Name: 전체 게놈 시퀀싱 Candida glabrata 검출의 마커 항진균 약물 저항에 대 한의 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: 학습하세요 Candida glabrata의 전체 게놈 시퀀싱을 통해 항진균제 내성 유전자 돌연변이를 식별하는 방법을. 이 기술은 임상 진단 환경에서 내성 균주 검출 및 유행 모니터링에 활용됩니다.

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이 작품 전염병 및 미생물학, 보건 센터에 의해 지원 되었다. 저자는 어떤 다른 자금 조달이 연구에 대 한 받지. 저자는 그들의 전문가 조언 및 지원 전체 게놈 시퀀싱 실험에 대 한 Drs 엘리샤 Arnott, 네이 선 Bachmann 및 Ranjeeta Menon을 감사합니다.

윤리적인 승인을이 연구를 위해 필요 했다.
1. 서브 컬쳐와 inoculum Candida glabrata 에 대 한 준비
<ol><li>또한 적어도 하나의 C. glabrata 미국 유형 문화 수집 (ATCC) 알려진된 민감성 패턴을 포함 해야 공부를 해야 C.glabrata 분리의 패널을 선택 합니다.</li>
	<li>Subculture 단일 식민지 만져 격리 멸 균 일회용 플라스틱 루프를 사용 하 여 및 Sabouraud의 포도 당 한 천 (SDA)에 줄무늬 접시8.</li>
	<li>좋은 성장 분리의 순수한 문화에 대 한 35 ° C에서 24-48 h SDA 플레이트를 품 어.</li>
</ol>2입니다. 항진균 자화 율의 결정
<ol><li>SDA 접시에 갓 subcultured C. glabrata 에서 약 1 m m 직경의 4 ~ 5 식민지를 선택 살 균 일회용 플라스틱 루프 격리를 사용 합니다. 3 mL의 멸 균 증류수에 resuspend. 균일 한 현 탁 액을 얻기 위해 부드러운 pipetting으로 잘 섞는다.</li>
	<li>1 x 106 8농도계 사용 하 여 5 x 106 셀/mL에 0.5 맥 팔 랜드에 셀 밀도 조정 합니다.</li>
	<li>민감성 상업 분석 결과 사용 하 여 테스트 수행 (테이블의 재료 및 시 약 참조) 모든 C. glabrata 에 제조업체의 지침에 따라 분리. CLSI 지침에 따라 항진균 약물의 결과 마이크에 따라 격리의 민감도 해석 하 고 보고서 (표 1)8.</li>
</ol>3. 시퀀싱에 대 한 게놈 DNA 추출
<ol><li>1.5 mL 튜브에 50 mM EDTA의 300 µ L에서 갓 자란된 SDA 접시에서 식민지의 loopful를 resuspend.</li>
	<li>Zymolyase (10 mg/mL)의 40 µ L를 추가 정지, 그리고 부드럽게 피펫으로 5 번까지 현 탁 액이 균일 합니다.</li>
	<li>세포 벽을 소화 하기 위해 1-2 h 37 ° C에서 샘플을 품 어. 5 분 동안 실내 온도에 냉각 하십시오.</li>
	<li>원심 2 분 14000 × g 에서 정지 하 고 신중 하 게는 상쾌한 제거.</li>
	<li>DNA 추출 키트 지침 (재료의 표 참조)에 따라 genomic DNA를 추출 합니다.</li>
	<li>Resuspend 50 µ L 10 mM Tris 버퍼 (pH 7.5-8.5)는 키트에 제공 된 차입 버퍼 대신의 펠 릿 DNA를 추출.</li>
	<li>260/280 nm25에 광학 밀도 (O.D) 측정 하 여 DNA의 순도 확인 하십시오.</li>
</ol>4. 게놈 DNA 정량화
<ol><li>트리 스 EDTA (테) 버퍼 형광 분석 결과 대 한 제조업체의 지침에 따라 분석 결과 키트에 제공 된 x 1을 준비 (재료의 표 참조).</li>
	<li>테 분석 결과 버퍼 (100 µ L, 희석 비율 1시 50분의 최종 볼륨) 일회용 96 잘 접시에서 x 1의 98 µ L를 2 µ L을 추가 하 여 DNA 샘플을 희석. 또한 수동으로 사용 하 여 멀티 채널 피 펫이 희석 단계를 수행할 수 있습니다 또는 워크스테이션을 처리 하는 자동화 된 액체에 의해.</li>
	<li>람다 DNA를 diluting 하 여 표준의 범위를 준비 (100 µ g/mL) 형광 분석 결과 키트 (표 2)에서 제공 하 고 측정 샘플 함께 포함.</li>
	<li>100 µ L 100 µ L 형광 염료의 희석 DNA 샘플과 반응에 대 한 기준을 추가 합니다. 빛 으로부터 보호 하는 실 온에서 5 분 동안 품 어.</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 모든 샘플의 형광을 측정 합니다.</li>
	<li>형광 신호를 사용 하 여 표준 곡선을 플롯 하 고 DNA 샘플의 원래 농도 계산.</li>
	<li>DNA 농도 0.2 ng / µ L를 조정에 추가 될 DNA와 10 mM Tris 버퍼 (pH 8)의 볼륨을 결정 합니다.</li>
	<li>워크스테이션을 처리 하는 자동화 된 액체를 사용 하 여 DNA 희석을 수행 합니다. 이 단계는 또한 수동으로 pipetting으로 얻을 수 있습니다.</li>
</ol>5. DNA 라이브러리 준비
참고: 라이브러리 준비 및 시퀀싱의 프로토콜 및 회사 (그림 1A)에 의해 제공 된 지침에 따라 수행 했다 (재료의 표 참조).
<ol><li>Tagmentation 및 PCR 증폭
	<ol>
<li>새로운 96-잘 단단한 얇은 벽 플레이트를 레이블을 지정 합니다.</li>
		<li>0.2 ng / µ L에서 정량된 입력 DNA의 5 µ L를 추가 (1 총에서 ng) 접시의 각 샘플을.</li>
		<li>각 잘 포함 dna tagmentation 버퍼의 10 µ L 및 증폭 버퍼의 5 µ L을 추가 하 고 부드럽게 혼합 플라스틱. 접착성 판 도장 접시를 봉인.</li>
		<li>열 cycler에 접시를 놓고 다음 PCR 프로그램 실행: 5 분, 그리고 10 ° c.에 보류에 대 한 55 ° C 샘플 10 ° C를 도달 하는 때, 즉시 중화를 진행 합니다.</li>
		<li>Amplicon 반응, 중화를 접시에 중화 버퍼의 5 µ L을 추가 하 고 부드럽게 혼합 플라스틱. 접시를 봉인 하 고 5 분 동안 실 온에서 품 어.</li>
		<li>샘플을 PCR mastermix 인덱싱의 15 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>96 잘 접시 형식 설정 사용할 수 있는 인덱스 뇌관 튜브의 상자를 사용 하 여 각 샘플 인덱스 템플릿 (표 3)에 따라 인덱스의 독특한 조합을 가져옵니다 있도록.</li>
		<li>인덱스 뇌관 튜브 인덱스 플레이트 랙 (그림 1B)에서 표 3에 서식 파일에서 제공 하는 순서를 사용 하 여 정렬 하 고 서식 파일에서 인덱스의 위치를 기록 합니다.</li>
		<li>순서로 인덱스 튜브와 인덱스 플레이트 선반에 추가 PCR mastermix로 tagmentation 접시를 놓습니다.</li>
		<li>인덱스 선반에 수평 배열에서 수직 배열에서 인덱스 뇌관 1 튜브 및 인덱스 뇌관 2 튜브를 넣어. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 신중 하 게 추가할 인덱스 뇌관의 5 µ L 각 샘플.</li>
		<li>인덱스 사이 상호 오염을 피하기 위해 새로운 모자에 인덱스 튜브의 오래 된 모자를 바꿉니다.</li>
		<li>분명 96 잘 접시 포경을 사용 하 여 접시를 밀봉 하 고 다음과 같이 두 번째 PCR을 수행: 95 ° C 30에 대 한 s, 10 95 ° C의 12 주기 s, 55 ° C 30에 대 한 s, 72 ° C 30에 대 한 s와 5 분 동안 72 ° C.</li>
	</ol></li>
	<li>PCR 정리
	<ol>
<li>깊은 잘 격판덮개 tagmentation 판에서 PCR-정리, PCR 제품을 전송 (재료의 표 참조).</li>
		<li>소용돌이 상업 자석 구슬 솔루션 (재료의 표 참조) 제조업체의 지침에 따라 하 고 깊은 잘 격판덮개에 각 PCR 제품을 구슬의 30 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>2 분 동안 1800 rpm에서 미 판 통에 접시를 흔들어 하 고 5 분 동안 흔들어 하지 않고 실 온에서 품 어.</li>
		<li>상쾌한이 맑게 될 때까지 2 분 마그네틱 스탠드에 접시를 놓습니다.</li>
		<li>마그네틱 스탠드에 여전히 접시와 함께 신중 하 게 상쾌한을 삭제 합니다.</li>
		<li>마그네틱 스탠드에는 접시와 함께 갓된 80% 에탄올의 200 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>30 대 한 마그네틱 스탠드에 접시를 품 어 s 신중 하 게 제거 하 고 구슬을 방해 하지 않고는 상쾌한 삭제.</li>
		<li>세척 단계를 다시 반복 하 고 구슬 있는 경우 15 분 제거 초과 에탄올에 대 한 건조를 허용 합니다.</li>
		<li>마그네틱 스탠드에서 접시를 제거 하 고 구슬에 물의 resuspension 버퍼의 52.5 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>2 분 동안 1800 rpm에서 미 판 통에 접시를 흔들어 하 고 동요 하지 않고 2 분 동안 실 온에서 품 어.</li>
		<li>마그네틱 스탠드에 접시를 놓고 취소 상쾌한 허용 합니다.</li>
		<li>멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 신중 하 게 전송 50 µ L는 상쾌한의 정리 판에서 새로운 단단한 격판덮개.</li>
	</ol></li>
	<li>라이브러리 정규화
	<ol>
<li>(재료의 표 참조) 제조 업체의 지침에 따라 라이브러리 정규화 시 약 녹여</li>
		<li>정리 판에서 새로운 깊은 잘 격판덮개는 상쾌한의 20 µ L를 전송.</li>
		<li>마그네틱 비드 현 탁 액의 45 µ L을 추가 하 고 접시 마감재와 접시를 봉인.</li>
		<li>30 분 1800 rpm에서 미 판 통에 접시를 흔들어. 이 보육 시간 중요 한 이며 초과할 수 없습니다.</li>
		<li>2 분 동안 마그네틱 스탠드에 접시를 놓고 확인 하는 상쾌한 (그림 1B)를 허가 했다.</li>
		<li>제거 하 고 상쾌한 마그네틱 스탠드에 여전히 접시와 함께 적절 한 유해 폐기물 용기에 폐기.</li>
		<li>마그네틱 스탠드에서 접시를 제거 하 고 세척 45 µ L 워시 버퍼와 구슬.</li>
		<li>5 분 동안 1800 rpm에서 미 판 통에 워시 버퍼와 플레이트를 흔들어.</li>
		<li>분명 때 2 분 및 폐기 상쾌한 마그네틱 스탠드에 접시를 놓습니다.</li>
		<li>마그네틱 스탠드에서 접시를 제거 하 고 다시 워시 버퍼와 세척을 반복.</li>
		<li>마그네틱 스탠드에서 접시를 제거 하 고 0.1 N NaOH의 30 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>5 분 동안 1800 rpm에서 미 판 통에 0.1 N NaOH와 플레이트를 흔들어 하 고 마그네틱 스탠드 2 분 또는 때까지 액체 분명 하다에 접시를 놓습니다.</li>
		<li>새로운 96-잘 단단한 얇은 벽 최종 정규화 된 라이브러리 플레이트의 각 우물에 차입 버퍼의 30 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>마지막 볼륨 60 µ L을 최종 정규화 된 라이브러리 접시에 정규화 접시에서 상쾌한의 30 µ L를 전송. 라이브러리 이제 시퀀싱 할 준비가 되어 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>정량에 의해 DNA 도서관 농도의 결정
	<ol>
<li>녹여 mastermix, 뇌관 및 표준 (재료의 표 참조) 제조 업체의 지침에 따라 정량 키트에 제공 된.</li>
		<li>PCR 시 약 mastermix와 제조업체의 지침에 따라 정량 키트에 제공 된 뇌관 결합 하 고 aliquots는-20 ° c.에 저장 될 수 있다</li>
		<li>DNA 라이브러리 농도 확인 하려면 1:80 희석 (2 µ L 1: 100에서 158 µ L Tris 버퍼에) 다음 1: 100 희석 (1.5 µ L DNA 라이브러리 148.5 µ L Tris 버퍼)를 수행 하 여 10 mM Tris 버퍼 (pH 8)를 사용 하 여 DNA 라이브러리의 1/8000 희석을 확인 합니다.</li>
		<li>적어도 1 분 동안 700 rpm에서 희석 플레이트를 흔들어 하 고 1 분 동안 14000 × g 에서 원심.</li>
		<li>희석된 DNA 라이브러리 또는 DNA 표준의 4 µ L mastermix의 16 µ L를 혼합 하 여 최종 PCR 반응의 20 µ L를 준비 합니다.</li>
		<li>다음 제조 업체의 설정을 thermocycler에서 PCR을 수행: 5 분, 95의 35 주기 동안 95 ° C 45 s, 및 마지막 65 ° C ~ + 95 ° C 용융 곡선 분석을 위한 30 s 및 60 ° C에 ° C.</li>
		<li>정량 Pcr thermocycler에서 샘플 DNA 라이브러리 및 표준의 Ct 값을 가져옵니다.</li>
		<li>(그림 2) 표준의 Ct 값에서 표준 곡선을 생성 합니다. 3 주기 평균에서 ± 하 여 상위 및 하위 QC 범위를 정의 합니다. 예를 들어 평균 Ct 값은 13 주기 하는 경우 다음 QC 범위는 16과 10 주기 사이.</li>
		<li>표준 곡선 및 Ct 값에서 개인 및 평균 라이브러리 농도 (ALC)을 결정 합니다.</li>
		<li>대상 라이브러리 농도 사이 1.4-8 오후 1 고려 최종 시퀀싱에 대 한 아래에 주어진 계산을 기반으로 총 풀링된 라이브러리 (PAL) 사용할 수의 볼륨을 결정 합니다. 참고: 라이브러리 농도 정량에서 얻은 평균 ALC; = 총 풀링된 라이브러리 (PAL) ALC = / 2; PAL (DAL) 변성 PAL = * 0.666 버퍼와 혼합 되어 달의 볼륨에 따라 흐름 셀에 추가할 라이브러리의 농도가 이다. 예를 들어 라이브러리의 65 µ L 버퍼의 835 µ L에 추가 됩니다, 다음이 희석 (Dil 1) 195에서에서 추가 됩니다 1300 µ L의 총 볼륨: (65/900) * dnPAL = Dil1 Dil1 * (195/1300) = 최종 농도 (사이 1.4-8 오후 1 이어야 함)</li>
	</ol></li>
</ol>6. 도서관 풀링 및 벤치탑 시퀀서에서 Initiating 시퀀싱
<ol><li>해 동 시 약 카트리지 제조 업체의 지침에 따라입니다. 4 ° C 저장소에서 패키지에서 새로운 흐름 세포 밖으로가 고 실 온 이어야 시퀀싱 전에 30 분을. 버퍼 카트리지 및 prechill 시퀀싱 버퍼 사용 하기 전에 밖으로 데리고 (재료의 표 참조).</li>
	<li>컨트롤 라이브러리 라이브러리의 5 µ L를 혼합 하 여 준비 (1 nM)와 0.2 N NaOH의 5 µ L. 짧게 소용돌이 컨트롤 라이브러리를 단일 가닥으로 변성을 실 온에서 5 분 동안 품 어 고.</li>
	<li>200 mM Tris HCl, pH 7 및 소용돌이의 5 µ L를 추가 합니다. 235 µ L prechilled 시퀀싱 버퍼를 추가 하 고 부드럽게 혼합. 총 볼륨은 컨트롤 라이브러리 최종 농도 20 250 µ L 오후.</li>
	<li>각 샘플 라이브러리 단일 낮은 바인딩 1.5 mL 튜브에 최종 표준된 라이브러리 접시에서 시퀀스의 5 µ L를 전송 하 여 풀 DNA 라이브러리.</li>
	<li>30 µ L의 풀링된 라이브러리 및 라이브러리 다른 낮은 바인딩 튜브에 변성을 0.2 N NaOH의 30 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>소용돌이 낮은 바인딩 튜브 및 단일 가닥으로 라이브러리를 변성을 실 온에서 5 분 동안 품 어.</li>
	<li>200 mM Tris HCl, 중화 반응에 변성된 라이브러리와 튜브를 pH 7의 30 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>중화 변성된 라이브러리 현 탁 액의 65 µ L 미리 냉장된 시퀀싱 버퍼와 잘 혼합 하는 소용돌이의 835 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>최종 낮은 바인딩 튜브에서 다음 결합: 중화 변성된 라이브러리, 컨트롤 라이브러리 및 시퀀싱 버퍼의 1103.70 µ L의 1.30 µ L에서 195 µ L. 제대로 믹스.</li>
	<li>시 약 카트리지에 지정 된 장소로 최종 라이브러리 믹스 (1300 µ L)를 로드 합니다.</li>
	<li>시퀀싱 Sequencer에서 프로젝트 및 샘플 세부 정보를 입력 하 여 실행 설정 지정 지침에 따라 웹사이트.</li>
	<li>시작 시퀀스 지침입니다. 흐름 세포, 라이브러리와 시 약 카트리지 및 벤치탑 시퀀서에서 버퍼 카트리지를 로드.</li>
	<li>모든 시 약 키트 및 시퀀싱에 사용 되는 카트리지 일괄 처리 번호를 기록 합니다.</li>
</ol>7. 데이터 시퀀싱 웹사이트에서 다운로드
<ol><li>웹사이트에서 제공 하는 제조업체의 지침에 따라 FASTQ 파일을 다운로드 합니다.</li>
	<li>좋은 품질 검사 실행에 대 한 170-280 K/m m2 와 사이 Q30 비율 ≥ 75%와 클러스터 밀도 200-210 K/m m2 (표 4)에 최적.</li>
</ol>8. 시퀀싱 데이터 분석
<ol><li>데이터 분석 통합된 소프트웨어 패키지로 시퀀스 샘플의 FASTQ 파일 가져오기 (재료의 표 참조).</li>
	<li>참조 (선택 참조 게놈) 매핑, 지방 재배치와 변형 분석그림 3(A) 설정을 사용 하 여 표 5에 나열 된, 즉 트리밍 목록에서 기능을 추가 하 여 소프트웨어에서 시퀀싱 워크플로 만듭니다.</li>
	<li>한 샘플 또는 샘플 FASTQ 파일의 배치를 선택 하 여 워크플로 실행 하 고 지정 된 샘플 폴더에서 출력 파일을 저장 합니다.</li>
	<li>게놈 (그림 3B)에 시퀀스 범위 깊이, 매핑된 영역 및 구조 이체의 목록에 대 한 보고서를 생성 합니다.</li>
	<li>목록 구조 이체의를 사용 하 여 동의어 아닌 단일 뉴클레오티드 동 질 다 상 (Snp) 유전자 부여 저항 및 독성에에서 대 한 검색.</li>
	<li>SNP 위치, 유전자, 및 저항 또는 취약 격리 (표 6)의 수를 나열 하 여 보고서를 준비 합니다.</li>
</ol>

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<li>Vale-Silva, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+the+adhesin+gene+EPA1+mediated+by+PDR1+in+Candida+glabrata+leads+to+enhanced+host+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Upregulation of the adhesin gene EPA1 mediated by PDR1 in Candida glabrata leads to enhanced host colonization.</a> mSphere. 1 (2), (2016).</li>
</ol>

저자 있고 아무 경쟁 금융 관심사 없이 상충 공개.

이 연구는 타당성, 대략적인 일정 및 C. glabrata에서 약물 저항의 WGS 기반 검출의 정밀도 결정 했다. 라이브러리 준비 및 시퀀싱에 대 한 처리 시간 (TAT) 4 일 되었고 분석된 결과 1-2 일의 보고. 이것은 적어도 비슷한 금액으로 문신 문화 접시와 Sanger에서 민감도 분석에 대 한 비교 시퀀싱 샘플의 상당히 높은 수. 약 30-90 C. glabrata 게놈 시퀀싱 흐름 셀 용량, 80-100% 연속 범위에 따라 시퀀싱 할 수 있습니다. 이 연구의 비용/리소스 요구 사항을 생어의 현재 비용을 해당 되었다 있기 때문에 시퀀싱 사내 WGS 실험실 설치에서 수행 되었다, 시퀀싱 및 프로브 기반 분석 샘플 당 AUD 80-100의 예상 비용. 모든 격리의 감수 성은 시각적으로 읽기 미러를 사용 하 여 읽어온 상업 시험 키트에 의해 결정 되었다. 문화 성장 변화 블루 색도계 성장 표시기에 의해 표시 되었다 분홍색. 마이크 읽 었는 데 잘 첫 블루로 핑크 (성장)의 시리즈 즉, 우물 후...

Candida glabrata 는 azoles 뿐만 아니라 최근에, echinocandins,12,3저항을 전시 하는 종족으로 중요도 점점 발생된 병원 체 이다. 2 중 C. albicans, 달리 C. glabrata 의 단일 게놈 돌연변이 획득 하 고 보다 쉽게 다중 약물 저항을 개발 하도록 허용할 수 있습니다. 공동 저항에 두 약물 클래스 되었습니다 보고4. 따라서, 항진균 민감성의 초기 평가 및 C. glabrata 에서 약물 내성의 검출은 항균 성 저항1 의 드라이버 제한 항진균 집사의 직의 맥락에서 뿐만 아니라 정확 하 고, 타겟 치료에 대 한 중요 한 , 5 , 6. 빠르게 감지 저항 격리 바이오 마커의 저항에 연결 하는 확실 한 돌연변이의 존재는 또한 처방을 개선 하기 위해 도움이 결정 하는 효율적인 워크플로 및 임상 결과 설정.
항진균 민감성은 일반적으로 최소 억제 농도 (MIC) 마약 없는 성장의 저것과 비교 된 미생물의 성장에 있는 뜻깊은 감소에 있는 결과 낮은 약물 농도로 정의 되는 측정 하 여 평가 제어 합니다. 임상 실험실 표준 협회 (CLSI)와 유럽 위원회 항균 민감성 테스트 (EUCAST)를에 마이크 결정 수 있도록 메서드를 테스트 하는 민감성 표준화 더 정확 하 고 일관 된7, 8. 그러나, 항진균 마이크의 유틸리티 남아 있다 echinocandins, 특히 제한 특히 inter-laboratory 비교에 관해서는 다양 한 방법론 및 조건 있는 사용된9. Echinocandin 처리와 WT를 구별 하는 무 능력에 대 한 응답으로 마이크의 불확 실한 상관 관계 있다 (또는 취약) FKS 돌연변이 (echinocandin 내성 변종)10,11은닉에서 격리. 확실 한 단일 유전자 PCRs 생어의 가용성에도 불구 하 고 항진균 저항 마커의 시퀀싱, 결과의 실현은 종종 지연 인해 여러 저항 마커5,12의 동시 탐지의 부족. 따라서, 전체 게놈 시퀀싱 기반 분석을 사용 하도록 설정한 게놈에서 서로 다른 위치에 저항을 부여 돌연변이의 동시 검출 현재 접근에 비해 상당한 이점을 제공 합니다.
전체 게놈 시퀀싱 (WGS)는 발생 동안 질병 전송 게놈 넓은 위험 평가 약물 저항 박테리아와 바이러스13에서 테스트에 대 한 접근 추적을 성공적으로 구현 되었습니다. 핵 산 시퀀싱 기술의 최근 발전 만들었습니다 전체 게놈 시퀀싱을 (WGS) 병원 균의 임상 실용적인 차례-주위-시간에 기술적으로 그리고 경제적으로 가능. DNA 시퀀싱 병원 체 식별 및 미생물학 실험실14,,1516에 특성의 다른 방법에 비해 중요 한 장점을 제공 합니다. 첫째, 그것은 높은 처리량, 속도와 품질 범용 솔루션을 제공합니다. 시퀀싱은 미생물에 적용 될 수 있습니다 하 고 로컬 또는 지역 연구소에서 규모의 경제를 있습니다. 둘째, 국내 및 국제 수준에서 비교 의무가 ' 미래-증거 ' 형식으로 데이터를에서 생성합니다. 마지막으로, 의학에 WGS의 잠재적인 유틸리티가 추가 임상 및 역학 메타 데이터17 를 포함 하는 해당 데이터 베이스에 연결할 수 있는 참조 게놈을 포함 하는 공용 데이터 기지의 급속 한 성장에 의해 확장 되었습니다. 18.
최근 연구는 Candida spp의 임상 격리에서 항진균 저항 마커의 식별 WGS의 유틸리티를 증명 하고있다. 10 , 19 , 20.이 높은 처리량 벤치탑 시퀀서, 설립된 생물 정보학 파이프라인 및 시퀀싱21,22의 비용 감소의 가용성 때문입니다. 생어 시퀀싱은 WGS 단일 실행에 여러 게놈의 연속을 허용을 통해 곰 팡이 WGS의 장점. 또한, Candida 게놈의 WGS 약물 목표에서 새로운 돌연변이 식별 수, 유전 진화 및 임상 관련 시퀀스 형식을20,,2223의 출현을 추적. 가장 중요 한 것은, 경우에 본질적인 multidrug 저항, WGS 치료 선택22,24이전 저항 부여 돌연변이의 조기 발견에 지원할 수 있습니다.
여기, 우리는 약물 저항 antifungal 에이전트의 다른 클래스와 관련 된 돌연변이 대 한 심사 WGS 사용의 타당성 검사. 우리는 최종 사용자와 진단 균 학 실험실 관점에서 샷건 시퀀싱의 구현에 대 한 방법론을 제시. 우리는 3 세 별도 임상 사례는 생체 외에서 echinocandins와 5 flucytosine 항진균 치료 다음과 같은 시간이 지남에 개발에서 경작 하는 쌍을 분리 하는이 분석에 포함.

<table><tbody><tr><td>DensiCHECK 플러스</td><td>BioM&eacute; rieux Inc</td><td>K083536</td><td>McFarland 판독에 사용되는 농도계,</td></tr><tr><td>Sensititre YeastOne</td>, <td>TREK 진단 시스템, Thermo Scientific</td><td>YO10</td>, <td>표준 항진균제를 사용한 상업용 감수성 분석 플레이트.</td></tr><tr><td>Fisherbrand 일회용 접종 루프 및 바늘</td><td>Fisher Scientific, Thermo Fisher Scientific</td><td>22-363-605</td><td>일회용 플라스틱 루프는 패키지에서 직접 사용할 수 있습니다. 화염이 필요하지 않습니다.</td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Sigma Aldrich, Merck</td><td>T2795&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>용량 2.0 mL, 천연 &nbsp;</td></tr><tr>Arthrobacter luteus <td>MP Biomedicals, LLC</td><td>의 ZYMOLYASE 20T</td><td>8320921</td><td>진균 분리 전 DNA 추출</td></tr><tr><td>마법사 게놈 DNA 정제 키트의</td> 세포벽 용해에 사용됩니다.<td>프로메가&nbsp;</td><td>A1120</td>은 <td>100개의 DNA 추출을 수행합니다</td></tr><tr><td>. Quant-iT PicoGreen dsDNA 분석 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P7589</td><td>&nbsp; 프로토콜에서 형광 염료라고 하는 Picogreen 시약 분석을 위한 Lambda DNA 표준 및 피코그린 시약을 포함합니다.</td></tr><tr><td>Nextera XT DNA 샘플 준비 키트</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1096</td><td>포함 박스 1 및 박스 2&nbsp; 96개 샘플용 시약</td></tr><tr><td>Nextera XT 인덱스 키트 v2</td><td>Illumina</td><td>FC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004</td><td>인덱스 세트 A 인덱스 세트 B 인덱스 세트 C 인덱스 세트 D</td></tr><tr><td>NextSeq 500/550 고출력 키트 v2&nbsp;</td><td>Illumina</td><td>FC-404-2004</td><td>300 사이클, 키트당 250개 이상의 샘플</td></tr><tr><td>NextSeq 500 Mid Output v2 Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-404-2003</td><td>300 사이클, 키트당 130개 이상의 샘플</td></tr><tr><td>PhiX Control Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3001</td><td>Index 키트에서 인덱스를 정렬하려면</td></tr><tr><td>TruSeq Index Plate Fixture Kit</td><td></td><td>FC-130-1005</td><td>&nbsp; 2개의 조명기구</td></tr><tr><td>KAPA 라이브러리 수량화 키트 차세대 시퀀싱용</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK4824</td><td>사전 제작된 표준, 프라이머 및 MasterMix</td></tr><tr><td>Janus NGS Express 액체 처리 시스템 포함&nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td>YJS4NGS</td><td>염기서열 분석 중 DNA 희석에 사용됩니다</td></tr><tr><td>&nbsp; 0.8 mL 저장 플레이트</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB0765B</td><td>MIDI 플레이트 DNA 라이브러리 정리 및 정규화</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>&nbsp; 라이브러리 정제를 위한 용액에 있는 자석</td></tr><tr><td>비드 Magnetic Stand-96</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM10027</td><td>자석 비드 기반 DNA 정제에 사용되는</td></tr><tr><td>OrbiShaker MP&nbsp;</td><td>벤치 마크 사이언티픽</td><td>BT1502</td><td>96 웰 플레이트 쉐이커 4 플랫폼</td></tr><tr><td>하드 쉘 PCR 플레이트</td><td>BioRad</td><td>HSP9601</td><td>얇은 벽, 96</td></tr><tr><td>웰 LightCycler 480 기기 II&nbsp;</td><td>로슈&nbsp;</td><td>5015278001</td><td>96 웰 플레이트</td></tr><tr><td>Microseal 'B' PCR 플레이트 밀봉 필름, 접착제, 광학&nbsp;</td><td>바이오라드</td><td>&nbsp; MSB1001</td><td>투명 96웰 플레이트 실러,</td></tr><tr><td>CLC Genomics Workbench</td>, <td>Qiagen</td>, 데이터 분석을 위한 <td>CLICBio</td><td>소프트웨어, 버전 8</td></tr><tr><td>NextSeq500 기기</td><td>Illumina&nbsp;</td><td>일루미나&nbsp;</td><td>차세대 염기서열분석에 사용되는 벤치탑 시퀀서</td></tr></tbody></table>

전체 게놈 시퀀싱 candida glabrata 검출의 마커 항진균 약물 저항에 대 한의

Whole Genome Sequencing of Candida glabrata for Detection of Markers of Antifungal Drug Resistance

Candida glabrata 신속 하 게 될 약물 저항, 특히 azoles 및 echinocandins 돌연변이 수집할 수 있습니다. 유전자 변이의 식별, 필수적 이다 저항 체 외에서 수 자주와 상관 될 임상 실패 감지. 우리는 항진균 약물 저항 C. glabrata의 게놈 넓은 분석에 대 한 전체 게놈 시퀀싱 (WGS)를 사용 하 여의 타당성을 검사 합니다. 목표는 torecognize enablers와 장벽을 WGS 구현에서 되었고 그 효과 측정. 이 문서는 주요 품질 관리 검사점 및 항진균 요원 민감성 감소와 관련 되었던 유전자 표시를 조사 WGS 방법론의 필수 구성 요소를 설명 합니다. 그것은 또한 데이터 분석의 정확도 테스트 시간 주위 차례 견적.
12 임상, phenotypic 민감성과 C. glabrata 의 한 ATCC 스트레인 항진균 민감도 테스트를 통해 결정 되었다. 이 포함된 3 쌍, 3 환자, 마약 최소 억제 농도 상승 개발에서 격리. 두 쌍에서 두 번째의 각 쌍 개발 저항 echinocandins 격리 합니다. 3 쌍의 두 번째 분리 5 flucytosine에 저항을 개발 했다. 나머지 구성 취약 azole 내성 격리. Echinocandin, azole 5 flucytosine 저항에 연결 하는 유전자에 있는 단 하나 뉴클레오티드 동 질 다 상 (Snp)는 WGS 다음 세대 시퀀싱을 사용 하 여 통해 저항 격리에서 확인 되었다.   FKS1, FKS2, CgPDR1, CgCDR1 및 FCY2 같은 유전자 발견 했다 항진균 저항 비 동의어 Snp. 전반적으로, 약 75-fold 읽기 깊이 범위와 참조 게놈에 매핑된 C. glabrata 격리의 WGS 읽기의 98%의 평균. 처리 시간 및 비용 생어 비교 했다 순서.
결론적으로, C. glabrata 의 WGS 다중 PCR/DNA 연속 반응에 대 한 필요 없이 다른 항진균 약물 클래스에 저항에 관련 된 임상적으로 중요 한 유전자 돌연변이 공개에서 가능 했다. 이 항진균 성 부여 대체의 동시 검출에 대 한 임상 실험에서 샷건 시퀀싱 기능 설정으로 긍정적인 단계를 나타냅니다.

C. glabrata (CMRL12에 CMRL1 격리) 임상 균 학 참조 실험실에서 C. glabrata ATCC 90030 및 12 격리 구성, 웨스트 미드 병원, 시드니 공부 했다 13 (표 1). 이러한 CMRL-1/CMRL-2, CMRL-3/CMRL-4 CMRL-5/CMRL-6 얻은 그들 사이의 역학 링크와 항진균 치료 전후 격리의 3 개 쌍을 포함 24 (표 1).
마이크 CLSI 해석 중단점을 사용 하 여 9 항진균 요원 즉, 암포 (AMB), Anidulafungin (애니), Micafungin (MIF)에 대 한 결정 했다 Caspofungin (CAS), 5-Flucytosine (5-FC), Posaconazole (POS), Voriconazole (VRC), Itra...

이 연구는 Candida glabrata에 항진균 약물 저항을 부여 하는 유전자에 돌연변이의 분석을 위한 전체 게놈 시퀀싱을 구현. C. glabrata 격리 저항 echinocandins, azoles 및 5-flucytosine 하는 방법론을 설명 하기 위해 시퀀싱 했다. 유전자의 특정 돌연변이 패턴의 존재 여부와 상관 하는 격리의 민감성 프로필.

전체 게놈 시퀀싱 Candida glabrata 검출의 마커 항진균 약물 저항에 대 한의

Candida glabrata can rapidly acquire mutations that result in drug resistance, especially to azoles and echinocandins. Identification of genetic mutations ...

이 연구의 전반적인 목표는 진단 실험실에서 Candida glabrata에서 항진균제 내성을 부여하는 유전자의 돌연변이를 식별하기 위해 전체 게놈 염기서열 분석을 구현하는 것입니다. 곰팡이의 전체 게놈 염기서열 분석은 항진균제 내성 분야에서 상당한 기여를 할 수 있습니다. 이를 통해 약물 내성 진균에서 중요한 항진균제에 대한 게놈 전체 돌연변이를 동시에 검출할 수 있습니다.의학적으로 중요한 진균의 전체 게놈 염기서열 분석은 또한 의료 환경에서 발병, 진균 질병 및 전염 사건의 감지 및 모니터링을 가능하게 할 뿐만 아니라 임상의가 알아야 하는 진균 종 및 클론의 출현을 가능하게 할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 우리 연구실의 박사 과정 연구원인 Rebecca Rockett 박사와 Verlaine Timms 박사입니다. 시작하려면 Candida glabrata의 임상 및 상용 균주에서 게놈 DNA 샘플을 준비합니다.그런 다음 5마이크로리터의 정량화된 DNA를 이전에 라벨링된 새로운 96웰 하드 쉘 얇은 벽 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 각 웰에 10마이크로리터의 태그 부착 완충액과 5마이크로리터의 증폭 완충액을 추가합니다. 그런 다음 피펫을 사용하여 샘플을 부드럽게 혼합하고 접착 씰로 플레이트를 밀봉한 다음 플레이트를 열 순환기에 넣고 적절한 PCR 프로그램을 실행합니다.샘플이 섭씨 10도에 도달하면 즉시 5마이크로리터의 중화 버퍼를 추가하고 피펫을 사용하여 샘플을 부드럽게 혼합합니다. 그런 다음 플레이트를 밀봉하고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 배양 기간이 끝나면 각 웰에 15마이크로리터의 Indexing PCR Master Mix를 추가합니다.인덱스 플레이트 랙에 프라이머 도구를 배치하고 템플릿에 인덱스의 위치를 기록합니다. 그런 다음 PCR Master Mix가 들어있는 태그 플레이트를 인덱스 튜브와 함께 올바른 순서로 인덱스 플레이트 랙에 놓습니다. 인덱스 프라이머 1개의 튜브를 수평 방향으로, 인덱스 프라이머 2개의 튜브를 수직 방향으로 배열하는 것이 중요합니다.인덱스 템플릿에 제공된 순서와 위치를 기반으로 합니다. 인덱스 프라이머 튜브에서 오래된 캡을 제거하고 폐기합니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 각 웰에 5마이크로리터의 인덱스 프라이머를 추가합니다.샘플과 지표 간의 교차 오염을 방지하기 위해 이 단계를 신중하게 수행하는 것이 중요합니다. 인덱스 간의 교차 오염을 방지하려면 기존 인덱스 튜브 캡을 각각 교체하십시오. 마지막으로 플레이트를 밀봉하고 두 번째 PCR 프로그램을 실행합니다.먼저 PCR 산물을 태그멘테이션 플레이트에서 딥웰 플레이트로 옮깁니다. 마그네틱 비드 용액을 소용돌이치고 각 웰에 30마이크로리터의 비드를 추가합니다. 그런 다음 마이크로플레이트 셰이커에서 플레이트를 저어주고 실온에서 5분 동안 배양합니다.플레이트를 마그네틱 스탠드에 2분 동안 또는 상층액이 투명해질 때까지 놓습니다. 그런 다음 플레이트를 움직이지 않고 상등액을 조심스럽게 버리고 200 마이크로 리터의 80 % 에탄올을 첨가하십시오. 플레이트를 마그네틱 스탠드에 올려 놓고 상층액을 버리기 전에 30초 동안 배양합니다.세척 과정을 반복하고 구슬을 15분 동안 건조시킵니다. 마그네틱 스탠드에서 플레이트를 제거하고 비드에 52.5마이크로리터의 재현탁액을 추가합니다. 마이크로플레이트 셰이커를 사용하여 1, 800RPM으로 2분 동안 플레이트를 교반합니다.그런 다음 셰이커가 멈춘 후 플레이트를 실온에서 2분 동안 배양합니다. 배양 기간이 끝난 후 상층액이 투명해질 때까지 플레이트를 마그네틱 스탠드에 놓습니다. 마지막으로, 멀티채널 피펫을 사용하여 세척 트레이에서 50마이크로리터의 투명 상층액을 새 하드 쉘 플레이트로 옮깁니다.먼저 라이브러리 정규화 시약을 따르고 하드 쉘 플레이트에서 새로운 딥 웰 플레이트로 20마이크로리터의 투명 상등액을 옮깁니다. 딥 웰 플레이트의 각 웰에 45마이크로리터의 마그네틱 비드 현탁액을 추가하고 플레이트 씰러를 사용하여 플레이트를 밀봉합니다. 그런 다음 마이크로플레이트 셰이커에서 1, 800RPM으로 30분 동안 플레이트를 교반합니다.상층액이 제거될 때까지 2분 동안 플레이트를 마그네틱 스탠드에 놓습니다. 피펫을 사용하여 상층액을 제거하고 상층액을 적절한 유해 폐기물 용기에 폐기합니다. 그런 다음 마그네틱 스탠드에서 플레이트를 제거하고 45마이크로리터의 세척 버퍼를 사용하여 비드를 세척합니다.마이크로플레이트 셰이커에서 플레이트를 교반하고 플레이트를 마그네틱 스탠드에 2분 동안 놓습니다. 상층액이 제거되면 상층액을 버리고 마그네틱 스탠드에서 플레이트를 제거합니다. 세탁 버퍼로 세탁 과정을 한 번 더 반복합니다.마그네틱 스탠드에서 플레이트를 제거하기 전에 각 웰에 NaOH를 추가하십시오. 그런 다음 액체가 투명해질 때까지 플레이트를 마그네틱 스탠드에 놓기 전에 1, 800RPM으로 마이크로플레이트 셰이커에서 플레이트를 5분 동안 교반합니다. 30마이크로리터의 용리 완충액을 새로운 96웰 하드 쉘 얇은 벽 플레이트의 각 웰에 추가합니다.마지막으로, 정규화 플레이트에서 30마이크로리터의 상등액을 용리 완충액이 포함된 각 웰로 옮깁니다. 이제 최종 정규화된 라이브러리 플레이트는 추가 실험에서 염기서열을 분석할 준비가 되었습니다. C.glabrata ATCC 90030으로 구성된 항진균 요법 전후에 얻은 13개의 C.glabrata 분리물과 임상 실험실에서 12개의 분리물을 연구했습니다.최소 억제 농도 또는 MIC는 9개의 항진균제에 대한 각 분리물에 대해 얻어졌습니다. 이 표에는 각 분리 항진균 테스트 조건에 대한 MIC 값이 나열되어 있습니다. 분리 시 내성을 부여하는 유전자에 SNP가 존재하는 것은 항진균제에 대한 체외 MIC 증가와 상관관계가 있습니다.이 표는 임상 C.glabrata 분리물에서 SNP 위치와 유전자가 내성을 부여하는 약물을 요약합니다. 이 비디오를 시청한 후 시청자는 전체 게놈 염기서열 분석의 인증을 위해 진단 실험실 환경에서 이 기술을 복제할 수 있습니다. DNA 라이브러리 준비의 중요한 단계와 정확하고 재현 가능한 결과를 위한 필수 품질 관리 지점을 강조합니다.

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연구

JoVE Journal

Medicine

의학

우리는 유전자 - 약물 및 유전자 - 환경 상호 작용을 이해하는 포괄적인 불편 게놈 - 와이드 스크린을 개발했습니다. 이러한 돌연변이 컬렉션을 검사 방법이 제공됩니다.

Barcoded 효모 게놈 라이브러리의 경쟁력 화면

우리의 3 차원 나노 biofilms 구성된 고밀도 microarray 플랫폼을...

높은 처리량 Antifungal 약물 검사를위한 칸디다 albicans Biofilm 칩 (CA BChip)

PCR 매개 유전자 변형은 시각화 및 효모 세포 및 단백질의 정량을 용이 칸디다 종의 형광 단백질 융합체를 생성하기 위해 사용될 수있다. 여기서, 우리는 칸디다에서 형광 단백질 융합 (Eno1-FP)을 구축하기위한 전략을 제시한다.

에 형광 단백질 융합의 시대<em&gt; 칸디다</em&gt; 종

Candida albicans 의 효율적인 게놈 엔지니어링 pathogenesis 및 치료제의 개발을 이해 하는 데 중요 하다. 여기, 우리는 신속 하 고 정확 하 게 편집 C. albicans 게놈 CRISPR를 사용 하 여 프로토콜을 설명. 프로토콜에는 다양 한 유전 수정 점 돌연변이, 삽입, 삭제 등을 소개 하는 조사 수 있습니다.

Candida albicans 인간의 곰 팡이 병원 체 게놈 편집 CRISPR 중재

이 문서는 칸디다 알비칸스 ABC (ATP 결합 카세트) 단백질 Cdr1의 특성화를위한 소규모 플라즈마 막 격리 프로토콜을 제시, 사카로미세스 cerevisiae에서 과발현. 프로테아제-클레이블 C-단말 mGFPCdr1과 태그 사이에 16잔류 링커를 장착한 이중 태그는 Cdr1의 정제 및 세제 스크리닝을 용이하게 하도록 설계되었습니다.

칸디다 알비칸스 Cdr1-mGFPHis 분석을 위한 소규모 플라즈마 멤브레인 준비

이 프로토콜은 인간 곰팡이 병원균 칸 디다 알비칸스에서 뉴클레아제(CUT&amp;RUN)를 사용하여 표적 하에서의 절단 및 방출을 위한 실험 방법 및 데이터 분석 워크플로우를 기술한다.

칸디다 알비칸스에서의 전사 인자-DNA 결합 상호작용의 게놈 전체 프로파일링: 포괄적인 CUT&amp;RUN 방법 및 데이터 분석 워크플로우

벤치탑 기기를 사용한 전체 게놈 시퀀싱(WGS) 전략의 실현 가능성은 실험실 환경에서 공중 보건과 관련된 모든 미생물의 게놈 조사를 단순화했습니다. 박테리아 WGS에 대한 워크 플로우의 방법 론적 적응이 설명되고 분석을위한 생물 정보학 파이프 라인도 제시됩니다.

전체 게놈 시퀀싱을 사용하는 Oreochromis spp. 농장에서 파생된 병원성 대장균 균주의 특성 분석

Candida spp. 약물 내성에서 몸집이 작은 군집의 중요성은 완전히 탐구되지 않았습니다. 항균 광역학 요법(aPDT)은 약물 내성 진균 감염에 대한 유망한 전략을 제공합니다. 이 연구는 로즈 벵골 매개 aPDT가 칸디다 글라브라타(Candida glabrata) 를 효과적으로 비활성화하고 몸집이 작은 콜로니를 유도하여 독특한 절차를 제시한다는 것을 보여줍니다.

로즈 벵골 매개 광역학 요법을 통한 칸디다 글라브레이트의 쁘띠 콜로니 유도

이 프로토콜은 긴 판독 시퀀싱 플랫폼을 사용하여 결핵균 의 18개 약물 내성 영역에 대한 표적 심층 시퀀싱에 최적화되었으며, 이어서 장기 판독 데이터용으로 설계된 결핵 특이적 생물정보학 파이프라인으로 분석했습니다.

Long-Read Sequencing Technologies를 사용한 Amplicon Sequencing

잠복기 암 치료를 모니터링하기위한 Cerenkov 발광 이미징 (CLI)의 사용은 여기에 설명되어 있습니다. 이 방법은 Cerenkov 방사선 (CR) 및 방사성 동위 원소 표지 된 프로브를 시각화하는 광학 이미징 (오이)의 활용하므로 잠복기 치료 모니터링 및 약물 검사에서 PET에 대한 대안을 제공합니다.

암 치료 모니터링을위한 Cerenkov 발광 이미징 (CLI)

학습하세요 Candida glabrata의 전체 게놈 시퀀싱을 통해 항진균제 내성 유전자 돌연변이를 식별하는 방법을. 이 기술은 임상 진단 환경에서 내성 균주 검출 및 유행 모니터링에 활용됩니다.

전체 게놈 시퀀싱 Candida glabrata 검출의 마커 항진균 약물 저항에 대 한의

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