쥐 청각 피 질 및 뇌에서 병 변의 지역화의 stereotactically 인도 제거

이 절차의 전반적인 목표는 청각 피질의 정위 유도 절제와 좌표 지도를 사용하여 뇌 표면의 그림에서 병변을 국소화하는 방법을 설명하는 것입니다. 이 방법은 청각 신경 과학 연구자가 소리 인식에서 경로에서 피질의 역할을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 뿐만 아니라 메커니즘과 라인 위치 가소성.

이 기술의 주요 장점은 모든 조사자가 적용할 수 있는 기본 방법을 사용하여 청각 피질의 외과적 노출 및 절제가 가능하다는 것입니다. 따라서 이 방법은 청각 신경 과학 분야에서 유용할 수 있으며 시각 및 체성 감각과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 이 방법은 또한 편측성 청각 피질 절제가 다른 피질 영역에 가하는 결함을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

이 방법의 시각적 시연은 매우 중요한데, 그 이유는 입체성 좌표를 측두골로 적절하게 식별하고 변환하는 것이 청각 피질을 정확하게 찾는 데 필수적이기 때문입니다. 이 절차를 시작하려면 마취된 쥐를 발열 패드에 올려 체온을 유지합니다. 그런 다음 두 개의 이어바와 바이트 바를 사용하여 동물의 머리를 입체 프레임으로 고정합니다.

두피를 면도하고 포비돈 요오드로 수술 부위를 소독한다. 메스를 사용하여 정중선을 따라 절개하여 두개골을 드러내고 두개골 표면을 덮고 있는 골막을 후퇴시킵니다. 그런 다음 멸균 면봉을 사용하여 두개골 표면을 덮고 있는 혈액을 부드럽게 제거합니다.

브레그마(Bregma), 람다(Lambda) 및 귀 사이 라인을 시각화하려면 메스로 두개골의 등쪽 삽입 부위 근처의 측두근을 절개합니다. 그런 다음 바늘과 봉합사 재료를 사용하여 근육을 빼내고 봉합사 재료를 정위 골격에 고정하여 측두골을 노출시킵니다. 멸균된 직선 바늘을 두개골 표면 바로 위에 올 때까지 천천히 내려 바늘 끝이 귀 간 0에 고정되도록 합니다.

이 점을 0으로 설정합니다. 그런 다음 4개의 점을 사용하여 AC를 대상으로 합니다. 그런 다음 바늘을 측두골 바로 위로 내려 이 네 점을 각각 시각화합니다.

템포럴 골격에 마커로 점을 표시하고 연결하여 직사각형을 그립니다. 사각형은 뼈에서 창을 여는 가이드 역할을 합니다. 이 절차에서는 전기 드릴과 작은 드릴 비트를 사용하여 창을 엽니다.

뼈가 사라질 때까지 8, 000rpm으로 직사각형의 둘레를 뚫습니다. 드릴링 표면을 차가운 멸균 식염수로 헹궈 냉각시켜 피질하 구조의 손상을 방지합니다. 뼈가 무너질 때 뇌를 뚫지 않도록 주의해야 합니다.

경계가 없어지면 미세한 집게로 덮고 있는 뼈를 잡아당겨 차갑고 멸균된 식염수에 보관하십시오. 수술용 현미경을 사용하여 미세 수술용 칼로 수막을 부드럽게 자르고 두 개의 뾰족한 집게를 사용하여 제거합니다. 출혈이 발생하면 수술 부위를 차갑고 멸균된 식염수로 헹굽니다.

다음으로, 멸균 20게이지 뭉툭한 끝 바늘에 연결된 수술용 흡입 장치를 사용하여 AC를 부드럽게 흡인합니다. 6개의 피질층만 흡인하고 아래에 있는 백질은 흡인하지 않습니다. 이 점은 매우 중요하며 매우 신중하게 수행해야 합니다.

흡인이 끝나면 적출된 뼈로 수술 부위를 덮고 흡수성 지혈 거즈를 바릅니다. 측두근이 원래 위치를 회복하도록 한 다음 상처 클립을 사용하여 피부를 봉합합니다. 그 후 상처에 항생제 연고를 바르십시오.

그 후, 부프레노르핀을 진통제로 쥐의 등에 피하 주사, 수술 종료 후 1시간 및 8시간 후. 동물이 깨어날 때까지 가열 패드에 동물을 보관하고 회복을 위해 케이지로 되돌려 놓으십시오. AC 절제 쥐로 수행 한 연구가 완료되면 0.1 밀리리터의 펜토 바르비탈 나트륨을 복강 내 주사하여 말기 마취시킵니다.

링거 용액과 포름알데히드를 심장 주사한 후 머리의 피부와 근육을 제거하여 두개골을 노출시킵니다. 스펜서 가위를 사용하여 안와뼈를 횡단으로 자릅니다. 그런 다음 두개골 뒤쪽을 제거하고 룽거스를 사용하여 두개골의 위쪽 가장자리를 잘라 뇌를 노출시킵니다.

뇌가 손상되지 않도록 주의한다. 뇌가 노출되면 뾰족한 집게를 사용하여 경막을 조심스럽게 제거합니다. 손가락을 사용하여 뇌를 부드럽게 퍼내고 들어 올립니다.

그런 다음 뇌를 들어 올리고 자유로워질 때까지 신경을 절단합니다. 그런 다음 뇌를 포름알데히드 용액에 담그고 섭씨 4도에서 24시간 동안 보관합니다. 고정 후 뇌를 시상 쥐 뇌 매트릭스에 조심스럽게 배치하여 뇌의 측면 표면을 노출시킵니다.

카메라 홀더를 사용하여 피질 표면에서 21cm 위에 카메라를 놓습니다. 그런 다음 슈퍼 매크로 촬영 모드를 선택하고 뇌 표면의 사진을 찍습니다. 그런 다음 이미지 편집기 프로그램을 사용하여 이미지를 열고 50% 축소합니다.Bregma, Lambda 및 귀 간 제로 참조를 식별하고 사진에서 해당 위치를 표시합니다.

뇌의 측면 그림 위에 절제의 윤곽을 그립니다. 청각 피질의 1차 영역과 2차 영역이 위치한 좌표 맵을 편집기 프로그램의 파일로 가져옵니다. 그런 다음 지도를 클릭하고 드래그하여 절제된 뇌의 측면 사진에 겹쳐 놓습니다.

좌표 맵의 Bregma 및 Lambda 참조가 측면 뇌의 그림에서 식별된 Bregma 및 IA 참조와 일치하도록 합니다. 그런 다음 Rhinal fissure를 참조로 사용하여 뇌의 그림을 지도에 맞게 조정하고 일치하게 만듭니다. 백질이 손상되지 않았는지 확인하는 것이 중요합니다.

이것은 뇌의 연속적인 부분을 초기에 면역염색함으로써 이루어질 수 있습니다. 프로토콜의 효능을 입증하기 위해 AC 절제 쥐 3마리를 일주일 동안 생존시킨 다음 달팽이관을 채취하여 성인 달팽이관에 존재하는 가장 관련성이 높은 AMPA 소단위인 GluA2 및 GluA3의 발현 변화를 qPCR에 의해 연구했습니다. AC를 절제한 쥐와 가짜 대조군 동물의 전사체를 비교한 결과, 두 달팽이관에서 GluA2에 대한 하향 조절과 GluA3에 대한 상향 조절이 나타났으며, 이는 본 연구의 이전 연구와 일치합니다.

수술을 시도하는 동안 세 가지를 기억하는 것이 중요합니다: 최소한의 압력으로 가장 낮은 속도로 측두골을 뚫는 것, 혈관이 끊어지지 않도록 수막을 조심스럽게 제거하는 것, 그리고 회백질에 대한 흡인을 제한하는 것입니다. 일단 숙달되면 청각 피질의 외과적 노출 및 절제는 적절하게 수행될 경우 45분 동안 수행할 수 있습니다. 이 절차에 따라 청각 피질의 결핍이 추가 감각 시스템의 기능에 어떤 영향을 미치는지와 같은 추가 질문에 답하기 위해 생리학적, 행동 및/또는 면역세포화학적 방법을 수행할 수 있습니다.