Name: 체 외에 대사 시 토 크롬 P450s에 의해 니트로의 Nitrosamide 형성을 탐지 하기 위한 일반적인 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: 학습하세요 사이토크롬 P450에 의한 니트로사민의 니트로사마이드 산화 대사 경로를 평가하는 민감한 질량 분석법을 통해. 이 방법은 발암 기전 연구에 활용됩니다.

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이 연구 보조금에 의해 지원 되었다 아니. 캘리포니아-81301 국립 암 연구소에서. 우리 편집 지원에 대 한 칼 슨 밥, 박사 피터 Villalta 프리메이슨 암 센터의 분석 생화학 공유 리소스에서 질량 분석에 쉰 밍 박사 아담 T. Zarth 그리고 그들의 귀중 한 토론에 대 한 박사 안 나 공화국 미셸 감사 합니다. 그리고 입력. 분석 생화학 공유 리소스는 부분적으로 지원 하 여 국립 암 연구소 암 센터 지원 그랜트 CA-77598

1. 자료 및 일반 절차 <ol><li>종합 NNN 앞 15에서 설명한. Norcotinine, P450 2A6 Baculosomes, NADPH 재생 시스템, 0.5 x 반응 버퍼, 및 다른 모든 화학 시 약 급료에 상용 소스 로부터 용 매 또는.</li>
	<li>500 MHz 분석기에 기록 NMR 스펙트럼. 보고서 화학 당 부품으로 교대 백만 (ppm). 잔류 용 매 피크를 사용 하 여 내부 참조 1 H NMR (7.26 ppm CDCl 3)와 13 C NMR (77.2 ppm CDCl 3). 
	참고: 피크 분할은 다음과 같은 약어를 사용 하 고 있다: s 내의 d = 더블 릿, dd = = 남자, dt의 남자 용 상의 삼중 항, dq의 더블 릿 = 사중주, ddd의 더블 릿 = = 남자, 그리고 m의 남자 용 상의의 더블 릿 multiplet =.</li>
	<li>LTQ Orbitrap Velos와 m/z로 보고서 데이터에 선택 된 화합물에 대 한 고 분해능 질량 분석 (HRMS) 수행.</li>
	<li>사용 polygram 미리 254 nm 형광 표시기 얇은 층 크로마토그래피 (TLC)와 실리 카 젤 TLC 판 (40 m m x 80 m m, 두께 0.2 m m) 코팅. UV 램프 조사 하 여 TLC 번호판을 시각화.</li>
	<li>1.5 cm x 15 cm 유리 열을 사용 하 여 Å, 70-150 메쉬 실리 카 젤 60에 플래시 크로마토그래피를 수행.</li>
</ol> 2. Nitrosamide 긍정적인 통제의 준비 (N &#8242;-nitrosonorcotinine, NNC) <ol><li>건조, 하룻밤 오븐에서 (16 h, ~ 140 ° C), 25 mL, 둥근 바닥 플라스 크 자기 볶음 bar가 포함 된. 아침에 차가운 흐름의 N 2 N 2 흐름을 유지 하는 석유 bubbler를 사용 하는 동안 플라스 크 속도 초당 1 개 거품. 
	참고: 냉각 후, 아무 주의 N 2 플라스 크를 유지 하는 필요.</li>
	<li>연기 후드, norcotinine (31.8 mg, 0.196 mmol), 아세트산 무수 물 (5 mL), 및 초 산 (1 mL)을 추가 냉각된 플라스 크. 지속적으로 물이 얼음 욕조와 0 ° C에 냉각 하는 동안이 혼합물을 저 어. 
	주의: 아세트산 무수 물과 아세트산은 부식성.</li>
	<li>추가 나노 2 (33.3 mg, 0.483 mmol) 한 부분을 지속적으로 2.5 h. TLC에 의해 모니터 반응 진행에 대 한 혼합물을 저 어 (100 %EtOAc, R f = 0.19, 단계 1.4 참조). 
	참고:이 시간이 지남에 혼합 될 것입니다 점점 노란색 가끔 버블링.</li>
	<li>(18 mL) 얼음 처럼 차가운 H 2 O로 혼합물을 붓는 의해 반응을 끄다. 바로 채널 2 Cl 2 100 mL separatory 깔때기에 18 mL와 용액을 추출 합니다. 추출 물의 레이어 채널 2 Cl 2 (각 9 mL)와 적어도 2 추가 시간.</li>
	<li>풀링된 생명체 2 분 필터 MgSO 4 이상 ~ 100 mg을 건조 하 고 원유, 노랑, 석유를 회전 증발에 의해 솔루션을 집중. 증발 잔류 초 산을 제거 하는 동안 30 ° C에 물 목욕 열. 
	참고: 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다 여기 화합물 채널 2 Cl 2와 2-8 ° c.에 어둠 속에 저장 하는 솔루션에 용 해 하는 경우</li>
	<li>칼럼 크로마토그래피에 의해 원유 화합물 정화 (단계 1.5 참조) 실리 카 젤을 사용 하 여 고정 위상 및 100%로 EtOAc eluent 16. 
	주의: NNC와 관련된 nitrosamides 처리 주의 그들은 인간의 발암 물질로 간주 됩니다.</li>
	<li>CDCl 3 순수 화합물을 녹이 고 NMR을 사용 하 여 (단계 1.2 참조) 구조를 확인 하 고이 솔루션 17의 몰 확인 하. 2-8 ° C까지 필요에 어둠 속에서이 솔루션을 저장. 
	참고:이 솔루션 (3.5 단계)의 체 외에 분석 결과에 긍정적인 컨트롤로 사용 됩니다. NMR 스펙트럼 및 화학 교대 지원 정보에서 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>순수한 NNC 솔루션으로는 정확한 확인 질량 부모 고 1.3 및 4.3 단계에서 설명 하는 매개 변수에서 고해상도 질량 분 서 계 (HRMS)에 직접 주입 하 여 제품 이온 대중의 결정. 
	참고: 제품 질량 체 외에 대사 분석 결과 (4.3 단계)에서 화합물 검출을 위해 사용 됩니다.</li>
</ol> 3. 예제 nitrosamine P450 생체 외에서 부 화 <ol><li>-80 ° C 냉동 고에서 P450 2A6 Baculosomes, 생생한 NADPH 재생 시스템, 그리고 10 mM NADP + 재고 솔루션을 제거 하 고 얼음에 녹여 그들. 일단 해 동, 희석 Baculosomes 및 NADPH 재생 시스템 1: 10과 1:50, 0.5 X 반응 버퍼 단일 1 mL 튜브에 각각. 마찬가지로, 추가 반응 버퍼 X + 재고 솔루션 0.5 97 μ를 NADP의 3 μ. 
	참고: NADP +은 빛에 민감한입니다. 이 솔루션의 컨테이너 알루미늄 호 일에 감싸서 보호 유지. 효소 솔루션은 민감한 freeze-thaw 주기; 이 2 개 이상의 주기를 제한 합니다. Aliquots 미래 실험을 위한 필요에 따라 준비.</li>
	<li>각 보육에 대 한 추가 50 μ 효소 솔루션 (5 pmol P450 포함) 1 mL의 튜브 반응 버퍼와 4 μ M NNN 솔루션의 포함 40 μ. 미리 물을 욕조를 사용 하 여 37 ° C에서 2 분에 대 한이 새로운 혼합물을 품 어 고 희석된 NADP + 솔루션의 10 μ를 추가 합니다. 37에 1-30 분에 대 한 전체 시스템을 품 어 ° c. 
	참고: 보육 시간 5 분 간격을 사용 하 여 (예: 5, 10, 15 분, 등) 충분 한 nitrosamide 형성 시간 코스를 제공 합니다.</li>
	<li>원하는 보육 시간 후 3.0 N ZnSO 4의 첫 번째 추가 10 μ와 3.0 N Ba(OH)의 다음 10 μ 끄다 2. 소용돌이이 솔루션 및 백색 침전 물은 형성할 것 이다. 원심 침전 작은 4 분 8000 x g에서 샘플. 
	참고: 절차 해야 하지 일시 중지이 단계에서 수성 해결책에 있는 안정성을 제한 하는 구성 된 nitrosamides로 합니다. 허위 제외 어 긴 일시 중지 될 수 있습니다.</li>
	<li>즉시는 상쾌한 플라스틱 및 액체 크로마토그래피 긍정적인 nanoelectrospray-이온화 고해상도 탠덤 질량 분석에 의해 2 μ를 분석 (LC-NSI +-HRMS/MS, 4.1 4.3 단계).</li>
	<li>긍정적인 제어 외피에 대 한 흐름의 N 2 1 mL 튜브에 합성된 NNC 솔루션의 100 fmol을 포함 하는 약 수를 증발. 이 유리병에 3.2 단계에서 전체 효소 시스템을 추가 하 고 3.3-3.4 단계에 설명 된 대로 진행.</li>
	<li>부정적인 제어 외피 수행 실험 설명된 (3.2-3.4 단계)로 바꾸기는 50 μ 효소 반응 버퍼 X 0.5 솔루션 제외.</li>
</ol> 4. LC-NSI +에 의해 nitrosamide 탐지에 대 한 매개 변수 예제-HRMS/MS <ol><li>LC에 대 한 구성 요소를 사용 하는 상업, 손 포장 18 C18 UPLC 시스템 단계 4.2에서에서 다음과 같은 여러 단계로 그라데이션 적용 (5 μ m), 100 m m x 75 μ m, 15 μ m 구멍 모 세관 칼럼.</li>
	<li>용 매와 용 매 b MeCN로 사용 하 여 5 mM NH 4 OAc 1 μ/분 5 %B 실행 하 여 열에 샘플을 로드 0-5 분, 그리고 다음 이후에 0.3 μ/분 유량을 둔화. 다음, 실행 그라디언트 5에서 20% 이상 4 분, 55% B 10 분 이상 램프 및 다음 5%를 다시 평형 b.</li>
	<li>수행 LC NSI +-LTQ Orbitrap에 HRMS/MS. 전체 검사와 MS 2 조각화 NNC 위한 모니터. 60, 000의 해상도에서 전체 검사를 수행 하 고 5 ppm의 대량 허용에 정확한 부모 질량 (192.07670)를 추출 합니다. 격리 하 부모 이온 (2.0 amu) 및 조각 충돌 유도 된 분리 (CID) 충돌 에너지 25 eV, 15000의 해상도의 여 고 30 양의 시간을 스캔 사용 MS 2 조각화 추출 NNC (m/z의 제품 이온에 대 한 정확한 질량 192 m/z 134.04739와 162.07874) 5 ppm의 대량 허용 오차에서.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

니트로의 신진 대사를 elucidating 그들의 성에 이해 하는 중요 한 구성 요소입니다. 이기 때문에 관련 된 시 토 크롬 P450s와 다른 대사 효소 다형, 더욱이 지식을 응용 프로그램 식별할 수 있는 잠재적으로 위험이 높은 개인1,4. 새로운 데이터의 α-hydroxynitrosamines, DNA 바인딩에 관련 된 니트로의 추정된 주요 대사 산물을 더 산화, nitrosamides 하는 것은 가능 합니다; 그러나, 이것은 엄격 하 게 테스트 되지 기판의 넓은 범위에 걸쳐. 우리는 nitrosamides 체 외에 니트로의 processive 산화의 정도 결정 하기 위한 프로토콜을 설명 했습니다. 이 방법의 다양 한 응용 물질 대사의이 루트의 전반적인 중요성을 결정 하는 데 도움이 됩니다.
메서드는 표준 관심의 nitrosamide에 대 한 준비 하 여 ...

N-니트로 사 민 다이어트, 담배 제품 및 일반 환경;에 있는 발암 물질의 큰 클래스는 1인체에서를 endogenously 형성 수 있습니다 또한. 이상의 300 N-nitroso 화합물 테스트 및 &gt; 90%에서 발암 성 평가 했다 동물 모델2,3. 그들의 성에 전시, 먼저이 화합물 시 토 크롬 P450s1,,23에 의해 작동 한다. 연구는 시 토 크롬 P450s 쉽게 산화 α-hydroxynitrosamines (그림 1)는 ~ 5의 반감기와 반응성이 매우 높은 화합물에 니트로 자발적으로 alkyldiazohydroxides를 분해 하기 전에 s. 후자는 H2O N2의 손실 후에 DNA을 알 수 있습니다. 결과 DNA adducts unrepaired, 암 개발1이어질 중요 onco-또는 종양 억제기 유전자는 돌연변이 일으킬 수 있습니다. 이러한 이유로, 많은 노력 변화 통로의 완전 한 이해를 얻으려고 소비 되어, DNA adducts, 그리고 발암 성 니트로의 시 토 크롬 P450 산화의 다운스트림 대사 산물. 이 지식에 개별 암 위험 평가4잠재적인 응용 프로그램 합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56312/56312fig1.jpg"> 
그림 1: 일반 및 니트로의 제안 된 대사. (1) 니트로 P450s α-hydroxynitrosamines (2) 자발적으로 alkyldiazohydroxides (3)을 분해 하는에 산화 됩니다. 이러한 화합물 형태로 DNA adducts DNA에 바인딩할 수 있습니다. 그것을 가정 했다 그 2 는 nitrosamides 4P450s에 의해 더 산화 된다. 이러한 형태로 소설 DNA adducts 또는 3 알려진된 DNA adducts 형태로 분해 DNA에 직접 바인딩할 수 있습니다. R1 과 R2 알 킬 그룹을 나타냅니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56312/56312fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
Α-hydroxynitrosamine 가설을 단단하게 광범위 한 데이터에 의해 지원 됩니다, 하지만 몇 가지 불일치;는 주요 것은 α-hydroxynitrosamines5,6의 짧은 반감기 이다. 이러한 화합물 바인딩과 그물 막에 생산 고 나중 핵 DNA를 알 알려져 있다. 몇 초 그들의 일생을 감안할 때, 그것은 어떻게 이러한 중간체 살아남을 필요한 여행 하지만 cytosol 수수께끼 이다. 하나의 가설은 이다 α-hydroxynitrosamines의 부분 산화 processively는 nitrosamides7,8, 비교9에서 매우 안정적입니다. 이것은 아마도 시 토 크롬 P450 활성 사이트에서 α-hydroxynitrosamines의 보존을 통해 발생 합니다. 산화의이 유형에 대 한 전례가 니코틴10, 알콜11, 그리고 간단한 alkylnitrosamines12,13보아 왔다. 또한, nitrosamides는 직접 연기 발암 물질2,3. 9그들의 반응 따라, 이러한 화합물 생산 DNA adducts 함께 새로운 α-hydroxynitrosamines에서 인 동일 하, 미개척된 DNA adducts (그림 1) 추정 된다. 따라서,이 가설 뿐만 아니라 설명 한다 cytosol, 통해 전송 하지만 또한 DNA의 형성 제품 손상.
이 문서에는 생체 외에서 시 토 크롬 P450 중재 변환 니트로의 nitrosamides 평가 하기 위한 일반 프로토콜을 설명 합니다. N ′-nitrosonorcotinine (NNC) 시 토 크롬 P450 2A6에 의해 n ′-nitrosonornicotine (NNN)의 이전에 보고 된 변환 예제14로 전시 됩니다. 다양 한 기질-효소 시스템에이 프로토콜의 응용 프로그램 전반적인 nitrosamine 대사 nitrosamides의 중요성을 결정 하는 데 도움이 됩니다.

<table><tbody><tr><td>Norcotinine</td><td>AKoS GmbH (Steinen, Germany)</td><td>CAS 17708-87-1, AKoS AK0S006278969</td><td></td></tr><tr><td>아세트산</td><td>시그마-알드리치</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>아세트산 무수물</td><td>시그마-알드리치</td><td>242845</td><td></td></tr><tr><td>암모늄 아세테이</td><td>트 시그마-알드리치</td><td>431311</td><td></td></tr><tr><td>수산화바륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>433373</td><td></td></tr><tr><td>D-클로로포름</td><td>시그마-알드리치</td><td>151823</td><td></td></tr><tr><td>HPLC 아세토니트릴</td><td>시그마-알드리치</td><td>34998</td><td></td></tr><tr><td>마그네슘 황산염</td><td>시그마-알드리치</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>메틸렌 클로라이드</td><td>시그마-알드리치</td><td>34856</td><td></td></tr><tr><td>아질산나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>237213</td><td></td></tr><tr><td>ViVid CYP2A6 블루 스크리닝 키트</td><td>라이프 테크놀로지</td>스<td>PV6140</td><td></td></tr><tr><td>황산아연</td><td>, 시그마-알드리치</td><td>221376</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mL 튜브</td><td>, Fisher</td><td>AB0533</td><td></td></tr><tr><td>100 mL 원형 플라스크</td><td>, 시그마-알드리치</td><td>Z510424</td><td></td></tr><tr><td>125 mL 삼각 플라스크</td><td>, 시그마-알드리치</td><td>CLS4980125</td><td></td></tr><tr><td>125 mL 분리 깔때기</td>, <td>시그마-알드리치</td><td>Z261017</td><td></td></tr><tr><td>25 mL 원형 하단 플라스크</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z278262</td><td></td></tr><tr><td>500 MHz NMR 분광계</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-22R 원심분리기</td><td>Beckman-Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LC 바이알</td><td>ChromTech</td><td>CTC&ndash; 0957&ndash; BOND</td><td></td></tr><tr><td>LTQ Orbitrap Velos</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마그네틱 교반 바</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z127035</td><td></td></tr><tr><td>NMR 튜브</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z274682</td><td></td></tr><tr><td>P1000, P200 및 P10 피펫</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>회전 증발기</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z691410</td><td></td></tr><tr><td>RSLCnano UPLC 시스템</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>쉐이킹 수조</td><td>피셔</td><td>FSSWB15</td><td></td></tr><tr><td>교반 플레이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS6795420</td><td></td></tr><tr><td>PicoFrit 컬럼</td><td>새로운 대물</td><td>렌즈 PF3607515N5</td><td></td></tr><tr><td>Luna C18, 5 um</td><td>Phenomenex</td><td>535913-1</td><td></td></tr></tbody></table>

체 외에 대사 시 토 크롬 p450s에 의해 니트로의 nitrosamide 형성을 탐지 하기 위한 일반적인 방법

A General Method for Detecting Nitrosamide Formation in the In Vitro Metabolism of Nitrosamines by Cytochrome P450s

N-니트로 시 토 크롬 P450 산화 전시 활동을 요구 하는 환경 발암 물질의 기초가 튼튼한 그룹. 대사 활성화의 허용된 메커니즘 저절로 DNA alkylating 에이전트를 분해 하는 α-hydroxynitrosamines의 대형을 포함 한다. DNA 손상의 결과 돌연변이 축적 궁극적으로 암으로 이어질 수 있습니다. 새로운 증거는 α-hydroxynitrosamines 수 수 추가 산화 nitrosamides에 processively 시 토 크롬 P450s에 의해 나타냅니다. Nitrosamides α-hydroxynitrosamines 보다 일반적으로 더 안정 하 고 또한 DNA를 알 수 있습니다, 때문에 nitrosamides 발암에 역할을 재생할 수 있습니다. 이 보고서에서 우리는 니트로의 생체 외에서 시 토 크롬 P450 촉매 물질 대사에서 nitrosamide 생산을 평가 하기 위한 일반 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜 관련 nitrosamides 및 생체 외에서 시 토 크롬 P450 물질 대사 분석 결과 검색에 대 한 액체 착 색 인쇄기-nanospray 이온화 높은 해상도 탠덤 질량 분석을 사용 하 여 합성 하는 일반적인 접근 방식을 활용 합니다. 이 방법은 n ′-예제 연구에서 nitrosonornicotine의 작은 대사 산물으로 n ′-nitrosonorcotinine를 감지. 메서드는 높은 감도 및 선택적으로 인해 정확한 대량 검출. 다양 한 nitrosamine-시 토 크롬 P450 시스템에이 방법의 응용이이 변환의 일반 성을 결정 하는 데 도움이 됩니다. 시 토 크롬 P450s 다형성을 활동에서 변화 하기 때문에 개별 암 위험 평가에 도움이 수 nitrosamide 대형의 더 나은 이해.

백인 외의 작업을 기반으로 합니다. 19, norcotinine 되었고 NNC에 니트로 소화 깔끔하게 높은 수율 (80-92%)에서 생체 외에서 실험에 대 한 표준 생산 하. 성공적인 반응에 대 한 구조적 증거 1H NMR, 13C NMR, 아늑한, 그리고 부모 질량 [M + H] 확인 HRMS 함께 HSQC (지원 정보)를 포함 하 여 분 광 분석에서 얻은+ 의 5 ppm 이내는 이론적인 값 (그림 2)입니다. MS2 조각화 NNC의 가장 풍부한 제품 이온 질량을 결정 하기 위해 사용 되었다. 대 중에서 체 외 분석 결과의 LC-NSI+-HRMS/MS 방법에서 사용 되었다 결정된 정확한 부모 질량과 제품 이온. 2-8 ° C에서 ...

시 토 크롬 P450s에 의해 발암 성 니트로의 α-hydroxylation는 돌연변이 일으키는 원인이 되는 DNA 손상 중간체 생산 허용된 신진 대사 통로. 그러나, 새 데이터 나타냅니다 nitrosamides 산화 추가 발생할 수 있습니다. 우리는 일반 설명 nitrosamides을 탐지 하기 위한 방법 체 외에서 시 토 크롬 P450 촉매의 물질 대사 니트로에서 생산.

체 외에 대사 시 토 크롬 P450s에 의해 니트로의 Nitrosamide 형성을 탐지 하기 위한 일반적인 방법

N-nitrosamines are a well-established group of environmental carcinogens, which require cytochrome P450 oxidation to exhibit activity. The accepted ...

이 방법론의 전반적인 목표는 사이토크롬 P450이 in vitro에서 n개의 니트로사민을 n개의 니토사미드로 공정하게 산화할 수 있는지 확인하는 것입니다. 이 방법은 니토사민이 니트로사미드로 직접 대사되는지 평가하여 독성학 분야에 도움이 됩니다. 니트로사마이드는 알킬레이트 DNA에서 비교적 안정하기 때문에 발암에 중요한 역할을 할 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 유사한 체외 니트로사민 대사 분석에 대해 이전에 달성한 것보다 검출 한계를 낮추는 고감도 질량 분석기를 사용한다는 것입니다. 이 절차를 시작하려면 마그네틱 교반 막대가 들어 있는 25ml의 둥근 바닥 플라스크를 오븐에 넣습니다. 섭씨 140도에서 16시간 동안 건조합니다.그런 다음 플라스크를 흄 후드로 옮기고 질소 가스 흐름으로 냉각시킵니다. 플라스크에 노르코티닌 31.8mg, 무수아세트산 5ml, 아세트산 1ml를 넣고 저어주기 시작합니다. 플라스크를 얼음물 수조로 옮깁니다.아질산나트륨 33.3mg을 넣으십시오. 2.5시간 동안 계속 저어준 다음 반응을 18ml의 얼음물에 부어 반응을 가라앉힙니다. 용액을 18ml의 DCM이 함유된 분리 깔때기로 즉시 옮기고 수용액을 추출합니다.매번 9ml의 DCM을 사용하여 수성층을 두 번 더 추출합니다. 다음으로, 100mg 이상의 황산마그네슘이 함유된 풀링된 유기물을 2분 동안 건조시킵니다. 여과 후 회전 증발기를 사용하여 용액을 섭씨 30도에서 농축하여 조황 오일을 생성합니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 미처리 화합물을 정제합니다. 그 후, 순수한 화합물을 1 밀리리터의 중수소화 클로로포름에 용해시킵니다. NMR을 사용하여 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 용액의 구조와 몰 농도를 확인합니다.필요할 때까지 이 용액을 섭씨 2도에서 8도 사이의 온도에서 어두운 곳에 보관하십시오. 그런 다음 정확한 모 질량을 확인하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 고분해능 질량 분석기에서 직접 주입하여 순수 NNC 용액의 생성물 이온 질량을 측정합니다. 시작하려면 섭씨 80도의 냉동고에서 필요한 시약을 꺼내 얼음에서 해동합니다.하나는 0.5 강도의 반응 완충액을 사용하여 NADPH 재생 시스템 1-10 및 1-50의 Baculosome을 각각 1 밀리리터 튜브에 희석합니다. 다음으로, 97마이크로리터의 0.5 강도 반응 완충액이 들어 있는 1밀리리터 튜브에 3마이크로리터의 NADP 스톡 용액을 추가합니다. 각 배양에 대해 반응 완충액으로 만든 4마이크로몰 NNN 용액 40마이크로리터를 추가하여 1밀리리터 튜브를 준비합니다.각 튜브에 P450 2A6 5피코몰 5개를 함유한 효소 용액 50마이크로리터를 추가합니다. 37도의 수조에서 2분 동안 사전 배양합니다. 그런 다음 각 튜브에 10마이크로리터의 희석된 NADP+용액을 추가합니다.섭씨 37도에서 1분에서 30분 동안 배양합니다. 그 후, 먼저 10 마이크로 리터의 3.0 일반 황산 아연을 첨가 한 다음 10 마이크로 리터의 3.0 일반 수산화 바륨을 첨가하여 반응을 냉각시킵니다. Vortex는 용액을 흰색 침전물을 형성합니다.다음으로, 8,000Gs에서 4분 동안 원심분리기를 합니다. 즉시 상등액을 수집하고 액체 크로마토 그래피 포지티브 나노 전기 분무 이온화 고해상도 세로로 연결되는 질량 분석기로 2 마이크로 리터를 분석합니다. 이 연구에서 노르코티닌은 깨끗하고 높은 수율로 NNC로 니트로화되어 시험관 실험에 사용할 표준물질을 생성합니다.반응의 성공은 고분해능 탠덤 질량 분석법을 포함한 분광 분석에 의해 검증되었으며, 이를 통해 부모의 질량이 이론 값의 5ppm 이내임을 확인했습니다. 그런 다음 NNC의 탠덤 질량 분석법 단편화를 사용하여 가장 풍부한 생성물 이온 질량을 측정합니다. 보시다시피 가장 풍부한 두 가지 생성물 이온은 134와 162이며 소수점 이하 다섯 자리까지 정확한 질량 검출이 가능합니다.그런 다음 합성된 NNC는 in vitro P450 대사 분석의 표준으로 활용됩니다. 사용된 조건에서 합성 NNC는 약 17.5분에 용리되며, 모체의 이온 채널과 생성물 이온 채널 모두에서 잘 분리된 피크가 나타납니다. 양성 대조군에 따라 NNC 형성은 1분, 5분 및 10분 배양에서 볼 수 있습니다.적절하게 수행되면 니트로사마이드 합성 검사 분석은 약 6시간 내에 완료할 수 있습니다. 마찬가지로, 여러 번의 배양을 통한 체외 분석은 8시간 이상 걸리지 않아야 합니다. 이 기술의 의미는 니트로사마이드 관련 바이오마커의 측정이 개별 니트로사민 활성화에 대한 정보를 제공할 수 있기 때문에 담배 관련 암에 대한 위험 평가로 확장됩니다.이 절차를 시도하는 동안 효소 배양을 신속하게 처리해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 니트로사마이드는 이러한 조건에서 가수분해되며 질량 분석 전에 오래 방치되어서는 안 됩니다. 이 동영상을 시청한 후에는 니트로사마이드 표준물질을 준비하는 방법을 잘 이해하고 적절한 니트로사민 사이토크롬 P450 시스템에 의해 시험관에서 형성되었는지 평가할 수 있습니다.NNN, NNC 또는 관련 발암 물질로 작업하는 것은 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 이러한 화합물은 항상 실험실 가운, 보안경 및 장갑을 착용한 상태에서 배기 후드에서 취급해야 합니다. 또한 모든 발암성 폐기물은 적절하게 보관하고 라벨을 부착해야 합니다.

a-general-method-for-detecting-nitrosamide-formation-vitro-metabolism

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

전자 상자 성체의 공명 (EPR) 분광학은 철 (II)-N-메틸-D-glucamine dithiocarbamate, 철 (MGD)를 사용하여 인간 neutrophils에서 소 대동맥 내피 세포와 초과 산화물 라디칼 음이온에서 질소 산화물을 감지하기 위해...

질소 산화물과 세포로부터 전자 상자 성체의 프로그램 공명 분광학에 의한 초과 산화물 음이온 급진적가 탐지 스핀 트랩을 사용하여

질소 산화물 (NO)의 내생적인 생산은 생물 학적 기능의 다양한 조절. 그것은 어떠한 기반 시그널링의 장애 또는 dysregulation이 많은 사람이 질병에 연루되어 있는지 점점 더 분명 해지고 있습니다. 메소드는 더 이상 metabolites 인간 질병에 대한 소설 진단 또는 전조 생체 자료를 제공할 수 없습니다 관련된 계량합니다.

질소 산화물 Bioactivity을 시금을위한 분석 기법

산화질소(NO)는 혈관 항상성에서 중요한 신호 분자입니다. NO in vivo 생산량은 직접 측정하기에 너무 낮습니다. 화학발광(Chemiluminescence)은 전구체와 산화 생성물인 아질산염 및 질산염을 측정하여 NO cycle에 대한 유용한 통찰력을 제공합니다. 신체 조직과 체액에서의 아질산염/질산염 측정에 대해 설명합니다.

화학 발광 법을 사용하여 생체 물질에서 산화 질소 통로에서 아질산염과 질산염, 대사 산물을 측정

체외 시스템의 신진 대사 능력은 약물 및 독성 물질의 생체 내 변화 및 처분을위한 핵심 요구 사항입니다. 이러한 프로토콜에서는, I는 세포 배양 대사 위상을 평가하기위한 기준 대사 프로브의 적용을 설명한다.

질량 분석 및 Luminogenic 기반의 접근 방법은 단계 I 대사 역량의의 특성을<em&gt; 체외</em&gt; 세포 배양

혼합 모드 양이온 교환 (MCX) 96- 웰 마이크로 플레이트상에서 효율적인 고체상 추출과 결합 된 선택적이고 민감한 액체 크로마토 그래피 탠덤 질량 분석법 (LC-MS / MS)이 유리 3- 니트로 티로신의 측정을 위해 개발되었다 3-NT)을 임상 적으로 사용하기에 적합합니다.

임상 응용을위한 인간의 소변에서 3- 니트로 타이로신의 소형 고체 상 추출 및 LC-MS / MS 검출의 통합

선물이 3 monoamine 신경 전달 물질의 동시 결정 하 고 두 유아 소변에 그들의 대사 산물의 전기 화학 검출 (ECD) 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 결합 하 여 편리한 고체 상 추출. 우리 또한 유아에 대 한 뇌 손상의 조기 진단에 대 한 잠재적인 biomarker로 대사 산물 MHPG를 식별합니다.

추출 및 카 테 콜 아민 신경 전달 물질과 그들의 대사 산물의 고압 액체 크로마토그래피로 분석 하는 편리한 방법

환경 약품 및 중간체 공유 DNA를 생성 하는 bioactivated adducts 효소 수 약물의 효능을 평가 암과 치료의 개발에 중요 한 필드입니다. 메서드는 양식에 그들의 탐지 및 정량화에 대 한 기술 뿐만 아니라 DNA adducts 복합 활성화에 대 한 설명 합니다.

형성 화학식 DNA Adducts 효소 활성화 된 발암 물질 및 생체 외에서 마약 및 32P postlabeling에 의해 그들의 결정에 의해

우리는 6 mm 직경 라운드-고성능 액체 크로마토그래피-전기 화학 검출기 (HPLC-ECD)를 사용 하 여 공기 샘플러 prefilters에서 잘라와 대기 단백질의 화학 수정 3-nitrotyrosine를 검색 하는 방법을 제시.

3-Nitrotyrosine 대기 환경을 통해 고성능 액체 착 색 인쇄기-전기 화학 검출기 시스템에서의 탐지

여기에서는 고감도의 화학 발광 기반 분석을 사용하여 산화 질소 및 이의 생물학적 관련 유도체를 검출하기위한 프로토콜을 제시합니다.

산화 질소 및 그 유도체의 검출을위한 화학 발광 기반 분석 및 자동 산화 및 니트로화 화합물

이 프로토콜은 초파리의 눈 / 더듬이 가상적인 디스크 (EAD에게)에서 형광 표시, 유 전적으로 정의 클론 종양을 생성하는 방법을 보여줍니다. 그것은 세 번째 령 유충과 방법을 시각화하고 유전자 발현 변화와 종양 침입을 정량화를 처리하는 방법에서 EAD 뇌를 해부하는 방법에 대해 설명합니다.

그만큼<em&gt; 초파리</em&gt; 가상적인 디스크 종양 모델 : 유전 모자이크를 사용하여 유전자 발현 및 종양 침윤의 시각화 및 정량화

학습하세요 사이토크롬 P450에 의한 니트로사민의 니트로사마이드 산화 대사 경로를 평가하는 민감한 질량 분석법을 통해. 이 방법은 발암 기전 연구에 활용됩니다.

체 외에 대사 시 토 크롬 P450s에 의해 니트로의 Nitrosamide 형성을 탐지 하기 위한 일반적인 방법

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