Name: Proteomic 분석에 대 한 인간의 망막과 맥락 막의 RPE의 해 부 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: 학습하세요 인간 망막의 황반부, 중심와, 주변부에서 조직 생검을 채취하여 단백질체학 분석을 수행하는 방법을. 이 기술은 망막 분자 구성 연구에 필수적입니다.

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VBM은 NIH 교부 금 [K08EY020530, R01EY024665, R01EY025225, R01EY024698, R21AG050437], 도리스 듀크 자선 재단 보조금 지원 #: 2013103, 및 연구를 방지 실명 (RPB), 뉴욕, 뉴욕. MT 및 GV는 NIH에서 지원 T32GM007337를 부여.

이 연구는 아이오와의 대학에 의해 승인 되었다 &#39; s 기관 검토 위원회와 헬싱키의 선언에 명시 된 신조에 고착.
 1. Foveal 및 황 반 생 검 펀치 <ol>오픈 및 나비 인간의 눈, 그것은 조직의 4 별도 플랩의 이전 게시에 설명 된 대로 구성 되어 그런 <li>. 5</li> <li>butterflied 육안 페 트리 접시에 배치와 함께 시작, 4 m m 펀치 생 검 도구는 fovea에 센터, 누르고는 fovea 주위 절 개를 만든 때까지 부드럽게 롤.</li>
	<li>다음, 중심 및 망막의 아케이드 내 8 m m 피부 펀치 생 검 도구를 누르고, 부드러운 압력을 적용 및 압 연 하 여 황 반 주위 절 개를 생성 합니다. 이 조직 둘러싼 첫 번째의 두 번째, 외부 반지를 생산할 예정 이다.</li>
</ol> 2. 주변 망막 생 검 펀치 아케이드 밖에 주변 망막에서 펀치의 시리즈를 만들기 위하여 <ol><li>사용 4 mm 피부 펀치 생 검 도구. 여기, 각 사분면 플랩에 대 한 두 개의 펀치를 확인. 
	참고: 모든 펀치 만들어집니다, 눈 fovea 및 망막, 대표 센터, 2 개의 동심 펀치를 가질 것이 고 두 각 플랩 총의 기지에서 펀치 후 8 펀치 주변 망막에서.</li>
</ol> 3. Fovea 및 망막 생 컬렉션 <ol><li>조직 완충, 이제는 별도 microfuge 관에 모든 조직 생 검을 수집 하 고 액체 질소를 사용 하 여 다운스트림 처리에 대 한 고정. 활용도까지-80 ° C에서 모든 샘플을 저장.</li>
	<li>곡선된 0.12 Colibri 집게를 사용 하 여 망막 fovea의 반투명 직물의 가장자리를 잡아. 수집, 상승 하 고 근본적인 RPE 맥락 막에서 시야 조직 분리.</li>
	<li>에서는 마찬가지로 0.12 Colibri 집게를 사용 하 여 반투명 망막 직물의 외부 반지를 파악. 조직 내부 또는 인접 조직에 연결 아직도, Westcott가 위를 사용 하 여 신중 하 게 그냥 망막 구성 요소를 캡처하는 펀치에 포함 된 모든 시 신경 조직을 멀리 해 부 가장자리 트림.</li>
</ol> 4. 주변 망막 컬렉션 <ol><li>곡선된 0.12 Colibri 집게를 사용 하 여 부드럽게 근본적인 RPE 맥락 막 및 개별 microfuge 관 내에서 주변 망막 조직 디스크 구분.</li>
	<li>잔여 유리 체 젤의 경우 리프트 젤 멀리 분리 하는 겸 자 사용 망막 직물의 수집 하기 전에 가능한 만큼 많이. 일단 망막 제거 된 안료 RPE 맥락 막 아래 남아.</li>
</ol> 5. 시야와 망막 RPE 맥락 막 컬렉션 <ol><li>제거 fovea의 영역 아래 어두운 RPE 맥락 막 조직의 가장자리 파악 하 사용은 0.12 Colibri 집게. 조심 스럽게 sclera 및 수집에서이 조직 분리.</li>
	<li>어두운 RPE 맥락 막 조직의 제거 된 황 반 지역 기본 외부 링의 가장자리를 잡고 같은 집게를 사용 하 여. 조심 스럽게 반지 주위 다른 지점에서 가장자리를 파악 하 고 가볍게 당겨 여는 sclera에서이 조직을 구분 합니다. 결국, RPE 맥락 막 조직의 반지 dislodged 됩니다 및 수집 될 수 있습니다. 
	참고: 반대 손으로 보조 겸 RPE 맥락 막 조직을 제거 하는 동안 조작에 유용할 수 있습니다. 망막 조직 처럼 웨스 콧은 위 펀치 도구를 사용 하 여 완전히 베 하지는 모든 조직을 제거에 도움을 사용할 수 있습니다.</li>
</ol> 6. 주변 망막 RPE 맥락 막 컬렉션 <ol><li>0.12 Colibri 집게를 사용 하 여 벗 겨 8 주변 펀치 영역에서 RPE 맥락 막.</li>
	<li>이전, RPE 맥락 막 조직 microfuge 관에서 놓고 다운스트림 처리에 대 한 액체 질소를 사용 하 여 고정 합니다. 활용도까지-80 ° C에서 모든 샘플을 유지.</li>
</ol> 7. 해 부가 위 참고: 펀치 생 검 칼 날이 무딘 또는 펀치 생 검 도구는 충분히 열심히 강요 하지, 있을 수 있습니다 하지 맵시 주변 조직.
<ol><li>이러한 경우 멀리 당겨 조직을 가능한 한 많이, 다음 Westcott가 위를 사용 하 여 장식 하 고 분리.</li></ol>

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</ol>

관심 없음 충돌 선언.

조직 후 컬렉션, 샘플 처리 및 치료입니다 중요 한 고려 사항14. 액체 질소에 보존은 선호 화학 기정에 후자 손상 될 수 있습니다 다운스트림 분석을 기울일 수 있는 단백질 구조. 또한, 액체 질소 보존 샘플의 포함 하지 않는 방법을 선호입니다. 특히, 페 러 외. 4 ° C 또는 0 ° C15에 저장에 비해 상 온에서 보존 하는 뇌 샘플 사이 단백질 수준에서 큰 차이가 나타났다. 또한, 그것은 어는 단백질 수준 및 포스트 번역 상 수정16,17를 변경 하기 전에 특정 화학 및 물리 치료로 샘플을 처리할 때 주의 해야 하는 것이 중요. 이 샘플의 의도 다운스트림 분석 고려의 중요성을 강조. 별도로, 사후 타이밍 수확 하는 조직 수준 및 특정 단백질의 안정성에 영향을 미칠 수 있는 또 다른 요인은 이다. 저하는 시간 사후 및 ...

망막, RPE, 및 맥락 막 단백질 표정, 생리 적 기능 및 병 적인 감정1,2에서 중요 한 지역 차이 보여 주는 복잡 한 조직이 있습니다. 예를 들어 등 의학 황 반 변성 (AMD), 망막 화, 중심 장 액 망막 질환 각 질병 특성 지역화 fovea, 흑점, 또는 망막 주변1,3, 설명 4,6. 여기, 우리가 어떻게 다른 망막 영역 수 수 독립적으로 샘플링 하지를 보여주는 방법 제시. 이 방법의 전반적인 목표 proteomic 분석에 대 한 인간의 망막 및 RPE 맥락 막 시야, 황 반, 및 주변 지역에서 조직 샘플의 컬렉션에 대 한 신뢰할 수 있는 가이드를 제공 하는 것입니다. 개발 및이 기술의 사용에 대 한 근거는 이러한 특정 망막 지역, 중요 한 분자 통찰력이이 지역의 생리 및 병 태 생리 기능에 기록 될 수 있습니다의 proteomic 분석을 통해.
이 접근에는 상대 지역 질병 감정, proteomic 기초를 공개 하 고 새로운 구체적인 치료 목표의 식별을 용이 하 게 약속 드립니다. 실제로, 유리 체 및 망막에와 함께 자사의 상호 작용의 proteomic 조사 분자 조성과 건강 하 고 병에 걸리는 조직5,,78 의 기능에 중요 한 통찰력 제공 , 9 , 10 , 11 , 12 , 그러나 13. 별개의 망막 영역의 명확한 비교 proteomic 분석 결여 되는. 기술은 안정적이 고 재현 가능한 조직 컬렉션 접근으로 다른 방법 이상의 장점을 제공이 많이 필요한 연구를 지원 하기 위해 도움이 됩니다. 더 많은 그래서, 방식은 매우 접근 하 고, 표준 사이즈와 쉽게 사용할 수 있는 조직 펀치 생 검 도구 활용 합니다. 우리의 기술 강조 적절 한 수집 및 proteomic 처리, 단백질 안정성과 성능 저하에 대 한 중요 한 고려 사항에 대 한 조직의 저장 합니다. 따라서,이 방법은 proteomic 요인의 다운스트림 분자 분석을 고려 하 고 조사에 가장 적합 합니다.

<table><tbody><tr><td>4-mm 스킨 펀치 생검 도구</td><td>Miltex</td><td>REF 33-34</td><td></td></tr><tr><td>8-mm 스킨 펀치 생검 도구</td><td>Miltex</td><td>REF 33-37</td><td></td></tr><tr><td>0.12 Colibri Forceps</td><td>Stephens Instruments</td><td>S5-1145</td><td></td></tr><tr><td>Wescott Scissors</td><td>Sklar Surgical Instruments</td><td>64-3146</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge tubes</td><td>Eppendorf</td><td>#022364111</td><td>1.5 mL</td></tr><tr><td>액체 질소</td><td>Praxair, Inc.</td><td>7727-37-9 [R]</td><td></td></tr></tbody></table>

proteomic 분석에 대 한 인간의 망막과 맥락 막의 rpe의 해 부

Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis

인간의 망막 혈관 맥락 막 층을 단단히 complexed은 감각 neuroretina 및 근본적인 망막 안료 상피 (RPE)의 구성 됩니다. 망막의 다른 영역은 해부학 및 분자로 독특한, 독특한 기능을 촉진 하 고 질병에 차동 민감성을 보여주는입니다. 각 이러한 영역 및 레이어 Proteomic 분석 연령 황 반 변성 (AMD), 녹 내장, 당뇨병, 등 많은 질병의 분자 과정에 중요 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 그러나, 망막 지역과 계층의 분리 정량 proteomic 분석을 수행할 수 있습니다 전에 필수적 이다. 여기, 해 부 및 컬렉션의 시야, 황 반, 및 주변 망막 영역 및 근본적인 RPE 맥락 막 복잡 한, 지역 펀치 생 검 및 인간의 눈에서 조직 층의 수동 제거를 포함 하는 방법을 설명 합니다. 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석 (LC-MS/MS) 등 다운스트림 proteomic 분석 뿐만 아니라 1 차원 SDS 페이지 사용할 수 있습니다 각 해 부 망막 층에 단백질을 식별 하기 위해 망막 질환에 대 한 분자 biomarkers를 공개.

망막 및 맥락 막의 RPE 조직 개별 조사에 맞게 다양 한 방법으로 처리할 수 있습니다. 수령 후, 연구원 망막 및 RPE 맥락 막 시야 지역, 외부 망막 및 주변 망막 (그림 1)에서 조직 샘플을가지고 것입니다. 특히, 시야 지역 펀치는 fovea, parafovea, 및 인접 한 perifovea의 작은 금액을 포함 됩니다. 황 반 펀치 perifoveal 지역 뿐만 아니라 인접 한 근처 주변 지역의 작은 금액 나머지 포함 됩니다. 마지막으로, 주변 펀치 샘플 중간 주변 멀리 주변 지역. 대표적인 실험에서 조직 샘플 트립 신 소화 했다 고 단백질 함량 (그림 2A)을 시각화 하기 위해 1 차원 SDS 페이지를 사용 하 여 분석. 이 분석의 결과 것 망막의 여러 지역 중에서 독특한 단백질을 좋습니다. 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석 (LC-MS/MS)<sup ...

인간의 망막 fovea, 흑점, 그리고 주변 망막을 포함 하 여 기능 및 분자로 별개 영역 구성 됩니다. 여기, 펀치 생 검 및 인간의 눈에서 조직 층의 수동 제거를 사용 하 여 부하 다운스트림 proteomic 분석이 고유한 망막 영역을 수집 하는 방법을 설명 합니다.

Proteomic 분석에 대 한 인간의 망막과 맥락 막의 RPE의 해 부

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular ...

이 영상에서는 단백질체 연구를 위해 중심와, 황반 및 주변부 망막에서 조직 생검 샘플을 채취하는 방법을 설명합니다. 여러 단계에 걸쳐 4 mm 피부 펀치 생검 도구를 사용합니다. 나비 모양으로 절개한 인간의 안구를 페트리 접시에 놓습니다.펀치 생검 도구를 중심와 바로 위에 맞춘 다음, 아래로 누르며 중심와 주변에 절개선이 생길 때까지 약간 회전시킵니다. 8mm 펀치 생검 도구를 황반의 혈관궁(arcade) 내에 맞추고 가볍게 누르며 회전시킵니다. 다시 4mm 펀치 생검 도구를 사용하여 혈관궁 바로 바깥쪽의 주변부 망막에 일련의 펀칭을 수행합니다.각 플랩당 두 개의 펀칭을 수행합니다. 모든 펀칭이 완료되면 안구는 다음과 같은 모습이 됩니다. 이제 조직 수집 과정을 시작할 준비가 되었습니다.곡선형 0.12 colibri 포셉을 사용하여 조직의 가장자리를 잡습니다. 여기서는 중심와 망막의 가장자리를 잡습니다. 동일한 포셉을 사용하여 황반 조직 링을 잡습니다.이 경우, 망막이 디스크에 붙어 있는 것으로 보입니다. Westcott 가위를 사용하여 가장자리를 다듬어 망막 부분만 캡처할 수 있습니다. 다음으로 주변부 망막 펀치에 집중하여, Colibri 포셉을 사용해 하부의 RPE 및 맥락막으로부터 조심스럽게 들어 올려 분리합니다.경우에 따라 유리체 겔이 일부 남아 있을 수 있습니다. 조직을 채취하기 전에 포셉을 사용하여 이를 제거하십시오. 이것은 유리체 겔이 많이 포함된 또 다른 검체입니다.포셉을 사용하여 분리된 조직을 들어 올린 다음 망막을 포착합니다. 망막이 제거되면 RPE-맥락막이 남습니다. 동일한 포셉을 사용하여 이 색소 조직의 가장자리를 잡고 공막에서 조심스럽게 분리합니다.이 조직은 중심와 아래에 위치한 RPE-맥락막을 나타냅니다. 여기는 황반 아래의 RPE-맥락막 링입니다. 조직을 조작할 때 왼손에 든 두 번째 기구가 유용할 수 있습니다.망막과 마찬가지로, RPE-맥락막 복합체는 디스크에 융합되어 있으며, 이 조직을 안구에서 분리하는 데 다시 한번 westcott 가위가 유용합니다. 주변부 펀치 영역에서 RPE-맥락막을 벗겨내기 위해 12 colibri 포셉을 사용합니다. 펀치 생검 블레이드가 무뎌졌거나 충분히 강하게 누르지 않은 경우, 조직 주변이 깔끔하게 절단되지 않았을 수 있습니다.이러한 경우, 조직을 가능한 한 멀리 잡아당긴 다음 westcott 가위를 사용하여 다듬고 분리하십시오. 조직 샘플을 트립신으

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생화학

이 문서는 망막 안료 상피 하나에서 세 일 postfertilization의 배아에게 부착과 않고 zebrafish의 망막 microdissect하는 방법을 설명합니다.

Zebrafish 배아 눈 조직의 Microdissection

우리는 형태, 생리, 극성, 그리고 성인 기본 조직의 단백질과 유전자 발현 패턴을 전시 인간 태아의 망막 색소 상피 세포 (hfRPE) 세포의 culturing 합류 monolayers에 대한 재현성 방법을 제공합니다. 이 작품은 여러 가지 안과 질환의 동물 모델로 확장되었습니다.

망막 안료 상피 생리학과 Pathophysiology 연구를위한 실험 모델

이 동영상은 사후의 눈에 인간의 유리 신체의 다양한 반투명 구조를 차별하고 해부를위한 효과적인 기법을 보여줍니다.

Proteomic 분석을위한 인적 유리 바디 요소의 해부

마우스 눈 해부의 정식 데모는 망막 안료 상피의 전체 마운트의 결과.

망막 안료 상피의 전체 마운트를위한 마우스 아이의 해부

해부 기술은 유리체, 망막, 그리고 마우스 눈에서 렌즈, 원심 분리에 의해 분리하고, 단백질 as​​says과 특성화의 내장 적출을 보여줍니다.

Proteomic 분석을위한 마우스 유리체 및 망막의 내장 적출

단일 망막 세포와 그 cDNAs의 후속 증폭의 절연을위한 방법을 설명합니다. 단일 세포 transcriptomics는 조직의 세포 이질 선물의 정도를 보여 희귀 세포 집단에 대한 새로운 마커 유전자를 알게되어. 동반 프로토콜은 다양한 세포 유형에 맞게 조정할 수 있습니다.

개발하고 성숙한 망막 신경 세포의 단일 세포 프로 파일링

이 프로토콜은 단백질 분석을 위해 뮤린 막대 광수용체의 세포 하부 구획을 분리하는 두 가지 기술을 제시합니다. 첫 번째 방법은 살아있는 망막과 셀룰로오스 여과지를 사용하여 막대 외부 세그먼트를 분리하는 반면, 두 번째 방법은 동결 건조 된 망막과 접착 테이프를 사용하여 막대 내부 및 외부 세그먼트 층을 제거합니다.

단백질 분석을 위한 마우스 망막에서 광수용체 세포 구획의 단리를 위한 두 가지 박리 방법

우리는 인간의 눈에서 망막 색소 상피 (RPE)를 효율적으로 분리하고 RPE의 조직 학적 및 형태 측정 분석을 위해 전체 RPE / 맥락막 플랫 마운트를 생성하는 방법을 설명합니다.

조직학적 분석을 위해 인간의 눈에서 망막 색소 상피/맥락막 플랫마운트의 효율적이고 일관된 생성

마우스 모델은 망막 색소 상피(RPE)의 생물학을 조사하는 데 유용한 도구가 될 수 있습니다. 마우스가 일련의 RPE 병리를 개발할 수 있다는 것이 확인되었습니다. 여기에서는 빛, 투과 전자 및 공초점 현미경을 사용하여 마우스의 RPE 병리를 설명하고 정량화하는 표현형 프로토콜을 설명합니다.

연령 관련 황반변성의 마우스 모델에서 망막 색소 상피 병리를 평가하고 정량화하기 위한 프로토콜

이 연구는 광수용체 세포체를 제거함으로써 면역조직화학, in situ hybridization 및 전기생리학 실험을 위해 더 빠른 항체 확산과 내부 망막 뉴런에 대한 패치 피펫 접근을 개선할 수 있는 대체 편평 장착 망막 제제를 제시합니다.

척추동물 망막의 내부 핵층 뉴런 연구를 위한 개선된 평판 준비로서의 망막 분할

학습하세요 인간 망막의 황반부, 중심와, 주변부에서 조직 생검을 채취하여 단백질체학 분석을 수행하는 방법을. 이 기술은 망막 분자 구성 연구에 필수적입니다.

Proteomic 분석에 대 한 인간의 망막과 맥락 막의 RPE의 해 부

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