전체 셀 전류 두뇌 분할 영역에서 GABA의 퍼프 응용 프로그램에 의해 유도 된

이 퍼프 기술의 전반적인 목표는 전체 세포 패치 클램프 기록에서 약리학적 투여를 수행하는 것입니다. 이 방법은 약리학적 투여와 같은 전기생리학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 기록 부위 주변의 약물 농도가 빠르게 증가하여 막 수용체의 탈감작을 방지한다는 것입니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 급성 전전두엽 피질 절편의 준비와 퍼프 마이크로피펫의 위치가 상대적으로 어렵기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 이 절차를 시작하려면 얼어붙은 절단 용액을 부수어 슬러시를 얻으십시오. 슬러시 용액을 얼음에 보관하고 산소 95%, 이산화탄소 5%로 거품을 냅니다.

다음으로, 절개된 머리를 얼음처럼 차가운 절단 용액을 채운 비커에 넣고 몇 초 후에 꺼냅니다. 가는 가위로 꼬리-꼬리 방향으로 정중선을 따라 두개골을 자르고 측면 두개골 부분을 제거합니다. 그런 다음 미세한 주걱으로 뇌를 제거하고 얼음처럼 차가운 절단 용액에 떨어뜨립니다.

그런 다음, 얼음으로 채워진 9cm 페트리 접시의 뚜껑에 뇌를 올려 놓는다. 얼음처럼 차가운 절단 용액으로 뇌를 헹굽니다. 그런 다음 면도날로 소뇌와 후각구를 잘라냅니다.

그런 다음 Vibratome 표본 홀더에 시아노아크릴레이트 접착제를 적용합니다. 뇌 블록을 접착제 방울에 조심스럽게 놓고 목이 위로 향하게 한 다음 즉시 얼음처럼 차가운 절단 용액에 담그십시오. 블레이드 홀더를 수평면을 기준으로 15도 각도로 조정합니다.

뇌 조직을 350미크론의 코로나 조각으로 나눕니다. 그런 다음 슬라이드를 ACSF로 채워진 회수 챔버로 옮기고 산소 95%, 이산화탄소 5%의 지속적인 거품으로 1시간 동안 배양합니다. 본 실험에서는 급성 전전두엽 피질 절편을 준비하는 것도 절차에서 매우 중요합니다.

건강한 뇌 절편은 단단히 패치할 수 있는 활성 뉴런을 의미합니다. 이 절차에서는 기록 전극 또는 퍼프 마이크로피펫으로 사용할 유리 붕규산 마이크로피펫을 만듭니다. 전극 기록의 경우 팁 저항은 4-6메가옴 범위인 반면 퍼프 마이크로피펫은 팁 직경이 2-5마이크로미터 범위입니다.

ACSF에 나트륨 채널 차단제를 추가하여 빠른 나트륨 채널과 활동 전위를 차단하고 기록 챔버에서 이 용액의 분당 2-3밀리리터의 일정한 유속을 유지합니다. 슬라이스의 생존력을 보장하기 위해 ACSF에 95%의 산소, 5%의 이산화탄소를 지속적으로 거품을 냅니다. 뇌 절편을 기록 챔버로 옮기고, 절편의 크기에 맞게 끝이 가늘게 자른 파스퇴르 피펫을 사용합니다.

다음으로, 슬라이스 위에 플래티넘 슬라이스 앵커를 놓아 플랫폼에 고정합니다. 그 후, 기록 마이크로피펫에 내부 용액을 채우고 퍼프 마이크로피펫에 10마이크로몰, 50마이크로몰, 100마이크로몰에서 GABA를 채우거나 차량 제어로 ACSF를 채웁니다. 이물질로 막히는 것을 방지하려면 기록 전극을 ACSF에 담그기 전에 1밀리리터 주사기를 사용하여 약간의 양압을 가하십시오.

현미경 아래에서 기록 전극과 퍼프 마이크로피펫을 팁이 모니터 중앙에 나타나도록 배치합니다. 그런 다음 표적 뉴런을 식별합니다. 퍼프 마이크로피펫을 서서히 내리면서 현미경 초점을 조정하고 45도 각도로 기록 뉴런 위에 놓습니다.

퍼프 마이크로피펫의 끝과 표적 뉴런 사이의 거리를 20-40마이크로미터 범위로 유지하십시오. 천천히 그리고 조심스럽게 기록 전극으로 뉴런에 접근한 다음 양압을 해제합니다. 전극 홀더에 연결된 튜브를 통해 약하고 짧게 흡입하여 기가옴 밀봉을 만듭니다.

전압을 0밀리볼트로 유지하십시오. 기가 옴 씰이 형성 된 후 빠르고 느린 커패시턴스를 수동 또는 자동으로 보상하십시오. 그런 다음 튜브를 통해 짧고 강하게 흡입하여 전체 셀 모드로 전환합니다.

그런 다음 전압 클램프 모드에서 유발된 IPSC 전류를 기록합니다. Master-8 전압 스텝 발생기로 제어되는 퍼프 마이크로피펫을 통해 단일 또는 쌍의 GABA 퍼프를 전달합니다. 최상의 유발 IPSC 전류 결과를 얻기 위해 퍼프 지속 시간을 변경하고 LPS 유도 우울증 모델에서 유발된 IPSC 전류를 측정합니다.

여기에 표시된 것은 10, 50 및 100 마이크로몰 GABA에 의해 유도된 샘플 IPSC입니다. 다음은 퍼프 지속 시간 반응 곡선입니다. 1초, 2초 또는 3초의 인터퍼프 간격으로 50마이크로몰 퍼프에서 GABA가 유발하는 반복적인 전류가 여기에 나와 있습니다.

한 번 숙달된 이 기술은 제대로 수행되면 두 시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 건강한 뇌 조각을 얻기 위해 기억하는 것이 중요하다. 개발 후 이 기술은 약리학 관리 분야의 연구자들이 전기 생리학에서 약물의 효과를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 전체 세포 패치 클램프 기록에서 약리학적 투여를 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. TTX로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 장갑 착용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.