2017년 12월 31일
우리는 vivo에서 이미징 방법 성인 Sprague-Dawley 쥐에 contusive 척수 상해 다음 동적 척추 혈관 변화 추적 하기 위한 두 개의 서로 다른 형광 성 염료를 사용 하 여 소개 합니다.
이 생체 내 듀오 컬러 이광자 이미징 방법의 전반적인 목표는 타박성 척수 손상 후 발생하는 급성 척수 혈관 역학 변화를 모니터링하는 것입니다. 이 방법은 이러한 동적 혈관 변화가 척수 손상 후 발생하는 병리학적 진행과 기능적 결핍에 어떤 영향을 미치는지에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 프로모던스 샘플을 사용하는 전통적인 기술에 비해 이 기술의 주요 장점은 살아있는 동물 내에서 척수 손상의 급성 혈관 역학에 대한 증거를 제공한다는 것입니다.
이 기술의 의미는 척수 손상 치료로 확장되며, 이 방법을 통해 조기 혈관 복구를 목표로 하는 잠재적인 신경 보호 전략을 검토할 수 있습니다. 이 듀오 컬러 이미징 방법에 대한 아이디어는 대비되는 형광 색상을 순차적으로 주입하면 척수 손상 후 파괴된 혈관을 시각화할 수 있다는 것을 발견했을 때 처음 떠올랐습니다. 시술을 시작하기 전에 6주 된 암컷 Sprague Dawley 쥐의 발가락 꼬집음에 대한 반응 부족으로 적절한 진정 수준을 확인한 후 진통제와 항염증제를 피하 주사합니다.
쥐의 경추 부위와 동물 가슴 쪽의 목 부위를 면도하고 베타 딘 수술 용 스크럽과 70 % 알코올 물티슈로 노출 된 피부를 면봉으로 닦습니다. 동물의 눈에 연고를 바르고 멸균 현미경으로 섭씨 37도의 가열 패드 위에 있는 멸균 수술 패드 위에 누운 자세로 쥐를 놓습니다. 쇄골 근처의 맥박점을 찾아 외부 경정맥을 찾고, 한 쌍의 작은 멸균 스프링 가위를 사용하여 오른쪽 하악의 꼬리 골반, 상완골의 큰 결절 및 마누브리움의 교차점을 수직으로 절개합니다.
스프링 가위와 가는 집게를 사용하여 경정맥 혈관을 분리하고 멸균 수술용 봉합선을 사용하여 혈관의 말단부를 접합합니다. 그런 다음 마이크로 가위를 사용하여 혈관 벽을 작게 절개하고 식염수가 채워진 1ml 주사기에 부착된 21게이지 바늘로 만든 특수 카테터를 혈관 안으로 밀어 넣습니다. 소량의 혈액이 바늘에 들어가면 삽입이 성공한 것입니다.
바늘의 근위부와 말단부에 바늘을 고정합니다. 척추를 안정시키려면 동물을 엎드린 자세로 바꾸고 숫자 15 메스 날을 사용하여 원하는 척추 수준에서 정중선을 따라 피부를 자릅니다. 견갑골 사이의 스파이크로 두 번째 흉추를 찾고 T2에서 위쪽으로 세어 C7 척추를 찾습니다.
5번째부터 7번째 경추까지 근육층을 양측으로 절개하여 외측을 노출시키고 외측 척추뼈의 양쪽에 슬릿을 만듭니다. 변형된 안정화 장치의 스테인리스강 암을 노출된 횡방향 공정 패싯 아래로 밀어 넣고 나사를 조여 척추를 안정화합니다. 그런 다음 C5에서 C7 얇은 판을 조심스럽게 제거하고 노출된 경막 위에 식염수에 적신 작은 젤 폼 조각을 올려 수분을 유지합니다.
이광자 이미징 창을 만들려면 근육과 척추뼈 사이의 틈새에 작은 젤 폼 조각을 넣고 척수와 척추뼈 사이의 얇은 젤 폼 선을 놓습니다. 그런 다음 조직 접착 접착제로 주변 근육 뼈 부위를 밀봉합니다. 성공적인 이미징 창을 준비하는 데 가장 중요한 단계는 창 내부에 경미한 출혈이 없는지 확인하는 것입니다.
접착제를 약 5분 동안 건조시킨 후 멸균 1ml 주사기에 따뜻한 4% 한천을 채우고 창 가장자리를 따라 한천 벽을 분배합니다. 한천은 유연성을 유지하면서 빠르게 응고됩니다. 기준선 이미지를 얻으려면 먼저 젤 폼을 제거하고 창 내부에 침수 유체를 추가합니다.
안정화된 동물을 저배율 대물렌즈 바로 아래에 있는 이광자 이미징 창이 있는 이광자 현미경 암실에 넣고 렌즈를 조심스럽게 창 안으로 내립니다. 1mL 멸균 주사기에 0.5mL의 갓 준비된 Rhodamine B isothiocyanate 덱스트란 용액을 채우고 주사기를 카테터에 연결합니다. 플런저를 매우 천천히 눌러 접안렌즈를 사용하여 염료를 전달하여 관심 영역을 식별하고, 전하 결합 장치 카메라를 사용하여 표면 혈관 패턴의 획기적인 명시야 이미지를 획득합니다.
그런 다음 이광자 이미징 소프트웨어를 열어 전원을 켜고 적절한 레이저 여기 파장을 선택합니다. 그런 다음 주입된 형광단 실험에 해당하는 적절한 이광자 레이저 출력, HV 수준 및 형광 채널을 선택하고 이미징 창을 통해 조직을 이미지화하여 이미지와 라인 스캔 데이터를 모두 수집합니다. C7 정중선 타박상 부상을 소개하려면 쥐를 Louisville Injury System Apparatus 장치에 놓고 0점 설정을 선택합니다.
그런 다음 조직 변위를 조정하고 실행 실험을 클릭하여 충격을 트리거하거나 부상을 일으키는 릴리스를 클릭합니다. 다음으로, 노출된 경막(dura mater) 위에 식염수에 적신 젤 폼의 작은 조각을 놓아 수분을 유지하고 동일한 이미징 매개변수를 사용하여 이미징 창을 통해 새로운 이미지를 엽니다. 동물을 어두운 방으로 다시 옮기고 갓 준비한 플루오레세인 이소티오시아네이트 덱스트란 0.5ml를 카테터에 주입합니다.
그런 다음 동물을 현미경 암실로 되돌려 놓고 두 형광단 채널에서 이미지를 얻습니다. Rhodamine dextran 형광 염료 주입을 사용하면 베이스라인에서 혈관 네트워크를 매핑하기 위한 랜드마크 이미지를 캡처할 수 있습니다. 중등도의 C7 정중선 타박상 손상이 발생한 후, FITC-dextran의 도입은 손상으로 인한 첫 번째 염료가 주변 실질로 누출된 후 혈관 구조를 쉽게 감지할 수 있습니다.
또한 손상 전후의 혈관을 이미징하면 혈관 직경의 변화와 부상에 대한 반응을 정량화할 수 있을 뿐만 아니라 혈관을 통한 손상 전후 적혈구 속도의 변화를 계산할 수 있습니다. 이러한 데이터를 종합하면 이미징된 혈관을 정맥 또는 동맥으로 분류하는 데 사용할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 눈에 띄는 호흡 인공물을 피하고 이미지 창 내에서 경미한 출혈을 제한하도록 노력하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.
이 절차는 척수 손상 후 발생하는 신경 혈관 상호 작용에 대한 추가 질문에 답하기 위해 형질전환 동물에게도 수행할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 살아있는 동물에서 타박상성 척수 손상 후 급성 혈관 역학 변화를 모니터링하기 위해 이광자 현미경을 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
본 연구는 Sprague-Dawley 쥐에서 외상성 척수 손상 후 동적 혈관 변화를 추적하기 위한 생체 내 이중색 이광 영상 방법을 소개합니다. 이 기술은 이러한 혈관 변화가 손상의 진행 및 조기 혈관 복구를 목표로 하는 치료 전략에 어떤 영향을 미치는지에 대한 통찰을 제공하는 것을 목적으로 합니다.
Monitoring acute vascular dynamics in vivo provides critical insights into early pathophysiological mechanisms following spinal cord injury, enabling mechanistic de-risking of vascular-targeted therapeutic strategies. This approach supports predictive confidence in evaluating neuroprotective interventions by quantifying vascular leakage, blood flow, and structural changes in real time. The method enhances translational continuity by linking early vascular events to functional outcomes in preclinical models.
The method integrates into the discovery continuum from target validation through preclinical research by providing dynamic vascular readouts that inform lead identification and risk-adjusted advancement decisions.