Name: 샘플 추출 및 독 소 루비와 미토마이신 C 다음 약물 조합을 전달 나노 입자에 종양 방위 쥐의 동시 크로마 정량 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: 학습하세요 Doxorubicin, Mitomycin C, Doxorubicinol을 동시 정량 분석하는 역상 HPLC 방법을 통해 나노입자 기반 암 치료제의 약동학을 연구하는 기법입니다. 이 방법은 효과적인 나노캐리어 시스템 설계에 필수적인 통찰을 제공합니다.

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저자는 기꺼이 HPLC, 캐나다 건강 연구 (CIHR) 캐나다 유 방 암 연구 (CBCR) 연구소에서 운영 보조금에 대 한 자연 과학 및 공학 연구 (NSERC) 위원회 캐나다에서 장비 부여를 인정 X.Y. 우, 얼라이언스 그리고 R.X. 장 하 토니 장 토론토 대학 장학금.

모든 동물 실험 동물 관리 위원회의 대학 건강 네트워크 온타리오 암 연구소에 의해 찬성 하 고 캐나다 위원회 동물 관리 지침에 따라 실시 했다.
 1. 생물학 견본 준비 <ol><li>전체 혈액, 주요 기관, 수집 하 고 포함 하는 약물의 정 맥 (i.v.) 관리 후 정해진된 시간 포인트에서 종양을 유 정립 (예를 들어, DMPLN, 자주 DOX) <ol><li>준비 포함 하는 약물 배합 유 방 종양 베어링 마우스 i.v. 주입.</li>
		<li>흡입 가능 2 %isoflurane 밀폐 챔버에 제공 하 여 지정 된 시간-포인트 (예를 들어, 15 분)에서 마우스를 anesthetize.</li>
		<li>마 취 마우스의 뒷면을 통해 지속적으로 공급 하는 2% isoflurane nosepiece는 코를 넣어. 
		참고: 마우스 겪 습 깊은 마 취 되도록 부드럽게 대 타 마우스와 어떤 꿈 틀 운동에 대 한 보고의 앞 팔.</li>
		<li>가슴 및 복 부 지역 70% 에탄올을 사용 하 여 철저 하 게 청소 한 다음 heparinized 1 mL 주사기 23 G 바늘을 사용 하 여 깊은 마 취 쥐에 심장 펑크의 터미널 절차 수행.</li>
		<li>레이블이 나트륨으로 전체 혈액 수집 덤플링을 플라스틱 튜브를 살포 하 고 부드럽게 코팅된 덤플링을 튜브 벽의 접촉으로 온다 수집된 전 혈 되도록 튜브 소용돌이. 전체 혈액의 50 µ L의 최소를 수집 합니다. 얼음에 샘플을 항상 유지</li>
		<li>그것을 확보 하 고 복 부 구멍이 위와 집게의 쌍을 사용 하 여 마우스의 흉 곽을 열고 마우스의 모든 4 개의 사지를 테이프. 창 자 쪽으로 이동 하 고 위쪽으로 문맥을 충분히 노출 간 밀어. 혈액의 배수 장치를 위한 포털 정 맥을 잘라.</li>
		<li>Perfuse 25g 바늘 10 mL 주사기를 사용 하 여 마음을 통해 차가운 0.9% 염 분의 50 mL와 함께 전체 마우스 몸. 
		참고: 포털 혈관에 주사기를 지도 대 한 90 °에 바늘을 벤드.</li>
		<li>소비 기관에는 다음과 같은 순서: 심장, 폐, 간, 비장, 신장. 그런 다음, 마우스의 오른쪽 유 방 지방 패드에 절 개가 위를 사용 하 여 주변 결합 조직에서 유 방 종양을 구분 합니다. 1.5 mL 폴 리 프로필 렌 튜브에 모든 장기를 개별적으로 수집 하 고 신속 하 게 액체 질소에 그들을 동결. 
		&#8203; 참고: 쓸 개는 간에 서 분리.</li>
		<li>나중 HPLC 분석까지-80 ° C 냉동 고에서 4 ° C 및 삭제 조직 전체 혈액 저장.</li>
	</ol></li> <li>추출 DOX, MMC 및 생물 학적 행렬에서 DOXol.
	<ol><li>그리고 모든 냉동된 해 부 조직을 신속 하 게 무게 13 mL 둥근 바닥 원뿔 관으로 그들을 전송. 얼음에 샘플을 유지 가능한 약물 대사 또는 저하를 방지 하려면</li>
		<li>튜브에 1-5 mL의 얼음 세포 세포의 용 해 버퍼를 추가. 
		참고: 사용 하는 버퍼의 볼륨 1 g: 5 mL (w/v);의 조직-버퍼 비율에 따라 조직 무게에 따라 달라 집니다. 작은 기관, 심장, 비장, 등에 대 한 비율은 1 g: 2 mL.</li>
		<li>업 다운 스트로크 모션 균질 전기 손 균질 화기를 사용 하 여 18000 rpm의 속도로 얼음에 조직 샘플을 사용 하 여. 
		참고: 완료 된 균질 필요 미만 15의 짧은 균질 화 과정의 약 3-5 반복 각 짧은 균질 사이 얼음 냉각 하는 조직 이어서 s.</li>
		<li>증류수 이온된 (DDI) H 2 O, 70% 에탄올, 그리고 DDI H 2 O 사이 상호 오염을 피하기 위해 각 조직 샘플을 균질 화기의 10 m m 톱니 생성기 프로브 세척.</li>
		<li>조직 homogenate 또는 폴 리 프로필 렌 마이크로 원심 튜브 1.5 mL와 5 스파이크에 전체 혈액의 전송 50 µ L µ L를 내부 표준 (윙하) 4-methylumbelliferone (4 무) (2000 ng/mL) 튜브에의. 
		참고: 4-무 솔루션 메탄올 여기에 준비 했다.</li>
		<li>전체 혈액 이나 조직 homogenate 포함 된 튜브에 얼음 추출 용 매 추가 250 µ L. 
		참고: 추출 용 매로 구성 되어 60% 이기 (ACN)와 40% 염화 아세테이트 (5mm)의 pH를 조정 하는 ph 3.5 = 0.05% 개미 산을 사용 하 여. 1:5 (v/v) 샘플을 사용 하 여: 볼륨 비율을 용 매 추출.</li>
		<li>적극적으로 소용돌이 혼합물 2 분, 10 분 및 다른 미리 냉장된 신선한 마이크로 원심 관으로 표면에 뜨는 피펫으로 200 µ L 4 o C에서 g 포스 x 3000에서 원심 분리기.</li>
		<li>Evaporate 상쾌한 빛 으로부터 보호와 질소 가스의 느린 스트림 아래 60 ° C에서.</li>
		<li>얼음 처럼 차가운 메탄올, 30 s 및 다른 5 분의 4 ° C에서 3000 x g에서 원심 분리기에 대 한 적극적으로 소용돌이의 100 µ L 말린된 잔류물을 다시 구성</li>
		<li>HPLC 유리병 삽입에는 상쾌한을 전송 하 고 샘플 튜브 사출 autosampler 트레이.</li>
	</ol></li></ol> 2. 작업 매개 변수 및 HPLC 계측 <ol><li>일관 재현성 준비 HPLC 이동 상 <ol><li>HPLC 급 H 2 O 졸업된 실린더를 사용 하 여 500 mL를 측정.</li>
		<li>HPLC 급 이기 (ACN)는 별도 졸업된 실린더를 사용 하 여의 500 mL를 측정.</li>
		<li>신중 하 게 H 2 O의 500 mL의 각 trifluoroacetic 산 (TFA) (주의)의 0.5 mL를 추가 및 H 2 O의 모바일 단계를 ACN ACN 0.1%를 포함 하 고 TFA, 각각. 
		참고: TFA 부식성 이며 독성이 고 실험실 연기 후드 처리 합니다. 모든 용 매 혼합물 상 온에서 준비가.</li>
		<li>0.45 μ m와 나일론 멤브레인 필터를 통해 필터 모바일 단계 기 공 크기와 깨끗 한 HPLC 저수지 병으로 그것을 전송.</li>
	</ol></li> <li>DOX, MMC, 및 DOXol 및 윙하 4-무의 동시 검출 설정 HPLC 계측.
	<ol><li>그라데이션 펌프, 드 gasser, 자동 샘플러, 포토 다이오드 배열 검출기와 다중 λ 형광 검출기에 스위치.</li>
		<li>16.5% H 2 O 모바일 단계 구성의 초기 조건 입력 (0.1 %TFA) 83.5 %ACN (0.1 %TFA) (v/v).</li>
		<li>310에 하나씩 두 개의 채널에 UV 검출기를 설정 4-뮤 (윙하)에 대 한 nm와 다른 360에서 mmc nm.</li>
		<li>Λ ex에 하나씩 두 개의 채널에 형광 검출기를 설정 / λ em 365/445 = 4-뮤와 λ ex에서 다른에 대 한 nm / λ em = 480 nm/560 nm DOX와 DOXol, 각각.</li>
		<li>한 isocratic 1.0 mL/분의 유량을 설정</li>
		<li>기준선 설립에 대 일 분 동안 실내 온도에 사전 설치 된 역 상 C 18 열 (4.6 mm x 250 m m, 5 µ m) equilibrate.</li>
	</ol></li> <li>약물 (DOX, MMC, DOXol 및 4-무)를 별도 그라데이션 모바일 단계 상태를 사용 하 여.
	<ol><li>자동 샘플러를 사용 하 여 추출 하 고 다시 집중 견본의 주입 15 µ L.</li>
		<li>점차 초기 모바일 위상 조건 변경 (프로토콜 단계 2.2.2 참조) 100 %ACN (0.1 %TFA) 18 분 이상 자동된 그라데이션 펌프를 사용 하 여. 
		참고: 분리 과정에서 4 개 채널 (2 개의 UV 흡수 및 2 개의 형광) 표시 동시에 한 약 복합 표시 각 채널 (2.2.3 및 2.2.4 프로토콜 단계 참조).</li>
		<li>ACN의 100%를 유지 (0.1 %TFA) 1 분을 1 분 이내 초기 모바일 위상 조건으로 다음 돌아가기</li>
		<li>다시 초기 모바일 단계와 1.5 mL/min의 유량에서 4 분에 대 한 다음 샘플 주입에 대 한 열을 조건.</li>
	</ol></li></ol> 3. HPLC 유효성 검사 <ol><li>DOX, MMC 및 DOXol, 및 4-뮤 (윙하) 작업 기준 준비.
	<ol><li>DOX 및 MMC 마약 가루 (주의)와 신선한 작은 종이 (3 x 3 인치 2) 무게에 4-무의 무게 별도로 1 mg. 
		Note 모든 항 암 제 약물 흡입 또는 섭취에 급성 독성 및 생식 세포 변이 일으킬 수 있는 건강 위험으로 간주 됩니다. 그들은 장갑 및 마스크와 함께 신중 하 게 처리 되어야 합니다.</li>
		<li>개별 1.5 mL 새로운 폴 리 프로필 렌 마이크로 원심 튜브로 전송 무게 DOX, MMC 및 4-무.</li>
		<li>추가 meth의 1 mLanol와 DOX 및 MMC의 1 mg/mL 농도를 간단히 소용돌이.</li>
		<li>DOXol (주의) 하 고 소용돌이 간단히 DOXol의 1 mg/mL 농도의 사전 무게 1 mg를 포함 하는 유리병에 메탄올의 1 mL을 추가. 
		참고: DOXol 심장 독성 대사 산물 이며 신중 하 게 처리 해야 합니다.</li>
		<li>DOX, MMC, DOXol 및 4-뮤로는 새로운의 준비 재고 솔루션의 피 펫 20 µ L 1.5 mL 폴 리 프로필 렌 마이크로 원심 튜브를 분리 하 고 각 약물의 20 µ g/mL의 작업 표준을 메탄올의 980 µ L을 추가.</li>
		<li>희석 20 µ g/mL DOX, MMC 및 50의 작업 표준을 얻기 위해 메탄올을 사용 하 여 DOXol의 ng-DOX, MMC, 및 DOXol에 대 한 20 µ g /mL 및 2000 ng/mL 윙하 4-무.</li>
		<li>메탄올 증발 방지, 직접 빛을-20에 게 노출을 피하기 위해 알루미늄 호 일 전체 튜브 포장 파라핀 영화 취재의 좁은 조각 작업 솔루션의 튜브의 뚜껑을 봉인 ° c.</li>
	</ol></li> <li>선형성, 정밀, DOX, MMC 및 생물 학적 행렬 (즉, 전체 혈액 및 종양 homogenate)에 DOXol의 정확도 결정.
	DOX 및 DOXol의 작업 표준의 <ol><li>동시에 스파이크 5 µ L (50 ng/mL-20 µ g/mL), MMC (1000 ng/mL-16 µ g/mL), 및 빈 전 혈 또는 폴 리 프로필 렌 마이크로 원심 튜브에서 조직 homogenate의 50 µ L로 4-뮤 (2 µ g/mL) 마약 화합물에 대 한 5-2000 ng/mL 및 4-뮤 (윙하)에 대 한 200 ng/mL에서 배열 하는 표준 농도 곡선을 구하는.</li>
		<li>프로토콜 1.2에서 설명한 약물 추출 분석 결과 수행.</li>
		<li>DOX와 DOXol의 낮은, 중간 및 높은 농도 사용 (50, 500, 및 2000 ng/mL) 및 MMC (100, 1000, 2000 ng/mL) 내부와 통해 하루 정밀도 정확도 대 한. 
		참고: 신선한 표준 농도 분석 당일 준비.</li>
	</ol></li> <li>샘플의 분석 <ol><li>자동 샘플러를 사용 하 여 샘플의 주사 15 µ L.</li>
		<li>점차 모바일 단계 0 ~ 18 분 이상, 증가 간격 동안 ACN의 구성 변경.</li>
		<li>후 18 분, 1 분에 대 한 모바일 위상 상태를 개최</li>
		<li>다음 2 분 동안 초기 상태로 반환 다음 다시 다음 주입 하기 전에 4 분 equilibrate.</li>
		<li>각 샘플을 실행 후 다음과 같이 그들의 보존 기간으로 약 화합물의 봉우리 표시 됩니다 참고: MMC, DOXol, 4-뮤 (윙하)와 DOX.</li>
		<li>HPLC 소프트웨어를 사용 하 여 약 화합물의 곡선 (AUC)에서 피크 지역 통합.</li>
		<li>개별 약물 화합물 및 윙하 (공식 1) 사이의 AUC 비율을 계산 하 고 동일한 추출 절차에 따라 준비 하는 표준 곡선을 사용 하 여 DMPLN 배합에 DOX, MMC 및 DOXol의 약물 농도 결정. 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56159/56159eq1.jpg" /></li> <li>그 아군된 생물 샘플의 추출 물에서 메탄올을 사용 하 여 재구성 하는 약물 농도 비교 하 여 약 복구 비율 (식 2)를 계산 표준 (&#34; 깔끔한 &#34;) 솔루션 메탄올에서 마약. 
		<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56159/56159eq2.jpg" /></li></ol></li></ol>

저자는 없고 경쟁 금융 관심사 이해 충돌 있다.

한 번에 단일 약물의 탐지를 가능 하 게 다른 컬럼에 방법에 비해, 현재 HPLC 프로토콜은 동시에 변경 하는 필요 없이 동일한 생물학 매트릭스에 세 약 화합물 (DOX, MMC, 및 DOXol)을 quantitate 수 모바일 단계입니다. 약 동학 및 바이오-2 나노 기반 약물 전달 시스템의 배포를 확인 하려면이 준비 및 분석 방법은 성공적으로 적용 (즉, 자주 DOX와 DMPLN)22. 이후 PEGylated 나노 연장 시간의 오랜 기간 동안 높은 혈액 약물 농도 결과로 로드 된 약물의 전신 순환 (&#62; 24 h), 설명된 컬럼에 메서드는 큰 규모의 샘플 분석을 위한 비용 효율적인 전 임상 연구22나노 공동 로드 약물 조합. 무료 DOX 솔루션 및 자주 DOX 그림 4A 의 약 동학은 설치류<sup class="xref"...

아직 그것은 종종 심각한 부작용 및 약물 저항으로 인해 제한 된 효능 및 다른 요인1,2,3관련 된 화학 요법 많은 암에 대 한 기본 치료 양식 적임 이다. 화학 요법의 결과 개선 하기 위해, 약물 조합 regimens 겹치지 독성, 약물 행동, 그리고 크로스 비 약물 저항4,5 의 다른 메커니즘 같은 고려 사항에 따라 병원에 적용 된 , 6. 임상 시험에서 더 나은 종양 응답 속도 종종 관찰 되었다 약물 조합을 순차적 마약 배달7,8의 처방에 비해 관리 동시에 사용 하 여. 그러나, 무료 약물 형태 중 최적의 바이오-분포, 인해 여러 약물의 동시 주입 치료 효과9,,1011를 능가 하는 저명한 정상 조직의 독성을 발생할 수 있습니다. Nanocarrier 기반 약물 전달 약 동학 및 바이오-캡슐화 된 약물, 종양을 대상으로 축적12,,1314강화의 배포 변경 표시 되었습니다. 우리의 최근 기사에서 검토 한 결과, 나노 공동 시너지 약물 조합 로드은 설명 했다 때문에 그들의 통제 시간적 및 공간적 공동 배달의 무료 약물 조합에 의해 발생 하는 문제를 완화 하는 기능 종양 조직에 여러 약물,4,,1516세포 암에 대 한 시너지 약물 효과 활성화. 그 결과, 우수한 치료 효능 및 낮은 독성 두 전 임상 및 임상 연구4,,1718에서 입증 되었습니다.
우리의 이전 체 외에 연구 발견 두 항 암 약물, 독 소 루비 (DOX) 및 미토마이신 C (MMC), 조합의 여러 유 방 암 세포 라인에 대 한 시너지 효과 생산 하 고, 또한, 공동 DOX 및 MMC 내에서 로드 폴리머-지질 하이브리드 나노 입자 (DMPLN) 다양 한 다중 약물 내성 관련된 경과 펌프 (예: P-당단백질과 유 방 암 저항 단백질)19,,2021극복. Vivo에서, DMPLN에 활성화 DOX 및 종양 사이트 MMC의 공간 일시적인 공동 배달 암 세포 내에서 약물의 증가 생체 이용률 DOX 대사 산물 doxorubicinol (DOXol)22의 형성의 검토에 의해 표시 된 대로. 결과적으로 DMPLN 종양 세포 apoptosis, 종양 성장 억제, 그리고 장기간된 호스트 생존 DOX 및 MMC 조합 또는 자주 DOX 배합22,,2324, 무료에 비해 향상 된 25.
공동는 nanocarrier에 의해 전달 하는 약물의 실제 금액을 분석 하는 것이 효과적인 나노 제형 설계에 대 한 중요 합니다. 많은 방법이 플라스마 수준 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)만 사용 하 여 단일 DOX 또는 MMC 복용량의 또는 질량 분석 (MS)26,,2728 와 함께에서 분석 하도록 개발 되었습니다. , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 그러나 34., 이러한 방법 들은 시간과 조합 치료에 대 한 허무로 많은 수의 생물 학적 샘플 (때로는 약물 대사 산물 등) 여러 약물의 분석을 위해 별도로 준비를 해야. DOX 및 MMC의 강한 플라스마 단백질 바인딩 뿐만 아니라 붉은 혈액 세포는 또한 바인딩 많은 항 암 약35,36집중 하 큰 용량을가지고. 따라서, 플라즈마 분석 DOX 또는 MMC에 대 한 실제 혈액 약물 농도 난독 처리할 수 있습니다. (그림 1) 현재 작업에 설명 합니다 간단 하 고 강력한 동시에 추출 하 고 quantitate DOX, MMC 및 전체 혈액 및 다양 한 조직 ( DOX 대사 산물 doxorubicinol (DOXol) 역 상 HPLC를 사용 하 여 여러 약물 분석 방법을 예를 들어, 종양). 그것은 성공적으로 적용 되었다는 orthotopically에는 약 동학 및 바이오-DOX 및 MMC의 분포 뿐만 아니라 무료 솔루션 또는 나노 형태 (즉, DMPLN 및 자주 DOX)를 통해 약물 전달 후 DOXol의 형성을 결정 하 정 맥 (i.v.) 후 murine 유 방 종양 마우스 모델을 이식 주입22.

<table><tbody><tr><td>독소루비신&nbsp;</td><td>Polymed Theraeutics</td><td>111023</td><td>항암제</td></tr><tr><td>Mitomycin C</td><td>Polymed Theraeutics</td><td>060814</td><td>항암제</td></tr><tr><td>Doxorubicinol (DOXol)</td><td>토론토 연구 화학물질</td><td>D558020</td> DOX <td></td></tr><tr><td>4-Methylumbelliferone 나트륨 염의 대사산물&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1508</td><td>내부 표준</td></tr><tr><td>Myristic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>544-63-8&nbsp; &nbsp;</td><td>폴리지질 하이브리드 나노입자용 재료</td></tr><tr><td>폴리옥시에틸렌 (100) 스테아레이트</td><td>스펙트럼</td><td>M1402</td><td>폴리지질 하이브리드 나노입자용 재료</td></tr><tr><td>폴리옥시에틸렌 (40) 스테아레이트</td><td>시그마-알드리치</td><td>P3440</td><td>폴리지질 하이브리드 나노입자용 재료</td></tr><tr><td>Pluronic F68 (PF68)</td><td>BASF Corp.</td><td>9003-11-6</td><td>폴리 지질 하이브리드 나노 입자</td></tr><tr><td>재료 초음파 (UP100H)</td> <td>Hielscher, 초음파 기술</td><td>NA</td><td>나노 입자 준비</td></tr><tr><td>수조 (ISOTEMP 3016HS)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>NA</td><td>나노 입자 준비</td></tr><tr><td>Liposomal Doxorubicin&nbsp; (케일릭스)</td><td>Janssen</td><td>약국에서 구매 Princess Margaret Hospital</td><td>임상적으로 승인된 나노 입자 제형&nbsp;</td></tr><tr><td>HPLC 등급 메탄올</td><td>Caledon Chemicals</td><td>6701-7-40</td><td>HPLC 이동상 구성</td></tr><tr><td>HPLC 등급 H2O</td><td>Caledon Chemicals</td><td>8801-7-40</td><td>HPLC 이동상 조성</td></tr><tr><td>HPLC 등급 아세토니트릴&nbsp;</td><td>Caledon 화학</td><td>물질 1401-7-40</td><td>HPLC 이동상 조성</td></tr><tr><td>Trifluoroacetic 산</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>302031</td><td>HPLC 이동상 조성</td></tr><tr><td>0.45 &mu; m 나일론 멤브레인 여과지</td><td>Whatman</td><td>WHA7404004</td><td>HPLC 이동상 준비</td></tr><tr><td>1cc 플라스틱 주사기</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>2606-309659</td><td>처리 주입</td></tr><tr><td>5cc 플라스틱 주사기</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>2608-309646</td><td>조직 수집</td></tr><tr><td>30G 1/2 바늘</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>305106</td><td>치료 주입</td></tr><tr><td>25G 5/8 바늘</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>305122</td><td>조직 컬렉션</td></tr><tr><td>멸균 0.9% 식염수</td><td>토론토 대학 하우스 브랜드</td><td>1011</td><td>조직 관류</td></tr><tr><td>13 ml 둥근-바닥 원뿔형 튜브&nbsp;</td><td>SARSTEDT</td><td>62.515.006</td><td>프로리프롤렌, 조직 균질화</td></tr><tr><td>알파 최소 필수 배지(MEM)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>12571063</td><td>Cell medium</td></tr><tr><td>1 x 인산염 완충액 식염수</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>조직 균질화</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-100 ML</td><td>조직 균질화</td></tr><tr><td>Formic acid</td><td>Caledon Chemicals</td><td>1/5/3840</td><td>추출 용매를 위해 pH 조정</td></tr><tr><td>헤파린 나트륨 스프레이 플라스틱 튜브</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>367878</td><td>혈액 채취</td></tr><tr><td>분석 계량 저울&nbsp;</td><td>싸토리우스&nbsp;</td><td>CPA225D</td><td>NA</td></tr><tr><td>pH 미터&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-637-671</td><td>Accumet BASIC</td></tr><tr><td>Vortex Mixter</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-365</td><td>원하는 속도로 샘플 볼텍싱</td></tr><tr><td>1.5 ml&nbsp; 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Fisherbrand</td><td>2043-05408129</td><td>Prolyprolene</td></tr><tr><td>모델 1000 균질화기</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-451-672</td><td>조직 균질화</td></tr><tr><td>원심분리기 5702R</td><td>Eppendorf</td><td>5702R</td><td>추출 준비</td></tr><tr><td>가열식 증발기 시스템</td><td>Glas-Col</td><td>NA</td><td>샘플 재구성</td></tr><tr><td>HPLC 나사산 바이알</td><td>DIKMA</td><td>5320</td><td>HPLC 샘플 주입</td></tr><tr><td>HPLC 스크류 캡과 PTFE 화이트 실리콘 격막</td><td>DIKMA</td><td>5325</td><td>HPLC 샘플 주입</td></tr><tr><td>HPLC 폴리프로필렌 인서트&nbsp; &nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>5182-0549</td><td>최대 볼륨 250 &mu; l, HPLC 샘플 주입</td></tr><tr><td>Xbridge C18 Column</td><td>Waters Corporation</td><td>186003117</td><td>약물 분석</td></tr><tr><td>그라디언트 펌프&nbsp;</td><td>Waters Corporation</td><td>W600</td><td>약물 분석</td></tr><tr><td>자동 샘플러</td><td>Waters Corporation</td><td>W2707</td><td>약물 분석</td></tr><tr><td>포토다이오드 어레이 검출기&nbsp;</td><td>Waters Corporation</td><td>W2998</td><td>약물 분석</td></tr><tr><td>멀티 &lambda; 형광 검출기&nbsp;</td><td>Waters Corporation</td><td>W2475</td><td>약물 분석</td></tr><tr><td>EMPOWER 2</td><td>Waters Corporation</td><td>NA</td><td>데이터 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>과학자</td><td>Micromath</td><td>NA</td><td>약동학 분석</td></tr><tr><td>Female Balb/c Mice</td><td>Jackson Laboratory</td><td>001026</td><td>In vivo</td></tr><tr><td>EMT6/WT 유방암 세포</td><td>Ian Tannock 박사 제공; 온타리오 암 연구소</td><td>NA</td><td>In vivo</td></tr></tbody></table>

샘플 추출 및 독 소 루비와 미토마이신 c 다음 약물 조합을 전달 나노 입자에 종양 방위 쥐의 동시 크로마 정량

Sample Extraction and Simultaneous Chromatographic Quantitation of Doxorubicin and Mitomycin C Following Drug Combination Delivery in Nanoparticles to Tumor-bearing Mice

조합 화학요법은 자주 사용 병원에서 암 치료; 그러나, 정상 조직에 관련 된 불리 한 효과 치료 혜택을 제한할 수 있습니다. 나노 기반 약물 조합 무료 약 조합 치료에 의해 발생 하는 문제를 완화 하기 위해 표시 되었습니다. 우리의 이전 연구는 그 두 항 암 약물, 독 소 루비 (DOX) 및 미토마이신 C (MMC)의 조합, 두 murine에 대 한 시너지 효과 생산 하 고 인간의 유방암 세포 생체 외에서. DOX 및 MMC 공동 로드 폴리머-지질 하이브리드 나노 입자 (DMPLN) 다양 한 경과 전송 펌프 multidrug 저항 및 유 방 종양 모델에 설명 된 향상 된 효능을 부여 하는 무시 됩니다. 기존의 솔루션 형태에 비해, DMPLN의 이러한 우수한 효능 DOX 및 MMC nanocarrier pln.로 활성화 하는 종양 세포 내 생체 이용률 증가 세포내 약물의 동기화 된 약물 동력 학에 기인 했다
약 동학 및 바이오-분포의 평가를 공동 관리 DOX 및 MMC 무료 솔루션에 나노 형태, 역 상 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)는을 사용 하 여 간단 하 고 효율적인 다중 약물 분석 방법 개발. 달리는 플라즈마에 DOX 또는 MMC를 개별적으로 분석 하는 방법에 대 한 이전에 보고 된,이 새로운 HPLC 방법은 동시에 quantitate DOX, MMC 및 주요 심장 독성 DOX 대사 산물, 다양 한 생물 학적 행렬 ( 에서에서 doxorubicinol (DOXol), 수 예를 들어, 전체 혈액, 유 방 종양, 및 심 혼). 이중 형광 및 자외선 흡수 성 조사 4-methylumbelliferone (4-무) 다른 검출 파장 다중 약물 분석의 단계 검출을 위한 내부 표준 (윙하)으로 사용 되었다. 이 방법은 성공적으로 DOX 및 MMC 전체 혈액에 나노와 솔루션 접근 및 orthotopic 유 방 종양 murine 모델에서 다양 한 조직에 의해 전달의 농도 결정 하기 위해 적용 되었습니다. 제시 하는 분석 방법 약물 조합 중 나노 기반 배달의 전 임상 분석을 위한 유용한 도구입니다.

두 항 암 약물, DOX MMC, 뿐만 아니라 DOX 대사 산물, DOXol, 동시에 형광 및 자외선 감지기는 윙하도 4-무를 사용 하 여 동일한 적용 된 그라데이션 HPLC 조건 하에서 어떤 생물 학적 간섭 없이 감지 했다. DOX, MMC, DOXol 및 4-무 잘 보존 시간 mmc 5.7 분, DOXol 위한 10.4 분, 4-뮤, 10.9 분 및 DOX (그림 2)에 대 일 분 서로에서 분리 했다. 전체 혈액에 각 약물 및 다양 한 조직 상관 관계 계수 (R2) 0.98에서 1.00 (그림 3 및 표 1)에 이르기까지 함께 농도 선형성을 보였다. DOX, DOXol 및 MMC의 정량 (LLOQ)의 하한값은 10 ng/mL, 10 ng/mL 및 100 ng/mL 전 혈 및 25 ng/mL...

이 프로토콜에 설명 합니다 샘플 추출의 효율적이 고 편리한 분석 프로세스와 여러 약물, 독 소 루비 (DOX), 미토마이신 C (MMC) 및 심장 독성 DOX 대사 산물, doxorubicinol (DOXol), 생물학에서의 동시 결정 전 임상 유 방 종양 모델에서 샘플 시너지 약물 조합의 나노 제형으로 치료.

샘플 추출 및 독 소 루비와 미토마이신 C 다음 약물 조합을 전달 나노 입자에 종양 방위 쥐의 동시 크로마 정량

Combination chemotherapy is frequently used in the clinic for cancer treatment; however, associated adverse effects to normal tissue may limit its ...

이 분석 프로토콜의 전반적인 목표는 간단하고 강력한 역상 고성능 액체 크로마토그래피 방법을 사용하여 생물학적 매트릭스에서 고분자-지질 하이브리드 나노 입자와 독소루비신의 대사 산물인 독소루비시놀에 의해 함께 전달되는 두 가지 항암제인 독소루비신과 미토마이신 C를 동시에 추출하고 정량화하는 것입니다. 이 방법은 약물 조합의 나노 약동학을 기반으로 효과적인 나노 캐리 시스템을 설계하는 방법과 같은 나노 의학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 HPLC의 이동상을 변경할 필요 없이 동일한 생물학적 매트릭스에서 3개의 약물 화합물을 동시에 정량화할 수 있다는 것입니다.따라서 이 방법은 원발성 유방 종양에서 독소루비신, 미토마이신 C 및 독소루비시놀의 생물학적 행동에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 유사한 약물로 치료하는 다른 암 유형에도 적용할 수 있습니다. 효율적인 시료 전처리 단계를 배우기 어렵기 때문에 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다.이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 전혈, 주요 장기 및 유방 종양을 수집하고 동결합니다. 얼어붙은 조직의 무게를 빠르게 측정하고 실험실 노트에 무게를 기록합니다. 그런 다음 13ml 둥근 바닥 원뿔형 튜브로 옮깁니다.다음으로, 1-5ml의 얼음처럼 차가운 Cell Lysis buffer를 추가합니다. 전기 손 균질화기를 사용하여, 18, 000 분당 회전수에 얼음에 여기저기 치기 동의를 가진 조직을 균질화하십시오. 그런 다음 균질기의 10mm 톱니 발생기 프로브를 증류수 탈이온수로 세척합니다.프로브를 70% 에탄올로 세척한 다음 증류수 탈이온수로 다시 세척합니다. 50마이크로리터의 조직 균질산염 또는 전혈을 1.5ml 폴리프로필렌 미세원심분리기 튜브로 옮깁니다. 다음, 2의 5 마이크로리터, 밀리리터 내부 기준 4-MethylUmbelliferone 당 000 nanogram를 가진 스파이크.150마이크로리터의 아세토니트릴과 100마이크로리터의 5밀리몰 암모늄 아세테이트를 함유한 얼음 저온 추출 용매를 추가합니다. 2분 동안 혼합물을 격렬하게 소용돌이치십시오. 3, 000g 및 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리기.그런 다음 200마이크로리터의 상등액을 미리 냉각된 새 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 질소 가스의 느린 흐름을 사용하여 빛으로부터 보호하면서 섭씨 60도에서 상층액을 증발시킵니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

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포괄적 인 절차를 평가하는<em&gt; 생체</em&gt; 암 나노 의학의 성능

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표적 약물 전달을 위해 독소루비신으로 로드된 압타머-PEI-g-PEG 수정 금 나노 입자의 합성

여기에서는 동물 모델에서 RNA 올리고머를 운반하는 자성 산화철 나노입자를 전이성 유방암으로 생체 내 전달하기 위한 프로토콜을 설명하여 발암성 핵산의 치료적 침묵을 위한 임상적으로 실행 가능한 접근 방식을 제공합니다.

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학습하세요 Doxorubicin, Mitomycin C, Doxorubicinol을 동시 정량 분석하는 역상 HPLC 방법을 통해 나노입자 기반 암 치료제의 약동학을 연구하는 기법입니다. 이 방법은 효과적인 나노캐리어 시스템 설계에 필수적인 통찰을 제공합니다.

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