Name: Immunosurgery에 의해 인간 배아 줄기 세포의 유도 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-12-13T00:28:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: 배우세요 인간 배아 줄기 세포 유도를 위한 면역외과학 기법을 사용하여 내부 세포질량을 분리하는 방법을. 고품질 배아와 정확한 기술이 성공적인 줄기 세포주 확립에 필수적입니다.

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AEC는 의료 연구 및 연구 머크 연구소에 대한 제인 코핀 차일즈 기념 기금의 동료입니다. 우리는 실험적인 조언과 토론 D. 에글리과 C. 카원 감사드립니다.

<html> 인간의 배아 줄기 (hES) 세포 유도에 사용되는 냉동 인간 배아는 하버드 대학에서 인간 과목의 사용에위원회와 배아 줄기 세포 연구 감독위원회 모두의 검토와 승인되었습니다 연구 프로토콜에 따라 적절한 정보를 동의를 다음과 같은 연구를 위해 기증했다 . 아래 서면 프로토콜 카원 외 의해 보고된 출판 매개 변수를 기반으로합니다. 2004 년 약간의 수정. 배아 문화 개발까지 확장 blastocyst 단계에 15 % Plasmanate로 보충 글로벌 매체의 방울로 퀸의 장점 해동 키트와 문화를 사용하여 인간 배아를 해동. 내부 세포 질량 Immunosurgery 기반 격리 준비 : <ol><li> 10cm 플레이트의 각 솔루션의 방울을 설정하여 조나 pellucida 및 immunosurgery의 제거 (아래 참조) 접시를 준비합니다. 증발을 방지하기 위해 미네랄 오일과 중첩. 파생위한 배아마다 하나의 행을 준비합니다. <ul><li> EmbryoMax 산성 Tyrodes는 그대로 사용합니다. </li><li> hES 세포 유도 매체 : 75 % KO - DMEM 10 % KO - 세럼 교체, 10 % Plasmanate, 2.5 % ES 세포 검사 태아 소 혈청 (FBS), 2mM Glutamax - I, 1 %가 아닌 필수 아미노산, 50 대 / ML 페니실린, 스트렙토 마이신의 50μg/ml, 0.055mM B - 메르 캅 토 에탄올, 5ng/ml bFGF. </li><li> 토끼 안티 - 인간의 적혈구 세포 일차 항체는 hES 세포 유도 매체와 1시 10분에 희석 제조 업체의 제안에 따라 재구성. </li><li> 기니 돼지 보완 혈청, hES 세포 유도 매체와 1시 10분에 희석 제조 업체의 제안에 따라 재구성. <img src="/files/ftp_upload/old/574_2008_9_18_6/574_Figure-01.png" alt="574_Figure - 01" width="600" height="166" /> </li></ul></li><li> ° C 조직 문화 인큐베이터에서 사용하기 전에 37 모든 번호판을 평형. </li><li> 전송 배아에 사용하기 위해 50μl - 100μl 모세관 pipettes (VWR)을 당기세요. 다이아몬드 펜과 0.2μm 필터를 갖춘 입 피펫 튜브와 함께 사용 끝을 잘라. </li></ol> Immunosurgery 절차 : 참고 : <ul><li> 이 절차에서는 trophectoderm의 세포는 보완 활동과 협력하여 인간의 세포에 대한 감독 항체에 대한 간단한 노출에 의해 파괴됩니다. blastocyst만을 구조적 무결성 또한 면역 반응에 민감한되는 ICM을 방지 등 따라서, 프로토콜, 손상 trophectoderm와 함께 고품질의 배아와 함께 잘 작동됩니다. </li><li> 모든 절차가 열띤 무대를 갖춘 절개 범위를 사용하여 수행했습니다. </li></ul> 단계 : <ol><li> 고집에서 배아를 방지하기 위해 FBS와 배아 전송을 위해 사용할 수 입 피펫을 씻어. </li><li> 문화 접시에서 요리 AT의 hES 개최 드롭에 blastocyst을 전송. </li><li> 방울 AT 시리즈를 통해 hES 드롭에서 blastocyst를 전송하여 절차를 시작합니다. 셋째 드롭, 조나 pellucida (보통 5~30초)의 해산에 대한 감시. 아니여 - 치료 또는 배아 무결성에주의하는 것은 위험 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/old/574_2008_7_21_2/574_Figure-02.png" alt="574_Figure - 02" width="551" height="273" /> </li><li> hES 세포 유도 매체의 시리즈를 통해 전송 blastocyst은 하차 린스로 방울. 미디어와 Preloading 피펫은 즉시 반응 AT 무력화하는 것이 좋습니다. 모두 - 처리 AT 때까지 Blastocysts 여기 개최 수 있습니다. </li><li> 37 부화 30 분 제 3 드롭 ° 조직 문화 인큐베이터에서 C에두고, 기본 항체 방울의 시리즈를 통해 blastocyst을 전송합니다. </li><li> hES 세포 유도 매체의 시리즈를 통해 전송 blastocyst은 기본을 린스로 방울. </li><li> trophectoderm 세포의 용해를 위해 볼 셋째 드롭 떠나, 보수 방울의 시리즈를 통해 blastocyst을 전송합니다. 그들이 lyse로 trophectoderm 세포의 &quot;버블링&quot;에 대한 무대에서 처음으로 30 초 동안 blastocyst을 관찰. 용해이 기간 내에 관찰되면 완료 때까지 반응을 모니터하기 위해 현미경의 무대에서 요리를 계속. 더 버블링이 최초 30 초 동안 관찰하지 않으면 trophectoderm 대부분 lysed 때까지 5 분마다 확인, 인큐베이터으로 돌아갑니다. 이 5~15분 소요될 수 있습니다. 반응 시간과 내부 세포 덩어리 잠재적인 피해를 최소화하기 위해 밀접하게 반응을 모니터링합니다. <img src="/files/ftp_upload/old/574_2008_7_21_3/574_Figure-03.png" alt="574_Figure - 03" width="571" height="273" /> </li><li> hES 세포 유도 매체의 시리즈를 통해 전송 blastocyst은 보완 작업을 씻어 방울. </li><li> blastocyst (10μl VWR 모세관 튜브에서 나온)보다 약간 작은 직경 유리 피펫을 사용하여 lysed trophectoderm의 대부분을 벗겨 아래로 blastocyst을 그려합니다. G &quot;고도 =&quot;574_Figure - 0 &quot;너비 =&quot;577 &quot;높이 =&quot;270 &quot;/&gt; </li><li> 플레이트 ICM은 mitotically inactivated 마우스 배아 섬유아 세포 (MEFs)의 피더 세포로 분리. MEFs는 파생 전날을 준비과 hES 세포 유도 미디어 하루에 전환해야합니다. 4 잘 NUNC 요리 유도의 초기 단계를 잘 작동합니다. </li><li> 첫째 1~2일에 대한 번호판을 방해하지 마십시오. 이후 배아 줄기 세포 식민지 (보통 명백한 1~2주 이내)의 가지에 대해 매일 확인합니다. 미디어는 3 일에있는 모든 다른 하루를 시작 이분의 일 볼륨에서 변경해야합니다. </li></ol> ES 세포 파생물 및 passaging hES 세포 가지가 약 0.5mm 이상에 도달하면 기계 수확하여 확장 준비가되었습니다. <ol><li> 기계식 가지의 절반을 분산 신선한 피더를 포함하는 새로운 접시에 전송할 수 있습니다. 배아의 줄기 세포 대단히 짧은 시간은 약 30-50 전지 각각해야합니다. 백업 최초의 통로 (P1)에 같은 가지의 다른 절반을 둡니다. 이 확장을 계속하고 같이 파생물 (p0)이 여러 번 포착에서하실 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/old/574_2008_7_21_5/574_Figure-05.png" alt="574_Figure" width="639" height="219" /> </li><li> 보조 식민지는 마찬가지로 분산하고 새로운 세포 라인이 효소 트립신과 passaging 적응 수있는 시간 구절 3-5 때까지 큰 문화 요리에 걸쳐 확장하실 수 있습니다. 문화 미디어의 혈청 내용도 점차 ES 세포 차별을 최소화하기 위해 이러한 초기 구절 중에 1퍼센트 0 %로 감소한다. </li><li> 모든 기존 배아 줄기 세포 라인은 향후 확장을위한 초기 구절의 일부를 냉동하여 틀었해야합니다. </li><li> 또한, 각각의 세포 라인은 핵형 분석에 의해 특징이어야하며 체외 및 생체내에 pluripotency와 분화 연구에 의해 확인되었습니다. </li></ol>

<ol><li>Cowan, C. A., Klimanskaya, I., McMahon, J., Atienza, J., Whitmyer, J., Zucker, J. P., Wang, S. P., Morton, C. C., McMahon, A. P., Powers, D., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+embryonic+stem-cell+lines+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22N+ENGL+J+MED%22%5BJournal%5D)">Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts.</a> N ENGL J MED. 350 (13), 1353-1356 (2004).</li>
</ol>

저자들은 공개할 사항이 없습니다.

프로토콜 여기에 소개가와 연구자를 제공하는 간결한, 쉬운 따라 내부 세포 질량 immunosurgical 절연에 의해 인간 배아 줄기 세포 라인을 도출하는 방법에 대한 개요.

<table><tbody><tr><td>Quinn&amp;rsquo;s Advantage 해동 키트</td><td>Sage</td><td>ART-8016</td><td></td></tr><tr><td>Global 배지</td><td>Life Global</td><td>GMGB-050</td><td></td></tr><tr><td>Plasmanate</td><td>Talecris</td><td>61325</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax Acidic Tyrodes</td><td>Chemicon International</td><td>MR-004-D</td><td></td></tr><tr><td>KO-DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>10829-018</td><td></td></tr><tr><td>KO-Serum Replacement</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>ES 세포 테스트 완료 소태아혈청, Defined</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax-I</td><td>Invitrogen</td><td>35050-079</td><td></td></tr><tr><td>비필수 아미노산</td><td>Invitrogen</td><td>11140-076</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 기본 섬유아세포 성장 인자</td><td>Invitrogen</td><td>13256-029</td><td></td></tr><tr><td>Beta-mercapt&amp;#8211;hanol</td><td>Invitrogen</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>토끼 항-인간 적혈구 1차 항체</td><td>Rockland Immunochemicals</td><td>109-4139</td><td></td></tr><tr><td>기니피그 보체 혈청</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-1639</td><td></td></tr><tr><td>모세관 피펫(10 microL, 50 microL, 100 microL 크기)</td><td>VWR international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>튜브 포함 마우스 피펫</td><td>VWR international</td><td></td><td>VWR 모세관 피펫과 함께 제공됨</td></tr><tr><td>0.2 microm Acrodisc 시린지 필터</td><td>Pall Corporation</td><td>PN4192</td><td></td></tr><tr><td>0.5% Trypsin-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25300-120</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 접시</td><td>VWR international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 접시</td><td>Nalge Nunc international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Tokai Hit ThermoPlate 가열 스테이지가 장착된 Nikon SMZ1500 해부 현미경</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>마우스 배아 섬유아세포 (E12.5)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

immunosurgery에 의해 인간 배아 줄기 세포의 유도

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

자기 갱신과 신체의 모든 세포 유형으로 차별화하는 인간 배아 줄기 세포의 능력은 그들이 모두 의료 어플 리케이션을위한 개발과 질병의 근본적인 질문을 해결하기위한 연구 도구로 큰 약속을 개최하는 것이 좋습니다. 여기서 우리는 내부 세포 질량 immunosurgical 절연에 의해 배아에서 인간 배아 줄기 세포의 유도에 대한 간결한, 단계별 절차를 제공합니다.

Immunosurgery에 의해 인간 배아 줄기 세포의 유도

인간 배아줄기세포가 자기 복제하며 신체의 모든 세포 유형으로 분화할 수 있는 능력은, 이 세포들이 ... 모두에 있어 매우 큰 가능성을 가지고 있음을 시사합니다.

안녕하세요, 저는 melting 연구실의 박사후 연구원 Alice Chen입니다. 오늘은 인간 배아로부터 배아줄기세포를 유도하는 방법을 시연하겠습니다. 저희는 다양한 발달 단계의 배아를 수령하여, 적절한 확장 포배기 단계에 도달할 때까지 체외에서 배양합니다.이것은 배아가 첫 번째 단계인 단세포 단계부터 초기 배반포, 그리고 인간 배아줄기세포를 유도하는 확장 배반포까지 발달하는 과정의 예시입니다. 유도를 위해 선택된 고품질 배아는 세 방울의 ACE-조사(ACE roads)를 통해 이동시키며, 여기서 배아를 두고 투명대(zona lucida)가 용해되는지 관찰합니다. 탈투명대 과정은 비특이적 과정으로, rabbit anti-human 항체가 세포의 외층에 결합하게 됩니다.이 사례에서는 trifecta derm을 사용합니다. 기니피그 혈청 보체를 처리하면, 항체가 결합된 이 모든 세포들이 용해됩니다. 우선, 3개의 플레이트를 준비하겠습니다.첫 번째 플레이트는 zita를 제거하는 데 사용하는 ACE tyros용입니다. 두 번째와 세 번째 플레이트는 면역 수술용입니다. 먼저 acid tyros 방울과 인간 배아 줄기세포 유도를 배치할 플레이트를 제작하는 것부터 시작하겠습니다.배지 방울. 플레이트 왼쪽에 산성 티로스(acid tyros) 세 방울을 준비하고, 플레이트 오른쪽에는 인간 배아줄기세포(ES) 배양 배지 세 방울을 준비합니다. 두 번째 플레이트는 1차 항체인 rabbit anti-human RBC로 구성됩니다.다시 한번 설명하자면, 플레이트의 왼쪽은 1차 항체용으로 배아당 세 방울씩 할당하고, 플레이트의 오른쪽은 인간 ES 배양물용으로 할당합니다. 보충 플레이트의 경우, 마찬가지로 배아당 세 방울의 배지를 사용합니다. 다시 말씀드리면, 플레이트 왼쪽에 보충제 세 방울을 놓은 다음, 플레이트 오른쪽에 인간 ES 배양 배지 세 방울을 놓습니다.다시 한번 말씀드리면, 각 행은 배아 하나를 위해 할당됩니다. 세 개의 플레이트 모두 증발을 방지하기 위해 미네랄 오일로 덮어 평형화를 위해 인큐베이터에 넣습니다. 이곳은 조직 배양과 마찬가지로 층류(laminar flow)가 형성되는 피킹 구역 내의 해부 현미경이며, 여기서 대부분의 인간 배아 조작을 수행합니다.배아 작업을 시작하기 전 가장 먼저 준비해야 할 것은 마우스 피펫입니다. 이것은 표준 마우스 피펫 튜브이지만, 멸균 상태를 보장하기 위해 입과 피펫 연결 부위 사이에 0.2 µm 필터를 삽입했습니다.마우스 피펫을 제작하는 방법을 보여드리겠습니다. 저는 다양한 크기로 제작하는 것을 선호합니다. 이 모든 제품은 VWR에서 구입할 수 있으며, 저는 10 µL, 50 µL, 100 µL 직경으로 제작하는 것을 선호합니다.이제 다이아몬드 핀을 사용하여 마운트 파이프를 절단합니다. 이 첫 번째 단계에서는 배아 전체를 다루기 때문에 직경이 다소 큰 핀을 사용하는 것이 좋습니다. 유도를 위해 선정된 고품질 배아를 세 개의 방울을 통해 이동시킵니다.첫 번째 방울에서 두 번째, 세 번째 방울로 순차적으로 옮기며 zap palita의 용해 여부를 관찰하십시오. 이 과정은 보통 30초 미만이 소요되며, 실제로 zap palita가 녹아 없어지는 것을 확인할 수 있습니다. zap palita가 완전히 용해되면.그 후 배아를 인간 ES 배양액이 담긴 세 개의 세척 드롭으로 옮겨 첫 번째, 두 번째, 세 번째 드롭을 차례로 통과시킵니다. 그다음 배아를 1차 항체 드롭으로 다시 옮겨 첫 번째 드롭에서 두 번째 드롭, 그리고 세 번째 드롭 순으로 이동시킨 후, 조직 배양 인큐베이터에서 30분 동안 배양합니다. 배아 외부의 세포에서 기포가 발생하는 것이 보이면 외배엽의 용해가 일어나는 것입니다. 이는 외배엽 세포가 용해되기 시작했음을 의미합니다.배아의 전체 외곽 가장자리를 따라 용해가 뚜렷하게 나타나면, 배아를 humanus 배양 배지 세 방울로 세척할 준비가 된 것입니다. 면역 수술 후, 배아를 입구 직경이 더 작은 피펫을 사용하여 기계적으로 마쇄합니다. 이 피펫은 첫 번째 피펫보다 직경이 작아야 하며, 이를 통해 용해된 삼중층을 깎아내는 마쇄 과정을 더 효율적으로 수행할 수 있습니다.피부 세포. 기계적 처리의 마지막 단계에서 중앙에 세포 집단이 남게 됩니다. 여기에는 손상되지 않은 내세포집단이 있습니다.이 주변에는 많은 용해된 trifecta 진피 세포와 일부 온전한 trifecta 진피 세포들이 있습니다. 이렇게 분리된 내세포집단은 마우스 배아 피더 세포가 준비된 웰에 배치됩니다. 피더 세포 플레이트는 전날 밤에 준비되었으며, 오늘 아침에 배지를 마우스 배아 섬유아세포 배지에서 인간 es 유도 배지로 교체하였습니다.보충 후 세척 드롭에 있는 내세포집단 분리물을 피더 세포층이 포함된 이 웰로 옮깁니다. 그다음 이 디쉬를 인큐베이터로 다시 옮기고, 내세포집단 분리물이 부착될 수 있도록 며칠 동안 그대로 둡니다. 이것은 외성장이 발달하는 모습의 예시입니다.배양물이 충분히 커지면, 이 배양물을 절반으로 나누어 첫 번째 계대를 시작할 수 있습니다. 현재는 최초 유도 후 14일이 경과한 상태이며, 여기는 저희가 유도한 배양물 중 하나의 예시입니다.이것은 그러한 성장 조직의 한 예이며, 오늘은 이 성장 조직의 절반을 떼어내겠습니다. 이 성장 조직을 반으로 나눈 뒤 정사각형 조각으로 자르고, 각 조각을 피더 세포(feeder cells)가 들어 있는 새 웰로 옮깁니다. 성장 조직의 절반을 그대로 두는 것이 좋은데, 이는 세포를 증폭하거나 수행한 계대 배양을 백업하기 위해 다시 돌아갈 수 있는 지속적인 세포 공급원을 확보하기 위함입니다.처음 2~3회 계대 배양 동안에는 이러한 방식으로 기계적 계대 배양을 수행하고, 이후 더 효율적인 계대 배양을 위해 세포를 효소 해리에 적응시키는 것이 좋습니다. 본 연구실에서는 발생과 분화의 이해 및 활용을 위해 인간 배아 줄기 세포주를 지속적으로 유도하고 있습니다.이 세포주들은 전 세계 줄기세포 연구자들에게도 분양됩니다. 저는 유도 성공 여부에 영향을 미치는 네 가지 주요 요인이 있다고 생각합니다. 첫 번째는 배아의 품질과 관련된 것으로, 이는 유전적 배경, 배아의 동결 및 해동 상태, 그리고 배반포 단계의 유도 시점까지의 체외 배양 품질에 따라 달라집니다.두 번째 요인은 아마도 분리 후 내세포집단의 품질 무결성일 것이며, 이는 내세포집단 분리에 사용된 기술뿐만 아니라 경험과 숙련도에 따라 달라질 수 있습니다. 세 번째 요인은 분리된 내세포집단이 공급층에 얼마나 잘 부착되는가이며, 네 번째 요인은 이 ICM 분리물의 외성장입니다. 기술적으로 어려운 과정이라고 생각하지 않습니다.약간의 연습만 있으면 됩니다. 사실 각 단계는 상당히 간단하므로, 프로토콜을 잘 따라하고 조금만 연습한다면 누구나 수행할 수 있을 것입니다. 실험실에서 확인한 결과, 완전히 파악하지 못한 몇 가지 이유로 인해 각 세포주는 조금씩 차이가 있었습니다.예를 들어, 10개의 라인에 대해 분화 능력을 테스트한다면, 그중 두세 개의 라인이 귀하가 관심을 가지고 있는 세포 유형으로 발달할 가능성이 더 높을 수 있습니다. 저는 이러한 차이가 배아줄기세포 라인이 유래된 배아의 단계뿐만 아니라, 이러한 세포들의 수동 조작 방식과 관련이 있을 것이라고 생각합니다. 세포 라인의 불균질성과 그 잠재력은 때때로 그 특성이 변하기 때문에, 모든 줄기세포 연구자가 명심해야 할 사항이라고 생각합니다.다시 말씀드리자면, 이러한 현상의 원인은 정확히 알 수 없으나 제 연구의 예시로 설명하자면, 저희의 최종 목표는 췌장의 인슐린 생성 베타 세포를 만드는 것입니다. 이러한 유형의 세포주를 만들기 위한 첫 번째 단계는 배아줄기세포로부터 내배엽을 생성하는 것인데, 10~20개의 세포주를 비교 분석한 결과, 이 중 한두 개의 세포주는 내배엽을 효율적으로 생성하는 반면, 절반 정도는 생성 효율이 낮았으며, 일부는 내배엽을 거의 생성하지 못한다는 것을 발견했습니다. 따라서 이러한 초기 스크리닝 과정을 통해 관심 있는 세포 유형으로 분화될 가능성이 높은 세포를 선택하고, 해당 세포들을 이용하여 나머지 분화 과정을 진행합니다.인간 배아줄기세포의 최초 유도는 1998년 Thompson 등에 의해 보고되었으며, 2004년에 본 연구실은 17개의 새로운 인간 배아줄기세포 라인 유도를 보고했습니다. 본 연구에서는 기발표된 프로토콜을 수정하였으며, 이러한 수정 사항은 유도 과정을 더욱 효율적으로 만들기 위한 것이었습니다. 수정 내용은 배지 조성, 세포 계대 배양 방식 및 동결-해동 방식의 변경으로 구성됩니다.그 이후로 모든 유도 과정에서 프로토콜과 유도 속도를 개선할 새로운 방법을 모색하고 있습니다. 예를 들어, 저희 연구실에서는 토끼 항체나 기니피그 혈청 보체와 같은 외래 시약을 사용하는 대신, 내세포집단을 보다 기계적으로 분리해내는 대안적인 방법을 탐구하고 있습니다. 이러한 방법들이 내세포집단을 분리하는 데 있어 최소한 기존과 비슷하거나, 혹은 더 나은 방법으로 이어지기를 기대하고 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

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생물학

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