Name: 에 비보 듀오 컬러 이미징 혈관 역학 Contusive 척수 상해를 따르는 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: 학습하세요 척수 손상 후 혈관 역학 변화를 실시간 모니터링하는 듀얼 컬러 투광자 현미경법을 이용한 방법입니다. Sprague-Dawley 쥐 모델에서 혈관 직경 및 혈류 변화를 정량화하여 조기 혈관 복구 전략 개발에 활용할 수 있습니다.

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이 작품은 NIH NS059622, NS073636, 국방부 CDMRP W81XWH-12-1-0562, 장점을 검토 상 I01 미국 재향 군인 담당 부서, 크레이그 H Neilsen 재단 296749, 인디애나 척수 및 뇌 손상 연구 재단 (BX002356에 의해 부분적으로 지원 ISCBIRF) 인디애나 주 보건 (019919), 및 Mari Hulman 조지 기부금 펀드의.

모든 수술 및 동물 취급 절차 관리 및 실험 동물 사용 (국가 연구 위원회)의 인디애나 대학 학교의 약 기관 동물 관리 및 사용 지침에 대 한 가이드 아래 승인으로 수행한 위원회입니다.
1. 수술 준비
<ol>
	<li>척추 안정제를 포함 하 여 모든 수술 도구를 소독. 수술 테이블 및 70% 에탄올과 모든 주변 지역 청소. 비 생존 수술의 준비, 37 ° C가 열 패드 상단 깨끗 한 수술 패드 장소.</li>
	<li>6 주 오래 된 Sprague Dawley (SD) 쥐를 사용 하 여이 연구에 대 한. 무게와 케 타 민 (87.7 mg/kg) 및 xylazine (12.3 mg/kg) 혼합물의 복 주사와 쥐를 anesthetize. 동물 발가락 꼬집어 자극에 응답을 중단 하는 경우 마 취의 적절 한 단계를 확인 합니다. 피하 주사 0.01-0.05 mg/kg Buprenorphine 및 5 mg/kg Carprofen 수술 전에.</li>
	<li>2 지역에 쥐 면: 뒷면 및 목 지역을 가슴 쪽에 자 궁 경관 등뼈 지역. 70% 알코올 잎사귀 betadine 외과 스크럽과 피부 영역 면봉. 수술 중 안구 건조를 방지 하기 위해 눈 연 고를 적용 합니다. 깨끗 한 수술 패드에서 부정사 위치에 동물을 놓습니다.</li>
</ol>
2. 외부 경 정 맥 도관 법
<ol>
	<li>외부 경 정 맥, 쇄 골 근처 펄스 포인트를 찾는 하 여 찾아서 3 해 부 포인트 크로스 포인트는 자리에 수직 절 개를 만들기 위해 작은 봄이 위 컷: 오른쪽 mandible의 큰 결 절의 꼬리 ramus 상 완 골 및 위 (그림 1A). 봄이 위 및 미세 집게를 사용 하 여 선박을 격리 합니다. 1 메 마른 외과 봉합 사 선 (그림 1C)20선단부를 묶어.</li>
	<li>1 1 mL 주사기 가득 염 분 및 21-게이지 바늘 (그림 1B)에서 만든 특수 카 테 터와 연결을 준비 합니다. 그릇에 마이크로 위를 사용 하 여 작은 절 개를 하 고 선박에는 카 테 터를 슬라이드.<ol>
		<li>두 인접 하 고 원심 끝 (그림 1C)을 매 서 바늘을 보안 합니다. 특수 카 테 터는 21-게이지 바늘에서 이루어집니다. 갈기 플랫 팁 및 용접 팁의 2 밀리미터 조각으로 또 다른 21-게이지 바늘에서 잘라. 이 밖에 미 끄 러에서 테를 방지할 수 있습니다. 
		참고: 바늘에 흐르는 혈액의 작은 양의 바늘 혈관을 성공적으로 입력 했습니다 나타냅니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 척추 안정화 및 C5-C7 Laminectomy
<ol>
	<li>경향이 위치에 동물을 놓습니다. 원하는 척추 레벨에서 15 번 메스 블레이드와 중간 선 따라 피부를 잘라. 근육 레이어 5회 에서 7번째 경관 척추 (C5-C7) 양측 측면 측면 (그림 2A)21폭로 해 부. 
	참고: 고 견 사이 스파이크를 찾는 하 여 두 번째 흉부 척추를 (T2)을 찾습니다. C7 척추21,22,,2324찾을 T2 척추에서 위쪽으로 계산 합니다.</li>
	<li>수정 된 안정화 장치를 사용 하 여 쥐의 척추를 안정화 합니다. 측면 척추 뼈의 양쪽에 슬릿을 만듭니다. 스테인리스 스틸 팔 노출된 가로 프로세스 측면 아래 슬라이드와 안정성 (그림 2B)를 확보 하 고 나사를 조입니다.</li>
	<li>조심 스럽게 제거 C5-C7 하기 (laminectomy, 그림 2C).</li>
	<li>계속 moisturized (그림 2D) 노출된 dura mater 위에 식 염 수에 젖은 gelfoam의 작은 조각을 넣으십시오.</li>
</ol>
4. 2 광자 (2 P) 이미징 창 설치
<ol>
	<li>물건 작은 조각의 gelfoam 근육과 척추 뼈 사이의 간격으로 또한 척수와 척추 뼈 사이 gelfoam의 얇은 라인을 물건 다음 조직 접착제 접착제를 사용 하 여 근육-뼈 주변을 밀봉 하기 위하여. 완전 한 건조 (그림 2E)에 대 일 분 기다립니다. 
	참고: 이 단계는 효과적으로 창 시키는 침수 솔루션으로 미래의 출혈을 방지 합니다.</li>
	<li>DdH2O 전자 레인지에 4 %agar 준비 합니다. 고 한 천이 녹는 완전히 후 만질 수 있는 온도에 반환 될 때까지 기다립니다. 한 솔루션으로 1 mL의 멸 균 주사기를 (그림 2E) 벽을 만들려고 윈도우의 가장자리에 파이프. 솔루션 신속 하 게 굳은 렌즈 또는 목표 자유롭게 이동할 수 있도록 유연 하 고.</li>
	<li>이미징에 대 한 준비를 하는 경우 2 P (그림 2F) 이미징에 대 한 창 gelfoam 및 장소 침수 액체를 제거 합니다. 2 광자 현미경 어두운 챔버 내부 안정화 동물 전송 및 2 P 이미징 창 렌즈 아래에 직접 배치. 이미지 창으로 렌즈를 신중 하 게 낮은.</li>
</ol>
5. 첫 번째 형광 염료 및 초기 이미징의 주입
<ol>
	<li>0.5 mL Rhodamine B isothiocyanate-Dextran의 준비 (4 mg/mL 평균 분자량 ~ 70kDa) 염 분에. 솔루션 1 mL의 멸 균 주사기를 이전에 설치한 카 테 터에 주사기를 연결. 
	참고: 형광 염료 솔루션을 준비 하 고 전에 사용 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>주사기를 매우 느리게 우울 하 여 첫 번째 염료를 주사 (그림 3B). 먼저, 관심의 영역을 식별 하는 접 안 렌즈를 사용 합니다. 충전 결합된 장치 (CCD) 카메라를 사용 하 여 랜드마크 이미지와 낮은 확대율에서 표면 혈관 패턴의 밝은 필드 이미지를 얻으려고. 전환 하 레이저 스캐닝 모드와 다음 두 이미지를 수집 하기 위한 소프트웨어 이미징 2p를 열고 고 라인 스캔 데이터.</li>
	<li>Fluorophores 군데 조직에 있는 사용에 맞게 적절 한 2 P 레이저 여기 파장, 전력 및 형광 채널 (첫 번째 염료 빨강 채널)을 선택 하 고 vivo에서 화상 진 찰 (그림 3E)를 수행. 전체 과정에서 열 패드에 동물 유지.</li>
</ol>
6. C7 Contusive 부상 리사 장치를 사용 하 여
<ol>
	<li>C7 중간 타 박상 부상 이전 설립된 프로토콜25,26에 따르면 루이빌 부상 시스템 장치 (리사) 장치를 사용 하 여 수행 합니다.<ol>
		<li>간단히, 다음 보정 리사 무대에 동물을 배치 합니다.</li></ol></li></ol>0 포인트 설정을 선택 하 고 조직 조정 후 변위 (이 경우 0.800 m m), 소프트웨어 충돌 릴리스를 실행 하 고 부상을 만들의 "실험 실행" 버튼을 클릭 합니다.
		<li>부상, 후 식 염 수에 젖은 gelfoam moisturized 유지 하 노출된 dura mater 위에 다른 작은 조각을 놓습니다.</li>
	
	
	<li>4.3 단계를 반복 하 고 다시 수행 vivo에서 화상 진 찰 이전 주입된 붉은 염료와 표시 같은 지역에 (그림 3C &#38; F).</li>
	<li>동물 다시 수술 테이블에 전송 하 고 동물 IACUC IUSM 프로토콜에 따라 적절 한 마 취와 진정을 유지.</li>

7. 두 번째 형광 염료 주입 후 부상 영상
<ol>
	<li>염 분에 Fluorescein isothiocyanate-dextran (4 mg/mL, 평균 분자량 ~ 70 kDa) 0.5 mL를 준비 5.1에서 동일한. 1 mL의 멸 균 주사기에서 솔루션을 작성 하 고 이전에 설치 된 카 테 터와 연결.</li>
	<li>2 P 현미경 어두운 챔버 내부 안정화 동물 다시 전송 하 고 다시 첫 번째 염료에 대 한 빨강 채널와 두 번째 염료에 대 한 녹색 채널 같은 지역 이미지 (3D 인물 &#38; G).</li>
	<li>영상의 마지막에 척추 안정화 장치에서 쥐 놓고 천 벽 청소.</li>
</ol>
8. 동물 희생
<ol>
	<li>이미징, 후 transcardial 관류 프로토콜27다음 쥐를 희생. 척수 샘플을 수집 하 고 4%에 그들을 수정 PFA.</li>
</ol>
9. 오프 라인 데이터 분석: 혈관 직경의 정량화
<ol>
	<li>오프 라인 분석에 대 한 워크스테이션에 이미지 파일을 전송.</li>
	<li>ImageJ 고 "파일"을 선택 하 고 이전 저장 된 원시 데이터 선택 열고 연관 된 단일 이미지 파일 (그림 4B).</li>
	<li>"분석" "비율 설정" (그림 4C) 다음을 선택 하 여 이미지를 보정. "픽셀에서 거리"에 배치 하는 값은 그림 4A에 표시 하는 수식을 사용 하 여 계산 됩니다. 2 광자 광 렌즈의 교정 방정식에 기본 값을 결정합니다. "OpticalZoom"의 값은 Excel 확장 태그 Languagefile (XML 파일) 단일 이미지 파일 (그림 4B)와 관련 된에서 발견 된다.</li>
	<li>혈관의 긴 축에 수직인 선 그리기 (그림 4D1 &#38; E1)와 "분석" 뒤에 "측정"을 선택 하십시오. 혈관 직경의 측정 결과 창에 표시 됩니다 (그림 4D2 &#38; E2). 평균 값을 얻으려고 선박에서 3 회를 반복 한다.</li>
</ol>
10. 오프 라인 데이터 분석: 빨간 혈액의 정량화 셀 (RBC) 속도
<ol>
	<li>분석을 위한 워크스테이션을 라인 스캔 파일을 전송.</li>
	<li>ImageJ 소프트웨어 시작 고 "파일"을 선택 하 고 이전 저장 된 원시 데이터 선택한 확장 이름 ".ome"와 모든 연결 된 라인-스캔 파일을 열.</li>
	<li>"이미지"를 열고 "스택" 뒤에 "스택 이미지"를 선택 합니다. 단일 이미지 스택 TIFF 파일로 모든 오메 파일을 변환 합니다.</li>
	<li>Matlab 소프트웨어를 시작 하 고 "열기"를 클릭 합니다, 그리고 "LSPIV_parallel.m" 코드 파일을 선택 합니다. 참고: LS-PIV를 위한 Matlab 코드 https://sourceforge.net/projects/lspivsupplement/files/18 에서 다운로드 될 수 있다</li>
	<li>다음 주문을 선택: "실행" &#62; "폴더 변경" &#62; "동맥". 10.3에서 생성 된 이미지 스택 TIFF 파일을 선택 합니다.</li>
	<li>"Y"를 입력 하 고 Enter 키를 누릅니다.</li>
	<li>커서를 왼쪽 및 오른쪽 이미지의 각각, 그리고 프로그램 데이터 처리 하기 시작.</li>
	<li>프로그램의 끝에, 최종 읽기 계산을 2 값을 입력: "pixel_meter 변환 값", 그리고 "스캔 시간 변환 값". 둘 다 라인 스캔 데이터와 관련 된 XML 파일에서 찾을 수 있습니다. 최종 값으로 평균 및 표준 편차 (mm/s) 당 밀리미터의 단위로 속도의 표시 됩니다.</li>
</ol>

<ol><li>National Spinal Cord Injury Statistical Center. <a target="_blank" href="https://www.nscisc.uab.edu/Public/Facts%20and%20Figures%20-%202017.pdf">Spinal Cord Injury Facts and Figures at a Glance.</a> SCI Data Sheet 2016. , (2016).</li>
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<li>Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O'Herron, P., Kara, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+artery-specific+fluorescent+dye+for+studying+neurovascular+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling.</a> Nat Methods. 9 (3), 273-276 (2012).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

과학 다음 혈관 연구에 대 한 하나의 도전 전통적인 기법 혈관 구조 변화 사후 샘플에 크게 제한 하기 때문에 기술적 제한입니다. 이 소설 에서 vivo imaging 위에서 설명한 방법을 혈액 흐름과 관련된 매개 변수 (속도 및 선박 직경) 살아있는 쥐에서 2 P-LSM을 사용 하 여 동적 측정을 수 있습니다. 그것은 또한 contusive 영향은 다음 다른 시간 지점에서 혈관의 동일한 세트에 반복된 검사 수 있습니다. 이전 2 광자 현미경 이미징 기술을 단일 추적 프로그램의 누설 때문 후 외상 혈관 구조를 포착 하지 못했습니다. 우리의 듀오 컬러 디자인 충격적인 모델에 대 한 동적 혈관 이미징이 있습니다. 또한,이 방법의 유연성 급성 혈관 변화 영향은 다음의 임시 공간 프로 파일을 생성 하는 기회를 제공 한다
우리의 에 비보 듀오 컬러 이미징 방법에 몇 가지 중요 한 단계가 있다. 첫째, 시간 경과 영상, 특히 호흡 모션 아티팩트를 줄일 전에 척수의 물리적 안정성을 보장 하기 위해 기본적 이다. 우리 설계 안정화 동안 척추 척추의 높이 약간 인상 척추 클램프의 모양. 따라서 호흡 동물을 연관 척수의 운동 수 크게 감소 (그림 1D-F, 2B). 이미징 각 세션의 시작 전에 척수의 안정성을 확인 하는 것이 좋습니다. 척수 안정성을 달성 하지 못하면 조정 정렬 및 척수 클램프의 견고 하 여야 한다. 둘째, 주변 조직 (뼈, 근육 층 및 피부) 이미징 창으로 출혈 보기의 오염 위험 수 있습니다. 부드러운 이미지 세션에 대 한 효과적인 예방에 대 한 주변 조직에 gelfoam 조직 접착제 접착제를 적용 합니다. 셋째, 우리가 선택 하는 형광 염료로 알 부 민 (66 kDa), 주요 높은 분자량의 혈장 단백질은 비슷한 크기를 있다. 조건 하에서 항상성, 염료 민28유사한 선박 내부 크게 유지 했다. 부상 후 염료 방해 내 피 구조를 통해 전달 하 고 맥 관 구조 (그림 3 층-G)의 주변 지역에서 형광 강도 중요 한 증가 일으키는 실질에 유출. 또한, 우리가 외부 경 정 맥 도관 법을 선택 하는 이유는 두 가지 이유가 있다. 첫째, 그것은 언제 든 지 실험의 배달의 일관 되 게 액세스할 수 있는 경로 제공할 수 있습니다. 둘째, 그것은 미래의 치료 주사에 대 한 경로로 사용할 수 있습니다.
비록 우리의 vivo에서 듀오 컬러 방법 외상 성 혈관 이미징 연구에 대 한 새로운 장소를 제공할 수 있게,이 기술에 대해 약간의 경고를 해결 합니다. 현재,이 기술은 2 시간 포인트 (기준선 및 1 시간 후 포인트)에서 혈관 변화를 평가 하기 위해 설계 되었습니다 하지만 추가 형광 염료와 채널 사용할 수 있는 경우 여러 시간 포인트 전환 가능. 비록 만성 intravital 이미징 이식된 유리 창을 사용 하 여 여러 연구, 외상 성 부상19,,2930, 후 동일한 선박에 초기 계획 정보 제공할 수 있습니다 그들 중 누구도 31,32. 이러한 연구와 달리 우리의 창 없는 유리 창이입니다. 이것은 사전 및 사후 부상 이미징, 편리 하지만 장기 관찰에 대 한 창 재건에 대 한 도전 수 있습니다. 우리의 미래 연구는 만성 이미징 기술 향상에 노력 하고있다. 혈관 시스템은 여러 선박 종류 (동맥, 정 맥 및 모 세관)로 구성 되며 각 형태와 기능의 측면에서 다른. 영상 중 선박 종류 중에서 차별화는 애타게 혈관 변화의 명확한 패턴을 도울 수 있었다. 위의 프로토콜 형태 및 속도;에 따라 선박을 식별 하는 관찰자에 따라 달라 집니다. 그러나, 동맥 특정 염료 선박 종류33사이 더 명확한 분류 줄을 쉽게 추가할 수 있습니다.
이 기술은 contusive에 평가 제한 및 다른 충격 모델, 호감의 부상과 방사선 상해 뿐만 아니라 하지만에 BSCB의 초점을 맞추고, 뿐만 아니라 혈관 침투성 변경. 스키, 외 루 경화 증 (ALS), 다 발성 경화 증 (MS) 등 다른 신경 퇴행 성 질환에 따라 혈관 변화를 공부 하 사용 될 수 있습니다. 또한, 동적 neurovascular 상호 작용을 공부 하는 유전자 변형 동물 모델에 양도 될 수 있습니다. 강력한 검사 도구로 서 미래 연구는 척수 부상에 대 한 치료의 효능을 평가 하기 위해 여기에 설명 된 이미징 기술을 활용 수 있습니다.
결론적으로, vivo에서 듀오 컬러 방법은 신뢰할 수 있는, 실시간 vivo에서 접근 도구는 시간적 공간적 혈관 프로필의 동적 혈관 변화를 평가 하 고 치료에 대 한 심사 영향은 다음과 같은 2 차 피해를 줄이기 위해

외상 성 척수 상해 (SCI) 모터, 감각, 및 자치 기능의 손상으로 이어지는 일반적인 상해가 이다. 에 따르면는 국립 척수 부상 통계 센터 (NSCISC) 2016 년에, 약 282000 명 동안 그들의 69% 교통 사고 때문에 주로 영향을 받은 또는1폭포. 이러한 환자는 종종 인텐시브 케어; 필요 그러나, 효과적인 치료는 현재 사용할 수 있습니다. 따라서, 과학으로 새로운 효과적인 전략 시급히 필요 합니다.
과학은 주로 두 개의 단계로 분할 된다: 기본 부상과 2 차 부상. 영향2, 염증, 세포 apoptosis, 점차적으로 이어질 나머지 축 삭의 demyelination 등 보조 부상 사건의 연속에 의해 다음의 사이트에서 출혈 성 괴 사를 일으키는 물리적 모욕을 구성 하는 주요 부상 에 형태학 상과 기능적인 적자3,4,,56의 확장. 출혈 부상, SCI7,8의 급성 단계에서 즉각적인 혈관 장애를 나타내는의 첫번째 보이는 표시 이다. 초기 혈관 손상을 줄이기 위한 신경 보호 전략 환자의 회복을 향상 시킬 수 있습니다 하지만이 사건의 초기 포스트 상해는 혈관 병 태 생리 메커니즘의 더 나은 이해.
이전 연구는 척수 맥 관 구조 공부를 다양 한 방법을 사용 하 여에 불구 하 고 중요 한 한계는 남아 있다. 예를 들어 수소 클리어런스9, autoradiography10, microangiogram8, 관 부식 캐스트11및 immunohistochemistry12, 사후 샘플만을 공부 하는 가장 공유 단점 ,13. 레이저 도플러 Flowmetry 척수 혈액 흐름14의 비 침범 성 실시간 모니터링을 제공, 하지만 그것은 혈관 시스템을 구별 하 여 혈관 형태학 상 변화를 감지 수 없습니다. 동적 대비 강화 된 MRI (DCE-MRI) 또한 비 침범 성, 하지만 그것은 저해상도 이미지를 생성 하 고 비싼 인프라15요구.
Vivo에서 2 광자를 사용 하 여 이미징 레이저 스캐닝 현미경 검사 법 (2 P-LSM) 피 질16,,1718에 vasodynamics 공부에 대 한 개발 되었습니다, 그리고 연구의 제한 된 수 있다 두 가지 이유로 더 도전 contusive 부상 후 시연된 혈관 변화 영향은 탕 외. 다음 hemisection 모델19, 그러나 영상에서 병 변 사이트의 가장자리에 혈액의 흐름에 변화를 보여왔다. 첫째, 전통적인 유리 광학 창 부상 사이트 것 하지 기계적 영향을 유지 하 고 이미징 기능 유지. 둘째, 누설으로 인해 실질에 추적의 출혈 후 부상 영상과 어려움을 만듭니다.
여기 우리가 영상 사전 및 사후 부상 시간 지점에서 동일한 개별 선박 수 소설 듀오 컬러 이미징 방법 제시. 또한, 그것은 contusive 문화에 따라 혈관 동적 변화의 시간적 공간 프로 파일 제공 또한 여러 후 시간 점에서 이미징에 대 한 가능성이 있다. 이 프로토콜은 혈관의 상호 작용을 공부 하는 유전자 변형 동물에 직접 적용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>퍼듀 제품 베타딘 외과용 스크럽</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>19-027132</td><td>피부 살균</td></tr><tr><td>케타민 (87.7 mg/kg)/자일라진 (12.3 mg/kg)</td><td>패터슨 수의사&nbsp;</td><td>07-881-9413, 07-890-5745</td><td>마취제</td></tr><tr><td>부프레노르핀(0.03 mg/mL)&nbsp;</td><td>패터슨 수의사&nbsp;</td><td>07-891-9756</td><td>통증 완화제</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-844-7425</td><td>비스테로이드성 항염증제</td></tr><tr><td>Dukal Gauze Sponges&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-415-490</td><td>피부 살균</td></tr><tr><td>Decon Ethanol 200 Proof</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-450</td><td>피부 살균</td></tr><tr><td>인공 눈물 눈 연고</td><td>Webster 수의학</td><td>07-870-5261&nbsp;</td><td>안구 건조를 방지&nbsp;</td></tr><tr><td>코튼 팁 애플리케이터</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1006015 로다민 B 이소티오시아네이트; Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R9379</td><td>평균 mol wt 70kDa</td></tr><tr><td>Fluorescein isothiocyanate&ndash; dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46945</td><td>평균 mol wt 70kDa</td></tr><tr><td>기기 살균기</td><td>정밀 과학 도구</td><td>18000-50</td><td>살균 수술 도구</td></tr><tr><td>척추 안정기 세트</td><td>Norton Neuroscience Institute</td><td></td>에서 맞춤 제조 <td>자세한 내용은 Y. Ping Zhang에게 문의하십시오. (yipingzhang50@gmail.com)</td></tr><tr><td>Vetbond</td><td>3M Animal Care Products</td><td>1469SB</td><td>Tissue 접착제</td></tr><tr><td>접착제 Gelfoam</td><td>Henry Schein</td><td>9083300</td><td>출혈 중지</td></tr><tr><td>Noyes 스프링 가위</td><td>F.S.T</td><td>15013-12</td><td></td></tr><tr><td>파인 펜셋 - Dumont # 5</td><td>F.S.T</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Rongeur</td><td>Fine Science Tools</td><td>16021-14</td><td>laminectomy</td></tr><tr><td>외과 견인기</td><td>Fine Science Tools</td><td>17005-04</td><td></td></tr><tr><td>메스</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>10003-12&nbsp;</td><td>스킨 컷</td></tr><tr><td>메스 블레이드 #15</td><td>Royal-Tek</td><td>BS2982</td><td>스킨 컷</td></tr><tr><td>마이크로 각도 가위</td><td>세계 정밀 기기</td><td>500260</td><td>모든 공급업체에서 제공 가능</td></tr><tr><td>3-0 vicryl 봉합사</td><td>Ethicon</td><td>J393H</td><td>모든 공급업체에서 제공 가능</td></tr><tr><td>Silk Black Braided Non-Absorbable Suture, 3-0, C-7, Reverse Cutting, 18"</td><td>LOOK</td><td>786</td><td>모든 공급업체에서 제공 가능</td></tr><tr><td>1 ml 주사기</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4010.200.V0</td><td>모든 공급업체에서 제공 가능</td></tr><tr><td>21 게이지 바늘</td><td>BD</td><td>305165</td><td>모든 공급업체에서 제공 가능</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td><td>모든 공급업체에서 제공 가능</td></tr><tr><td>Two-photon Laser Scanning Microscope</td><td>Bruker Fluorescence Microscopy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LISA device</td><td>Norton Neuroscience Institute</td><td></td><td>에서 맞춤 제작자세한 내용은 Y. Ping Zhang에게 문의하십시오. (yipingzhang50@gmail.com)</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>HCImage Live</td><td>Hamamatsu Corporation</td><td></td><td>이미징 소프트웨어</td></tr><tr><td>PrairieView</td><td>Prairie Technologies/Bruker</td><td></td><td>Two-photon imaging software</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>Image analysis software</td></tr><tr><td>Matlab statistics 도구 상자</td><td>The MathWorks, Inc.</td><td>https://www.mathworks.com/products/statistics.html?s_tid=srchtitle</td><td>이미지 분석 소프트웨어</td></tr></tbody></table>

에 비보 듀오 컬러 이미징 혈관 역학 contusive 척수 상해를 따르는 방법

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

척수 상해 (SCI) 상해의 사이트에 중요 한 혈관 장애를 발생합니다. 혈관 병 리 과학 후 즉시 발생 하 고 급성 부상 단계에 걸쳐 계속 됩니다. 사실, 내 피 세포 contusive 문화 후에 먼저 표시 혈액 척수 장벽 (BSCB)의 증가 된 침투성을 포함 한 초기 혈관 이벤트 vasogenic 부 종 유발 하 고 복잡 한 부상 메커니즘에 의해 발생 하는 해로운 2 차 부상 이벤트에 기여. 혈관 장애를 대상으로 따라서, 수 과학 후 조직학 및 기능 장애에 기여 하는 보조 부상 계곡을 줄이기 위해 핵심 전략 이전 연구와 사후 샘플에 수행 주로 했다 혈관 네트워크의 동적 변화를 포착 하지 못했습니다. 이 연구는 vivo에서 듀오 컬러 2 광자 이미징 메서드를 contusive 문화에 따라 급성 혈관 동적 변경 내용을 모니터링 개발 했습니다. 이 방법은 혈액 흐름, 혈관 직경, 및 사전 및 사후 부상 같은 쥐의 다양 한 사이트에서 다른 혈관 병 리 수 있습니다. 전반적으로,이 방법은 혈관 역학 조사에 대 한 훌륭한 장소를 제공 합니다.

방법은 변화를 모니터링 vivo에서 동적 척추 혈관 개별 선박 수 사전 및 포스트 외상 성 문화 첫째, 카 테 터는 후속 형광 염료 주사 (그림 1A-C, 그림 3)에 대 한 액세스 권한을 제공 하려면 외부 경 정 맥을 통해 설치 됩니다. 두 번째 단계에서 전문된 기구는 노출된 C5-C7 (그림 1D-F, 그림 2A-B)를 안정화 하는 데 사용 됩니다. 이 안정화 단계 호흡 아티팩트를 제거 하 고 꾸준한 이미지를 제공할 수 있습니다. (그림 2C) laminectomy, 다음 다음 단계 2 P C5-C7 (그림 2D-F)을 통해 창 이미징의 설치입니다. 주변 조직 척추 영상 창의 주위 출혈을 최소화 하는 것이 성공적인 혈관 이미징에 대 한 중요 합니다. 다음 단계 (그림 3A-B, E) 기준으로 rhodamine dextran 형광 염료 (빨간색) 랜드마크 지도 혈관 네트워크를 언급 한 카 테 터를 통해 주입 하는. C7 중간 중간 심각도 contusive 부상, 후 원하는 후 시간 포인트에서 도입 FITC-dextran (녹색) (그림 3A &amp; D). 듀오-색 방법의 아름다움은 한 여전히 첫 번째 염료는 이미 부상 (그림 3G)으로 인해 실질으로 밖으로 유출 하는 경우 두 번째 염료를 사용 하 여 혈관 구조를 검색할 수 있습니다.
이미징 세션 동안 그것은 마 취 유도 후 몸 핵심 온도 유지 하는 생리대에 동물을 유지 하는 것이 좋습니다.
우리의 듀오 컬러 메서드를 사용 하 여 개별 혈관의 직경 및 적혈구 속도 (RBC 속도) 측정 되 고 계산. 직경, 하나 ImageJ 교정 (그림 4) 후 3 반복에 그것의 최대 직경에 선박을 측정 하기 위해 사용할 수 있습니다. 속도, 라인 스캔 이미지 RBC 속도 (그림 5)18계산 Matlab 프로그램 (MATLAB R2013a)를 사용 하 여 측정 됩니다. 형태학, 혈액 흐름 속도, 및 혈관 직경에 따라, 혈관으로 분류할 수 있습니다 2 카테고리: 동맥과 정 맥 (표 1 참조).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56565/56565fig1.jpg"> 
그림 1 . 경 정 맥 도관 법 및 척추 안정화 (A) 외부 경 정 맥을 찾기 위한 그리기 회로도. (B) 21-게이지 바늘에서 만든 특수 카 테 터. 팁 지상 평평 하 고 다른 21-게이지 바늘에서 잘라 2 밀리미터 팁의 조각으로 용접 했다. (C)는 회로도 도관 법의. 선단부는 근 위 카 테 터 안정화, 혈관 (혈관 결 찰, 파란색 화살표) 함께 바늘을 고정으로 끝나는 다음 먼저, 출혈입니다. (D) 수정된 척추 안정제의 이미지. C5-C7 창 laminectomy (E) 이전 및 laminectomy contusive 문화 (F) 후 표시 됩니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56565/56565fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56565/56565fig2.jpg"> 
그림 2 . 광 창 설치 단계별 회로도입니다. ( A) 1 단계: 절단 피부와 중간 선 따라 근육에 의해 척추를 노출. (B) 2 단계: 척추 안정화. (C) 3 단계: laminectomy. (D) 4 단계: 식 염 수에 젖은 gelfoam의 조각을 배치 하 여 척수의 수 분을 유지. 5 단계 (E) : 살 균 gelfoam와 vetbond 간격 물개. 건조 후, 한 천 벽의 레이어 창의 가장자리에 만들어집니다. (F) 6 단계: 이미지에 대 한 준비, 이미징 창 2 P 내부 gelfoam 및 장소 침수 액체 제거. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56565/56565fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56565/56565fig3.jpg"> 
그림 3 . vivo에서 듀오 컬러 방법 절차 단계별. 5 단계 (A)모든 절차에 의하여 이루어져 있다. 다음 1 단계와 2 단계, 대략 70의 크기와 한 쌍 dextran 추적기의 KDa는 (전에 척수 맥 관 구조를 시퀀스에 주입 하는B 와 C) contusive 문화 (D)후. (E)-(G) 대표 2 P 이미지-단계 5 단계 3에서 척수 맥 관 구조를 표시. 흰색 화살표 영역 (F 및 G)를 새 첫 번째 파 붉은 염료를 가리킨, 청록색 화살촉 표시 두 번째-파도 녹색 염료 누설 (G). 눈금 막대 = 50 µ m. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56565/56565fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56565/56565fig4.jpg"> 
그림 4 . 수집 및 척추 혈관 직경의 정량화 준비, 다음 단일 이미지 파일 보정된 값 (B)의 XML 파일과 함께 2 P 현미경 아래 획득 됩니다. (A) 방정식 표시 "픽셀의 미크론 당" 광학 확대/축소 값에 따라 계산이 됩니다. ImageJ (C)에서 교정, 후 선박 직경 전에 경도 축을 3 지점에서 측정 된다 (D1) 후 (E1) 부상. (D2) 및 (E2) 측정된 값을 표시. (F) 기준선과 30 분 후 상해에서 혈관 직경의 정량화. 눈금 막대 = 50 µ m. 데이터 표시 됩니다 ± SD, 의미 * * * p &lt; 0.0001, 양측 쌍체 t 검정.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56565/56565fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56565/56565fig5.jpg"> 
그림 5 . 수집 및 척추 배 속도의 정량화 라인 스캔 이미지 파일은 단일 선박 속도 계산 하기 위해 2 P 현미경 아래 획득 됩니다. (A)는 선택한 용기와 혈관 RBC 속도 평가 하는 방법의 예입니다. (B) 라인 스캔 이미지와 속도의 계산에 대 한 해당 플롯 파일의 동맥 예 뿐 아니라 정 맥 (C)의 예. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56565/56565fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>동맥</td>
			<td>정 맥</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>형태학</td>
			<td>직선, 부드러운, 두꺼운 혈관 벽</td>
			<td>분기, 거친 가장자리</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>혈액 흐름 속도</td>
			<td>빠른</td>
			<td>천천히 하지만이 다릅니다.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>직경</td>
			<td>30-80 µ m</td>
			<td>100-250 µ m</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 1: 기준 선박 유형 식별

우리는 vivo에서 이미징 방법 성인 Sprague-Dawley 쥐에 contusive 척수 상해 다음 동적 척추 혈관 변화 추적 하기 위한 두 개의 서로 다른 형광 성 염료를 사용 하 여 소개 합니다.

에 비보 듀오 컬러 이미징 혈관 역학 Contusive 척수 상해를 따르는 방법

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues ...

이 생체 내 듀오 컬러 이광자 이미징 방법의 전반적인 목표는 타박성 척수 손상 후 발생하는 급성 척수 혈관 역학 변화를 모니터링하는 것입니다. 이 방법은 이러한 동적 혈관 변화가 척수 손상 후 발생하는 병리학적 진행과 기능적 결핍에 어떤 영향을 미치는지에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 프로모던스 샘플을 사용하는 전통적인 기술에 비해 이 기술의 주요 장점은 살아있는 동물 내에서 척수 손상의 급성 혈관 역학에 대한 증거를 제공한다는 것입니다.이 기술의 의미는 척수 손상 치료로 확장되며, 이 방법을 통해 조기 혈관 복구를 목표로 하는 잠재적인 신경 보호 전략을 검토할 수 있습니다. 이 듀오 컬러 이미징 방법에 대한 아이디어는 대비되는 형광 색상을 순차적으로 주입하면 척수 손상 후 파괴된 혈관을 시각화할 수 있다는 것을 발견했을 때 처음 떠올랐습니다. 시술을 시작하기 전에 6주 된 암컷 Sprague Dawley 쥐의 발가락 꼬집음에 대한 반응 부족으로 적절한 진정 수준을 확인한 후 진통제와 항염증제를 피하 주사합니다.쥐의 경추 부위와 동물 가슴 쪽의 목 부위를 면도하고 베타 딘 수술 용 스크럽과 70 % 알코올 물티슈로 노출 된 피부를 면봉으로 닦습니다. 동물의 눈에 연고를 바르고 멸균 현미경으로 섭씨 37도의 가열 패드 위에 있는 멸균 수술 패드 위에 누운 자세로 쥐를 놓습니다. 쇄골 근처의 맥박점을 찾아 외부 경정맥을 찾고, 한 쌍의 작은 멸균 스프링 가위를 사용하여 오른쪽 하악의 꼬리 골반, 상완골의 큰 결절 및 마누브리움의 교차점을 수직으로 절개합니다.스프링 가위와 가는 집게를 사용하여 경정맥 혈관을 분리하고 멸균 수술용 봉합선을 사용하여 혈관의 말단부를 접합합니다. 그런 다음 마이크로 가위를 사용하여 혈관 벽을 작게 절개하고 식염수가 채워진 1ml 주사기에 부착된 21게이지 바늘로 만든 특수 카테터를 혈관 안으로 밀어 넣습니다. 소량의 혈액이 바늘에 들어가면 삽입이 성공한 것입니다.바늘의 근위부와 말단부에 바늘을 고정합니다. 척추를 안정시키려면 동물을 엎드린 자세로 바꾸고 숫자 15 메스 날을 사용하여 원하는 척추 수준에서 정중선을 따라 피부를 자릅니다. 견갑골 사이의 스파이크로 두 번째 흉추를 찾고 T2에서 위쪽으로 세어 C7 척추를 찾습니다.5번째부터 7번째 경추까지 근육층을 양측으로 절개하여 외측을 노출시키고 외측 척추뼈의 양쪽에 슬릿을 만듭니다. 변형된 안정화 장치의 스테인리스강 암을 노출된 횡방향 공정 패싯 아래로 밀어 넣고 나사를 조여 척추를 안정화합니다. 그런 다음 C5에서 C7 얇은 판을 조심스럽게 제거하고 노출된 경막 위에 식염수에 적신 작은 젤 폼 조각을 올려 수분을 유지합니다.이광자 이미징 창을 만들려면 근육과 척추뼈 사이의 틈새에 작은 젤 폼 조각을 넣고 척수와 척추뼈 사이의 얇은 젤 폼 선을 놓습니다. 그런 다음 조직 접착 접착제로 주변 근육 뼈 부위를 밀봉합니다. 성공적인 이미징 창을 준비하는 데 가장 중요한 단계는 창 내부에 경미한 출혈이 없는지 확인하는 것입니다.접착제를 약 5분 동안 건조시킨 후 멸균 1ml 주사기에 따뜻한 4% 한천을 채우고 창 가장자리를 따라 한천 벽을 분배합니다. 한천은 유연성을 유지하면서 빠르게 응고됩니다. 기준선 이미지를 얻으려면 먼저 젤 폼을 제거하고 창 내부에 침수 유체를 추가합니다.안정화된 동물을 저배율 대물렌즈 바로 아래에 있는 이광자 이미징 창이 있는 이광자 현미경 암실에 넣고 렌즈를 조심스럽게 창 안으로 내립니다. 1mL 멸균 주사기에 0.5mL의 갓 준비된 Rhodamine B isothiocyanate 덱스트란 용액을 채우고 주사기를 카테터에 연결합니다. 플런저를 매우 천천히 눌러 접안렌즈를 사용하여 염료를 전달하여 관심 영역을 식별하고, 전하 결합 장치 카메라를 사용하여 표면 혈관 패턴의 획기적인 명시야 이미지를 획득합니다.그런 다음 이광자 이미징 소프트웨어를 열어 전원을 켜고 적절한 레이저 여기 파장을 선택합니다. 그런 다음 주입된 형광단 실험에 해당하는 적절한 이광자 레이저 출력, HV 수준 및 형광 채널을 선택하고 이미징 창을 통해 조직을 이미지화하여 이미지와 라인 스캔 데이터를 모두 수집합니다. C7 정중선 타박상 부상을 소개하려면 쥐를 Louisville Injury System Apparatus 장치에 놓고 0점 설정을 선택합니다.그런 다음 조직 변위를 조정하고 실행 실험을 클릭하여 충격을 트리거하거나 부상을 일으키는 릴리스를 클릭합니다. 다음으로, 노출된 경막(dura mater) 위에 식염수에 적신 젤 폼의 작은 조각을 놓아 수분을 유지하고 동일한 이미징 매개변수를 사용하여 이미징 창을 통해 새로운 이미지를 엽니다. 동물을 어두운 방으로 다시 옮기고 갓 준비한 플루오레세인 이소티오시아네이트 덱스트란 0.5ml를 카테터에 주입합니다.그런 다음 동물을 현미경 암실로 되돌려 놓고 두 형광단 채널에서 이미지를 얻습니다. Rhodamine dextran 형광 염료 주입을 사용하면 베이스라인에서 혈관 네트워크를 매핑하기 위한 랜드마크 이미지를 캡처할 수 있습니다. 중등도의 C7 정중선 타박상 손상이 발생한 후, FITC-dextran의 도입은 손상으로 인한 첫 번째 염료가 주변 실질로 누출된 후 혈관 구조를 쉽게 감지할 수 있습니다.또한 손상 전후의 혈관을 이미징하면 혈관 직경의 변화와 부상에 대한 반응을 정량화할 수 있을 뿐만 아니라 혈관을 통한 손상 전후 적혈구 속도의 변화를 계산할 수 있습니다. 이러한 데이터를 종합하면 이미징된 혈관을 정맥 또는 동맥으로 분류하는 데 사용할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 눈에 띄는 호흡 인공물을 피하고 이미지 창 내에서 경미한 출혈을 제한하도록 노력하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.이 절차는 척수 손상 후 발생하는 신경 혈관 상호 작용에 대한 추가 질문에 답하기 위해 형질전환 동물에게도 수행할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 살아있는 동물에서 타박상성 척수 손상 후 급성 혈관 역학 변화를 모니터링하기 위해 이광자 현미경을 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

마우스 척추를 안정화하고 반복 수행하는 법으로서...

두 광자 현미경을 사용하여 마우스 척수의 생체내 이미징에

우리는 축삭돌기 및 미엘린 손상의 역학을 실시간으로 동시에 시각화하기 위해 이광자 여기 타임 랩스 현미경을 사용하는 프로토콜을 제시합니다. 이 제안된 프로토콜은 손상 후 중심 수초화된 축삭돌기의 운명에 영향을 미치고 영구적인 임상적 장애에 기여할 수 있는 내적 및 외적 요인에 대한 연구를 가능하게 합니다.

전의 VIVO 레이저에 의한 척수 손상 모델은 실시간으로 축삭 변성의 메커니즘을 평가하기 위해

이 비디오에서는, 우리는 라이브 마우스의 등쪽 척수를 통해 만성 광학 영상 실을 주입하는 절차에 대해 설명합니다. 실, 수술, 만성 이미징 검토하고 증명한다.

종의 척추 상공 회의소를 주입하는 절차 생체 마우스 척수의 영상

Two-photon intravital imaging은 등쪽 기둥 외상성 척수 파쇄 손상이 있는 골수 키메라 동물의 원래 조직 환경에서 척수의 다양한 세포 유형 간의 상호 작용을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

마우스 지느러미 열 압박 손상에 마이크로 글 리아와 대 식세포와 축삭의 상호 작용의 생체 내에 이미징

Contrast Enhanced Ultrasound imaging은 실험용 쥐 척수 손상 모델에서 척수 혈류를 정량화하기 위한 신뢰할 수 있는 생체 내 도구입니다. 이 논문에는 흉추 척수 손상의 타박상 모델과 관련하여 이 기술을 적용하기 위한 포괄적인 프로토콜이 포함되어 있습니다.

실험 척수 부상에서 척수 혈액 흐름의 평가를위한 향상된 초음파 이미징 대비

마우스 척수 이미징을위한 새로운 생체 준비. 이 프로토콜은 척수 걸쳐 라이브 세포 상호 작용의 두 광자 이미징을 허용한다.

마우스 척수의 세포 역학의 두 광자 이미징

광혈전증은 척수에 국소 허혈을 유발하는 최소 침습적이고 재현성이 높은 시술이며 생쥐의 척수 손상 모델 역할을 합니다.

쥐의 척수 손상의 모델로 초점 국소 빈혈을 Photothrombosis는 유도

여기 우리 레이저 도플러 관류 (LDPI) 이미징의 조합을 제시 하 고 소개 하는 척수에 대 한 표준화 된 절차 뿐만 아니라 국부 적으로 혈액 흐름과 산소 포화 (2등), 코드 레이저 도플러 관류 모니터링 (LDPM) 척추를 측정 하 쥐에 외상입니다.

레이저 도플러 이미징 및 모니터링을 사용 하 여 쥐에서 척수 미세 분석 하

척수 미세 순환은 척수 손상에 중추적 인 역할을합니다. 대부분의 방법은 미세 순환 표적 치료의 발달을 위해 필수적인 척수 미세 순환의 실시간 평가를 허용하지 않습니다. 여기에서, 우리는 허혈 / 재퍼퓨전의 큰 동물 모델에서 레이저 도플러 - 흐름 바늘 프로브를 사용하여 프로토콜을 제안한다.

허혈/재관류의 돼지 모델에서 척수 미세 퍼퍼퓨전의 실시간 평가

자극된 라만 산란(SRS) 현미경은 특정 화학 결합의 고유 진동을 기반으로 생체 분자의 라벨 없는 이미징을 가능하게 합니다. 이 프로토콜에서, 통합 SRS 및 이광자 형광 현미경의 도구 셋업은 살아있는 마우스의 척수에서 세포 구조를 시각화하기 위해 기술된다.

생체 내 결합 된 이광자 형광 및 자극 된 라만 산란 현미경을 사용한 생물학적 조직 이미징

학습하세요 척수 손상 후 혈관 역학 변화를 실시간 모니터링하는 듀얼 컬러 투광자 현미경법을 이용한 방법입니다. Sprague-Dawley 쥐 모델에서 혈관 직경 및 혈류 변화를 정량화하여 조기 혈관 복구 전략 개발에 활용할 수 있습니다.

에 비보 듀오 컬러 이미징 혈관 역학 Contusive 척수 상해를 따르는 방법

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