Name: 전체 셀 전류 두뇌 분할 영역에서 GABA의 퍼프 응용 프로그램에 의해 유도 된 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: 배우세요 전체 세포 패치 클램프 기록에서 퍼프 기법을 이용한 약물 투여 방법을. 급속한 약물 농도 증가와 수용체 탈감작 방지를 통해 전기생리학 연구의 정확도를 높입니다.

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저자는 다음 단체를 감사 하 고 싶습니다: 국가 자연 과학 재단의 중국 (31171018, 31171355), 과학 및 기술 부의 광 (2013KJCX0054), 자연 과학 재단의 광 동성 ( 2014A030313418, 2014A030313440), 광저우 과학 및 기술 관리국 (201607010320).

동물 주택 및 모든 동물 실험 동물 관리의 국립 연구소에 의해 설립에 대 한 지침에 따라 남 중국 사범 대학에서 동물 연구에 대 한 윤리 위원회에 의해 승인 절차에 따라 실시 했다 건강.
 1. 준비의 솔루션 <ol><li>표준 인공 뇌 척추 액체의 (실제) 우리의 출판된 작업 7에서 설명 하는 표 1에 나열 된 구성 요소가 포함 된 준비 500 mL.
	신선한 실제 솔루션을 준비 하는 이온된 수로 <ol><li>사용 깨끗 한 유리 비 커. 이온된 수와 주걱을 청소 하 고 NaCl, KCl, NaH를 추가 하려면 사용 하기 전에 건조 2 포 4, NaHCO 3, MgSO 4, D-포도 당, CaCl 2 95% O 2 / 5% 솔루션 부풀어 데 후 추가 공동 2 ~ 20 분 (에 표 1)으로 500 mL 이온된 수의 혼합물. 완전히 녹아 때까지 저 어.</li>
		<li>확인은 실제는 완전 하 게 어떤 강 수 없이 취소 합니다. PH 7.2-7.4로 조정 합니다. 95% O 2와 5% CO 2 ~ 20 분에 대 한 가스 혼합물으로 거품</li>
	</ol></li> <li>슬라이스 절단 솔루션 포함 하는 표 2에 설명 된 화학 7의 250 mL를 준비.
	<ol><li>KCl, MgCl 2, NaH 2 포 4, NaHCO 3, choline·Cl, D-포도 당을 추가 하 고 1.1.1, 이온된 물 250 mL에에서 표시 된 마지막 CaCl 2를 추가 하 고 1.1.1와 1.1.2에 설명 된 대로 분해.</li>
		<li>후 버블링 95% O 2 / 5% CO 2, 배치 솔루션 15-20 분 동안 냉장고에서 절단 솔루션은 차가운 하 고 부분적으로 냉동. 
		참고: 우리가 사용 하 여이 절단 솔루션 1-2 달에서 분할 영역을 만들 때-오래 된 쥐; 수식을 마우스 2 개월 이상에 대 한 다를 수 있습니다.</li>
		<li>살 균도 무료 isotonic 식 염 수에 용 해 하 여 준비 LPS 솔루션 (0.9 %NaCl). LPS는 intraperitoneally 관리 (0.5 mg/kg) 2 h 나중 녹음 시작.</li>
	</ol></li></ol> 2. 전 두 엽 피 질 조각의 준비 <ol><li>절단 솔루션 냉동 실에서 하 고 있는 비 자금을 얻기 위해 균질. 얼음에 솔루션을 놓고 거품 지속적으로 95% O 2 / 5% CO 2.</li>
	<li>크고, 날카로운가 위를 사용 하 여 신속 하 게 설명 9 마우스를 목을 벨 고 즉시 머리 가득한 비 커에 얼음 (0-4 ° C) 절단 솔루션.</li>
	<li>좋은 위 코 꼬리 방향으로 중간 선 따라 두개골의 상단을 잘라 고 측면 두개골 부분을 제거. 얼음 처럼 차가운 절단 솔루션으로 잘 주걱와 드롭 뇌 제거. 
	주: 단계 2.2-2.3 빠르게 수행 되어야 합니다 (이상적으로 &#60; 1 분).</li>
	<li>얼음으로 채워진 9 cm 배양 접시의 뚜껑에는 두뇌를 놓습니다. 린스 차가운 절단 솔루션 두뇌. 소 뇌 및 후 각 전구는 면도날으로 잘라.</li>
	<li>적용 cyanoacrylate 접착제는 견본에는 vibratome의 홀더. 조심 스럽게 뇌 블록에 접착제, rostral 쪽, 방울 놓고 즉시 얼음 절단 솔루션에 몰입할.</li>
	<li>수평 비행기에 관하여 15 °의 각도를 vibratome의 블레이드 홀더를 조정 하 고 준비 350 µ m 코로나 뇌 조각 (블레이드 진동 주파수 = 85 Hz, 속도 = 0.1 m m/s).</li>
	<li>95% O 2 / 5% 상수 버블링 (RT)에 1 시간에 대 한 품 어 전송 복구 챔버로 조각을 가득 실제, 한 피 펫을 사용 하 여, CO 2.</li>
</ol> 3. 전체 셀 패치 녹음 <ol><li>확인 유리 붕 규 산 micropipettes에 대 한 기록 전극으로 사용 하거나 끌어당기는 작동 설명서에는 특정 지침에 따라 micropipettes 퍼프. 전극, 기록에 대 한 팁 저항 범위 4-6 M에에서는 &#8486;, 퍼프 micropipettes 있는 팁 직경 범위 2-5 µ m.</li>
	<li>블록 빠른 Na + 채널을 따라서 실제를 활동 전위 나 + 채널 차단 (TTX, 1 µ M)를 추가 하 고 챔버로 연동 펌프에 의해 녹음 실에서 2-3 mL/min이 솔루션의 일정 유량을 유지 그리고 그것의 포부입니다. 거품 실제 95% O 2 / 5% CO 2 조각의 생존 능력을 보장 하기 위해 지속적으로.</li>
	<li>그 좋은 팁 조각 크기에 맞게 잘라 했다 수정 된 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 녹음 실로 두뇌 슬라이스를 전송 합니다. 백 금 조각 앵커와 슬라이스 병렬 나일론 스레드 간격 커버 &#8805; 플랫폼에는 슬라이스를 2mm 떨어져.</li>
	<li>내부 솔루션 7 (표 3), 녹음 micropipette 작성 및 10 µ M, 50 µ M, 100 µ M (실제에 녹아 있는), 또는 차량 제어로 실제에서 GABA와 퍼프 micropipettes를 작성.</li>
	<li>파편과 막힘을 방지 하기 위해 가벼운 긍정적인 압력에는 실제 기록 전극 immersing 전에 1 mL 주사기를 사용 하 여 적용 됩니다. 팁 ( 그림 1 A) 모니터에 비디오 이미지의 중심에 표시 되도록 기록 전극과 퍼프 micropipette 위치 micromanipulator (4 x 렌즈), 현미경을 사용 하 여.</li>
	<li>퍼프 micropipette 점차 줄이면서 현미경 초점 (40 x 렌즈)를 조정 하 고 45 °의 각도에서 녹음 신경 위에 그것을 배치. 퍼프 micropipette의 끝 및 20-40 µ m ( 그림 1 B) 기록 하는 뉴런 사이의 거리를 유지. 천천히, 그리고 신중 하 게 접근 기록 전극과 신경 하 고 긍정적인 압력 다음 놓습니다. 전극 홀더 기가 옴 씰을 만들에 연결 하는 튜브를 통해 약하고 짧은 흡입 적용.</li>
	<li>유지 0 전압 mV입니다. 기가 옴 씰의 형성, 후 빠른 보상 하 고 수동 또는 자동으로 커패시턴스를 속도. 그런 다음 전체 셀 모드에 들어가 위에서 언급 한 튜브를 통해 짧고 강한 흡입을 적용.</li>
	<li>전압 클램프에 기록 eIPSC 모드입니다. 퍼프 micropipette 퍼프 ( 그림 2) 단일 또는 짝 GABA를 제공 하는 마스터 8 전압 단계 발전기에 의해 제어 하는 Picospritzer를 사용 하 여 낮은 가스 압력 (질소, 4-6 psi) 적용.</li>
	<li>최고의 eIPSC 결과 ( 그림 3) 우울증 LPS 유발 모델 ( 그림 4)에서 eIPSC를 측정 하는 퍼프 기간 변경.</li>
</ol>

<ol><li>Neher, E., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-channel+currents+recorded+from+membrane+of+denervated+frog+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres.</a> Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).</li>
<li>Sakmann, B., Edwards, F., Konnerth, A., Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+used+for+studying+synaptic+transmission+in+slices+of+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Q+J+Exp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques used for studying synaptic transmission in slices of mammalian brain.</a> Q J Exp Physiol. 74 (7), 1107-1118 (1989).</li>
<li>Eyo, U. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+hyperactivity+recruits+microglial+processes+via+neuronal+NMDA+receptors+and+microglial+P2Y12+receptors+after+status+epilepticus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal hyperactivity recruits microglial processes via neuronal NMDA receptors and microglial P2Y12 receptors after status epilepticus.</a> J Neurosci. 34 (32), 10528-10540 (2014).</li>
<li>Dickinson, G. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+determining+the+recruitment+of+inositol+trisphosphate+receptor+channels+during+calcium+puffs%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Factors determining the recruitment of inositol trisphosphate receptor channels during calcium puffs.</a> Biophys J. 105 (11), 2474-2484 (2013).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Columnar+distribution+of+activity+dependent+gabaergic+depolarization+in+sensorimotor+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">Columnar distribution of activity dependent gabaergic depolarization in sensorimotor cortical neurons.</a> Mol Brain. 5, 33(2012).</li>
<li>Glykys, J., Mody, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+main+source+of+ambient+GABA+responsible+for+tonic+inhibition+in+the+mouse+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The main source of ambient GABA responsible for tonic inhibition in the mouse hippocampus.</a> J Physiol. 582, (Pt 3) 1163-1178 (2007).</li>
<li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APP+modulates+KCC2+expression+and+function+in+hippocampal+GABAergic+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">APP modulates KCC2 expression and function in hippocampal GABAergic inhibition.</a> Elife. 6, (2017).</li>
<li>Dunn, A. J., Swiergiel, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+interleukin-1+and+endotoxin+in+the+forced+swim+and+tail+suspension+tests+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Biochem+Behav%22%5BJournal%5D)">Effects of interleukin-1 and endotoxin in the forced swim and tail suspension tests in mice.</a> Pharmacol Biochem Behav. 81 (3), 688-693 (2005).</li>
<li>Engel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+Patch-clamp+Recordings+from+the+Somatodendritic+Domain+of+Nigral+Dopamine+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons.</a> J Vis Exp. (117), (2016).</li>
<li>Wondolowski, J., Frerking, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit-dependent+postsynaptic+expression+of+kainate+receptors+on+hippocampal+interneurons+in+area+CA1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Subunit-dependent postsynaptic expression of kainate receptors on hippocampal interneurons in area CA1.</a> J Neurosci. 29 (2), 563-574 (2009).</li>
<li>Yang, L., Wang, Z., Wang, B., Justice, N. J., Zheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+precursor+protein+regulates+Cav1.2+L-type+calcium+channel+levels+and+function+to+influence+GABAergic+short-term+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Amyloid precursor protein regulates Cav1.2 L-type calcium channel levels and function to influence GABAergic short-term plasticity.</a> J Neurosci. 29 (50), 15660-15668 (2009).</li>
<li>Huo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prefrontal+Cortical+GABAergic+Dysfunction+Contributes+to+Aberrant+UP-State+Duration+in+APP+Knockout+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Prefrontal Cortical GABAergic Dysfunction Contributes to Aberrant UP-State Duration in APP Knockout Mice.</a> Cereb Cortex. , (2016).</li>
<li>Zhou, W. L., Gao, X. B., Picciotto, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylcholine+Acts+through+Nicotinic+Receptors+to+Enhance+the+Firing+Rate+of+a+Subset+of+Hypocretin+Neurons+in+the+Mouse+Hypothalamus+through+Distinct+Presynaptic+and+Postsynaptic+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Acetylcholine Acts through Nicotinic Receptors to Enhance the Firing Rate of a Subset of Hypocretin Neurons in the Mouse Hypothalamus through Distinct Presynaptic and Postsynaptic Mechanisms.</a> eNeuro. 2 (1), (2015).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

퍼프 응용 프로그램은 널리 postsynaptic 수용 체 기능3,,47, 평가 하는 데 사용 됩니다 하지만 각 실험에 정확한 컨트롤을 요구 한다. 여기에 나온 전 두 엽 피 질 뇌 조각에서 Ipsc (즉, eIPSCs)을 유도 하는 GABA 퍼프 전체 셀 패치 클램핑 관련 절차를 설명 합니다. 기록 전극의 저항은 약 5 m ω, 퍼프 micropipettes의 팁 직경에 대해 2-5 µ m. 퍼프 압력은 4-6 psi 사이:이 범위는 중요 한, 높은 압력 낮은 압력 귀 착될 수 있다 하는 동안 신경 손상 발생할 수 있습니다로 postsynaptic GABA 수용 체의 활성화 부족입니다. 에 대 한 기록 하는 뉴런에 퍼프 micropipette의 끝에서 수평 거리는 20-40 µ m (1-2 신경의 직경), 그리고 퍼프 micropipette 슬라이스 표면 사이의...

패치 클램프 기술, 뉴런의 전기 신호를 조사 하기 위한 기본 도구는 1970 년대1,2에서 개발 되었다. 이 기술의 주요 장점은 어떻게 특정 치료에 지식을 제공 한다는 것입니다 (예를 들어, 약리) 신경 기능 또는 실시간으로3채널을 변경할 수 있습니다. 전체 셀 두뇌 조각에서 녹음 하는 동안 신경 기능 약리학 평가 기록 되 고 신경에 촉진제 또는 특정 수용 체의 길 항 제와 같은 약물의 응용 프로그램을 필요 합니다. 이 메서드는4신경 생리 적 및 병 적인 속성을 더 잘 이해 하는 특정 약물의 응용 프로그램에 따라 발생 하는 신경 변경 식별 수 있습니다. 약리학 관리 중 관류5 또는 퍼프6을 통해 수행할 수 있습니다, 비록 후자의 우수한 기술입니다. 특히: (i) 응용 프로그램을 빠르게 퍼프 증가 약물 농도 수준으로 기록 된 신경 주위를 막 수용 체의 탈 감 작 예방; (ii) 부풀어 약물의 볼륨이 매우 낮은, 따라서 뇌 조각;에 관리 화학 물질의 어떤 바람직하지 않은 효과 감소 시키는 목욕 솔루션에는 효과가 거의 되도록 (iii) 퍼프 프로토콜 수 설정 하 고 저장, 실험을 매우 정확 하 게 재현할 수; 만들기 (iv) 퍼프 응용 촉진제/길 항 근, 특히 어디 이러한 시 약 인지 비싼 얻기 어려운의 경제적인 사용을 나타냅니다.
여기, 우리는 심하게 준비 뇌 조각, 상대적으로 잘 보존 된 두뇌 회로의 장점이 준비에에서 GABA를 피에 의해 유도 된 전체 셀 전류 기록에 집중할 것 이다. 우리가 퍼프 유발 억제 전류7 을 수행 하는 방법이 문서에서 설명 합니다. 세 슘 (Cs+)를 사용 하 여-기반 내부 솔루션, 그리고 0에서 신경 세포를 들고 mV, GABA-퍼프 갖는 소개 합니다 적절 한 기술적 세부 사항 가진 금지 postsynaptic 전류 (eIPSCs). 우리는 eIPSC 보여 lipopolysaccharide (LPS) 주입8에 의해 유도 된 우울증의 마우스 모델을 사용 하 여 GABA 퍼프에 의해 갖는 진폭 차량 컨트롤에 비해 LPS-주입 마우스의 조각에 상당히 절감 됩니다. 우리의 의도이 문서가 어떻게 퍼프 기술 두뇌 조각에서 신경 활동에 어떤 화학 물질, 화합물 또는 약의 효과 평가 하기 위한 연구에 널리 적용 되는 표시 한다.

<table><tbody><tr><td>유리 붕규산 마이크로 피펫</td><td>셔터 기기</td><td>BF150-86-10</td><td>외경 1.50mm; 내경 0.86mm</td></tr><tr><td>마이크로 피펫 풀러</td><td>셔터 기기</td><td>모델 P-97&nbsp;</td><td>플레밍/브로우 마이크로피펫 풀러</td></tr><tr><td>Micromanipulators</td><td>셔터 악기</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>컴퓨터 제어 증폭기&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>분자 장치</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>디지털 수집 시스템&nbsp;</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>이미징 카메라</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>2115001</td><td>검사 장비</td></tr><tr><td>현미경&nbsp;</td><td>니콘&nbsp;</td><td>이클립스 FN1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>마스터 8</td><td>A.M.P.I.</td><td>Master-8 펄스 자극기</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome Slicer</td><td>Leica</td><td>VT 1000S</td><td></td></tr><tr><td>면도날</td><td>질레트</td><td>74-S</td><td>FLYING EAGLE</td></tr><tr><td>비디오 모니터</td><td>Panasonic</td><td>WV-BM 1410</td><td></td></tr><tr><td>502 Glue</td><td>Deli</td><td>7146</td><td>Cyanoacrylate Glue</td></tr><tr><td>연동 펌프</td><td>Shanghai JIA PENG Corporation</td><td>BT100-1F</td><td></td></tr><tr><td>비디오 카메라</td><td>올림푸스 아메리카 의료</td><td>OLY-150</td><td></td></tr><tr><td>전사 피펫</td><td>Biologix</td><td>30-0138A1</td><td></td></tr></tbody></table>

전체 셀 전류 두뇌 분할 영역에서 gaba의 퍼프 응용 프로그램에 의해 유도 된

Whole-cell Currents Induced by Puff Application of GABA in Brain Slices

약리학 관리 전체 셀 패치 클램프 두뇌 조각에서 녹화를 할 때 주로 사용 됩니다. Electrophysiological 녹음 중 약물 응용 프로그램의 가장 좋은 방법 중 하나는 두뇌 조각에서 신경 활동에 약리 시 약의 효과 연구 하는 데 사용할 수 있습니다 퍼프 기술입니다. 퍼프 응용 프로그램의 가장 큰 장점은 그 녹음 사이트 약물 농도 증가, 따라서 방지 막 수용 체의 둔감. 퍼프 응용 프로그램의 성공적인 사용 주의 다음과 같은 요소를 포함: 약물의 농도, 퍼프 micropipette, 퍼프 micropipette 기록, 신경의 끝 및 기간 사이의 거리의 매개 변수 및 퍼프는 운전 압력 (평방 인치 당 파운드 psi). 이 문서에서는 피 감마-aminobutyric 산 (GABA) 전 두 엽 피 질 조각의 뉴런에 의해 유도 된 전체 셀 전류를 기록 하기 위한 단계별 절차를 설명 합니다. 특히, 마가, 등 다른 두뇌 지역 그리고 다른 준비, 세포 배양 등 사소한 수정 같은 절차를 적용할 수 있습니다.

퍼프 기술은 특정된 뉴런의 표면에 특정 수용 체에 약물의 효과 연구 하는 연구자를 수 있습니다. 이 문서에서는, 우리는 GABA 수용 체에 의해 중재 전류에 초점. 그림 1 에서는 퍼프와 녹음 micropipettes. 퍼프, 실제에 의해 생성 된 실제 압력의 기록 된 신경 세포에 어떤 영향을 제거 하 고 자당 퍼프 (그림 2A) 컨트롤로 사용 됩니다. GABA 퍼프 (블랙)에 의해 유도 된 응답 그림 2B와 같이 실제 워시 아웃 (블루)으로 초기 상태를 복구할 수 있습니다 하는 동안 보고 된10, picrotoxin와 같은 GABA 수용 체 억제제에 의해 막힐 수 있다. 특히,는 실제도 자당 퍼프 유도 응답,...

우리는 약리 시 약 전체 셀 패치 클램프 기록 하는 동안 관리 될 수 및 그것의 성공에 대 한 중요 한 기능의 다양 한 측면을 강조 퍼프 기술을 설명 합니다.

전체 셀 전류 두뇌 분할 영역에서 GABA의 퍼프 응용 프로그램에 의해 유도 된

Pharmacological administration is commonly used when conducting whole-cell patch-clamp recording in brain slices. One of the best methods of drug ...

이 퍼프 기술의 전반적인 목표는 전체 세포 패치 클램프 기록에서 약리학적 투여를 수행하는 것입니다. 이 방법은 약리학적 투여와 같은 전기생리학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 기록 부위 주변의 약물 농도가 빠르게 증가하여 막 수용체의 탈감작을 방지한다는 것입니다.일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 급성 전전두엽 피질 절편의 준비와 퍼프 마이크로피펫의 위치가 상대적으로 어렵기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 이 절차를 시작하려면 얼어붙은 절단 용액을 부수어 슬러시를 얻으십시오. 슬러시 용액을 얼음에 보관하고 산소 95%, 이산화탄소 5%로 거품을 냅니다.다음으로, 절개된 머리를 얼음처럼 차가운 절단 용액을 채운 비커에 넣고 몇 초 후에 꺼냅니다. 가는 가위로 꼬리-꼬리 방향으로 정중선을 따라 두개골을 자르고 측면 두개골 부분을 제거합니다. 그런 다음 미세한 주걱으로 뇌를 제거하고 얼음처럼 차가운 절단 용액에 떨어뜨립니다.그런 다음, 얼음으로 채워진 9cm 페트리 접시의 뚜껑에 뇌를 올려 놓는다. 얼음처럼 차가운 절단 용액으로 뇌를 헹굽니다. 그런 다음 면도날로 소뇌와 후각구를 잘라냅니다.그런 다음 Vibratome 표본 홀더에 시아노아크릴레이트 접착제를 적용합니다. 뇌 블록을 접착제 방울에 조심스럽게 놓고 목이 위로 향하게 한 다음 즉시 얼음처럼 차가운 절단 용액에 담그십시오. 블레이드 홀더를 수평면을 기준으로 15도 각도로 조정합니다.뇌 조직을 350미크론의 코로나 조각으로 나눕니다. 그런 다음 슬라이드를 ACSF로 채워진 회수 챔버로 옮기고 산소 95%, 이산화탄소 5%의 지속적인 거품으로 1시간 동안 배양합니다. 본 실험에서는 급성 전전두엽 피질 절편을 준비하는 것도 절차에서 매우 중요합니다.건강한 뇌 절편은 단단히 패치할 수 있는 활성 뉴런을 의미합니다. 이 절차에서는 기록 전극 또는 퍼프 마이크로피펫으로 사용할 유리 붕규산 마이크로피펫을 만듭니다. 전극 기록의 경우 팁 저항은 4-6메가옴 범위인 반면 퍼프 마이크로피펫은 팁 직경이 2-5마이크로미터 범위입니다.ACSF에 나트륨 채널 차단제를 추가하여 빠른 나트륨 채널과 활동 전위를 차단하고 기록 챔버에서 이 용액의 분당 2-3밀리리터의 일정한 유속을 유지합니다. 슬라이스의 생존력을 보장하기 위해 ACSF에 95%의 산소, 5%의 이산화탄소를 지속적으로 거품을 냅니다. 뇌 절편을 기록 챔버로 옮기고, 절편의 크기에 맞게 끝이 가늘게 자른 파스퇴르 피펫을 사용합니다.다음으로, 슬라이스 위에 플래티넘 슬라이스 앵커를 놓아 플랫폼에 고정합니다. 그 후, 기록 마이크로피펫에 내부 용액을 채우고 퍼프 마이크로피펫에 10마이크로몰, 50마이크로몰, 100마이크로몰에서 GABA를 채우거나 차량 제어로 ACSF를 채웁니다. 이물질로 막히는 것을 방지하려면 기록 전극을 ACSF에 담그기 전에 1밀리리터 주사기를 사용하여 약간의 양압을 가하십시오.현미경 아래에서 기록 전극과 퍼프 마이크로피펫을 팁이 모니터 중앙에 나타나도록 배치합니다. 그런 다음 표적 뉴런을 식별합니다. 퍼프 마이크로피펫을 서서히 내리면서 현미경 초점을 조정하고 45도 각도로 기록 뉴런 위에 놓습니다.퍼프 마이크로피펫의 끝과 표적 뉴런 사이의 거리를 20-40마이크로미터 범위로 유지하십시오. 천천히 그리고 조심스럽게 기록 전극으로 뉴런에 접근한 다음 양압을 해제합니다. 전극 홀더에 연결된 튜브를 통해 약하고 짧게 흡입하여 기가옴 밀봉을 만듭니다.전압을 0밀리볼트로 유지하십시오. 기가 옴 씰이 형성 된 후 빠르고 느린 커패시턴스를 수동 또는 자동으로 보상하십시오. 그런 다음 튜브를 통해 짧고 강하게 흡입하여 전체 셀 모드로 전환합니다.그런 다음 전압 클램프 모드에서 유발된 IPSC 전류를 기록합니다. Master-8 전압 스텝 발생기로 제어되는 퍼프 마이크로피펫을 통해 단일 또는 쌍의 GABA 퍼프를 전달합니다. 최상의 유발 IPSC 전류 결과를 얻기 위해 퍼프 지속 시간을 변경하고 LPS 유도 우울증 모델에서 유발된 IPSC 전류를 측정합니다.여기에 표시된 것은 10, 50 및 100 마이크로몰 GABA에 의해 유도된 샘플 IPSC입니다. 다음은 퍼프 지속 시간 반응 곡선입니다. 1초, 2초 또는 3초의 인터퍼프 간격으로 50마이크로몰 퍼프에서 GABA가 유발하는 반복적인 전류가 여기에 나와 있습니다.한 번 숙달된 이 기술은 제대로 수행되면 두 시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 건강한 뇌 조각을 얻기 위해 기억하는 것이 중요하다. 개발 후 이 기술은 약리학 관리 분야의 연구자들이 전기 생리학에서 약물의 효과를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.이 비디오를 시청한 후에는 전체 세포 패치 클램프 기록에서 약리학적 투여를 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. TTX로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 장갑 착용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

whole-cell-currents-induced-puff-application-gaba-brain

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

우리는 GABA 활성화된 단일 채널 전류 (GABAA 채널, GABAA 수용체)와 그들이 뉴런의 시냅스 생성과 토닉 전류를 측정하는 패치 - 클램프 기법을 사용합니다. 채널의 활성화는 건강과 질병에의 연결을 흥분을...

랫 뇌 조각의 GABA 활성화된 단일 채널 및 토닉 해류

이 비디오는 쥐의 전전두엽 피질 뇌 절편에서 감마 아미노부티르산(GABA)에 의해 유도된 전체 세포 전류를 기록하는 것을 보여줍니다. GABA의 제어된 전달은 시냅스후 뉴런에서 염화물 채널을 열어 억제성 시냅스후 전류 또는 IPSC를 생성합니다. 이러한 IPSC는 GABA 농도가 높을수록 증가하며, 이는 시냅스 전달에 대한 GABA의 억제 활성을 반영합니다.

mouse brain slice에서 GABA Puffing을 사용한 전체 세포 전류 기록

대뇌 피질의 네트워크는 억제의 interneurons의 작지만 다양한 설정에 의해 제어된다. 의 interneurons의 기능 조사 그러므로 표적으로 기록하고 엄격한 확인이 필요합니다. 세포 내 라벨, 사후 형태 학적 및 면역 조직 화학적 분석 신경 세포의 단일 또는 시냅스 결합 쌍에서 전체 셀 녹음을 포함하는 통합 접근 방식은 여기에 설명한다.

Morphologically- 및 Neurochemically 확인 된 해마의 interneurons에서 전체 세포 패치 클램프 녹음

진동은 기본적인 네트워크 속성이며 질병과 약물에 의해 조절된다. 뇌 슬라이스 진동을 공부하는 것은 통제 된 조건에서 격리 된 네트워크의 특성을 수 있습니다. 프로토콜은 CA1의 γ 진동을 불러 일으키는 급성 뇌 조각의 준비를 위해 제공됩니다.

파상풍의 자극에 의​​해 지역의 CA1 γ 진동의 발생

이 프로토콜은 전체 셀 패치 클램프 녹음을 수행하기위한 기본 절차 단계를 설명합니다. 이 기술은 신경 세포의 전기적 동작의 연구를 허용하고, 뇌 조각에서 수행하는 경우, 여전히 상대적으로 잘 보존 된 뇌 회로에 통합되어 신경 세포에서 다양한 신경 기능의 평가를 할 수 있습니다.

뇌 조각에서 전체 셀 패치 클램프 녹음

여기, 선물이 생리학 및 약리학 바인딩에서 GABAA 수용 체에 활성 화합물을 발견 하는 프로토콜.

감마-Aminobutyric 산 성 수용 체 변조 소설 화합물의 발견에 대 한 메서드 있는 Neurotransmission 입력

급성 발작 모델은 epileptiform 이벤트를 기본 메커니즘을 공부 하 고 중요 합니다. 또한, epileptiform 이벤트에 수요를 생성 하는 기능에는 그들의 개시를 기본 이벤트의 정확한 순서를 공부 하 매우 효율적인 방법을 제공 한다. 여기, 우리가 마우스 및 인간의 조직에 급성 4-aminopyridine 대뇌 피 질의 발작 모델을 설명 합니다.

설치류와 인간의 조직에 급성 Ictal 활동의 생성 및 요청 시 개시

여기, 우리가 시험관에서 척수 조각에서 신경 세포 substantia gelatinosa (SG)에서 만든 전체 셀 패치 클램프 기록에 대 한 필수 단계 설명 합니다. 이 메서드는 기본 막 속성, 시 냅 스 전송 및 공부 SG 뉴런의 형태학 상 특성을 수 있습니다.

급성 척수 조각 Substantia Gelatinosa 신경에 있는 전체 셀 패치 클램프 기록에 대 한 준비

제시된 프로토콜은 잠재적인 항질 물질에 대한 전임상 평가 도구로 중요한 두뇌 조각을 사용하는 궁극적인 목표를 가진 절제된 인간 해마 조직의 수송 그리고 준비를 기술합니다.

전기 생리학적 기록을 위한 급성 인간 해마 슬라이스의 준비

생체 외 뇌 조각은 구 심성 입력에 대한 유발 반응에 대한 휘발성 마취제의 효과를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 광유전학은 시상피질 및 피질 피질 구심성을 비원발성 신피질에 독립적으로 활성화하는 데 사용되며 시냅스 및 네트워크 반응은 이소플루란으로 조절됩니다.

뇌 조각에서 구 심성 경로의 광유전 적 활성화 및 휘발성 마취제에 의한 반응의 조절

이 문서는 마우스에서 수평 해마 뇌 조각을 얻기 위해 체계적인 프로토콜을 설명하는 것을 목표로합니다. 이 방법론의 목적은 천공 경로 및 이끼 섬유장과 같은 해마 섬유 경로의 무결성을 보존하여 규톨염 자이러스 관련 신경학적 과정을 평가하는 것입니다.

마우스 뇌의 수평 해마 조각

배우세요 전체 세포 패치 클램프 기록에서 퍼프 기법을 이용한 약물 투여 방법을. 급속한 약물 농도 증가와 수용체 탈감작 방지를 통해 전기생리학 연구의 정확도를 높입니다.

전체 셀 전류 두뇌 분할 영역에서 GABA의 퍼프 응용 프로그램에 의해 유도 된

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