체 외에 대사 시 토 크롬 P450s에 의해 니트로의 Nitrosamide 형성을 탐지 하기 위한 일반적인 방법

이 방법론의 전반적인 목표는 사이토크롬 P450이 in vitro에서 n개의 니트로사민을 n개의 니토사미드로 공정하게 산화할 수 있는지 확인하는 것입니다. 이 방법은 니토사민이 니트로사미드로 직접 대사되는지 평가하여 독성학 분야에 도움이 됩니다. 니트로사마이드는 알킬레이트 DNA에서 비교적 안정하기 때문에 발암에 중요한 역할을 할 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 유사한 체외 니트로사민 대사 분석에 대해 이전에 달성한 것보다 검출 한계를 낮추는 고감도 질량 분석기를 사용한다는 것입니다. 이 절차를 시작하려면 마그네틱 교반 막대가 들어 있는 25ml의 둥근 바닥 플라스크를 오븐에 넣습니다. 섭씨 140도에서 16시간 동안 건조합니다.

그런 다음 플라스크를 흄 후드로 옮기고 질소 가스 흐름으로 냉각시킵니다. 플라스크에 노르코티닌 31.8mg, 무수아세트산 5ml, 아세트산 1ml를 넣고 저어주기 시작합니다. 플라스크를 얼음물 수조로 옮깁니다.

아질산나트륨 33.3mg을 넣으십시오. 2.5시간 동안 계속 저어준 다음 반응을 18ml의 얼음물에 부어 반응을 가라앉힙니다. 용액을 18ml의 DCM이 함유된 분리 깔때기로 즉시 옮기고 수용액을 추출합니다.

매번 9ml의 DCM을 사용하여 수성층을 두 번 더 추출합니다. 다음으로, 100mg 이상의 황산마그네슘이 함유된 풀링된 유기물을 2분 동안 건조시킵니다. 여과 후 회전 증발기를 사용하여 용액을 섭씨 30도에서 농축하여 조황 오일을 생성합니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 미처리 화합물을 정제합니다. 그 후, 순수한 화합물을 1 밀리리터의 중수소화 클로로포름에 용해시킵니다. NMR을 사용하여 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 용액의 구조와 몰 농도를 확인합니다.

필요할 때까지 이 용액을 섭씨 2도에서 8도 사이의 온도에서 어두운 곳에 보관하십시오. 그런 다음 정확한 모 질량을 확인하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 고분해능 질량 분석기에서 직접 주입하여 순수 NNC 용액의 생성물 이온 질량을 측정합니다. 시작하려면 섭씨 80도의 냉동고에서 필요한 시약을 꺼내 얼음에서 해동합니다.

하나는 0.5 강도의 반응 완충액을 사용하여 NADPH 재생 시스템 1-10 및 1-50의 Baculosome을 각각 1 밀리리터 튜브에 희석합니다. 다음으로, 97마이크로리터의 0.5 강도 반응 완충액이 들어 있는 1밀리리터 튜브에 3마이크로리터의 NADP 스톡 용액을 추가합니다. 각 배양에 대해 반응 완충액으로 만든 4마이크로몰 NNN 용액 40마이크로리터를 추가하여 1밀리리터 튜브를 준비합니다.

각 튜브에 P450 2A6 5피코몰 5개를 함유한 효소 용액 50마이크로리터를 추가합니다. 37도의 수조에서 2분 동안 사전 배양합니다. 그런 다음 각 튜브에 10마이크로리터의 희석된 NADP+용액을 추가합니다.

섭씨 37도에서 1분에서 30분 동안 배양합니다. 그 후, 먼저 10 마이크로 리터의 3.0 일반 황산 아연을 첨가 한 다음 10 마이크로 리터의 3.0 일반 수산화 바륨을 첨가하여 반응을 냉각시킵니다. Vortex는 용액을 흰색 침전물을 형성합니다.

다음으로, 8,000Gs에서 4분 동안 원심분리기를 합니다. 즉시 상등액을 수집하고 액체 크로마토 그래피 포지티브 나노 전기 분무 이온화 고해상도 세로로 연결되는 질량 분석기로 2 마이크로 리터를 분석합니다. 이 연구에서 노르코티닌은 깨끗하고 높은 수율로 NNC로 니트로화되어 시험관 실험에 사용할 표준물질을 생성합니다.

반응의 성공은 고분해능 탠덤 질량 분석법을 포함한 분광 분석에 의해 검증되었으며, 이를 통해 부모의 질량이 이론 값의 5ppm 이내임을 확인했습니다. 그런 다음 NNC의 탠덤 질량 분석법 단편화를 사용하여 가장 풍부한 생성물 이온 질량을 측정합니다. 보시다시피 가장 풍부한 두 가지 생성물 이온은 134와 162이며 소수점 이하 다섯 자리까지 정확한 질량 검출이 가능합니다.

그런 다음 합성된 NNC는 in vitro P450 대사 분석의 표준으로 활용됩니다. 사용된 조건에서 합성 NNC는 약 17.5분에 용리되며, 모체의 이온 채널과 생성물 이온 채널 모두에서 잘 분리된 피크가 나타납니다. 양성 대조군에 따라 NNC 형성은 1분, 5분 및 10분 배양에서 볼

적절하게 수행되면 니트로사마이드 합성 검사 분석은 약 6시간 내에 완료할 수 있습니다. 마찬가지로, 여러 번의 배양을 통한 체외 분석은 8시간 이상 걸리지 않아야 합니다. 이 기술의 의미는 니트로사마이드 관련 바이오마커의 측정이 개별 니트로사민 활성화에 대한 정보를 제공할 수 있기 때문에 담배 관련 암에 대한 위험 평가로 확장됩니다.

이 절차를 시도하는 동안 효소 배양을 신속하게 처리해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 니트로사마이드는 이러한 조건에서 가수분해되며 질량 분석 전에 오래 방치되어서는 안 됩니다. 이 동영상을 시청한 후에는 니트로사마이드 표준물질을 준비하는 방법을 잘 이해하고 적절한 니트로사민 사이토크롬 P450 시스템에 의해 시험관에서 형성되었는지 평가할 수 있습니다.

NNN, NNC 또는 관련 발암 물질로 작업하는 것은 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 이러한 화합물은 항상 실험실 가운, 보안경 및 장갑을 착용한 상태에서 배기 후드에서 취급해야 합니다. 또한 모든 발암성 폐기물은 적절하게 보관하고 라벨을 부착해야 합니다.