Name: 3D 세포 배양 및 비 anticoagulated 전 혈을 사용 하 여 내 피 세포의 항 응 혈 약 그리고 항 염증 제 속성에 대 한 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: 학습하세요 내피세포의 항응고 특성을 비항응고 전혈을 사용하여 평가하는 방법을. 이 기법은 심혈관 연구와 수술 관련 연구에서 응고 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

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이 연구는 스위스 국립 과학 재단 (SNSF, 보조금 번호 320030_156193)에 의해 지원 되었다. 저자 박사 Benoît Werlen Biosilon microcarrier 비즈 제공 감사 합니다. 우리는 또한 감사 교수 한스 피터 Kohler와 교수 안 드레 Haeberli microcarrier 구슬 모델을 설정 하는 방법에 대 한.

독일 Landrace 돼지는 (야생 타입 지역 농가에서 사육 하 고 유전자 변형 동물 사육 분자 연구소와 생명 공학, 루드비히 막시밀리안 대학, 뮌헨, 독일에서 자란), 무게 40 k g, 30 킬로그램 사이 사용 되었다 이 연구는. 모든 동물이 물과 음식을 임의로 광고와 표준 조건 하에서 보관 되어 있었다. 모든 동물 실험은 스위스 동물 보호 법률 뿐만 아니라 치료와 실험 동물의 사용에 대 한 영국 동물 (과학적인 절차) 고 NIH 가이드에 따라 수행 했다. 모든 동물 연구 도착 지침 준수. Cantonal 수의학 서비스 (구획의 베른, 스위스)의 동물 실험 위원회 아니 모든 동물 절차를, 허가 승인 했다. BE70/14입니다. 실험 프로토콜 3R 원칙에 따라 세련 되었고 최신의 마 취와 통증 관리 동물의 수를 최소화 하 고 실험 하는 동안 스트레스와 통증을 동물의 노출을 줄일 하는 데 사용 했다.
 피는 건강 한 개인에서 베른 대학 병원의 스위스 관할 및 윤리 지침에 따라 폐쇄 시스템 venipuncture에 의해 그려진 했다. 문구 &#34; anticoagulated 비 혈액 &#34; 어떤 응고 제와 혈액은 치료 되지 의미.
 다음 단계는 무 균 조건 하에서 수행 됩니다. 기본 셀 문화 무 균 기법으로 친숙이 필요.
 1. 절연의 PAEC 참고: 6 ~ 10 cm의 흉부 대동맥 세그먼트 3 ~ 6 개월의 나이 (다른 vivo에서 실험을 위해 사용)의 즉시 안락사 독일 Landrace 돼지에서 가져온 포함 하는 전송 매체 (DMEM + 1% 페니실린/스) 500 mL 유리병으로 옮겨.
<ol><li>미리 fibronectin 12.5 µ g/mL PBS 1와 6 잘 플레이트 코트 x 1 h. 위해 37 ° C에는 인큐베이터에 배치</li>
	<li>미리 따뜻한 무 균 PBS 1 x와 셀 문화 매체 (DMEM).</li>
	<li>전송 매체에서 돼지 대동맥 꺼내.</li>
	<li>폴리스 티 렌 격판덮개에 대동맥 장소.</li>
	<li>부드럽게 미리 따뜻한 PBS를 가진 플러시.</li>
	<li>경도 대동맥을 잘라 고 바늘으로 수정.</li>
	<li>내부 용기 표면에 따뜻한 세포 배양 매체 추가.</li>
	<li>Fibronectin 세포 배양 매체를 발음 하 고 신선한 세포 배양 매체 (DMEM 10 %FBS와 1% 페니실린/스 내 피 세포 성장 매체 보충 믹스의 0.4% 보충) 추가.</li>
	<li>세포 배양 매체에서 한 면봉을 담근 다. 같은 방향으로 부드럽게 그리고 천천히 맨 내부 용기 표면에 목화 꽃 봉 오리를 면봉.</li>
	<li>6 잘 플레이트의 한 잘에 셀 라운드 라운드 문.</li>
	<li>우물의 나머지 부분에 대 한 동일한 작업을 수행.</li>
	<li>현미경 세포를 확인 하 고 37 ° c, 5% CO 2 배양 기에서 6-잘 접시를 놓습니다.</li>
	<li>둘째 날에는 매체를 변경 하 고 다시 2-3 일 마다 변경.</li>
	<li>셀 confluent 될 거 야, trypsinize 셀 고 T75 플라스 크 (PAEC P1)으로 씨앗.</li>
</ol> 2. PAEC 특성화 <ol><li>미리 코트 fibronectin 12.5 µ g/mL PBS 1와 8 잘 chamberslide x 1 h. 위해 37 ° C에는 인큐베이터에 배치</li>
	<li>5 x 10 4 셀/잘 씨와 37에 인큐베이터에서 밤새 품 어 ° c.</li>
	<li>PBS + + (PBS CaCl 2와 MgCl 2 보충), 두 번 셀 세척 300 μ/잘.</li>
	<li>실내 온도에, 200 μ/잘 10 분 3.7 %paraformaldehyde 셀 수정.</li>
	<li>셀 3 회 PBS + +, 300 μ/잘 씻어.</li>
	<li>PBS 1 x-3_% BSA (블로킹 버퍼)의 300 μ를 추가 하 고 실 온에서 30 분 두고.</li>
	<li>1 차 항 체 (안티-VE-cadherin, 안티 CD31, 안티-vWF) PBS 1x-1%BSA-0.05% 세제, 160 μ/잘에에서 희석 적용 하 고 실 온에서 1 h에 품 어.</li>
	<li>PBS + + (200 μ/잘)를 가진 3 번 세척.</li>
	<li>이차 항 체와 DAPI에서 PBS 1x-1%BSA-0.05% 세제, 160 μ, 잘 희석 적용 하 고 실 온에서 1 h에 품 어.</li>
	<li>PBS + + (200 μ/잘)를 가진 3 번 세척.</li>
	<li>글리세롤 기반된 설치 매체와 함께 슬라이드를 탑재 하 고 내 피 세포 마커 식 형광 현미경 확인. 
	참고: 90% 합류까지 T175 플라스 크 (DMEM 낮은 포도 당 매체 + 10 %FBS, 1% 페니실린/스와 내 피 세포 성장 매체 보충 믹스의 0.4%)에 문화 돼지 대동맥 내 피 세포에 도달. (시드 밀도 1 x 10 6 셀, 90% 합류 해당 약 5 x 10 6 셀).</li>
</ol> 3. Microcarrier 구슬의 코팅 <ol><li>콜라겐 솔루션 50 mL 튜브 (100 μ g/mL, 0.2% 초 산 용액에 희석)의 42 mL와 함께 microcarrier 구슬의 7 mL를 혼합 하 고 실 온에서 1 h에 품 어.</li>
	<li>구슬 두 번 PBS pH 7.4의 25 mL로 씻고 (25 mL PBS의 추가, 잘와 함께 혼합에 피펫으로 상쾌한 및 반복 구슬 다음 삭제 정착은 될 때까지 기다립니다) DMEM 매체의 25 mL와 함께 한 번.</li>
	<li>커버 매체 199 10% 보충의 10 mL 50 mL 튜브에 구슬 FBS, 1% 페니실린/스, 1 %L-글루타민, 내 피 세포 성장 매체 보충 믹스의 0.4% 및 25 μ 헤 파 린 (5000 IU/mL)의 10 분에 대 한 평형 수 더 사용 하기 전에.</li>
</ol> 4. 세포를 수집 <ol><li>PAEC 포함 된 T175 플라스 크에서 세포 배양 매체를 제거 하 고 PBS pH 7.4의 5 mL을 추가.</li>
	<li>T175 플라스 크에서 PBS 제거.</li>
	<li>Trypsin-0.05% EDTA의 5 mL을 추가 하 고 37에서 3-4 분 동안 품 어 ° c.</li>
	<li>세포 배양 매체의 15 mL로 플라스 크를 rinsing 하 여 세포를 수집 하 고 전송 50 mL 튜브에 서 스 펜 션.</li>
	<li>실 온에서 8 분 1200 x g에서 세포를 원심 초과 매체를 제거 하 고 세포 배양 매체의 5 ml에서는 펠 릿 resuspend.</li>
</ol> 5. 활동가 플라스 크로 셀 시드 <ol><li>세포 현 탁 액을 세포 배양 매체의 20 mL를 추가 하 고 resuspend.</li>
	<li>자력 500 mL 플라스 크에 20 mL 세포 배양 (세포) 제외 추가.</li>
	<li>단계 3.3에서에서 씻어 microcarrier 구슬에 셀을 추가 하 고 신중 하 게 25 mL 혈 청 학적인 피 펫 혼합.</li>
	<li>자석 스피너 플라스 크에 구슬/셀 혼합 전송.</li>
	<li>나머지 수집 하 세포 배양 매체의 10 mL 50 mL 튜브 린스.</li>
	<li>스피너 플라스 크에 세포 배양 매체의 추가적인 85 mL를 추가 하 고 통에 37 ° C에서 하룻밤 인큐베이터에 배치 (100 x g, 혼합 간격: 3 분 마다 45 분).</li>
	<li>세포 배양 매체의 50 mL를 추가 (전체 용량 200ml) 추가 24 h에 대 한 교 반 통에 37 ° C에서 계속 (100 x g, 혼합 간격: 3 분 마다 45 분).</li>
	<li>추가 무색 RPMI 매체 (보충 10 %FBS, 1% 페니실린/스, 1 %L-글루타민, 내 피 세포 성장 매체 보충 믹스의 0.4% 및 헤 파 린의 25 μ) 320 mL 전체 볼륨에 도달할 때까지.</li>
	<li>대체 매체 오래 된 매체의 모든 48 h: 제거 100 mL 및 100 mL 신선한 보충된 무색 RPMI의 추가.</li>
	<li>5 ~ 7 일에 대 한 셀을 문화. 시간 셀 코팅 구슬의 합류 상태에 따라 달라 집니다.</li>
</ol> 6. 합류 확인 <ol><li>는 피 펫을 사용 하 여 셀 코팅 구슬의 200 μ를 수집 하 고 폴 리 프로필 렌 튜브에 그들을 전송.</li>
	<li>세척 3 회 PBS 1의 600 μ와 구슬 x (PBS, 추가 기울기는 튜브 셀의 분리를 피하기 위해, 구슬 대기를 부드럽게 혼합 정착, PBS 삭제 및 반복).</li>
	<li>Parapicric 산의 200 μ를 추가 하 여 10 분 동안 구슬 해결.</li>
	<li>X. PBS 1의 600 μ로 3 번 세척</li>
	<li>추가 DAPI에서 PBS 1 희석 x 10 분에 대 한 품 어 및</li>
	<li>구슬 유리 슬라이드에 전송과 coverslip 글리세롤 기반 설치 매체를 사용 하 여 적용.</li>
	<li>Confocal 현미경 구슬 시각화.</li>
</ol> 7. 실험 절차 <ol><li>10 mL 혈 청 학적인 피 펫으로 셀 코팅 구슬 (절차 없는 메 마른 조건 하에서 해야 할) 자력 플라스 크에서 제거 하 고 12 mL 라운드-하단 폴 리 프로필 렌 튜브에 그들을 전송.</li>
	<li>구슬과 정착 (약 1-2 분) 초과 매체를 제거 하자.</li>
	<li>구슬의 정확히 2 mL를 포함 하는 모든 튜브까지 관에 더 많은 구슬을 추가.</li>
	<li>5 mL 분명 RPMI 각 튜브를 추가 하 고 신중 하 게 10 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 혼합.</li>
	<li>구슬과 정착 초과 매체를 제거 하자.</li>
	<li>RPMI와 한 번 더 세척 절차를 반복 하 고 모든 초과 매체 제거.</li>
</ol> 8. 보육 비-anticoagulated 피 <ol><li>신중 하 고 천천히 (를 사용 하 여 jet도 vacutainers) 혈액 건강 한 지원자에서 그리고 9 mL 중립 폴 리 프로필 렌 튜브 (응고 제)에서 수집.</li>
	<li>천천히 각 셀 코팅 구슬 (10 mL 전체 볼륨 것입니다)의 2 개 mL를 포함 하는 폴 리 프로필 렌 튜브에 8ml 혈액 10 mL 혈 청 학적인 피 펫과의 전송 합니다. 항상 혈액 또는 조기 EC 활성화를 피하기 위해 구슬의 거친 처리를 하지 마십시오. 절차 1-2 분 소요</li>
	<li>신중 하 게 동등한 혼합 및 파라핀 필름 뚜껑을 밀봉 하 피/비드 혼합물을 기울기.</li>
	<li>수평 틸팅 테이블 (부드러운 기울기 설정만) 37 ° C 배양 기 및 기록 시간을 응고 내부에 튜브를 놓습니다.
	<ol><li>설정된 시간 간격 예: 10, 20, 30, 50, 70, 90 분, 후 혈 청 또는 플라스마 분석을 위한 혈액 비드 혼합물의 1.5-2 mL 이상 제거. 
		참고: 6 시간 점 좋습니다 셀의 한 그룹 내에서 3 개 이상의 복제 데로 다른 튜브에 혈액 샘플링을 할 수.</li>
		<li>혈 청의 컬렉션에 대 한 혈액 응고를 두고. 플라즈마를 수집 하려면 추가 EDTA 또는 구 연산 2 mL 튜브에 혈액 샘플을 추가 하기 전에.</li>
		<li>얼음에 튜브를 저장, 4 ° C에서 10 분 동안 2500 x g에서 원심 및 사용까지 80 ° C에서 혈 청/플라즈마를 저장. 
		참고: 자료에 자료의 테이블에에서 제공 됩니다</li></ol></li></ol>

<ol><li>Rajendran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vascular+endothelium+and+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">The vascular endothelium and human diseases.</a> Int. J. Biol. Sci. 9, 1057-1069 (2013).</li>
<li>Rajwal, S., Richards, M., O'Meara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+recalcified+citrated+whole+blood+-+a+pragmatic+approach+for+thromboelastography+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Anesthesia%22%5BJournal%5D)">The use of recalcified citrated whole blood - a pragmatic approach for thromboelastography in children.</a> Pediatric Anesthesia. 14, 656-660 (2004).</li>
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<li>Bongoni, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+Expression+of+Human+CD46+on+Porcine+Endothelium%3A+Effect+on+Coagulation+and+Fibrinolytic+Cascades+During+Ex+Vivo+Human-to-Pig+Limb+Xenoperfusions%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Transgenic Expression of Human CD46 on Porcine Endothelium: Effect on Coagulation and Fibrinolytic Cascades During Ex Vivo Human-to-Pig Limb Xenoperfusions.</a> Transplantation. 99, 2061-2069 (2015).</li>
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<li>Wuensch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+Sequences+of+the+Porcine+THBD+Gene+Facilitate+Endothelial-Specific+Expression+of+Bioactive+Human+Thrombomodulin+in+Single-and+Multitransgenic+Pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Regulatory Sequences of the Porcine THBD Gene Facilitate Endothelial-Specific Expression of Bioactive Human Thrombomodulin in Single-and Multitransgenic Pigs.</a> Transplantation. 97, 138-147 (2014).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

여기에 제시 된 모델은 응고에 대 한 적합 한 응고 및 적와의 상호 작용의 다양 한 측면의 분석을 허용 하는 연구 관련 8 xenotransplantation 연구에서는 인간의 피 9부 화 후 다른 유전자 변형된 돼지 ECs의 항 응 혈 약 속성을 테스트 하는 유용한 시스템입니다.
프로토콜의 가장 중요 한 단계는 실험을 시작 하기 전에 microbeads의 전체 셀 범위 (confluency)을 보장 및 주의 컬렉션에 관련 된 고을 피하기 위해 조 비 anticoagulated 전체 혈액의 처리 vacutainers 혈액을 수집 하는 데 사용 되는 경우 발생할 수 있는 높은 전단 응력으로 인해 혈소판 활성화. 10 그럼에도 불구 하 고,이 시스템 반복 닫힌된 시스템의 부재를 포함 하 여 몇 가지 제한 사항이 있으며 더 나은 것을 생리 적인 전단 응력의 ...

단층 선 루멘 혈관의 내 피 세포 (EC)의 혈관 내 피에 의하여 이루어져 있다. 생리 적인 상태에서 무부하 EC는 응고 제와 항 염증 제 환경의 유지 보수에 대 한 책임이 있습니다. 1 이 응고 제와 항 염증 단백질 EC 표면에 표현에 의해 중재 됩니다. 예를 들어 EC 활성화 국 소 빈 혈 또는 reperfusion로 인 한 부상 또는 혈관 거부 (이종-) 이식의 내 피는 응고 제와 항 염증 상태에서 프로 응집과 프로-염증 성 변화에 장기 결과 상태입니다. 1
매혹적이 고 복잡 한 상호작용으로 모방 하는 체 외에서 모델 endothelium 및 응고 요인 연구 가능한 vivo에서 상황 매우 바람직한 있습니다. 기존의 시험관에 응고 분석 실험을 짓는 일반적인 제한 anticoagulated 혈액 응고 중재 효과의 분석 힘든 게의 사용 이며 심지어 recalcification citrated 전체 혈액의 복제 수 없습니다. 신선한 비 anticoagulated 혈액으로 얻을 수 있는 결과. 2 사실, 전통적인 침대 형 세포 배양 시스템에서 그것은 혈액 볼륨 당 충분 한 내 피 세포 표면에 도달 하실 수 없습니다 endothelium의 항 응 혈 약 속성을 이용할 수 있습니다. 여기에 제시 된 모델 구형 microcarrier 구슬의 표면에 EC를 경작 하 여 이러한 한계를 극복 있도록 EC 표면 혈액 비율의 &#62; 작은 arterioles 또는 정 맥, 상황에 비슷한 16 cm2/mL 도달 될 수 있다 고 EC 표면에 의해 혈액의 "자연" anticoagulation 수 있도록 충분 한 것 설명 했다. 3 , 4 전체 혈액이이 설정에서 추가 응고 없이 사용할 수 있습니다. 혈액 샘플을 실험 하 고 cytokines, 응고 요인 동안 수집 될 수 있습니다 고 수용 성 보수 활성화 마커를 감지 및 측정할 수 있습니다. 또한, EC 코팅 microcarrier 구슬 EC 활성화 마커의 식으로 보완 및 면역 증 착 confocal 현미경 검사 법에 의해 분석 수 있습니다. 또 다른 흥미로운 응용 프로그램 내 피 세포 활성화 하 고, 따라서, 응고를 방지 하는 약물의 테스트 포함 되어 있습니다. 5 이 모델을 완전히 동물 실험 대체 수 없습니다, 비록 특정 기능 가설 비보 전 셀을 사용 하 여 테스트 하 고 따라서 국 소 빈 혈 또는 reperfusion에 기초 연구에 사용 된 동물의 수를 줄일 수 있는 방법을 제공합니다 부상 또는 (xeno) 이식.
설명된 모델 모방 xenotransplantation 돼지 대동맥 내 피 셀 (PAEC) microcarrier 구슬에 성장 하 고 전체, 비 anticoagulated 인간의 피와 알을 품는 사용 되었다. 보완 시스템 thrombomodulin 응고 시스템의 규정 (hTBM)의 규칙을 위한 CD46 등 여러 가지 인간 유전자를 운반 하는 다른 유전자 변형 PAEC 그들의 항 응 혈 약 속성에 대 한 분석 했다. 내 피 세포 활성화, 보수, 및 응고 시스템 긴밀 하 게 제어 하 고 상호 연결. 따라서 다른 유전자 변형 세포 접착 분자 식 및 cytokine 릴리스, 인간의 혈액에 노출 된 후 동작 하는 방법을 이해 하는 것이 중요 6 은 항 응 혈 약 단백질의 손실과 glycocalyx 흘리기. 7

<table><tbody><tr><td>PAEC</td><td></td><td></td>: <td>실험실에서 돼지 대동맥에서 분리,</td></tr><tr><td>마이크로캐리어 비드(Biosilon)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>160-250</td><td></td></tr>, <tr><td>Collagen I, Bovine</td><td>Gibco</td><td>A10644-01</td><td></td></tr>, <tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>21885-025</td><td></td></tr>, <tr><td>Medium 199</td><td>Sigma</td><td>M7528</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td>, <td>Gibco</td><td>32404-014</td><td></td></tr><tr><td>중성 튜브</td><td>Sarstedt</td><td>02.1726.001</td><td></td></tr><tr><td>폴리 프로필렌 튜브</td><td>Simport</td><td>T406-2A</td><td></td></tr><tr><td>교반기 플라스크</td><td>Tecnomara</td><td></td><td></td></tr><tr><td>생물학적 교반기</td><td>Brouwer</td><td>MCS-104S</td><td></td></tr><tr><td>쥐 안티 CD31</td><td>R & D 시스템</td><td>MAB33871</td><td>희석 1:100</td></tr><tr><td>염소 안티 쥐 IgG-Cy3</td><td>잭슨 면역 연구</td><td>112-166-003</td><td>희석 1:500</td></tr><tr><td>염소 안티 VE-cadherin</td><td>산타 크루즈</td><td>sc-6458</td><td>희석 1:100</td></tr><tr><td>토끼 안티 vWF</td><td>DAKO</td><td>A0082</td><td>희석 1:100</td></tr><tr><td>Dk 안티 Gt IgG &ndash; Alexa 488</td><td>Molecular Probes</td><td>A11055</td><td>희석 1:500</td></tr><tr><td>염소 안티 토끼 - FITC</td><td>Southern Biotech</td><td>4050-02</td><td>희석 1:500</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>32670-25MG-F</td><td>희석 1 &마이크로; g/mL</td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>농도: 세포 배양 배지 내 10%</td></tr><tr><td>어댑터</td><td>Sarstedt</td><td>14.1205</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM 710</td><td></td></tr><tr><td>이미지 분석 소프트웨어</td><td>Image J</td><td></td><td>무료 제공: https://imagej.net</td></tr><tr><td>내피 세포 성장 배지 보충제Mix</td><td>PromoCell</td><td>C-39216</td><td>2 mL in 500 mL of DMEM</td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>농도: 세포 배양 배지</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td> 중 1% <td>농도: 세포 배양 배지 내 1%</td></tr><tr><td>Heparinun natricum</td><td>Drossa Pharm AG</td><td></td><td>재고 농도: 5000 U.I./ mL</td></tr><tr><td>Chamberslides</td><td>Bioswisstec AG</td><td>30108</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 x 2H2O</td><td>Merck</td><td>2382.0500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 x6 H2O</td><td>Merck</td><td>1.5833.1000</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Axon Lab AG</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>글리세르겔 실장 매체</td><td>Dako</td><td>C0563</td><td></td></tr></tbody></table>

3d 세포 배양 및 비 anticoagulated 전 혈을 사용 하 여 내 피 세포의 항 응 혈 약 그리고 항 염증 제 속성에 대 한 평가

Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood

Vivo에서, 내 피 세포는 혈액 순환의 자연 anticoagulation에 대 한 중요 한. 따라서, 내 피 세포 활성화 혈액 응고에 지도 한다. 국 소 빈 혈 또는 reperfusion 상해에서 뿐만 아니라 장기 이식 xenotransplantation를 포함 하 여 미리 형성 된 안티 기증자 항 체의 존재 처럼 많은 임상 상황에서이 현상이 관찰 됩니다. 3R 표준 (감소, 교체 및 수정), 생체 외에서 모델 내 피 세포의 효과 연구에 따르면 동물 실험을 감소 시키기 위하여 활성화 혈액 응고에 매우 바람직한 것 이다. 그러나, 내 피 세포 배양의 일반적인 평판 시스템은 자연, 내 피-중재 anticoagulation에 대 한 충분 한 혈액의 mL 당 피 내 막의 1-5 c m2 의 표면-볼륨 비율을 제공 합니다. Microcarrier 구슬에 내 피 세포를 배양 하는 것은 표면 볼륨 비율 40-160 cm2/mL을 증가할 수 있습니다. 이 증가 비율은 전체 혈액의 "자연" anticoagulation 되도록 충분 한 응고의 사용을 피할 수 있도록 합니다. 여기는 생체 외에서 microcarrier 기반 시스템 전체를 비 anticoagulated 인간의 혈액의 응고에 돼지 내 피 세포의 유전자 조작의 효과 공부 설명 되어 있습니다. 기술된 분석 결과, 기본 돼지 대동맥 내 피 세포, 중 야생 종류 (WT)에서 또는 유전자 변형 인간 CD46 thrombomodulin, 했다 microcarrier 구슬에 성장 그리고 다음 갓 그려진된 비 anticoagulated 인간의 혈액에 노출. 이 모델은 측정 및 활성화로 사이토카인 방출의 정량화에 대 한 보완 및 혈액 플라스마에 응고의 마커 수 있습니다. 또한, 활성화 된 내 피 세포와 면역 글로불린의 증 착의 이미징, 보완 및 응고 단백질 endothelialized 구슬에 confocal 현미경 검사 법에 의해 수행 되었습니다. 이 분석 결과 또한 내 피 세포 활성화 하 고, 따라서, 응고를 방지 하는 약물 테스트를 사용할 수 있습니다. 그런 수사에 사용 되는 동물의 수를 줄이기 위해 그것의 잠재력, 위에 설명 된 분석 결과 수행 하기 쉽고 일관 되 게 재현할 수입니다.

스피너 플라스 크 (그림 1)에서 문화 7-10 일 후 셀 confluent microcarrier 구슬 (그림 2)의 전체 표면을 커버 했다. Confluency 상태 확인은 중요 한 단계는 microbeads에 EC의 비 합칠 단층 응고 시간 표시 감소로 이어질 것입니다 때문에, microcarrier는 주어진 구슬의 표면 강하게 직업 응고 (응고 시간: 4 ± 1 분) ( 그림 3).
주의 필요로 하는 또 다른 중요 한 포인트는 틸팅 격판덮개의 속도입니다. 고속 틸팅 혈액 응고 향상 됩니다. 응고 시간 연장 EC의 단층 있었다면 microcarrier 구슬의 표면에 현재 관찰 될 수 있었다. GalT...

우리는 전체, 비 anticoagulated 혈액에서 응고의 분석과 연구를 허용 하는 체 외에서 모델 제시. 그리고 시스템에 anticoagulation 건강 한 내 피 세포의 자연 anticoagulation 효과에 따라 내 피 세포 활성화 응고 귀 착될 것 이다.

3D 세포 배양 및 비 anticoagulated 전 혈을 사용 하 여 내 피 세포의 항 응 혈 약 그리고 항 염증 제 속성에 대 한 평가

In vivo, endothelial cells are crucial for the natural anticoagulation of circulating blood. Consequently, endothelial cell activation leads to blood ...

본 분석의 전체적인 목표는 항응고 처리를 하지 않은 전혈을 사용하여 혈관 내피 세포의 항응고 특성을 평가하는 것입니다. 이 방법은 심혈관 연구, 운송 및 수술 관련 연구와 관련된 연구 질문에 답하는 데 활용될 수 있습니다. 기본적으로 항면역 및 혈관 내피 세포의 활성화와 관련된 모든 질문에 사용될 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 혈관 내피 세포가 항응고 작용을 보장하므로 항응고제를 첨가하지 않은 전혈을 사용할 수 있다는 점입니다. 프로토콜을 시작하려면, 50 mL 튜브에 7 mL의 마이크로캐리어 비드와 42 mL의 응고액을 혼합하고 비드를 실온에서 1시간 동안 배양하십시오. 배양 후, 25 mL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 비드를 세척하고 피펫팅을 통해 비드를 헹굽니다.상층액을 버리고 과정을 반복하기 전, 비드가 튜브 바닥에 가라앉을 때까지 기다립니다. 다음으로, 25 milliliters의 Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM으로 비드를 1회 세척합니다. 그 후, 비드에 10 milliliters의 medium 199를 채우고 추가 사용 전 10분 동안 평형화시킵니다.PAEC가 포함된 T175 플라스크에서 세포 배양 배지를 제거하고 5 mL의 PBS를 첨가합니다. 그런 다음, T175 플라스크에서 PBS를 제거하고 0.05% EDTA가 포함된 트립신 5 mL로 교체합니다. 세포를 37 °C에서 3~4분 동안 배양합니다.플라스크를 15 milliliters의 세포 배양 배지로 헹구어 세포를 수집하고, 현탁액을 50 milliliter 튜브로 옮깁니다. 세포를 원심 분리한 후, 상층액을 제거하고 펠릿을 5 milliliters의 세포 배양 배지로 다시 현탁합니다. 세포 현탁액에 20 milliliters의 세포 배양 배지를 추가하고 세포를 재현탁합니다.세포가 포함되지 않은 세포 배양 배지 20 milliliters를 500 milliliter 마그네틱 교반 플라스크에 넣습니다. 세척된 마이크로 캐리어 비드에 세포를 첨가하고 25 milliliter 세롤로지컬 피펫을 사용하여 용액을 조심스럽게 섞습니다. 비드-세포 혼합물을 마그네틱 스피너 플라스크로 옮깁니다.잔여 세포를 수집하기 위해 튜브를 10 milliliters의 세포 배양 배지로 헹굽니다. 스피너 플라스크에 세포 배양 배지 85 milliliters를 추가로 넣습니다. 플라스크를 셰이커가 있는 37 degree celsius 인큐베이터에 넣고 하룻밤 동안 배양합니다.총 부피가 200 milliliters가 되도록 세포 배양 배지 50 milliliters를 추가합니다. 쉐이커에서 24시간 동안 더 교반합니다. 총 부피가 320 milliliters가 될 때까지 무색의 rockwell park memorial institute 또는 RPMI 배지를 추가합니다.48시간마다 기존 배지 100 milliliters를 제거하고, 보충제가 첨가된 신선한 무색 RPMI 100 milliliters를 추가합니다. 세포가 코팅된 비드의 합일(confluent) 상태에 따라 5~7일 동안 세포를 배양합니다. 10 milliliter 세롤로지컬 피펫을 사용하여 마그네틱 교반 플라스크에서 세포 코팅 비드를 제거하고, 이를 12 milliliter 라운드 바텀 폴리프로필렌 튜브로 옮깁니다.1~2분 후 비즈가 가라앉으면, 과량의 배지를 제거합니다. 각 튜브에 비즈가 정확히 2 mm가 될 때까지 비즈를 더 추가합니다. 다음으로, 각 튜브에 맑은 RPMI 5 mL를 넣고 10 mL 세롤로지컬 피펫으로 용액을 조심스럽게 섞어줍니다.비드가 가라앉을 때까지 기다린 후 과잉 배지를 제거합니다. RPMI를 사용하여 세척 과정을 한 번 더 반복하고 모든 과잉 배지를 제거합니다. 건강한 지원자로부터 혈액을 조심스럽고 천천히 채혈하여 항응고제가 없는 9 mL 중성 폴리프로필렌 튜브에 수집합니다.세포 코팅 비드 2 mL가 들어 있는 각 폴리프로필렌 튜브에 혈액 8 mL를 천천히 옮겨 담아 총 부피를 10 mL로 맞춥니다. 조기 EC 활성화를 방지하기 위해 혈액과 비드를 조심스럽게 취급하십시오. 혈액-비드 혼합물을 조심스럽게 기울여 균일하게 섞이도록 하고 파라핀 필름으로 캡을 밀봉합니다.튜브를 37 °C 인큐베이터 내부의 완만한 설정으로 맞춰진 수평 틸팅 테이블에 놓고 응고 시간을 기록합니다. 정해진 시간 간격으로, 혈청 또는 혈장 분석을 위해 혈액 비드 혼합물 중 최소 1.5~2 mL를 취합니다. 혈청을 수집하려면 혈액을 그대로 응고시킵니다.마지막으로, 튜브를 4 °C에서 2,500 G로 10분 동안 원심분리합니다. 사용 전까지 혈청 또는 혈장을 -80 °C에서 보관하십시오. CD31과 핵으로 염색된 마이크로캐리어 비드는 합류(confluency) 상태를 명확하게 보여줍니다.시각적 관찰 결과, 마이크로캐리어 비드 표면에 EC 단층이 존재할 경우 응고 시간의 연장이 관찰될 수 있음을 확인하였습니다. porcine aortic endothelial cells인 PAEC GalTKO/hCD46/hTBM이 마이크로캐리어 비드에 존재할 때 응고 시간이 유의미하게 증가하였으며, 이는 보체 체계와 응고 체계 모두 성공적으로 조절되었음을 시사합니다. 숙련된 경우, 내피세포가 코팅된 비드와 항응고 처리를 하지 않은 인간 혈액의 배양은 약 6시간 이내에 완료할 수 있습니다.실제 실험 소요 시간은 주로 실험 중에 관찰되는 응고 시간에 따라 달라집니다. 이 절차를 수행할 때, 마이크로 비즈가 내피세포로 완전히 덮이도록 하고 인혈의 조기 활성화를 방지하는 것이 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

microvascular 크기의 채널 (&lt;30 μm의)와 microfluidic 장치의 전체 내부 3D 표면에 걸쳐 문화 내피 세포 단일층를하는 방법이 설명되어 있습니다.

Hematologic 질환의 Microvascular 상호 작용 유학을위한 Endothelialized Microfluidics

석판술으로 새겨져와 PDMS에서 가공 Microfluidic 흐름 여왕님 EC 장애와 염증과 관련된 기능적 결과를 알아내기 위해 적용됩니다. 대표 실험에서는 차등 전단 응력의 능력 시토킨 활성화 EC monolayers에 monocytic 세포 접착을 조절하기 위해이 입증되었습니다.

온칩 내피 염증성 Phenotyping

인간의 혈관 혈액 상호 작용을 조사하기 위한 신뢰할 수 있는 모델의 접근성이 부족합니다. 우리는 혈액(ELISA)과 혈관 구획(현미경) 모두에서 세포 상호 작용을 조사하기 위해 인간 전혈과 결합된 배양된 1차 인간 내피 세포의 체외 모델을 제시합니다.

소설 시험관 인간의 전체 혈액과 내피 세포 사이의 상호 작용 유학을위한 모델

우리는 내피 세포 단층 내에서 접착 세포의 실제 수를 정량화할 수 있는 시험관 내 방법을 보고합니다.

내피 세포 접착 정량<em&gt; 체외</em

혈관 내 피는 단단히 백혈구 신규 모집을 제어합니다. 부적당 한 백혈구 넘쳐 흐름 인간의 염증 성 질병에 기여 한다. 따라서, 내 피 활성화의 새로운 규제 요소에 대 한 검색은 염증 성 질환에 대 한 향상 된 치료를 디자인 해야 합니다. 여기, 우리는 포괄적인 방법론 소설 내 피 레 귤 레이 터 백혈구 중 염증 매매 하는 것을 수정할 수 있는 특성을 설명 합니다.

심사 분석 실험 소설 내 피 레 귤 레이 터 염증 반응에 관여 하

혈액 뇌 장벽의 범위를 유지하는 것은 중추 신경계의 항상성을 유지하기위한 열쇠입니다. 이 프로토콜은 혈액 - 뇌 장벽 범위를 조정하는 근본적인 병적 과정을 묘사하는 체외 기술을 설명합니다.

혈액 뇌 장벽 메쉬와 유사한 혈관 형성 및 분열을 평가하기위한 In vitro 시험 법

여기, 선물이 대동맥 반지 분석 결과의 새로운 응용 프로그램 prelabelled 중간 엽 세포는 쥐 대동맥 파생 내 피 네트워크와 공동 경작. 이 새로운 메서드 Mesenchymal Stromal 세포 (MSCs) 유도 및 내 피 네트워크와 통합의 시각화, 네트워크 속성의 정량화 및 MSC immunophenotypes 고 진 식의 평가 수 있습니다.

대동맥 반지 공동 문화 분석 결과: Mesenchymal Stromal 세포에 생체 외에서 의 신생 잠재력을 평가 하는 편리한 도구

이 원고 설명 기자 유전자 변형 마우스의 사용 및 다른 관리 경로 angiotensin II 유발 고혈압 면역 세포의 활성화를 평가 하기 위해 혈관의 intravital 비디오 현미경을 사용 하 여 형광 염료의 그들의 롤 및 endothelium에 고착 하는 능력.

백혈구 롤링 Angiotensin II-주입 마우스에서 접착 시각화: 기술 및 함정

3차원 공동 배양 스페로이드 혈관신생 분석 시스템은 생리적 혈관신생을 모방하도록 설계된다. 공배양 스페로이드는 두 개의 인간 혈관 세포 전구체, ECFC 및 MSC에 의해 형성되고, 콜라겐 겔에 내장된다. 새로운 시스템은 혈관 신생 변조기를 평가하는 데 효과적이며 생체 내 연구에 보다 관련성이 있는 정보를 제공합니다.

내피 콜로니 형성 세포및 중간엽 줄기 세포에 의해 형성된 공동 배양 스페로이드를 이용한 3차원 혈관신생 분석 시스템

우리는 환자 유래 내피와 전혈 상호 작용을 조사하기 위하여 체외 혈관 질병 모형을 제시합니다. 이 시스템은 다양한 상황에서 1 차적인 내피 세포의 혈전 생성 특성의 연구를 허용합니다. 이 방법은 응고의 상이한 단계 도중 시혈전증 및 항응고 요법에서 평가하기위하여 특히 적합합니다.

시험관 에서 미세 유체 질환 모델 전체 혈액 내피 상호 작용 및 혈전 역학을 실시간으로 연구

여기서, 우리는 생리적 흐름하에서 제조된 실제 크기의 3차원 인간 동맥 모델에서 내피 세포에 약물 운반대의 표적 증착을 연구하고 매핑하는 새로운 프로토콜을 제시한다. 제시된 방법은 혈관 시스템 내의 약운반체를 표적으로 하는 새로운 플랫폼역할을 할 수 있다.

유동 하에서 혈관 약물 표적화 연구를 위한 체외 3D 세포 배양 동맥 모델

학습하세요 내피세포의 항응고 특성을 비항응고 전혈을 사용하여 평가하는 방법을. 이 기법은 심혈관 연구와 수술 관련 연구에서 응고 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

3D 세포 배양 및 비 anticoagulated 전 혈을 사용 하 여 내 피 세포의 항 응 혈 약 그리고 항 염증 제 속성에 대 한 평가

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