Name: 쥐 청각 피 질 및 뇌에서 병 변의 지역화의 stereotactically 인도 제거 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: 학습하세요 쥐의 청각 피질을 정밀하게 제거하는 스테레오택틱 수술 기법을 통해 병변을 좌표 지도로 지역화하는 방법을. 이 기술은 청각 신경과학 연구와 다른 감각 시스템 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 경제와 경쟁력 (MINECO) SAF2016-78898-c 2-2-R. 스페인 정부에서 교부 금에 의해 지원 되었다

이 연구 모두 스페인어 규정 (로얄 법령 53/2013-법 32/2007)에 따라에서 실시 했다 및 유럽 연합 지침 (지침 2010/63/EU) 관리 및 생물 의학 연구에 있는 동물의 사용에.
 1. 쥐의 준비 참고: 우리는 어떤 호르몬 변화를 피하기 위해 남자 쥐에 실험 수행.
<ol><li>Anesthetize 케 타 민 염 산 염 (30 mg/kg) 및 xylazine 염 산 염 (5 mg/kg) 피하 주사,이 복용량 혼합을 사용 하 여 동물 쥐 해야 될 깊이 취 약 1 헤에 대 한</li>
	<li>꼬집어 쥐 &#39; s 발가락; 부재는 철수의 반사 동물 완전히 의식 하지 않음을 나타냅니다. 쥐 꼬 집 음에 응답, 초기 복용량의 1/3에서 보조 마 취를 줄.</li>
	<li>두 피를 면도 하 고 외과 영역 povidone-요오드 소독.</li>
	<li>38 ° C의 온도 유지 하 고 동물을 안정화 하는 생리대에 동물을 배치 &#39; stereotaxic 프레임 두 귀 바, 물린 막대를 사용 하 여 s 머리. 주의 사용 하 여 피어 싱 귀 바 봐서 고 막 방지.</li>
	<li>각 눈 안과 젤 또는 염 분 혈 청 한 방울을 적용 하 여 눈을 보호.</li>
</ol> 2. 쥐의 측 뼈에 AC의 위치 <ol><li>두개골을 노출 하 고 두개골의 표면을 덮고과 철회 중간 따라 절 개 하 게 한 메스를 사용 하 여.</li>
	<li>Bregma, 람다, 및 쥐 두뇌 22 Paxinos와 왓슨 아틀라스에 따르면 interaural 0 시각화를 두개골의 표면을 덮고 있는 혈액을 부드럽게 제거 하는 살 균 면 팁을 사용.</li>
	<li>메스와 두개골에는 등 삽입 근처 일시적인 근육에서 절 개를 확인합니다. 바늘 및 봉합 사 물자를 사용 하 여 근육을 당겨 하 고 정위 적 프레임; 봉합 사 물자를 수정 이 측 뼈를 노출 합니다. 출혈이 발생 하는 경우 냉 멸 균 식 염 수로 씻어.</li>
	<li>확인을 그것은 완벽 하 게 확보 하는 정위 적 micromanipulator 살 균 스트레이트 바늘 장소.</li>
	<li>바늘의 팁 interaural 0으로 설정 되어 있도록, 두개골의 표면 위에 바로 때까지 바늘을 천천히 낮은. 이 0으로 설정 하 고이 시점에서 좌표를 결정.</li>
	<li>관심 뇌 영역에 따라 정위 적 좌표 다. 쥐 뇌 22 Paxinos와 왓슨 아틀라스를 이용 하 여이 좌표를 결정 합니다. 일단 좌표 결정 됩니다 이동 그 좌표에 맞게 바늘.</li>
	<li>대상 다음과 같은 4 포인트의 좌표를 사용 하 여 AC: a: A / P =-5.8 m m, M/L = + 6.4 m m; B: A/P =-2.7 m m, M/L = + 6.4 m m; C: A/P =-2.7 m m, M/L = + 8.67 m m; D: A/P =-5.8 m m, M/L = + 8.67 m m. 낮은 각이 4 포인트의 시각화 하 측 뼈 위에 오른쪽 바늘. 마커 펜을 사용 하 여, 측 뼈에 포인트를 표시 하 고 사각형; 그리기 위하여 그들을 연결합니다 사각형 창 뼈 ( 그림 1)에 열을 가이드로 될 것입니다.</li>
</ol> 3. AC의 외과 노출 <ol><li>오픈 전기 드릴 및 작은 드릴을 사용 하 여 창 비트 (0.6 m m Ø). 때까지 뼈 떨어져 8000 rpm에서 사각형의 경계를 드릴. Subcortical 구조에 손상을 방지 하기 위해 찬 메 마른 염 분으로 rinsing 하 여 드릴링 표면을 냉각 한다. 무너진 뼈 때 저항에 한 방울을 감지할 수 있습니다. 뇌를 훈련 하지 않도록 주의 하십시오.</li>
	<li>경계가 느슨한, 정밀한 집게와 덮 음 뼈를 올려 고 차가운 멸 균 식 염 수에 보관.</li>
</ol> 4. AC의 절제 <ol><li>수술 현미경 (10 배)를 사용 하 여 부드럽게 meninges microsurgical 칼으로 잘라내어 두 잘 지적 집게를 사용 하 여 그들을 제거. 출혈이 발생 하는 경우 냉 멸 균 식 염 수로 씻어.</li>
	<li>부드럽게 살 균 20 G 무딘 팁 바늘에 결합 된 외과 흡입 장치 (압력-0.24 바)를 사용 하 여 AC 발음. 이 이때 중요 하 고 매우 신중 하 게 수행 되어야 할: 발음만 6 대뇌 피 질의 레이어 및 기본 백색 질.</li>
	<li>꿰 뚫는 동맥 출혈이 멈출 때까지 발음.</li>
	<li>포부 완료 되 면 추출 된 뼈 부상된 영역을 커버 하 고 흡수 hemostatic 거 즈 적용.</li>
	<li>일시적인 근육 그것의 원래 위치에 복구할 및 다음 상처 클립 (9 mm)를 사용 하 여 피부를 봉합 하 게. 항생제 연 고를 적용 (재료의 표 참조). 계속 3 일 동안 매일 두 번 상처에 연 고를 적용. 
	참고: 각 응용 프로그램 이루어져 상처에 적용 얇은 층.</li>
	<li>수술 후 진통 1 시간 및 다음 모든 8 h 72 h. 동안 쥐 (0.05 mg/kg)의 뒤에 피하 주사 buprenorphine</li>
	<li>깨어나면 때까지 난방 패드에 동물을 유지 하 고 복구 하는 주택 케이지 돌아갑니다.</li>
	<li>감동 sutured 지역에서 감 금 소 동료를 방지 하기 위해 개별적으로 동물을 집 고 농축 항목 몇 가지를 제공 합니다. 톱 밥을 매일 감염을 방지 하기 위해 신중 하 게 확인 하는 동물 제대로 복구 불편의 어떤 표시 든 지 보여주지 않는다 변경.</li>
</ol> 5. 조직 컬렉션 주의: paraformaldehyde (PFA), 고체 및 수 처리, 개인 보호 장비 (PPE)를 착용 하 고 안전 캐비닛을 사용.
 참고: 4% (w/v) PFA 인산 염 버퍼 솔루션 (PBS) 열 (55 ℃)를 사용 하 여 x 1으로 용 해 하 여 750 mL 포름알데히드 해결책을 준비. 필터링 필터 종이 포름알데히드 해결책. 벨소리를 준비 &#39; 8.5 g의 NaCl, KCl, 물 1000 mL에 0.2 g NaHCO 3의 0.25 g을 용 해 하 여 s 솔루션 (해결책 pH = 6.9).
<ol><li>동물 연구를 위해 필요한 만큼 생존 하자. AC 연기나 쥐와 함께 수행 하는 연구를 완료 될 때 나트륨 pentobarbital (60 mg/kg)의 0.1 mL의 복 막 내 주입 하 여 그것를 anaesthetize 말기 발가락 핀치와 철수 반사의 부재에 의해 마 취의 깊이 평가.</li>
	<li>동물 취 깊이 때 수행 intracardiac 관류 23 벨의 125 mL의 &#39; s 솔루션 포름알데히드 솔루션의 750 mL의 1.8 m m의 바늘 게이지를 사용 하 여 다음 내경.</li>
	<li>는 관류 완료 되 면, 첫 번째 자 궁 경부 척추에 쥐 목을 벨.</li>
	<li>가 위를 사용 하 여 피부를 제거 하 고 머리에서 근육을 하 고 두개골을 노출. 가 위 컷 및 구멍 매그넘 열고 두개골의 뒤로 제거를 사용 하 여.</li>
	<li>통과 스펜서가 위를 사용 하 여 궤도 뼈를 잘라 하 고 뇌를 노출 하는 두개골의 상단 가장자리를 따라 잘라 rongeurs 사용을 확인 합니다. 두뇌를 손상 하지 않도록 주의 하십시오.</li>
	<li>일단 뇌 노출 조심 스럽게 dura mater 벌금 지적 집게를 사용 하 여 제거. 손가락을 사용 하 여 부드럽게 아래 푸 하 고 두뇌를 상승. 두뇌를 올리고 신경 unt 잘라il 무료입니다. 담가 포름알데히드 솔루션에 두뇌 그리고 24 h. 4 ° C에서 저장</li>
</ol> 6. AC 변의 지역화 <ol><li>후 고정 후 신중 하 게 두뇌의 측면 표면을 노출 화살 쥐 뇌 매트릭스로 두뇌를 배치.</li>
	<li>21 cm 위의 카메라 카메라 홀더를 사용 하 여 피 질 표면, 선택은 &#34; 슈퍼 매크로 촬영 &#34; 모드, 그리고 뇌 표면 사진.</li>
	<li>두뇌 코로나 쥐 뇌 매트릭스 노출은 뇌의 등 쪽 표면에 배치 하 고 다른 사진의 찍을.</li>
	<li>이미지 편집기 프로그램을 사용 하 여 이미지 열고 쉽게 작업할 수 있도록 50% 규모. bregma, 람다, 및 Paxinos와 왓슨 좌표 19에 따라 그림에 interaural 0 참조를 식별 하 고 그림 ( 그림 2)에서 그들의 위치를 표시. 두뇌의 측면 사진을 통해는 절제의 윤곽선을 그립니다. 경계 계산.</li>
	<li>가져오기는 좌표 기본 (A1)와 AC의 보조 영역 (지 및 복 부 외피가) 위치 위치 18 어디 사용 하는 사진 편집기 프로그램의 파일을 매핑합니다. 지도에서 클릭 하 고 끌어 연기나 두뇌의 측면 사진에 첨가를.
	<ol><li>는 bregma 만들고 측면 뇌의 그림에서 확인 된 bregma 및 람다 참조 맞춰 좌표 지도의 람다 참조.</li>
		<li>참조로 rhinal 균열을 사용 하 여 지도, 뇌의 그림을 조정 하 고 ( 그림 2B)에 맞춰 그들.</li>
	</ol></li> <li>계산는 AC.에 의해 점유 하는 영역을 기준으로 병 변의 비율</li></ol>

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</ol>

저자는 연구 잠재적인 상충으로 해석 될 수 있는 어떤 상업적 또는 금융 관계의 부재에서 실시 되었다 선언 합니다.

성공적인 뇌 수술 두 가지 요인에 따라 경첩: 동안 및 절차 후 동물을 살아있는 유지 하 고 정확 하 게 관심의 영역을 찾기. 쥐 (철수 반사 테스트), 수술 중 마 취 깊이 주고받는 적절 한 진통제 및 비 ototoxic 항생제는 생존 도움이 될 보장 합니다. 또한, 쥐 저체온증을 피하기 위해 마 취에서 깰 때까지 열 패드에 유지 되어야 한다. 감염, 민감성 줄어 봉합 및 적절 한 기술을 중요 하다: 동물 그래서 그들은 충분히 꽉 상처에 너무 많은 긴장을 삽입 하지 않고 제거를 방지 하기 위해 이식 한다 그들의 상처 클립에서 선택 합니다.
정확 하 게 찾을 AC (또는 다른 대뇌 피 질의 영역), bregma, 람다, 및 대상 영역의 한계를 계산 참조로 사용 하는 interaural 0의 위치를 결정 하는 것이 중요 하다. 어떤 실수 좌표 계산에 AC의 부분 절제 또는 다른 주변 지역의 원치 않는 열망에 발생 합니다. 따라서, 바늘 팁만 interaural 0에서 뼈를 터치 하 고이 프로토콜에서 설명에 따라 antero 후부 및 평점 옆 좌표를 번역 해야 합니다.
이 원고에 우리는 또한 수술 노출 하 고 AC ablate 방법을 설명 했습니다. 3 중요 한 단계는: 드릴링 과정, 열고 meninges, 및 포부에 의해 제거의 제거. 드릴링 수행 되어야 한다 최소 압력, 낮은 속도에서 높은 드릴링 속도 생성 열 subcortical 구조 근처에 영향을 미칠 수 있습니다. 그러나, 낮은 속도 유지 하 고 냉각 냉 멸 균 식 염 수와 드릴링 지역 손해를 방지 해야 합니다. 또한, 최소 압력의 두개골과 기본 피 질 이후 부상 갑자기 휴식을 피하기 위해 필수적입니다. 커버는 AC meninges의 제거와 혈관을 깨는 피하기 위해 신중 하 게 수행 되어야 한다. 출혈이 발생 하는 경우 초기와 후반 예 후는 일반적으로 호의 베푸는 고 등 동물 신뢰할 수 있는 연구에 대 한 포함 기준을 충족 하는 여부는. 안락사를이 경우에 좋습니다. 마지막으로, 포부 (아마 가장 어려운 측면에 효과적인 병 변), 회색 문제에 제한 되어야 합니다. 백색 물질의 존재를 감지 하는 것을 도울 수 있는 두 가지 지표: (1) 백색 질으로 색상 대비에 변화는 회색 문제; 보다 밝은 (2) 꿰 뚫는 동맥에서 출혈의 정지.
조작 하는 두뇌에서 수행 된 후 현지화, 크기, 및 절차 이후 분석 및 동물에서 얻은 데이터의 유효성 검사에 대 한 피 질에서의 확장을 평가할 필요가 있다. 이 원고에서 우리는 우리의 그룹18에 의해 설명한 좌표 지도 사용 하 여 피 질에서 수행 하는 절제를 지역화 하는 방법 선발. 이 지도 쥐 두뇌22Paxinos와 왓슨 아틀라스와 상관 조직학 섹션의 직렬 섹션 복원에서 얻은 해 부 참조를 사용 하 여 건설 되었다. 따라서, 지도 기본 (A1)와 AC의 보조 외피가 (지 및 복 부) 구분. 이 좌표 지도의 주요 장점은 좋군요 화살 두뇌 매트릭스에 배치 하는 두뇌의 측면 표면에서의 촬영으로 병 변의 신속한 지역화 수 있다는. 또 다른 장점은 실험실 해부학에 더 적은 경험을 가진 그들의 동물 모델에 적응 하 여 지도 사용할 수 있습니다. 그것은 단지 끼얹는다 제어 뇌에서 bregma, 람다, 및 interaural 0 참조 사이의 거리를 설정 하 고 지도 확장 하는 데 필요한 또는 그에 따라 아래로. 참고로 Rhinal 균열을 사용 하 여 지도 하는 두뇌의 그림을 조정. 두뇌 조직학 단면도에서 결정 되어야 합니다 그래서이 좌표 지도에 절제의 깊이 확인할 수 없습니다.
AC의 외과 노출 정위 적 방법의 조합은 누가 쥐에 AC 대상 하고자 조사에 의해 쉽게 적응 될 수 있는 기본 방법이 있습니다. 이것은 급성 실험 또는 영구 장치 주입에 필요한 수 있습니다. 또한, AC의 외과 제거는 이전 사용 되었습니다 모델 심리에 만성 대뇌 피 질의 부족의 효과 공부 하. AC 제거 또한 공부 효과 일방적인 AC 제거 다른 대뇌 피 질의 영역에서 발휘 또는 뇌졸중의 모델 역할을 사용할 수 있습니다. 따라서, 여기에 설명 된 실험 디자인 개별적으로 또는 실험 디자인의 다양 한 조합에 적용할 수 있는 유용한 방법이 있습니다.

쥐 청각 신경 과학에서 가장 일반적으로 사용 되는 동물 모델 중 하나입니다. 동작의 견고성은 재판 하루 수백 위해 일할 수 있습니다. 그것의 감도 및 청각1,2및3의 다른 포유류 비해 그것의 중앙 시스템의 해 부와 기능 조직에 대 한 스펙트럼 시력 만들 쥐의 넓은 범위를 분석 하기 위한 적절 한 동물 모델 청각 신경 과학에서 연구 주제입니다. 쥐 청각 피 질 (AC), 특히, 그것의 구조, 조직, 및 사운드 처리3역할 이해 하려고 여러 해 부와 생리 적인 연구의 대상이 되었습니다. 요즘, AC는 경험 의존 소성, 청각 지 각, 시 냅 스 수용 분야 조직, 기초 청각에 바꾸어 사운드 처리의 대뇌 피 질의 제어에 관심이 신경 과학자 들에 게 인기가 되고있다 핵4,,56,7,,89. 이러한 새로운 접근 포즈 하는 문제를 해결 하려면 절차를 정확 하 게 찾을 수 있는 수술로 AC를 노출 연구 노력 신속 하 게 됩니다. 정위 적 기법을 쉽게 생리 테스트 없이 뇌 내에서 특정 지역을 지역화할 수 있습니다. 비록 뇌 크기는 동물 사이 약간 다릅니다, 모든 뇌 영역의 위치 쥐 뇌의 두개골에 랜드마크에서 설정 하는 정위 적 좌표를 사용 하 여 확인할 수 있습니다.
AC의 제한 제거 가장 직접적 심리와 관련 된 피 질 감각 영역의 외과 제거 이다. 달리 AC, 냉각 또는 로컬 lidocaine 주사10,11,12, 기능의 만성 손실에 AC 결과의 외과 제거 등의 활동을 차단 하는 데 사용 되는 다른 방법. 따라서, AC 제거 병 변 소성의 후속 현상 뿐만 아니라 대뇌 피 질의 부족의 장기적인 효과 공부 하 고 위해 더 적당 하다. AC의 외과 제거와 정위 적 방법의 조합은 대뇌 피 질의 제어 부족13,14,15의 생리, 행동, 및 분자 효과 연구를 성공적으로 사용 되었습니다. ,,1617,,1819. 예를 들어 양자 AC 제거와 쥐 모델 청각 놀라게 반사 및 청각 brainstem 응답 (ABR)16피 질 절제술의 효과 연구 사용 되었습니다. 최근에, 우리는 부상18후 ABR 임계값, 진폭, 및 다른 시간 지점에서 대기 시간에 쥐 AC 생산의 양자 제거 대 그 일방적인 효과 비교 했습니다. 또한, 제한적인 AC 절제의 쥐 모델도 열 등 한 collicus13,,1415 에 내가17 corticofugal 통로 변성의 효과 연구에 사용 되었습니다. 19. 이러한 조작 두뇌에서 수행 된 후 지역화, 크기, 병 변이 피 질에서의 확장을 평가할 필요가 있다. 매우 유용 하지만 tonotopic 지도 기반 신경 응답20,21 의 주요 한계는 쥐 두뇌에서 청각 필드를 찾습니다 하는 데 필요한 electrophysiological 기술이 있습니다. 모든 실험실 필요한 장비 및 전문성 등 녹음을 때문에, 우리 뇌의 표면18의 이미지에는 AC의 cytoarchitectural 한계의 전송에 따라 좌표 지도 건설 한다. 이 지도 생리학 시험 없이 AC를 찾을 매우 유용할 수 있습니다.
현재 프로토콜 stereotactically 가이드 위치, 외과, 노출과 쥐에 AC의 절제 하는 방법을 설명합니다. 그것은 또한 우리의 좌표 지도18 를 사용 하 여 쉽게 녹지 두뇌의 표면 사진을 통해 병 변의 확장을 지역화 하는 방법을 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>입체 액자</td><td>David Kopf Ins.</td><td>900</td><td></td></tr><tr><td>수술용 현미경</td><td>WILD M650 Heerbrugg</td><td></td><td></td></tr><tr><td>가열 패드</td><td>DAGA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>치과 마이크로모터</td><td>W& H elco</td><td>5118</td><td></td></tr><tr><td>다이아몬드 버</td><td>B 브라운</td><td>GD021R</td><td>0.6mm</td></tr><tr><td>외과용 흡입 장치</td><td>Atmos</td><td>Atmoforte E2</td><td></td></tr><tr><td>케타민</td><td>Merial</td><td></td><td>30mg/kg</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Bayer</td><td></td><td>5mg/kg</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>SM-11</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Lawton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>포비돈 요오</td>드 <td>메다</td><td>베타딘</td><td></td></tr><tr><td>멸균 식염수 세럼</td><td>B.Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20G 멸균 바늘</td><td>Terumo Neolus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>면 팁</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>봉합사 재료</td><td>B.Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>항생제 연고</td><td>Quadriderm (Betametasona, Gentamicina, Clotrimazol) - Schering-Plough</td><td></td><td></td></tr><tr><td>겸자</td><td>dimeda</td><td>10.331.12</td><td></td></tr><tr><td>수술 바늘</td><td>세계 정밀 기기</td><td>501940</td><td></td></tr><tr><td>부프레노르핀</td><td>인디비어 영국</td><td>부프렉스</td><td>0.05 mg/kg</td></tr><tr><td>가위</td><td>dimeda</td><td>08.120.15</td><td></td></tr><tr><td>스펜서 가위</td><td>dimeda</td><td>08.804.14</td><td></td></tr><tr><td>Rongeurs</td><td>로튼</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsurgical 칼</td><td>MSP</td><td>7503</td><td></td></tr><tr><td>흡수성 지혈 거즈</td><td>Surgicel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saggital 쥐 뇌 매트릭스</td><td>활성화 시스템 Inc.</td><td>RBM-1000DV / RBM 4000C</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 펜토바르비탈</td><td>베토퀴놀</td><td></td><td>60mg/kg</td></tr><tr><td>카메라</td><td>올림푸스 5.1MP</td><td>C-5060 와이드 줌</td><td>렌즈 F2.8-4.8</td></tr><tr><td>상처 클립</td><td>Reflex 9</td><td></td><td>9mm</td></tr><tr><td>캔버스 12</td><td>ACD 시스템</td><td></td><td></td></tr><tr><td>바늘 게이지</td><td></td><td></td><td>직경 1.8mm</td></tr><tr><td>분리 깔때기</td><td>labbox</td><td>11409</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>GluA2 프라이머</td><td>Forward GeneBank</td><td>NM_017261</td><td>CGGCAGCTCAGCTAAAAACT</td></tr><tr><td>GluA2 프라이머</td><td>Reverse GeneBank</td><td>NM_017261</td><td>TTGTAGCTGGTGGCTGTTGA</td></tr><tr><td>GluA3 프라이머 Forward</td><td>GeneBank</td><td>NM_032990</td><td>ATTGCTGATGGTGCAATGAC</td></tr><tr><td>GluA3 프라이머 Reverse</td><td>GeneBank</td><td>NM_032990</td><td>TTTGCATTGTCGCAAGTCTC</td></tr></tbody></table>

쥐 청각 피 질 및 뇌에서 병 변의 지역화의 stereotactically 인도 제거

Stereotactically-guided Ablation of the Rat Auditory Cortex, and Localization of the Lesion in the Brain

쥐의 피 질 (AC) 청각 경험 의존 소성, 청각 지 각 과정, 및 소리 바꾸어 청각 핵 처리의 대뇌 피 질의 제어에 관심이 청각 신경 과학 수 사관 들에 게 인기가 되고있다. 새로운 주소를 도전, 정확 하 게 찾을 절차 그리고 수술 노출 청각 피 질 것이 연구 노력을 신속 하 게. 정위 적 신경외과 정기적으로 바늘 또는 청각 피 질 내의 미리 정의 된 위치에서 전극 engraft 동물 모델에서 전 임상 연구에 사용 됩니다. 다음 프로토콜을 사용 하 여 정위 적 방법을 새로운 방식. 우리 정의 창이 열리면, 정확 하 게 모두 주 (A1)를 노출 하는 쥐의 temporal bone 및 AC. 사용 하 여이 방법을 보조 (지 및 복 부) 외피가 표면 4 개의 좌표 지점을 식별, 우리는 수술 수행 AC의 제거입니다. 이러한 조작 수행 된 후 지역화, 크기, 병 변이 피 질에서의 확장을 평가할 필요가 있다. 따라서, 우리는 또한 두뇌의 표면에는 AC의 cytoarchitectural 한계를 전송 하 여 건설 좌표 지도 사용 하 여 AC 절제 사후를 쉽게 찾을 수 있는 방법을 설명 합니다. Stereotactically 기반 위치와 좌표 지도 사후에 부상 영역의 지역화와 AC의 절제의 조합 동물에서 얻은 정보의 유효성 검사를 용이 하 게 하 고 더 나은 분석을 리드 하 고 데이터 이해

우리 3 Wistar 쥐에 stereotactically 가이드 위치, 외과 노출 및 AC의 일방적인 제거를 수행합니다. 병 변의 지역화 제거 3에서 수행 확인 쥐 침식 AC (기본, 등, 그리고 복 부 외피가)의 주요 세분 그리고 총 AC 영역 (그림 2B)의 80 ~ 100%의 범위.
제한적인 AC 제거를 수행 하려면 여기에 설명 된 프로토콜 이전 바꾸어 청각 핵에서 대뇌 피 질의 제어 부족의 장기 효과 뿐만 아니라 소성의 후속 현상 연구를 우리의 실험실에서 사용 되었습니다. 이러한 연구에서 AC 제거의 프로토콜은 생리 (ABR)를 적용 하 여 검증 행동 (응답을 놀라게, prepulse 금지; PPI), 그리고 분자 (DNA microarrays, 정량, 그리고 서쪽 오 점) 방법13,14,15,,1617,18,19. 여기, 우리의 프로토콜의 효능을 보여 우리 3 AC 연기나 쥐 1 주일 동안 생존 시키고 수집 조직 수집 하는 동안 cochleae 단계 성인 달팽이 관에 가장 관련성이 높은 AMPA subunits의 표현에 변화를 공부 GluA2 및 GluA3, 정량에 의해. AC에서 사본 사이 비교 연기나 쥐 그리고 모든 수술 과정만 아니라 대뇌 피 질의 제거 수행 했다 가짜 제어 동물 다운 레 귤 레이 션 GluA2, 및 최대 규정 GluA3에 대 한 두 cochleae (그림 3)에 이 우리의 이전 계약 연구19.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56429/56429fig1.jpg"> 
그림 1: 세 가지 다른 수술 단계에서 쥐 측 뼈의 이미지. (A) 측 뼈를 ac stereotaxic 좌표의 이동. 4 개의 포인트 좌표는: a: A/P =-5.8 m m, M/L = + 6.4 m m; B: A/P =-2.7 m m, M/L = + 6.4 m m; C: A/P =-2.7 m m, M/L = + 8.67 m m; D: A/P =-5.8 m m, M/L = + 8.67 m m. (B) 좌표 창 개통을 안내할 것 입 측 뼈의 표면에 사각형을 그리는 데 참조로 사용 됩니다. 드릴링 후 뼈에 창 열 (C) 표시 합니다. 혈관 meninges 두뇌의 표면에 관찰 될 수 있다. R: rostral, d: 등입니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56429/56429fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56429/56429fig2.jpg"> 
그림 2: 쥐 뇌에 병 변을 찾기 위한 절차. (A) 사진 (Paxinos와 왓슨 좌표19)에 따르면 람다와 Bregma stereotactically 이식된 바늘으로 AC 연기나 뇌의 등 쪽 표면. 점선은 뇌의 등 쪽 표면에서 Bregma 및 Interaural 0 뿐만 아니라 9 cm x 9 cm 눈금에서의 위치를 표시합니다. (B)는 AC의 좌표 지도에 겹쳐 연기나 두뇌의 측면 표면의 사진. 병 변의 경계는 그림에서 빨간색으로 표시 됩니다. AC 영역의 경계는 지도에서 검정색으로 표시 됩니다. 이 예제에서는 총 면적 AC에 의해 점령에 관하여 AC 제거의 비율은 84.79%입니다. AC: 청각 피 질, IA: 청각, 인테르 FR: Rhinal 균열. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56429/56429fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56429/56429fig3.jpg"> 
그림 3: AMPA 수용 체 소 단위 GluA2 및 GluA3 일방적인 AC 제거 7 일 후 병 변 후의 mRNA 수준에서 변경. 결과 배 변경의 평균 ± 표준 편차로 표시 됩니다. GluA2 성적표에 대 한 변경 내용은 파란색으로 표시 됩니다. GluA3 성적표에 대 한 변경 내용 빨간색으로 표시 됩니다. GluA2에 있는 상당한 감소와 GluA3의 증가 두 cochleae에서 관찰 (ipsi-contralateral는 절제 하 고); 수술 후 7 일 없이 대뇌 피 질의 제거와 가짜 컨트롤을 기준으로 이것은 우리의 이전 결과19일치 하 여 이다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56429/56429fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

Stereotactically 기반 위치, 노출, 및 쥐에서 청각 피 질 제거 하는 방법을 설명합니다. 절제의 지역화 좌표 지도 사후를 사용 하 여 평가 됩니다.

The rat auditory cortex (AC) is becoming popular among auditory neuroscience investigators who are interested in experience-dependence plasticity, ...

이 절차의 전반적인 목표는 청각 피질의 정위 유도 절제와 좌표 지도를 사용하여 뇌 표면의 그림에서 병변을 국소화하는 방법을 설명하는 것입니다. 이 방법은 청각 신경 과학 연구자가 소리 인식에서 경로에서 피질의 역할을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 뿐만 아니라 메커니즘과 라인 위치 가소성.이 기술의 주요 장점은 모든 조사자가 적용할 수 있는 기본 방법을 사용하여 청각 피질의 외과적 노출 및 절제가 가능하다는 것입니다. 따라서 이 방법은 청각 신경 과학 분야에서 유용할 수 있으며 시각 및 체성 감각과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 이 방법은 또한 편측성 청각 피질 절제가 다른 피질 영역에 가하는 결함을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.이 방법의 시각적 시연은 매우 중요한데, 그 이유는 입체성 좌표를 측두골로 적절하게 식별하고 변환하는 것이 청각 피질을 정확하게 찾는 데 필수적이기 때문입니다. 이 절차를 시작하려면 마취된 쥐를 발열 패드에 올려 체온을 유지합니다. 그런 다음 두 개의 이어바와 바이트 바를 사용하여 동물의 머리를 입체 프레임으로 고정합니다.두피를 면도하고 포비돈 요오드로 수술 부위를 소독한다. 메스를 사용하여 정중선을 따라 절개하여 두개골을 드러내고 두개골 표면을 덮고 있는 골막을 후퇴시킵니다. 그런 다음 멸균 면봉을 사용하여 두개골 표면을 덮고 있는 혈액을 부드럽게 제거합니다.브레그마(Bregma), 람다(Lambda) 및 귀 사이 라인을 시각화하려면 메스로 두개골의 등쪽 삽입 부위 근처의 측두근을 절개합니다. 그런 다음 바늘과 봉합사 재료를 사용하여 근육을 빼내고 봉합사 재료를 정위 골격에 고정하여 측두골을 노출시킵니다. 멸균된 직선 바늘을 두개골 표면 바로 위에 올 때까지 천천히 내려 바늘 끝이 귀 간 0에 고정되도록 합니다.이 점을 0으로 설정합니다. 그런 다음 4개의 점을 사용하여 AC를 대상으로 합니다. 그런 다음 바늘을 측두골 바로 위로 내려 이 네 점을 각각 시각화합니다.템포럴 골격에 마커로 점을 표시하고 연결하여 직사각형을 그립니다. 사각형은 뼈에서 창을 여는 가이드 역할을 합니다. 이 절차에서는 전기 드릴과 작은 드릴 비트를 사용하여 창을 엽니다.뼈가 사라질 때까지 8, 000rpm으로 직사각형의 둘레를 뚫습니다. 드릴링 표면을 차가운 멸균 식염수로 헹궈 냉각시켜 피질하 구조의 손상을 방지합니다. 뼈가 무너질 때 뇌를 뚫지 않도록 주의해야 합니다.경계가 없어지면 미세한 집게로 덮고 있는 뼈를 잡아당겨 차갑고 멸균된 식염수에 보관하십시오. 수술용 현미경을 사용하여 미세 수술용 칼로 수막을 부드럽게 자르고 두 개의 뾰족한 집게를 사용하여 제거합니다. 출혈이 발생하면 수술 부위를 차갑고 멸균된 식염수로 헹굽니다.다음으로, 멸균 20게이지 뭉툭한 끝 바늘에 연결된 수술용 흡입 장치를 사용하여 AC를 부드럽게 흡인합니다. 6개의 피질층만 흡인하고 아래에 있는 백질은 흡인하지 않습니다. 이 점은 매우 중요하며 매우 신중하게 수행해야 합니다.흡인이 끝나면 적출된 뼈로 수술 부위를 덮고 흡수성 지혈 거즈를 바릅니다. 측두근이 원래 위치를 회복하도록 한 다음 상처 클립을 사용하여 피부를 봉합합니다. 그 후 상처에 항생제 연고를 바르십시오.그 후, 부프레노르핀을 진통제로 쥐의 등에 피하 주사, 수술 종료 후 1시간 및 8시간 후. 동물이 깨어날 때까지 가열 패드에 동물을 보관하고 회복을 위해 케이지로 되돌려 놓으십시오. AC 절제 쥐로 수행 한 연구가 완료되면 0.1 밀리리터의 펜토 바르비탈 나트륨을 복강 내 주사하여 말기 마취시킵니다.링거 용액과 포름알데히드를 심장 주사한 후 머리의 피부와 근육을 제거하여 두개골을 노출시킵니다. 스펜서 가위를 사용하여 안와뼈를 횡단으로 자릅니다. 그런 다음 두개골 뒤쪽을 제거하고 룽거스를 사용하여 두개골의 위쪽 가장자리를 잘라 뇌를 노출시킵니다.뇌가 손상되지 않도록 주의한다. 뇌가 노출되면 뾰족한 집게를 사용하여 경막을 조심스럽게 제거합니다. 손가락을 사용하여 뇌를 부드럽게 퍼내고 들어 올립니다.그런 다음 뇌를 들어 올리고 자유로워질 때까지 신경을 절단합니다. 그런 다음 뇌를 포름알데히드 용액에 담그고 섭씨 4도에서 24시간 동안 보관합니다. 고정 후 뇌를 시상 쥐 뇌 매트릭스에 조심스럽게 배치하여 뇌의 측면 표면을 노출시킵니다.카메라 홀더를 사용하여 피질 표면에서 21cm 위에 카메라를 놓습니다. 그런 다음 슈퍼 매크로 촬영 모드를 선택하고 뇌 표면의 사진을 찍습니다. 그런 다음 이미지 편집기 프로그램을 사용하여 이미지를 열고 50% 축소합니다.Bregma, Lambda 및 귀 간 제로 참조를 식별하고 사진에서 해당 위치를 표시합니다.뇌의 측면 그림 위에 절제의 윤곽을 그립니다. 청각 피질의 1차 영역과 2차 영역이 위치한 좌표 맵을 편집기 프로그램의 파일로 가져옵니다. 그런 다음 지도를 클릭하고 드래그하여 절제된 뇌의 측면 사진에 겹쳐 놓습니다.좌표 맵의 Bregma 및 Lambda 참조가 측면 뇌의 그림에서 식별된 Bregma 및 IA 참조와 일치하도록 합니다. 그런 다음 Rhinal fissure를 참조로 사용하여 뇌의 그림을 지도에 맞게 조정하고 일치하게 만듭니다. 백질이 손상되지 않았는지 확인하는 것이 중요합니다.이것은 뇌의 연속적인 부분을 초기에 면역염색함으로써 이루어질 수 있습니다. 프로토콜의 효능을 입증하기 위해 AC 절제 쥐 3마리를 일주일 동안 생존시킨 다음 달팽이관을 채취하여 성인 달팽이관에 존재하는 가장 관련성이 높은 AMPA 소단위인 GluA2 및 GluA3의 발현 변화를 qPCR에 의해 연구했습니다. AC를 절제한 쥐와 가짜 대조군 동물의 전사체를 비교한 결과, 두 달팽이관에서 GluA2에 대한 하향 조절과 GluA3에 대한 상향 조절이 나타났으며, 이는 본 연구의 이전 연구와 일치합니다.수술을 시도하는 동안 세 가지를 기억하는 것이 중요합니다: 최소한의 압력으로 가장 낮은 속도로 측두골을 뚫는 것, 혈관이 끊어지지 않도록 수막을 조심스럽게 제거하는 것, 그리고 회백질에 대한 흡인을 제한하는 것입니다. 일단 숙달되면 청각 피질의 외과적 노출 및 절제는 적절하게 수행될 경우 45분 동안 수행할 수 있습니다. 이 절차에 따라 청각 피질의 결핍이 추가 감각 시스템의 기능에 어떤 영향을 미치는지와 같은 추가 질문에 답하기 위해 생리학적, 행동 및/또는 면역세포화학적 방법을 수행할 수 있습니다.

stereotactically-guided-ablation-rat-auditory-cortex-localization

Research

연구

JoVE Journal

Behavior

행동

우리는 신경 활동과 혈액 산소 수준의 종속 (굵게) MRI 신호 사이의 관계의 조사를 위해 플랫폼을 제공하고 동시에 기능성 자기 공명 이미징 및 쥐 두뇌에 electrophysiological 기록하는 방법을 개발했습니다.

쥐 두뇌에 동시 fMRI와 전기 생리학

stereotaxic 좌표를 사용하여 excitotoxin의 주입에 의한 특정 뇌 영역의 타겟으로 절제 (들)은 설명되어 있습니다. 이 기술은 또한 쥐의 두뇌로 다른 화학 물질의 주입을 위해 적응 수 있습니다.

성인 쥐의 특정 두뇌 영역의 Excitotoxic 병변에 대한 Stereotaxic 외과

이 비디오는 무선 양방향 다채널 전극 장치를 쥐의 뇌에 이식하여 다채널 신경망을 기록하고 자극하는 절차를 보여줍니다.

쥐의 뇌에 무선 양방향 미세전극 시스템 이식

이 비디오는 전기 자극을 사용하여 마취된 쥐의 폰즈에서 조직 손상 또는 경색을 유도하는 절차를 보여줍니다.

전기 자극을 사용하여 쥐 모델에서 급성 폰스 경색 유도

이 비디오는 쥐의 청각 피질을 절제하기 위한 정위 유도 수술 절차를 보여줍니다. 이 단계에는 정위 프레임에 고정된 마취된 쥐에서 해부학적 랜드마크를 식별하고, 청각 피질 위의 두개골에 창을 만들고, 피질층을 흡인하고, 절제가 소리 처리에 미치는 영향을 평가하기 위한 수술 후 관리를 제공하는 것이 포함됩니다.

쥐의 청각 피질 제거를 위한 정위 유도 절제 기법(A Stereotactically Guided Ablation Technology for Auditory Cortex removal in Rats)

이 프로토콜은 설치류에서 동시에 기능성 자기 공명 영상과 깊은 두뇌 자극을위한 표준 방법을 설명합니다. 이러한 실험 도구를 함께 사용은 거의 모든 뇌 대상에 전기 자극에 대한 응답으로 글로벌 다운 스트림 활동의 탐사 할 수 있습니다.

설치류에 동시 fMRI를 깊은 뇌 자극

쥐의 시상하핵(STN)에 전극을 이식하는 방법을 설명합니다. STN의 더 나은 위치 파악은 마이크로 기록 시스템을 사용하여 달성되었습니다. 또한, 동물의 머리와 자극기 사이의 오래 지속되는 연결을 특징으로 하는 자극 설정이 제공됩니다.

미세 전극은 장기 깊은 뇌 자극 쥐의 Subthalamic 핵에 전극의 주입을 가이드

이 연구에서 방법론은 우레탄 마취하에 hyperdirect 통로에서 다중 부위 생체 내 생리 학적 기록을 수행하는 방법에 대해 제시됩니다.

심각한<em&gt; In Vivo</em&gt; 마취 된 래트에서의 Hyperdirect 경로로부터의 국소 장 전위 및 다중 단위 활성의 전기 생리 학적 기록

무선, 멀티 채널 신경 녹음 및 자유롭게 쥐 행동에 자극에 대 한 양방향 시스템 도입. 시스템은 가볍고 콤팩트, 따라서 animal´s 행동 레 퍼 토리에 최소한의 영향을 미치고. 또한,이 양방향 시스템 두뇌 활성화 패턴 및 행동 간의 인과 관계를 평가 하는 정교한 도구를 제공 합니다.

무선, Vivo에서 녹음 하 고 자유롭게 행동 하는 쥐에서 신경 활동의 자극에 대 한 양방향 인터페이스

이 프로토콜의 공동 화 된 electroencephalography (뇌 파)와 멀티-층 류 지역 필드는 마 취 쥐에 잠재적인 동시 녹음에 대 한 간단한 방법을 설명합니다. EEG 신호의 무시할 수 왜곡을 생산 하는 microelectrode의 삽입에 대 한 두개골에 드릴 버 구멍 표시 됩니다.

공동 화 된 Electroencephalography 및 설치류에서 로컬 필드 가능성의 동시 녹음

우리는 생체 내 FDG-PET를 이용한 급성 심부 뇌 자극에 의해 유도 된 대사 신경 조절을 평가하는 전임상 실험 방법을 설명합니다. 이 원고에는 정위 수술에서 자극 치료의 적용, PET 이미지의 획득, 처리 및 분석에 이르기까지 모든 실험 단계가 포함되어 있습니다.

생체 내 쥐의 심부 뇌 자극에 의해 유도 된 활동 패턴을 밝히기위한 양전자 방출 단층 촬영

학습하세요 쥐의 청각 피질을 정밀하게 제거하는 스테레오택틱 수술 기법을 통해 병변을 좌표 지도로 지역화하는 방법을. 이 기술은 청각 신경과학 연구와 다른 감각 시스템 연구에 활용됩니다.

쥐 청각 피 질 및 뇌에서 병 변의 지역화의 stereotactically 인도 제거

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