4.6: 3D 매트릭스를 사용한 침입 분석

과학자들은 세포 침입 및 이동 과정을 보다 정확하게 연구하기 위해 3D 모델을 개발했습니다. 대부분의 전통적인 세포 배양 시스템은 2D이지만, 우리 조직의 세포는 세포외 기질 또는 ECM으로 알려진 분자의 3D 네트워크 내에 존재합니다. 2D와 3D에서 세포 운동성에 필요한 많은 기계론적 과정은 유사하지만, 플라스틱 표면에 비해 ECM의 강성 감소, 이동을 위한 3차원 추가, ECM의 긴 폴리머 그물망을 통한 이동의 물리적 장애와 같은 요인은 모두 2차원 이동과 비교하여 세포에 다른 문제를 제시합니다.

이 비디오에서는 ECM의 기본 기능과 구조, 그리고 세포가 ECM을 통해 조절하고 이동하는 메커니즘을 간략하게 소개합니다. 다음으로, 내피 세포 침입을 연구하는 데 사용되는 일반적인 프로토콜에 대해 논의할 것입니다. 마지막으로, 다양한 생물학적 질문을 연구하기 위한 3D 매트릭스의 몇 가지 응용 분야를 강조합니다.

ECM의 구성과 세포가 ECM과 어떻게 상호 작용하는지 조사하는 것으로 시작하겠습니다.

ECM은 세포를 지원하고, 세포 간 통신을 촉진하고, 조직을 분리하는 등 많은 기능을 수행합니다. ECM 구성은 조직마다 다르고 생물학적 특성도 다르지만 크게 두 가지 유형으로 분류할 수 있습니다. 기저막(substitial membrane)은 조직을 고정하고 분리하는 역할을 하며, 간질성 기질(interstitial matrix)은 조직 내의 세포를 둘러싸고 지지합니다. 간질 기질은 대부분 섬유질 단백질 콜라겐으로 구성되지만 엘라스틴과 피브로넥틴도 포함합니다.

세포가 ECM을 통해 이동하기 위해서는 몇 가지 생물학적 과정이 발생해야 합니다. 첫 번째는 인테그린(integrin)이라고 하는 막관통 단백질을 포함하는 세포-매트릭스 접착입니다. 이들은 ECM을 세포골격(cytoskeleton)으로 알려진 세포의 내부 골격에 연결합니다.

또 다른 과정은 세포의 세포골격의 구조적 재배열입니다. 이것은 인바도포디아(invadopodia)라고 하는 특수 구조의 형성으로 이어지는데, 이는 세포가 주변 기질로 돌출된 것입니다. 마지막 단계는 ECM 변조입니다. 여기에는 일반적으로 기질 메탈로프로테아제(MMP)로 알려진 분해 분자가 포함되는데, 이 분자는 침습족(invadopodia)에 축적되어 주변 ECM을 분해하여 세포 침입을 촉진합니다. 3D 매트릭스 침습 분석을 통해 과학자들은 이 복잡한 과정을 시각화하고 연구할 수 있습니다.

이제 ECM 및 ECM과 세포와의 상호 작용에 대해 잘 알게 되었으므로, 내피 세포가 세뇨관을 형성하기 위해 ECM 침입을 연구하는 프로토콜을 살펴보겠습니다. 3D 환경에서 내피 세포를 배양함으로써 혈관 신생이라고도 하는 혈관 성장의 생물학적 과정을 시뮬레이션할 수 있으며, 이는 정상적인 발달과 암 발달 모두에서 중요합니다.

먼저 내피세포를 배양하고, 트립신과 같은 프로테아제로 세포를 처리한 후 메쉬 필터에 통과시켜 세포 덩어리를 분해하여 단세포 현탁액을 준비합니다. 일반적으로 콜라겐, 피브린, 라미닌 또는 이러한 구성 요소의 더 복잡한 조합으로 구성되는 3D 매트릭스는 실험실에서 준비하거나 상업용 공급업체에서 주문할 수 있으며 얼음 위에서 해동합니다. 대부분의 ECM 제제는 더 높은 온도에서 중합되기 때문에 다른 장비와 시약도 차갑게 유지하는 것이 도움이 됩니다. 세포 현탁액을 해동된 매트릭스 용액과 혼합하여 세포를 내장하고, 이 혼합물을 세포 배양 인큐베이터에 넣으면 더 높은 온도에서 매트릭스가 중합됩니다.

세포-함유 매트릭스가 설정되면, 혈관신생 인자를 포함하는 배양 배지가 매트릭스 접시에 추가됩니다. 그런 다음 타임 랩스 현미경 소프트웨어를 사용하여 개별 세포를 추적하여 매트릭스를 통한 이동을 관찰할 수 있습니다. 결과 이미지를 분석하고 셀 위치를 사용하여 이동 방향과 거리를 미크론 단위로 계산합니다. 그런 다음 이러한 값을 표시하여 세포의 평균 이동 속도인 운동 활동을 결정할 수 있습니다. 마지막으로, 노드, 튜브 및 루프와 같은 기능을 식별하기 위해 시각화 소프트웨어를 사용하여 튜브 네트워크 형성을 관찰하고 분석합니다.

이제 특정 실험에서 3D 매트릭스의 몇 가지 응용 프로그램을 살펴 보겠습니다.

세포 이동은 세포 세포골격의 활성 조절에 의해 매개됩니다. 이 실험에서는 콜라겐 매트릭스를 준비하고 적색 형광 단백질을 포함하는 염색과 혼합하여 시각화를 가능하게 했습니다. 자유 부유 세포 클러스터인 개별 세포 스페로이드는 분리되어 콜라겐 매트릭스에 내장되었습니다. 배양 후, 포동된 세포는 특정 세포골격 성분에 대해 염색되고 형광 현미경으로 이미지화되었습니다. 연구자들은 세포가 ECM을 통해 이동함에 따라 세포골격 구성 요소와 그 변화를 관찰했습니다.

과학자들은 또한 ECM의 특성이 마이그레이션에 어떤 영향을 미치는지 연구할 수 있습니다. 과학자들은 세포가 다양한 농도의 외부 매트릭스로 둘러싸인 내부 겔 매트릭스에 내장되어 있는 동심원 겔 시스템을 사용하여 타임 랩스 현미경을 사용하여 세포를 추적하여 내부 겔에서 초기에 세포가 없는 외부 겔로의 이동을 연구할 수 있습니다. 연구원들은 더 높은 농도의 겔의 강성이 높을수록 세포 변위와 세포 이동의 전체 거리가 모두 증가한다는 것을 관찰했습니다.

마지막으로, 기질 침습 분석은 장기 특이적 맥락에서 혈관 신생을 연구하기 위해 살아있는 동물 내에서 수행할 수 있습니다. 여기에서 생분해성 특성으로 인해 조직 공학에 일반적으로 사용되는 피브린 겔이 생성된 후 쥐의 폐에 이식되어 "접착제"로 젤을 제자리에 고정했습니다. 피브리노겐(Fibrinogen)이라는 단백질로 만들어졌습니다. 세포 이동 및 새로운 혈관 형성이 다음 7-30일 동안 일어나도록 허용한 후 폐와 섬유소 겔을 수확, 고정 및 절편화했습니다. 이 절편의 이미징을 통해 이식된 젤에서 혈관과 폐포 형성이 드러났으며, 연구자들은 생체 내 환경에서 폐 발달의 중요한 측면에 대한 통찰력을 얻을 수 있었습니다.

당신은 방금 세포외 기질 침입 분석에 대한 JoVE의 비디오를 시청했습니다. 이 비디오는 ECM의 구성과 ECM을 통한 세포 이동 방법에 대해 논의하고, 3D 매트릭스를 통한 내피 세포 이동을 연구하는 간단한 프로토콜을 제시하고, 세포-ECM 상호 작용의 맥락에서 현재 연구되고 있는 몇 가지 세포 과정을 강조했습니다. 내인성 세포 이동은 3D 공간에서 발생하기 때문에 이러한 생물학적 조건은 3D 배양 기술로 가장 잘 시뮬레이션할 수 있습니다. 기질 조성의 개선을 통해 과학자들은 실험실에서 세포 이동을 보다 정확하게 복제하고 연구할 수 있게 될 것입니다. 언제나 그렇듯이 시청해 주셔서 감사합니다!