Deformability 및 Ektacytometry에 의해 혈액이 질 레드 셀 측정

이 기술의 전반적인 목표는 엑타사이토메트리(ektacytometry)를 통해 적혈구 변형성과 세포 이질성을 측정하는 것입니다. 이 방법은 적혈구가 얼마나 변형될 수 있는지, 혈액 샘플이 얼마나 이질적인지, 실험이 질병의 함수로 어떻게 변화하는지와 같은 엑타사이토메트리의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 적혈구 집단의 변형성 및 이질성을 측정할 때 접근성, 편의성 및 신뢰성입니다.

이 기술은 겸상 적혈구 빈혈 환자의 치료에 대한 반응을 모니터링하는 데 유용할 수 있습니다. 적혈구 변형성과 이질성은 헤모글로빈 구성 및 농도와 상관관계가 있기 때문입니다. 이러한 방법은 적혈구 변형성 감소가 특징인 당뇨병과 같은 다른 질병에 적용할 수 있으며, 적혈구 변형성 감소는 미세혈관 질환에 기여할 수 있습니다.

먼저 제로 삼투압 튜브를 저삼투압 PVP 용액에 연결하고 500 삼투압 튜브를 고삼투압 PVP 용액에 연결합니다. 밥이 컵 안으로 완전히 내려갔는지 확인하십시오. 소프트웨어를 실행하고 Hardware Check를 선택하여 기계를 프라임한 다음 IO를 계측합니다. 기기가 프라이밍 주기를 완료할 수 있도록 합니다.

사이클이 완료되면 컵에서 밥을 들어 올리고 보푸라기가 적은 티슈로 밥과 컵을 완전히 말리십시오. 갓 채취한 전혈 샘플을 바이알을 여러 번 뒤집어 부드럽게 혼합합니다. 그런 다음 25마이크로리터의 전혈을 5ml의 iso-osmolar PVP 용액에 피펫팅합니다.

바이알의 뚜껑을 씌운 후 다시 여러 번 뒤집어 부드럽게 섞습니다. 소프트웨어 메인 메뉴에서 변형성을 선택한 다음 새 해석을 생성하고 실험 세부 사항을 추가합니다. 다음으로, 엑타사이토미터의 뚜껑을 들어 올리고 밥이 컵 안으로 완전히 내려갔고 컵이 돌아가고 있는지 확인합니다.

PVP 혈액 용액 1ml를 컵과 밥 사이의 공간에 피펫으로 넣습니다. 그런 다음 밥을 약간 들어 올려 샘플을 아래로 가져옵니다. 모든 기포가 용액에서 나올 때까지 기다렸다가 엑타사이토미터의 뚜껑을 닫습니다.

소프트웨어의 스크롤 막대를 따라 화살표를 이동하여 게인을 200으로 조정합니다. 온도가 섭씨 37도로 안정하고 회절 이미지가 안정적이면 시작을 누릅니다. 데이터 수집이 진행됨에 따라 회절 패턴을 관찰하여 원형, 타원형 또는 다이아몬드 모양으로 유지되는지 확인합니다.

데이터 수집이 완료되면 보고서를 인쇄하고 정리합니다. 전단 응력에 대한 반응으로 건강한 혈액에서 얻은 회절 패턴은 예상되는 타원형 패턴을 보여줍니다. 연신율 지수는 여기에 표시된 방정식을 사용하여 계산됩니다.

샘플이 흡인되면 기기가 세척 주기에 남아 있는 동안 탈이온수를 공간에 분출하여 컵과 밥 사이의 공간을 헹굽니다. 세척 주기가 완료되면 컵에서 밥을 들어 올리고 보푸라기가 적은 청소 티슈로 밥과 컵을 완전히 말리십시오. 잔류 물은 적혈구를 용해시켜 간섭을 일으키기 때문에 적절한 건조가 중요합니다.

내보내기를 선택하여 보고서를 저장합니다. 마지막으로 소프트웨어의 기본 메뉴 버튼을 클릭하여 기본 페이지로 돌아갑니다. 이전과 같이 다른 샘플을 엑타사이토미터에 로드한 후 안정적인 회절 이미지가 화면에 나타나는지 확인합니다.

3.8cm의 회절 높이가 생성될 때까지 화면을 따라 눈금자를 움직여 카메라 게인을 조정합니다. 눈금자를 사용하여 컴퓨터 화면에서 이미지의 높이를 확인합니다. 그런 다음 시작을 누르고 이전과 같이 데이터 수집을 관찰합니다.

이 이미지는 겸상 적혈구 빈혈 환자의 혈액에서 얻은 3.8cm 회절 패턴을 보여줍니다. 앞서 보여진 바와 같이 엑타사이토미터를 세척한 후 절차를 반복하여 4.5cm 및 5.4cm 높이에서 회절 패턴을 얻습니다. 회절 패턴 왜곡은 이질적인 혈액 샘플에서 발생하는데, 그 이유는 단단한 적색 세포가 변형 가능한 세포와 제대로 정렬되지 않아 다이아몬드 모양의 회절 패턴이 발생하기 때문입니다.

이 왜곡 패턴은 더 큰 회절 패턴을 생성하도록 카메라 게인이 조정됨에 따라 점점 더 감지될 수 있습니다. 삼투압 구배 ektacytometry의 경우, 5ml의 iso-osmolar PVP가 들어 있는 바이알에 250마이크로리터의 전혈을 넣고 부드럽게 혼합하는 것으로 시작합니다. 소프트웨어의 메인 메뉴에서 Osmoscan을 선택합니다.

그런 다음 혈액 PVP 용액이 들어 있는 바이알을 기계 왼쪽의 바늘 아래에 놓습니다. 바늘이 바이알 바닥에 닿을 때까지 바늘을 내립니다. 튜빙이 그래디언트 생성을 위해 저삼투압 및 고삼투압 용액에 제대로 연결되어 있는지 확인하십시오.

엑타사이토미터의 뚜껑을 닫고 아래쪽 절반의 도어를 열어 튜브로 들어가는 혈액을 볼 수 있습니다. 새 분석을 누르고 실험 세부 정보를 입력합니다. 카메라 게인을 200으로 조정한 후 기기 아래의 튜브에서 컵으로 혈액이 들어갈 때까지 기계를 작동시킵니다.

컴퓨터 화면에 안정적인 회절 패턴이 표시되면 대화 상자에서 지금 시작 버튼을 눌러 데이터 수집을 시작합니다. 엑타사이토미터가 킬로그램당 최대 약 500밀리오스몰까지 데이터를 수집할 수 있도록 한 다음 기기를 중지합니다. 보고서를 인쇄합니다.

다음으로, 오래된 PVP 혈액 바이알을 제거하고 탈이온수가 들어 있는 깨끗한 바이알로 교체합니다. 바늘이 바이알 바닥에 닿도록 아래로 내린 다음 대화 상자의 헹굼 버튼을 눌러 그라디언트 시스템을 헹굽니다. 헹굼이 완료되면 컴퓨터 모니터의 대화 상자에서 청소 옵션을 누르고 내보내기를 선택하여 보고서를 저장합니다.

이전과 같이 밥과 컵을 말리십시오. 건강한 지원자에서 발견되는 동질의 혈액 집단은 회절 크기를 측정할 때 다른 변형성 곡선을 생성하지 않습니다. 대조적으로, 겸상 적혈구 빈혈 환자의 혈액과 같은 이질적인 혈액 집단은 회절 패턴 크기의 함수로 변형성 측정에서 상당한 감소를 보여줍니다.

겸상혈에서 회절 패턴 왜곡의 정도를 EI max의 함수로 측정하면 헤모글로빈 S 및 성인 헤모글로빈 변이체인 헤모글로빈 A2와 상관관계가 있습니다. 수혈은 뒤틀린 현상을 바로잡는데, 이는 혈액 내 정상적인 성인 헤모글로빈의 비율과 반비례하는 관계로 알 수 있다. 회절 패턴 왜곡의 정도가 절반 최대 변형성을 달성하는 데 필요한 전단 응력의 함수로 측정되든 EI max의 함수로 측정되든 상관관계가 있습니다. EI max, EI min 및 O min과 같은 주요 삼투압 구배 엑타사이토메트리 매개변수는 각각 세포 수화, 표면 대 부피 비율 및 삼투압 취약성에 대한 추가 정보를 제공합니다.

이러한 기술은 일단 숙달되면 제대로 수행되면 약 1시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차에 따라 현미경 검사와 같은 다른 방법을 수행하여 개별 적혈구의 변형성과 관련된 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 혈액 샘플에서 변형성과 혈청 이질성을 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.