독감 조류 특정 항 체에 의해 유도 된 Fc 중재 Effector 기능을 평가 하는 방법

이 프로토콜의 전반적인 목표는 Fc 매개 효과기 기능을 활성화하는 항체 또는 혈청 샘플의 능력을 평가하는 것입니다. 이 방법은 항체 의존성 Fc 매개 면역의 활성화를 측정하여 면역학 및 백신학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 재료 준비에서 데이터 분석까지 24시간 이내에 실험을 수행할 수 있다는 것입니다.

이 절차를 시연하는 사람은 Peter Palese 연구실의 대학원생인 Mark Bailey입니다. 형질주입을 통해 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 발현을 유도하기 위해, 첫 번째 플레이트는 인간 배아 신장 293 세포를 2배 10 내지 네 번째 세포를 백색 조직 배양액에서 4번째 농도로 처리한 96-웰 플레이트를 처리하였다. 섭씨 37도 및 5%CO2에서 4시간 후, 바이러스 헤마글루티닌을 위한 DNA 코딩 100나노그램과 웰당 0.2마이크로리터의 트랜스펙션 시약, 총 부피 50마이크로리터의 1X 최적 감소 혈청 배지로 세포를 형질 주입합니다.

각 웰에 DNA 리포좀 복합체를 추가하여 transfection하고 플레이트를 18시간 동안 인큐베이터로 되돌립니다. 감염을 통한 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 발현을 유도하기 위해, 백색 조직 배양액에서 웰당 2배의 10 - 4번째 세포 농도로 A549 세포를 플레이트화하고, 96웰 플레이트를 처리하여 섭씨 37도 및 5%CO2에서 최소 18시간 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 인플루엔자 바이러스를 웰당 100마이크로리터의 1X MEM 배지 중 3개의 다중성 감염으로 희석하고 세포 배양 인큐베이터에서 1시간 동안 A459 세포를 감염시킵니다.

배양이 끝나면 바이러스가 없는 100마이크로리터의 새로운 1X MEM 배지로 접종물을 교체하고 세포를 18-24시간 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다. 헤마글루티닌 발현 세포를 표적으로 하는 특정 항체의 능력을 평가하기 위해 바이러스에 영향을 받은 세포 배양액의 상등액을 25마이크로리터의 항체 의존성 세포 매개 세포 독성 또는 ADCC 분석 배지로 교체합니다. 다음으로, 별도의 96-웰 플레이트에서 회로도에 따라 밀리리터당 10마이크로그램에서 시작하여 새로운 ADCC 배지에서 관심 항체를 3회 완전히 희석하고 배경 및 항체 대조군을 포함하지 않도록 주의합니다.

항체가 모두 희석되면 희석된 항체 25마이크로리터를 실험용 세포 플레이트의 적절한 해당 웰로 옮기고 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다. 15분 후, 25마이크로리터의 ADCC 배지에서 웰당 적절한 Fc 수용체를 발현하는 4번째 변형 효과기 Jurkat 세포에 7.5배의 10을 첨가하여 웰당 75마이크로리터의 ADCC 배지의 최종 부피를 얻습니다. 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 6시간 동안 다시 넣고 인큐베이션의 마지막 시간 동안 섭씨 37도의 수조에서 루시페라제 기질 완충액을 해동합니다.

완충액이 준비되면 배경 제어 웰을 제외한 모든 웰에 75마이크로리터의 루시페라제 기질 완충액을 추가하고 광도계에서 플레이트를 읽습니다. 그런 다음 transfection되거나 감염된 세포 배양에서 항체 의존성 세포 매개 세포 독성의 fold 유도를 계산할 수 있습니다. 이 실험에서 주식 특이적 단클론 항체는 쥐 Fc 감마 수용체 4를 발현하는 Jurkat 세포를 머리 특이적 단클론 및 대조군 IgG 항체에 비해 약 14배 강력하게 활성화하고 변형시켰습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 Fc 매개 면역을 활성화하기 위한 특정 관심 항체의 능력을 평가하기 위한 실험을 설정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.