Name: 독감 조류 특정 항 체에 의해 유도 된 Fc 중재 Effector 기능을 평가 하는 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 47 s
Description: 학습하세요 독감 바이러스 hemagglutinin을 표적하는 항체가 Fc 중재 effector 기능을 활성화하는 능력을 평가하는 방법을. 24시간 내에 완료 가능한 이 실험은 면역학 및 백신학 연구에 효율적인 도구를 제공합니다.

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이 프로젝트는 자금을 일부 알레르기 국립 연구소와 전염병에서 연방 자금, 건강의 국가 학회, 학과의 보건 및 인적 서비스, CEIRS 아래 계약 P01AI097092-04S1 (P.E.L.).

이 원고에서 preformed 실험 윤리 및 규정의 다음 아이 칸의 학부의 기관 코드를 완료 했다.
1. 인플루엔자 바이러스 조류 Transfection 또는 감염의 표현
Transfection:
<ol><li>플레이트 인간 미 발달 신장 (HEK 293T) 셀 셀/잘 백색 조직 문화에서에서 2 x 104 의 밀도에서 96 잘 접시를 처리 하 고 (와 함께 5% CO2) 37 °C 배양 기에서 4 h 동안 앉아 보자.</li>
	<li>100 셀 transfect DNA 바이러스 조류 및 50 μ의 전체 볼륨에 잘 당 transfection 시 약 0.2 μ에 대 한 코딩의 ng. 참고: 모두 Opti-최소 필수 미디어 (MEM) 감소 된 혈 청 매체 x 1에 플라스 미드 그리고 transfectant 시 약 희석 하.</li>
	<li>플레이트 18 h 5% CO2 와 37 °C 배양 기에서 배양 후 transfection 미디어를 제거 합니다.</li>
</ol>2입니다. 감염
<ol><li>플레이트 A549 또는 Madin 다 비 개 신장 세포 세포/잘 백색 조직 문화에서에서 2 x 104 의 밀도에서 96 잘 접시를 처리 하 고 5% CO2와 37 °C 배양 기에 18 h 이상에 대 한 성장.</li>
	<li>1에서 희석 바이러스 MEM x 3, 1, 또는 5% CO2와 37 °C 배양 기에서 1 h 0.33의 감염의 다양성에서 세포를 감염 하 고. 총 볼륨 100 μ 동일 해야 합니다. 참고: 10 x 메모리 위에서 언급 한 바이러스 희석에 대 한 메모리 작업 재고 x 1을 물으로 희석.</li>
	<li>감염 후는 inoculum을 제거 하 고 추가 1의 100 μ trypsin의 부재에서 접시에 MEM x.</li>
	<li>5% CO2와 37 °C 배양 기에서 18 ~ 24 h에 대 한 감염 된 세포를 성장 한다.</li>
</ol>3. FcRg/NFAT 중재 활성화 단일 클론 항 체 또는 세라 Luciferase 활동의 평가
<ol><li>첫째, 25 µ L 분석 결과 미디어 (1 x RPMI 1640 4% (vol/vol) 보충 낮은 IgG 태아 소 세라)의 transfected 또는 감염 된 세포의 성장 미디어를 바꿉니다.</li>
	<li>별도 96 잘 접시에 분석 결과 미디어를 사용 하 여 30 μ g/mL에서 시작 하는 관심사의 항 체가의 4 배 희석을 수행 합니다. Triplicates에 희석을 수행 하 고 예제 플레이트 레이아웃은 그림 1A에 나타나. 배경 컨트롤 (혼자 분석 결과 버퍼) 뿐만 아니라 항 체 (항 체 제어)을 제외 하는 컨트롤을 포함 해야 합니다. 참고 사항: 모두 '아무 항 체'에 대 한 컨트롤 배경, 25 µ L 대신에 항 체 분석 결과 버퍼의 추가.</li>
	<li>Transfected 세포 또는 감염 된 세포의 접시에 단계 3.2 해당 우물을 연속적으로 희석된 한 항 체의 25 μ 전송.</li>
	<li>15 분 동안 (와 함께 5% CO2) 37 °C 배양 기에서 접시를 품 어.</li>
	<li>Murine FcgRIV 또는 인간 FcgRIIIa (셀/잘 75000) 표현 적절 한 수정된 이펙터 Jurkat 세포의 25 μ를 추가 합니다. 각각에 대 한 총 볼륨 잘 75 µ L 고 항 체의 시작 최종 농도 10 µ g/mL (그림 1B)에 이다. 참고: 배경 컨트롤에 대 한 분석 결과 버퍼 이펙터 셀 대신의 25 µ L 추가 합니다. 항 체 의존 세포 중재 먹어서 검사, 인간 FcgRIIa 표현 수정된 Jurkat 세포를 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>플레이트 6 h 5% CO2 와 37 ° C 배양 기에서 품 어.</li>
	<li>해 동 하 고 사용 하기 전에 약 1 h는 37 °C 물에 따뜻한 luciferase 기판 버퍼. 참고: luciferase 기판 버퍼를 만들기 위해 제공 하는 분석 결과 버퍼에서 동결 건조 된 luciferase 분석 결과 기판 다시 구성. 재구성 된 기판 버퍼 최대 6 주 동안-30 °C ~-10 °C에 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>배경 컨트롤을 제외한 모든 우물에 75 μ/우물 luciferase 기판 버퍼를 추가 합니다.</li>
	<li>읽기는 루미 노에.</li>
	<li>배 유도 다음 방정식으로 계산: 유도 배 = (유도 값-배경 값) / (mAb 값-배경 값 없음).</li>
</ol>

<ol><li>Hobson, D., Curry, R. L., Beare, A. S., Ward-Gardner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+serum+haemagglutination-inhibiting+antibody+in+protection+against+challenge+infection+with+influenza+A2+and+B+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hygiene%22%5BJournal%5D)">The role of serum haemagglutination-inhibiting antibody in protection against challenge infection with influenza A2 and B viruses.</a> J Hygiene. 70 (04), 767-777 (1972).</li>
<li>Throsby, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterosubtypic+neutralizing+monoclonal+antibodies+cross-protective+against+H5N1+and+H1N1+recovered+from+human+IgM%2B+memory+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Heterosubtypic neutralizing monoclonal antibodies cross-protective against H5N1 and H1N1 recovered from human IgM+ memory B cells.</a> PloS One. 3 (12), e3942(2008).</li>
<li>Ekiert, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+recognition+of+a+highly+conserved+influenza+virus+epitope%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope.</a> Science. 324 (5924), 246-251 (2009).</li>
<li>Ekiert, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Highly+Conserved+Neutralizing+Epitope+on+Group+2+Influenza+A+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Highly Conserved Neutralizing Epitope on Group 2 Influenza A Viruses.</a> Science. 333 (6044), 843-850 (2011).</li>
<li>Tan, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pan-H1+anti-hemagglutinin+monoclonal+antibody+with+potent+broad-spectrum+efficacy+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A pan-H1 anti-hemagglutinin monoclonal antibody with potent broad-spectrum efficacy in vivo.</a> J Virol. 86 (11), 6179-6188 (2012).</li>
<li>Tan, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+Broadly+Neutralizing+Monoclonal+Antibody+That+Targets+the+Fusion+Domain+of+Group+2+Influenza+A+Virus+Hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Characterization of a Broadly Neutralizing Monoclonal Antibody That Targets the Fusion Domain of Group 2 Influenza A Virus Hemagglutinin.</a> J Virol. 88 (23), 13580-13592 (2014).</li>
<li>Friesen, R. H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+solution+to+group+2+influenza+virus+neutralization%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">A common solution to group 2 influenza virus neutralization.</a> PNAS. 111 (1), 445-450 (2014).</li>
<li>Dreyfus, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Conserved+Protective+Epitopes+on+Influenza+B+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Highly Conserved Protective Epitopes on Influenza B Viruses.</a> Science. 337 (6100), 1343-1348 (2012).</li>
<li>Krammer, F., Palese, P., Steel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+Universal+Influenza+Virus+Vaccine+Design+and+Antibody+Mediated+Therapies+Based+on+Conserved+Regions+of+the+Hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Microb+and+Immunol%22%5BJournal%5D)">Advances in Universal Influenza Virus Vaccine Design and Antibody Mediated Therapies Based on Conserved Regions of the Hemagglutinin.</a> Curr Top Microb and Immunol. , Chapter 408 (2014).</li>
<li>Impagliazzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stable+trimeric+influenza+hemagglutinin+stem+as+a+broadly+protective+immunogen%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A stable trimeric influenza hemagglutinin stem as a broadly protective immunogen.</a> Science. , (2015).</li>
<li>Nachbagauer, R., Krammer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Microbiology+and+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microb+Infect%22%5BJournal%5D)">Clinical Microbiology and Infection.</a> Clin Microb Infect. , 1-7 (2017).</li>
<li>Krammer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+universal+influenza+virus+vaccine+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+virology%22%5BJournal%5D)">Novel universal influenza virus vaccine approaches.</a> Current opinion in virology. 17, 95(2016).</li>
<li>Steel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+virus+vaccine+based+on+the+conserved+hemagglutinin+stalk+domain%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Influenza virus vaccine based on the conserved hemagglutinin stalk domain.</a> mBio. 1 (1), (2010).</li>
<li>Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Margine, I., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+hemagglutinin+influenza+virus+vaccine+constructs+elicit+broadly+protective+stalk-specific+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Chimeric hemagglutinin influenza virus vaccine constructs elicit broadly protective stalk-specific antibodies.</a> J Virol. 87 (12), 6542-6550 (2013).</li>
<li>Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Tan, G. S., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemagglutinin+Stalk-Reactive+Antibodies+Are+Boosted+following+Sequential+Infection+with+Seasonal+and+Pandemic+H1N1+Influenza+Virus+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Hemagglutinin Stalk-Reactive Antibodies Are Boosted following Sequential Infection with Seasonal and Pandemic H1N1 Influenza Virus in Mice.</a> J Virol. 86 (19), 10302-10307 (2012).</li>
<li>Hai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+viruses+expressing+chimeric+hemagglutinins%3A+globular+head+and+stalk+domains+derived+from+different+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Influenza viruses expressing chimeric hemagglutinins: globular head and stalk domains derived from different subtypes.</a> J Virol. 86 (10), 5774-5781 (2012).</li>
<li>Dunand, C. J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Both+Neutralizing+and+Non-Neutralizing+Human+H7N9+Influenza+Vaccine-Induced+Monoclonal+Antibodies+Confer+Protection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Both Neutralizing and Non-Neutralizing Human H7N9 Influenza Vaccine-Induced Monoclonal Antibodies Confer Protection.</a> Cell Host and Microbe. 19 (6), 800-813 (2016).</li>
<li>Tan, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadly-Reactive+Neutralizing+and+Non-neutralizing+Antibodies+Directed+against+the+H7+Influenza+Virus+Hemagglutinin+Reveal+Divergent+Mechanisms+of+Protection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Path%22%5BJournal%5D)">Broadly-Reactive Neutralizing and Non-neutralizing Antibodies Directed against the H7 Influenza Virus Hemagglutinin Reveal Divergent Mechanisms of Protection.</a> PLoS Path. 12 (4), e1005578(2016).</li>
<li>DiLillo, D. J., Tan, G. S., Palese, P., Ravetch, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadly+neutralizing+hemagglutinin+stalk-specific+antibodies+require+Fc%CE%B3R+interactions+for+protection+against+influenza+virus+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Broadly neutralizing hemagglutinin stalk-specific antibodies require FcγR interactions for protection against influenza virus in vivo.</a> Nat Med. 20 (2), 143-151 (2014).</li>
<li>DiLillo, D. J., Palese, P., Wilson, P. C., Ravetch, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadly+neutralizing+anti-influenza+antibodies+require+Fc+receptor+engagement+for+in+vivo+protection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Broadly neutralizing anti-influenza antibodies require Fc receptor engagement for in vivo protection.</a> J Clin Invest. 126 (2), 605-610 (2016).</li>
<li>Potter, C. W., Oxford, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+immunity+to+influenza+infection+in+man%5BTitle%5D)+AND+%22Brit+Med+Bull%22%5BJournal%5D)">Determinants of immunity to influenza infection in man.</a> Brit Med Bull. 35 (1), 69-75 (1979).</li>
<li>Memoli, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Antihemagglutinin+and+Antineuraminidase+Antibodies+as+Correlates+of+Protection+in+an+Influenza+A%2FH1N1+Virus+Healthy+Human+Challenge+Model%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Antihemagglutinin and Antineuraminidase Antibodies as Correlates of Protection in an Influenza A/H1N1 Virus Healthy Human Challenge Model.</a> mBio. 7 (2), e00417(2016).</li>
<li>Jegaskanda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-associated+cross-reactive+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity+toward+2009+pandemic+influenza+A+virus+subtype+H1N1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Age-associated cross-reactive antibody-dependent cellular cytotoxicity toward 2009 pandemic influenza A virus subtype H1N1.</a> J Infect Dis. 208 (7), 1051-1061 (2013).</li>
<li>Jegaskanda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-Reactive+Influenza-Specific+Antibody-Dependent+Cellular+Cytotoxicity+Antibodies+in+the+Absence+of+Neutralizing+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cross-Reactive Influenza-Specific Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity Antibodies in the Absence of Neutralizing Antibodies.</a> J Immunol. 190 (4), 1837-1848 (2013).</li>
<li>Jegaskanda, S., Wheatley, A. K., Kent, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScienceDirectAntibody-dependent+cellular+cytotoxicity+and+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Virol%22%5BJournal%5D)">ScienceDirectAntibody-dependent cellular cytotoxicity and influenza virus.</a> Curr Opin Virol. 22 (C), 89-96 (2017).</li>
<li>Srivastava, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Dominant+Antibody-Dependent+Cell-Mediated+Cytotoxicity+Epitopes+on+the+Hemagglutinin+Antigen+of+Pandemic+H1N1+Influenza+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification of Dominant Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity Epitopes on the Hemagglutinin Antigen of Pandemic H1N1 Influenza Virus.</a> J Virol. 87 (10), 5831-5840 (2013).</li>
<li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+specificity+plays+a+critical+role+in+regulating+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity+against+influenza+A+virus%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Epitope specificity plays a critical role in regulating antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity against influenza A virus.</a> PNAS. 113 (42), 11931-11936 (2016).</li>
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<li>Benjamin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Broadly+Neutralizing+Human+Monoclonal+Antibody+Directed+against+a+Novel+Conserved+Epitope+on+the+Influenza+Virus+H3+Hemagglutinin+Globular+Head%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A Broadly Neutralizing Human Monoclonal Antibody Directed against a Novel Conserved Epitope on the Influenza Virus H3 Hemagglutinin Globular Head.</a> J Virol. 88 (12), 6743-6750 (2014).</li>
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<li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadly+Neutralizing+Anti-Influenza+Virus+Antibodies%3A+Enhancement+of+Neutralizing+Potency+in+Polyclonal+Mixtures+and+IgA+Backbones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Broadly Neutralizing Anti-Influenza Virus Antibodies: Enhancement of Neutralizing Potency in Polyclonal Mixtures and IgA Backbones.</a> J Virol. 89 (7), 3610(2015).</li>
<li>Kristensen, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+Responses+with+Fc-Mediated+Functions+after+Vaccination+of+HIV-Infected+Subjects+with+Trivalent+Influenza+Vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Antibody Responses with Fc-Mediated Functions after Vaccination of HIV-Infected Subjects with Trivalent Influenza Vaccine.</a> J Virol. 90 (12), 5724-5734 (2016).</li>
<li>Greenberg, S. B., Criswell, B. S., Six, H. R., Couch, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+cytotoxicity+to+influenza+virus-infected+cells.+II.+Requirement+for+antibody+and+non-T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+%28Baltimore%2C+Md.+%3A+1950%29%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte cytotoxicity to influenza virus-infected cells. II. Requirement for antibody and non-T lymphocytes.</a> J Immunol (Baltimore, Md. : 1950). 119 (6), 2100-2106 (1977).</li>
<li>Corrales-Aguilar, E., Trilling, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+for+detecting+virus-specific+antibodies+triggering+activation+of+Fc%CE%B3+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Meth%22%5BJournal%5D)">A novel assay for detecting virus-specific antibodies triggering activation of Fcγ receptors.</a> J Immunol Meth. 387 (1-2), 21-35 (2013).</li>
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<li>Cheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+robust+reporter-based+ADCC+assay+with+frozen%2C+thaw-and-use+cells+to+measure+Fc+effector+function+of+therapeutic+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Meth%22%5BJournal%5D)">Development of a robust reporter-based ADCC assay with frozen, thaw-and-use cells to measure Fc effector function of therapeutic antibodies.</a> J Immunol Meth. 414 (1), 69-81 (2014).</li>
</ol>

저자는 관심 없음 충돌 선언합니다.

여기에 설명 된 메서드를 사용 하면 murine FcγRIV 참여 하 특정 단일 클론 항 체의 능력을 측정 하 수 있습니다. 대상 항 인플루엔자 바이러스 조류 바이러스 또는 플라스 미드 DNA의 transfection 감염 후 세포의 표면에 표현 된다. 분석 결과 (인간 또는 murine) 다른 FcγRs와 함께에서 다른 표면 표현 바이러스 성 단백질을 사용 하 여 의무가 더 이다. 또한, 우리는 세라 샘플 사용 Fc effector 기능 (데이터 표시 되지 않음), 유도 컨텍스트를 polyclonal 항 체의 능력을 평가 하기 위해 감염에 의해 유도 된 적합 한 면역 반응 공부 때 보다 관련성이 높은 정보를 제공할 수 있습니다 또는 예방 접종입니다. 우리는 또한 직접 수용 성 단백질으로 플레이트를 코팅 하 여 내부 바이러스 성 단백질을 인식 하는 항 체의 유도 측정 하는 분석 결과 수정할 수 있습니다 추측 하고있다. 그러나,이 방법론은 엄격 하 게 테스트 되지.
유도의 항 체 ...

계절 독감 백신에서 제공 하는 면역은 전통적으로 hemagglutination 억제 (HI) 분석 결과1, 대상으로 하는 조류의 수용 체 바인딩 사이트 항 체의 존재를 측정 하 여 평가 되었습니다. 이러한이 활성 항 체 살 균 면역을 부여 수 있습니다 하지만 일반적으로 인플루엔자 바이러스의 단지 선택 몇 가지 계통에 면역을 제공 하는 보호의 그들의 범위에서 좁은. 격리 및 조류 (HA)를 인식 하는 광범위 하 게 반응 단일 클론 항 체의 특성화 제안 범용 인플루엔자 백신의 개발은 도달 시간2,,34, 5 , 6 , 7 , 8. 인플루엔자 바이러스9,10,,1112 의 보존된 지역으로 강한 항 체 응답을 유도 하는 것은 보편적인 인플루엔자 백신의 주요 목표 중 하나 , 13 , 14 , 15 , 16. 이러한 보존된 epitopes, 중화 및 비 중화 항 체17,18의 인식 반응 항 체 Fc-FcγR 상호 작용에 대 한 요구를 광범위 하 게 표시 되었습니다 최적의 vivo에서 보호 하 고 하이라이트 Fc 중재 면역 인플루엔자 바이러스19,20전반적인 면역 응답에의 기여.
보호의 관계가 중요 한 감염에 면역을 평가에 있습니다. 이러한 통계 과학자와 임상 백신의 효능, 데이터의 의미와 치료 과정을 추정 하실 수 있습니다. 인플루엔자 바이러스 감염에 대 한 보호의 유일한 설립된 상관 hemagglutination 저해 분석 결과 이다. 1시 40분의 titer 질병1,21 -위험 50% 감소와 관련 이며 바인딩 사이트는 HA의 구형 머리에 있는 수용 체를 대상으로 교착을 억제 하는 항 체의 존재를 반영 한다. 그러나, 그것은 또한 주목 해야한다 T 세포 응답 노인에서 인플루엔자 바이러스 감염에 대 한 보호의 더 나은 상관 있을 수 있습니다. 흥미롭게도, 최근 보고서 응집 저해 행위 면책 독감22의 더 나은 예언자를 있을 수 있습니다 제안 합니다. 다행히도, 일반적인 체 외에서 분석 실험 같은 중화 또는 응집 저해 분석 하 줄기 또는 응집 특정 항 체를 측정할 수 있습니다. 그러나 대부분 이러한 기존의 시험관에서 분석의,만 항 체의 항 원 바인딩 영역의 기능을 고려 하 고 Fc 영역의 역할을 측정 하지 않습니다. 또한, 비 중화 항 체 Fc 수용 체 참여에서 vivo에서 를 통해 보호 하는의 기여 감지17,18되지 않습니다. Fc 중재 면역 항 체 의존 세포 중재 세포 독성 (ADCC) 등을 유발 하는 항 체에 의해 여유 보호를 측정 하기 위하여 강력한 생체 외에서 시험이 필요 합니다.
아래 설명 하는 방법을 평가 수 murine 단일 클론 항 체의 Fc 중재 기능 활성화는 표현 유전자 변형된 Jurkat 세포 라인 사용 유도 murine 입력 1 FcR, FcγRIV. 항 체는 FcγR의 교전 세포내 신호 트리거 활성화 된 T 세포 중재 luciferase 활동의 핵 요인 transduces. 분석 결과 여러 장점이 격리 및 기본 효과 기 세포의 문화 및 cytometry Fc 중재 effector 기능19,23,24의 활성화를 감지를 사용 하 여 요구 하는 전통적인 기법 ,,2526. 첫째, 여기에 설명 된 프로토콜을 쉽게 통합 하는 다른 바이러스 성 대상, FcγRs, 및 다른 종 (인간과 murine)에서 항 체 적용할 수 있습니다. 둘째, 수정된 Jurkat 세포를 사용 하 여 표현 하는 활성화 된 T 세포 (NFAT)의 핵 요인 아래 luciferase 취재 원 유전자와 FcγR 발광 측정 플레이트 리더를 사용 하 여 쉽게 분석할 수 있는 대형 분석 결과 대 한 수 선. 여기, 기본 효과 기 세포의 전통적인 활성화 Jurkat 세포의 표면에 FcγR의 항 체 참여 시 NFAT luciferase의 유도로 대체 됩니다. 이 96 잘 접시 형식 분석 결과 7 희석-성가신 전통적인 기술을 사용 하 여 될 수 있는 샘플 수와 triplicates에서 최대 4 개의 서로 다른 샘플의 측정에 대 한 수 있습니다. 이 분석 결과 실험의 설계 및 데이터의 해석에 영향을 미칠 수 있습니다 고려해 야 할 추가 포인트가 있다. 바이러스 성 대상 항 체 인식에 세포 표면에 표현 해야 합니다. 이 줄이기 위해 대상 항 원 (예: 내부 바이러스 성 단백질)는 격판덮개의 표면에 직접 코팅 수 수 있습니다. 그러나, 이것은 아직 엄격 하 게 테스트 되지. 또한, 수정 된 Jurkat 세포 선 및 FcγR 활성화의 한 유형을 표현 1 차 셀 라인 표현 생리 적 맥락에서 모든 수용 체 어떤 금지 FcγRs을 표현 하지 않는다.
우리가 이전 polyclonal 컨텍스트에서 epitope 특이성 Fc 중재 effector 기능 조절에 중요 한 역할을 담당 하며 그 항 체-종속 셀 중재 응답의 최적 활성화의 두 가지 포인트를 설명 하기 위해이 분석 결과 사용 27,28문의. 여기, 우리가 참여 하 고 FcγRIV를 활성화 murine 활성화 줄기 특정 단일 클론 항 체의 능력을 평가 하는 방법을 설명 합니다. 예외29,30비록 광범위 하 게 반응 항 체의 많은 수는 조류의 antigenically 보존된 스토킹 지역 대상 고 따라서 범용 인플루엔자의 개발에 중요 한 역 백신입니다.

<table><tbody><tr><td>A549 셀&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>선암성 인간 폐포 기저 상피 세포</td></tr><tr><td>HEK 293T 세포</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>인간 배아 신장 세포</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>11668019</td><td>Transfection 시약</td></tr><tr><td>1X Opti-MEM Reduced Serum Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51985-034</td><td></td></tr><tr><td>백색 조직 배양 처리된 96-웰 플레이트</td><td>Corning, Inc.&nbsp;</td><td>3917</td><td>분석 플레이트</td></tr><tr><td>10X MEM</td><td>Gibco</td><td>11430-030</td><td></td></tr><tr><td>쥐를 발현하는 Jurkat 세포 FcgRIV</td><td>Promega</td><td>M1201</td><td>키트는 세포, Bio-Glo Luciferase 분석 시스템, 1X RPMI 및 저 IgG 혈청</td></tr><tr><td>Jurkat 세포를 제공합니다. 인간 FcgRIIIa</td><td>Promega</td><td>G7010</td><td>키트는 세포, Bio-Glo Luciferase 분석 시스템, 1X RPMI 및 저 IgG 혈청</td></tr><tr><td>을 제공합니다.인간 FcgRIIa</td><td>Promega</td><td>G9901</td> 키트를 발현하는 Jurkat 세포<td>에는 세포, Bio-Glo Luciferase 분석 시스템, 1X RPMI 및 저 IgG 혈</td></tr>청 <tr><td>광도계</td>가 포함됩니다. <td>BioTek</td><td>Synergy H1 다중 모드 리더</td><td>발광 플레이트 리더</td></tr><tr><td>Bio-Glo Luciferase 분석 시스템</td><td>Promega</td><td>G7940</td><td>luciferase 분석 버퍼와 luciferase 분석 기질</td></tr><tr><td>Madin Darby 송곳니 세포</td>가 포함되어 있습니다<td>.ATCC</td><td>CCL-34</td><td>개 신장 세포</td></tr></tbody></table>

독감 조류 특정 항 체에 의해 유도 된 fc 중재 effector 기능을 평가 하는 방법

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

항 체 항 원 바인딩 도메인 Fc 영역을 통해 바이러스 성 병원 체에 대 한 타고 난 및 적응형 면역 응답 커플링에 중요 한 역할을 한다. 여기, 우리가 활성화를 측정 하는 방법에 설명 Fc의 단일 클론 항 체는 활성화 표현 유전자 조작된 Jurkat 세포 라인의 사용으로 인플루엔자 바이러스 조류를 대상으로 하 여 이펙터 기능 입력 1 Fc-FcγR. 전송 시각:이 메서드를 사용 합니다 특정 Fc-FcγR 상호 작용 면역 글로불린에 의해 수 여의 생체 외에서 분석 결과 사용 하 여 확인할 수 있습니다.

우리는 시연 스토킹 전용 mAb, 6F12, 하지만 하지 머리 전용 머리 전용 mAb, PY102, upregulating CD107a 및 인터페론 γ19에 의해 기본 자연 킬러 세포를 활성화할 수 있었습니다. 모델링 기본 인간 NK 세포를 활성화 하는 스토킹 특정 항 체의 능력, 우리 스토킹 관련 mAb, 6F12, 튼튼하게 의해 murine FcγRIV 표현 수정된 Jurkat 세포를 활성화할 수 있습니다 보여 ~ 14-fold. 다른 한편으로, 머리 전용 mAb, PY102 및 제어 IgG (그림 2)28하지 않습니다.
X31 (reassortant 인플루엔자 바이러스는 조류와 응집의 A/Hong 홍콩/1/68 (H3N2)와 MDCK 세포 감염 우리 조사 감염 (MOI)의 다양성 murine FcγRIV 표현 Jurkat 세포의 유도 영...

항 체에 의해 그 대상 인플루엔자 바이러스 조류 Fc 중재 effector 기능 활성화를 측정 하는 방법을 설명 합니다. 이 분석 결과 또한 Fc 중재 면역 유도의 단일 클론 항 체 또는 polyclonal 세라 다른 바이러스 표면 glycoproteins를 대상으로 능력을 평가 하기 위해 적응 수 있습니다.

독감 조류 특정 항 체에 의해 유도 된 Fc 중재 Effector 기능을 평가 하는 방법

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...

본 프로토콜의 전반적인 목적은 항체 또는 혈청 샘플이 Fc 매개 작동기 기능을 활성화하는 능력을 평가하는 것입니다. 이 방법은 항체 의존적 Fc 매개 면역의 활성화를 측정함으로써 면역학 및 백신학 분야의 핵심적인 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 재료 준비부터 데이터 분석까지 전체 실험을 24시간 이내에 완료할 수 있다는 점입니다.이 절차는 Peter Palese 실험실의 대학원생 Mark Bailey가 시연하겠습니다. transfection을 통해 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(hemagglutinin) 발현을 유도하려면, 먼저 흰색 조직 배양 처리된 96-well plate에 인간 배아 신장 293 세포를 well당 2×10⁴ cells 농도로 분주합니다. 37 °C, 5% CO2 조건에서 4시간 배양한 후, 1X optimum-reduced serum medium 총 50 µL 부피 내에 바이러스 헤마글루티닌을 코딩하는 DNA 100 ng과 transfection 시약 0.2 µL를 well당 첨가하여 세포를 transfection합니다.각 웰에 DNA 리포좀 복합체를 첨가하여 형질전환을 유도하고, 플레이트를 인큐베이터로 옮겨 18시간 동안 더 배양합니다. 감염을 통해 인플루엔자 바이러스 hemagglutinin 발현을 유도하려면, A549 세포를 웰당 2×10⁴ cells 농도로 조직 배양 처리된 흰색 96-well 플레이트에 분주하고, 37°C, 5% CO2 조건에서 최소 18시간 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 인플루엔자 바이러스를 웰당 100 µL의 1X MEM 배지 내에서 감염 다중도(multiplicity of infection) 3이 되도록 희석하고, 세포 배양 인큐베이터에서 A459 세포를 1시간 동안 감염시킵니다.배양 종료 후, 접종물을 바이러스가 없는 신선한 1X MEM 배지 100 µL로 교체하고 세포를 인큐베이터에 넣어 18~24시간 동안 더 배양합니다. 특정 표적 항체의 헤마글루티닌 발현 세포 표적 능력을 평가하기 위해, 바이러스에 감염된 세포 배양물의 상층액을 25 µL의 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC) 분석 배지로 교체합니다. 다음으로, 별도의 96-웰 플레이트에서 모식도에 따라 10 µg/mL부터 시작하여 표적 항체를 신선한 ADCC 배지로 3회 반복하여 4단계 연속 희석하며, 이때 배경 대조군과 항체 미처리 대조군을 반드시 포함하십시오.모든 항체의 희석이 완료되면, 희석된 항체 25 µL를 실험 세포 플레이트의 해당 웰에 각각 옮긴 후 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다. 15분 후, 적절한 Fc 수용체를 발현하는 변형 이펙터 Jurkat 세포 7.5 × 10⁴개를 25 µL의 ADCC 배지에 현탁하여 웰당 추가함으로써, 웰당 ADCC 배지의 최종 부피가 75 µL가 되도록 합니다. 플레이트를 다시 세포 배양 인큐베이터로 옮겨 6시간 동안 배양하며, 배양 마지막 1시간 동안 루시페레이스 기질 버퍼를 37 °C 항온수조에서 해동합니다.완충액이 준비되면, 배경 대조군 웰을 제외한 모든 웰에 75 µL의 루시페라아제 기질 완충액을 첨가하고 루미노미터로 플레이트를 측정합니다. 이후 형질전환 또는 감염된 세포 배양물에서 항체 의존성 세포 매개 세포독성의 유도 배수를 계산할 수 있습니다. 본 실험에서, 스톡 특이적 단클론 항체는 머리 특이적 단클론 항체 및 대조군 IgG 항체와 비교하여 마우스 Fc gamma receptor four를 발현하는 Jurkat 세포를 약 14배 강력하게 활성화하고 변형시켰습니다.이 영상을 시청하고 나면, 관심 있는 특정 항체가 Fc 매개 면역을 활성화하는 능력을 평가하기 위한 실험 설정 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

간단한 슬롯 얼룩 방법은 생물 정보학 분석을 통해 확인된 그들의 가장 보존 시퀀스를 대상으로 보편적인 항체를 사용하여 인플루엔자 바이러스 적혈구응집소과 neuraminidase의 부량 위해 개발되었습니다. 이 혁신적인 접근 방식은 모든 바이러스 적혈구응집소과 neuraminidase의 양적 결정에 유용한 대안을 제공할 수 있습니다.

모든 독감의 양적 분석 간단한 슬롯 얼룩 Assays에서 유니버설 항체를 사용하는 바이러스성 Hemagglutinins 및 Neuraminidases를 입력하십시오

이 방법은 높은 감도에 감염된 생쥐들의 bronchioalveolar 세척 (BAL) 유체에서 H1N1의 탐지를위한 적외선 염료 기반 이미징 시스템의 사용을 설명합니다. 이 방법론은 96에서 수행할 수 있습니다 - 또는 판 384 자, 시험 물질 &lt;10 μl 볼륨이 필요하고 여러 병원체의 동시 상영을위한 잠재력을 가지고 있습니다.

인플루엔자 바이러스에 대한 높은 처리량 검출 방법

이 비디오는 특정 항원에 대한 혈청 항체를 검출하기 위한 혈응집 억제 분석을 보여줍니다. 테스트 웰에서의 적혈구 응집 억제 및 대조군 웰에서의 적혈구 응집의 확인은 뚜렷한 시각적 패턴을 통해 달성됩니다. 이 분석은 면역 반응, 백신 효과를 평가하고 바이러스학 및 면역학에서 바이러스 감염을 연구하는 데 중요한 역할을 합니다.

표적 항원에 대한 혈청 항체를 검출하기 위한 Hemagglutination Inhibition Assay

이 비디오는 T 세포 효과기 기능의 항체 매개 활성화를 측정하는 분석을 보여줍니다. HA를 발현하는 형질주입된 포유류 세포에 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 특이적 단일클론 항체를 추가하면 HA와 함께 면역 복합체가 형성됩니다. Fc 수용체를 발현하는 조작된 T 세포와 루시페라제 리포터를 도입하면 T 세포는 항체-HA 복합체에 의해 활성화되며, 이러한 활성화는 루시페라제 기질을 추가하고 생성된 생물 발광을 측정하여 검출됩니다.

HA 항체에 의한 Fc 매개 효과기 기능의 활성화 측정

이 동영상은 혈청 샘플에서 인플루엔자 뉴라미니다아제(NA) 억제 항체 역가를 측정하는 분석을 보여줍니다. NA에 대한 항체를 포함하는 혈청 샘플을 페투인(fetuin)으로 코팅된 마이크로웰 플레이트에 첨가합니다. 바이러스를 추가하면 항체가 바이러스 NA가 fetuin을 쪼개고 갈락토오스 부분을 노출시키는 것을 방지합니다. 그런 다음 과산화효소(peroxidase-conjugated lectin)가 첨가되어 노출된 갈락토스에 결합합니다. NA 억제 항체 역가는 비색 테스트를 사용하여 측정되며, 여기서 과산화효소 기질은 고정된 렉틴 접합 과산화효소에 의해 절단되어 색상을 생성합니다.

인플루엔자 뉴라미니다아제 억제 항체 역가를 측정하기 위한 분석

인쇄된 글라이칸 마이크로어레이 전략을 사용하여 인플루엔자 A 바이러스 헤마글루티닌 열성 및 시알산 함유 수용체에 대한 특이성을 분석하기 위해 기존의 96웰 플레이트 분석을 소형화했습니다.

인플루엔자 바이러스 Hemagglutinins의 결합력 및 특이도를 평가하기위한 소형화 글리 칸 마이크로 어레이 분석

혈청에서 인플루엔자 뉴라미니다아제(NA) 억제 항체 역가를 측정하기 위한 효소 결합 렉틴 분석법(ELLA)을 설명합니다. 이 분석은 땅콩 응집소를 사용하여 NA가 fetuin으로 코팅된 96웰 플레이트에서 시알산을 제거할 때 접근할 수 있는 갈락토오스 잔류물을 정량화합니다.

효소 결합 렉틴 분석에 의해 인플루엔자 뉴 라미니다 아제 억제 항체가를 측정

제시 프로토콜 인플루엔자 백신 받는 사람 혈 청 샘플에서 인플루엔자-특정 항 체 titers 척도를 hemagglutination 억제 시험을 수행 하는 방법을 설명 합니다. 첫 번째 분석 결과 hemagglutination에 의해 최적의 바이러스 성 항 원 농도를 결정합니다. 두 번째 분석 결과 hemagglutination 저해 하 여 인플루엔자-특정 항 체 titers 단정.

인플루엔자-특정 항 체 Titers 계량에 최적화 된 Hemagglutination 억제 (HI) 분석 결과

인플루엔자 A 바이러스 (IAVs)는 중요 한 인간의 호흡기 병원 균. IAVs pathogenicity 이해 하 고 새로운 백신 접근의 전 임상 시험 수행 인간의 생리를 흉내 낸 동물 모델은 필요. 여기, 우리가 IAV pathogenesis, 체액 성 반응과 감염 마우스 모델을 사용 하 여 백신 효능을 평가 하는 기법을 설명 합니다.

감염 마우스 모델에서 인플루엔자 A 바이러스 연구

우리는 다른 바이러스 긴장에서 250개 이상의 항원에 대하여 다중 항체 이소타입을 위한 혈청을 동시에 조사하기 위하여 니트로셀룰로오스 코팅된 슬라이드에 인플루엔자 항원을 인쇄해서 건설된 단백질 마이크로어레이를 이용하기 위한 프로토콜을 제시합니다, 이렇게 바이러스 특수형에 걸쳐 혈청 항체의 폭의 측정을 허용.

바이러스 특수형에 걸쳐 혈청 항체의 폭을 측정하기 위해 인플루엔자 항원 마이크로어레이의 사용

이 논문은 인플루엔자 바이러스 감염의 마우스 모형에 있는 Tfh 및 GC B 반응을 평가하는 프로토콜을 기술합니다.

인플루엔자 A 바이러스 감염 중 T 여포 도우미 세포 및 발아 센터 반응 평가

학습하세요 독감 바이러스 hemagglutinin을 표적하는 항체가 Fc 중재 effector 기능을 활성화하는 능력을 평가하는 방법을. 24시간 내에 완료 가능한 이 실험은 면역학 및 백신학 연구에 효율적인 도구를 제공합니다.

독감 조류 특정 항 체에 의해 유도 된 Fc 중재 Effector 기능을 평가 하는 방법

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