4.6: 크로마토그래피 기반 생체 분자 정화 방법

생화학에서, 크롬토그래피 계 정제 방법은 복합 혼합물로부터 화합물을 분리하기 위해 사용된다. 생화학자에 의해 일반적으로 이용되는 2개의 그 같은 방법은 크기 배제 크로마토그래피 및 친화성 크로마토그래피입니다. 크기 배제 크로마토그래피에서 다공성 구슬로 포장된 컬럼은 크기에 따라 혼합물의 구성 요소를 분리합니다. 한편, 친화성 크로마토그래피는 표적 특이적 리간드를 포함하는 고정 상으로 구성된 컬럼을 사용하여 생체 분자의 보다 구체적인 분리를 허용한다.

이 비디오는 크기 배제 및 친화성 크로마토그래피뿐만 아니라 이를 제어하는 개념에 대한 소개 역할을 합니다. 고정금속 친화성 크로마토그래피에 의한 히스티딘 태그 단백질의 정제를 위한 단계별 절차가 설명된다. 생화학 및 생의학 연구에서 이러한 크로마토그래피 방법을 모두 위한 응용 프로그램도 프로파일화되어 있습니다.

"크로마토그래피"는 생체 분자의 특성과 활성을 결정하기 전에 필수적인 단계인 복잡한 혼합물에서 구성 요소를 분리하는 데 사용되는 광범위한 방법을 나타냅니다. 각 크로마토그래피 기법은 시료 매트릭스와 표적 화합물에 따라 분리를 위한 메커니즘이 다릅니다. 이 비디오는 생화학에 공통적인 두 가지 방법인 크기 배제 및 친화성 크로마토그래피의 원리와 작동에 중점을 둡니다.

크기 배제 크로마토그래피 또는 SEC는 샘플에 있는 화합물의 크기를 기반으로 합니다. 샘플을 포함하는 이동상은 다공성 물질이 있는 컬럼, 즉 고정상(stationary phase)에 추가됩니다. 샘플의 분자는 3가지 범주 중 1가지에 속합니다.

너무 커서 공극으로 들어갈 수 없는 분자는 컬럼을 통해 가장 짧은 거리를 이동합니다. 이 "제외 한계"를 초과하는 분자량을 가진 모든 종은 동시에 컬럼을 종료합니다. 공극에 자유롭게 들어갈 수 있을 만큼 작은 분자는 가장 오래 유지되고 함께 컬럼을 빠져나옵니다. 완전한 기공 진입을 허용하는 분자량은 "투과 한계"입니다.

이러한 한계 사이의 분자만이 서로 분리될 것인데, 이는 그들이 공극 안팎으로 확산되는 데 다양한 시간을 소비하기 때문입니다. 더 작은 분자는 고정상에서 더 많은 시간을 보내기 때문에 컬럼에 더 오래 머무르는 반면, 이 한계 내의 더 큰 분자는 더 일찍 빠져 나옵니다.

1-2 크기의 분자량은 이러한 한계 내에 속합니다. 칼럼은 이것을 염두에두고 선택되거나, 원하는 화합물의 넓은 범위가있는 경우 여러 칼럼을 직렬로 사용할 수 있습니다.

SEC 이론을 살펴보았으니, 이제 SEC가 어떻게 수행되는지 살펴보자.

SEC 절차를 시작하려면 컬럼을 탈이온수 및 크로마토그래피 완충액으로 평형을 이루어야 합니다. 준비가 완료되면 샘플이 포함된 버퍼가 컬럼에 주입됩니다. 그런 다음 버퍼는 낮은 유속으로 밀어 넣습니다. 검출기는 컬럼에서 나오는 것을 모니터링하여 원하는 분석물의 존재를 확인합니다. 배제 한계를 초과하는 분자량을 가진 큰 분자는 동시에 컬럼을 빠져나갑니다. 컬럼의 작은 조각이 튜브에 수집됩니다. 각 분획은 겔 전기영동 또는 기타 분석 기술에 의해 표적 분자의 품질을 테스트합니다.

이제 단백질을 정제하는 가장 효율적인 방법 중 하나인 친화성 크로마토그래피(AC)에 대해 살펴보겠습니다. 많은 생체 분자는 특정 리간드에 선택적으로 결합하며, 이는 AC가 표적 특이적 리간드를 고정상에 부착하여 활용하는 특성입니다.

혼합물이 컬럼을 통해 흐르면 표적 분자가 리간드에 부착되고 나머지는 통과합니다. 혼합물이 컬럼을 통과한 후, 특이성에 따라 두 가지 용출 방법 중 하나를 통해 표적 분자를 수집할 수 있습니다.

생물 특이적 용리는 "정상적" 또는 "역-역할"을 갖는다고 말할 수 있습니다. 정상 역할 생물특이적 용리(bio-specific elution)에서는 표적 생체 분자와 결합하기 위해 부착된 리간드와 경쟁하는 물질이 추가됩니다.

역역할(reverse-role) 생물특이적 용리(biospecific elution)에서 제제는 부착된 리간드에 결합하기 위해 표적과 경쟁합니다. 두 번째 용출 유형인 비특이적 용리는 용액의 pH, 이온 강도 또는 극성을 변화시켜 표적-리간드 결합을 낮춥니다. 단백질이 고정될 수 있는 리간드에 결합하지 않는 경우, 단백질은 리간드에 결합하도록 조작된 짧은 펩타이드 서열인 "태그"를 포함하여 발현될 수 있습니다.

한 가지 종류는 고정 금속 이온 친화성 크로마토그래피(줄여서 "IMAC")로, 니켈 또는 코발트와 같은 접착된 금속 리간드가 변형된 단백질의 히스티딘 잔기에 결합합니다. 분자 생물학 기술을 통해 표적 단백질은 히스티딘의 이미다졸 측쇄를 통해 금속에 결합하는 폴리히스티딘 태그(polyhistidine-tag)라고 하는 반복적인 히스티딘 잔기로 생성됩니다. 일단 결합되면 단백질은 역역할 특이적 용출을 통해 유리 이미다졸로 수집될 수 있으며 나중에 다양한 다운스트림 응용 분야에 사용될 수 있습니다. 친화성 크로마토그래피 이론을 살펴보았으니 이제 실험실에서 이루어지는 IMAC 절차를 살펴보겠습니다.

IMAC에서는 이동상과 샘플의 혼합물에 고정상을 직접 첨가할 수 있어 his 태그가 지정된 단백질의 결합을 허용할 수 있습니다. 그런 다음 이 슬러리를 컬럼에 붓고 비결합 화합물은 폐기물로 떨어지고 슬러리는 남아 있습니다. 슬러리 용기를 헹구어 잔류 수지와 샘플을 수집하여 컬럼에 첨가합니다.

수지는 결합되지 않은 구성 요소가 자유롭게 흐르도록 교반됩니다. 추가된 세척 버퍼는 그것들을 씻어내는 데 도움이 됩니다. 결합되지 않은 모든 성분이 제거되면 폐기물을 대상 단백질을 수집하기 위한 용기로 교체합니다.

이미다졸을 함유하는 완충액을 첨가하고 교반한 후 그대로 두어 표적 분자의 결합을 해제합니다. 이미다졸은 금속에 결합하여 태그가 지정된 단백질을 대체하고 방출합니다. 유리된 단백질을 수집하고 이미다졸 단계를 반복하여 전체 수집을 보장합니다. 시료를 추가로 정제하기 위해 분석 전에 시료에 대해 SEC를 실행할 수 있습니다.

지금까지 이 두 가지 기법의 이론과 절차를 살펴보았으니, 이제 이 두 가지 기법이 생화학 분야에 적용되는 몇 가지 방법을 살펴보자.

단백질을 정제하는 일반적인 이유는 질병에서 단백질의 역할을 연구하기 위해서입니다. 낭포성 섬유증은 낭포성 섬유증 막관통 전도 조절 단백질(CFTR)의 결함으로 인해 발생합니다. 효모에서 his 태그로 단백질을 성장시킨 후, 친화력과 크기 배제 크로마토그래피는 모두 단백질을 분리한 다음 그 기능에 대한 연구를 가능하게 합니다.

어떤 경우에는 폴리히스티딘 태그의 존재가 단백질의 구조를 변화시켜 기능에 영향을 미칠 수 있습니다. 또 다른 일반적인 태그는 맥아당 결합 단백질 또는 MBP로, 컬럼에서 결합된 아밀로스에 결합합니다. 그런 다음 맥아당을 사용하여 복합체를 방출합니다. 그런 다음 MBP를 절단하고 SEC로 제거하여 원하는 순수 단백질을 생산할 수 있습니다.

크기 배제 및 친화성 크로마토그래피에 대한 JoVE의 비디오를 시청하셨습니다. 그것은 기술의 이론을 다루고, 일반적인 절차를 검토하고, 기술의 일부 용도를 다루었습니다.

시청해 주셔서 감사합니다!