단백질 결정화

단백질 결정화는 단백질의 격자 고체 형태를 얻는 과정입니다. 이 결정은 단백질 기능 연구를 지원하는 구조 생물학자에게 특히 중요합니다. 질량 분석기 또는 SDS-PAGE와 같은 다른 기술은 단백질의 1차원 구조에 대한 정보만 제공할 수 있습니다. 단백질 결정화는 재조합 단백질 발현 및 X선 회절 기술로 보완됩니다. 이 비디오는 단백질 결정화의 원리, 일반적인 실험실 절차 및 생화학 분야에서의 여러 응용 분야를 보여줍니다.

이 과정에서 필요한 첫 번째 단계는 일반적으로 재조합 단백질 발현을 사용하여 매우 순수한 단백질의 밀리그램 수량을 얻는 것입니다. 관심 단백질에 해당하는 유전자를 발현 벡터로 복제하고, 발현된 단백질을 폴리히스티딘(poly-histidine)과 같은 친화성 태그(affinity tag)에 융합하여 친화성 크로마토그래피에 의한 정제를 돕습니다. 자세한 내용은 친화성 크로마토그래피에 대한 이 컬렉션의 비디오를 참조하십시오.

정제된 단백질을 결정으로 형성하는 것은 pH, 이온 강도, 침전제 및 단백질 농도, 온도, 평형 속도를 포함한 많은 요인의 적절한 조합에 따라 달라집니다. 가장 일반적으로 사용되는 방법은 증기 확산이며, 그 중 두 가지 범주가 있습니다 : 행잉 드롭과 시팅 드롭. 순수 단백질, 완충액 및 침전제(물 분자와 결합하여 단백질의 수분 가용성을 줄이고 더 높은 단백질 농도를 모방하는 이온 고체)를 포함하는 액적은 동일한 완충액과 침전제의 더 높은 농도 혼합물이 있는 저장소가 있는 밀폐된 마이크로웰에 있습니다. 처음에는 단백질과 침전물의 농도가 너무 낮아 결정화를 일으킬 수 없습니다. 실험이 진행되는 동안 물은 물방울에서 기화하여 저장소에 모입니다. 액적 내 물의 양이 감소하면 시스템이 과포화 상태가 되고 핵 형성 후 결정화가 발생할 수 있습니다. 물방울에서 물의 순 이동은 평형 상태에 있으며 프로세스는 완료될 때까지 유지됩니다.

3D 구조를 시각화하기 위해 X선 회절이 사용됩니다. 결정에서 X선 데이터를 얻기 위해 단색 X선 빔에 배치되어 모든 각도에서 빔에 노출됩니다. 각 노출은 이미지를 제공하며, 여기서 각 지점은 결정에서 나오고 검출기에 의해 등록되는 회절된 X선입니다. 데이터는 결정 내 원자 배열의 모델을 생성하기 위해 결합됩니다. 결과 결정 구조는 2 옹스트롬의 일반적인 해상도로 원자의 3차원 배치를 보여줍니다.

이제 단백질 결정화의 원리를 다루었으므로 일반화된 프로토콜을 살펴보겠습니다.

절차를 시작하기 위해 관심 유전자를 포함하는 발현 벡터를 세포로 변환합니다. 세포는 배양되고 mid-log 단계에서는 유전자의 mRNA의 전사를 유발하는 IPTG와 같은 유도제를 추가하여 발현이 시작됩니다. 단백질 발현 후, 조질 물질은 용해 완충액에 현탁된 다음 원심분리에 의해 정화됩니다.

그런 다음 정화된 용해물을 니켈 컬럼에 로드하고 폴리히스티딘 태그가 지정된 단백질은 다른 모든 생체 분자가 씻겨 나가는 동안 컬럼에 결합합니다.

수 밀리그램의 순수 단백질이 얻어지면 증기 확산에 의한 결정화 준비가 됩니다. 24웰 행잉/시팅 드롭 트레이는 다양한 농도의 염화나트륨과 아세트산나트륨 완충 용액으로 채워져 있습니다. 시팅 드롭 방법의 경우, 동일한 부피의 단백질과 저장 용액을 각 웰 위의 선반에 피펫으로 넣은 다음 트레이를 투명 테이프로 덮습니다. 그런 다음 트레이를 배양실에 넣고 다음 날, 그 다음날, 그 다음에는 며칠에 한 번씩 웰의 성장을 모니터링합니다.

적절한 결정이 얻어지면 X선 회절 분석을 수행할 준비가 된 것입니다. 크리스탈은 선택한 방향으로 크리스탈을 배치하기 위해 고니오미터에 장착됩니다. 결정은 모든 각도에서 단색 X선 빔으로 조명되어 회절 패턴을 생성합니다. 이 소프트웨어는 서로 다른 방향에서 촬영한 2차원 이미지를 결정 내 원자의 위치를 결정하여 결정 내 전자 밀도의 3차원 모델로 변환합니다.

이제 절차를 검토했으므로 단백질 결정화의 몇 가지 유용한 응용 분야와 또 다른 결정화 기술을 검토해 보겠습니다.

단백질 결정화는 인실리코(in silico) 약물 설계에 사용될 수 있습니다. 포유류의 바이러스 감염과 관련이 있는 인플루엔자 바이러스의 중합효소 염기성 단백질 2의 3차원 구조는 결정화와 X선 회절에 의해 결정되었습니다. 단백질의 잠재적 결합 부위가 시각화되고 도킹 프로그램을 사용하여 단백질의 갈라진 틈에 삽입되는 3차원 분자가 설계되었습니다.

단백질-DNA 복합체의 공동 결정화도 유용한 기술입니다. DNA 결합 단백질은 전사 및 DNA 중합 및 DNA 복구와 같은 다양한 생물학적 기능을 조절합니다. 그리고 이러한 복합체의 결정 구조는 단백질 기능, 메커니즘 및 특정 상호 작용의 특성에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. DNA 복제의 음성 조절자인 E. coli 단백질 SeqA는 헤미메틸화된 DNA와 함께 공동 결정화되었습니다.

G-단백질 결합 수용체(GCPR)와 같은 일체형 막 단백질은 결정 격자 접촉을 형성하는 데 사용할 수 있는 극 표면적의 양이 제한되어 있어 결정화가 어려우며, 이는 융합 단백질 보조 단백질 결정화의 개발로 이어졌습니다. ?2 아드레날린 수용체(adrenergic receptor), GCPR 및 라이소자임(lysozyme)을 암호화하는 유전자를 발현 벡터에 삽입하였다. ?2AR-라이소자임 융합 단백질의 결정화는 결정 격자에서 패킹 상호작용을 형성하는 데 필요한 라이소자임에 의해 제공되는 자연적으로 소수성인 ?2AR에 비해 증가된 세포 외 친수성 표면으로 인해 달성되었습니다.

단백질 결정화에 대한 JoVE의 비디오를 시청하셨습니다. 이 비디오는 원칙, 일반화된 프로토콜 및 생물 의학 분야에서의 일부 용도에 대해 설명했습니다. 시청해 주셔서 감사합니다!