metabolite formation in orthotopic tumor models.
- Screening: Ensures assay readiness through reproducible extraction and quantitation across whole blood, tumor, and heart tissues.
- Analytics: Generates chromatographic peak area ratios relative to internal standard, enabling cross-condition comparison of drug exposure.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by correlating tumor drug levels with enhanced apoptosis and reduced cardiotoxicity.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for evaluating multiple nanocarrier formulations in oncology pipelines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in nanocarrier design through simultaneous quantitation of drug combinations and metabolites.
- Operational Value: Standardized sample preparation and HPLC conditions ensure reproducibility across laboratories and studies.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by revealing synergistic drug ratios and tumor-specific accumulation profiles.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of nanoparticle formulations based on pharmacokinetic and biodistribution data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue homogenization, HPLC operation, and fluorescent/UV detection.
- Depends on access to refrigerated centrifuges, nitrogen evaporators, and autosampler-equipped HPLC systems.
- Necessitates standardization of extraction solvents and internal standard spiking across sample types.
- Must account for light sensitivity of doxorubicin and doxorubicinol during sample processing.
- Limited to analytes with compatible chromatographic behavior under isocratic and gradient conditions.
