Name: CRISPR 중재 Chromatin 루프 구조 개편 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 학습하세요 CRISPR-dCas9 기반 CLOuD9 시스템을 활용한 염색질 루프 재구성 기법으로 유전자 발현을 선택적이고 가역적으로 조절하는 방법입니다. 이 기술은 염색질 구조와 전사 역학의 관계를 규명하는 데 활용됩니다.

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우리는 헤 창, 토니 오로, S. Tavazoie, R. 플 린, P. 바티스타, E. Calo 및 전체 왕 실험실 기술 지원 및 원고의 중요 한 읽기에 대 한 감사합니다. S.L.M.는 NSFGRF (DGE-114747), NDSEGF (FA9550-11-C-0028), 국립 암 연구소 (1F99CA222541-01)를 통해이 작품에서 지원 되었습니다. K.C.W. 의료 과학자 버로우즈 Wellcome 기금에서에 대 한 경력 수상에 의해 지원 됩니다 그리고 도널드 E. 이며 델리 아 B. 터 재단 교직원 학자.

1입니다. gRNA 디자인
<ol><li>디자인 가이드 RNAs10표준 gRNA 디자인 도구를 선택 합니다. 이전 개발된 CLOuD9 구조9 의 보완적인 쌍을 사용 하 여 (즉, 1 S. 구 균 (CSA)와 1 S. pyogenes (CSP) 구성) 각 실험에 대 한.<ol>
<li>선택한 온라인 설계 도구를 사용 하 여 Protospacer 인접 한 모티브 (PAM) 시퀀스 "NGG" 가이드 길이 20의 CSP와 PAM에 대 한 혈압 CSA에 대 한 가이드 길이 21의 "NNGRRT" 시퀀스.</li>
		<li>선택 가이드 특이성에 따라 점수와 디자인 작업 가이드를 얻기의 기회를 최대화 하기 위해 두 가닥에 가이드.</li>
		<li>올리고 제조 업체에서 가이드 당 2 oligonucleotides 주문: 앞으로 올리고, "caccg" 5' 끝에 가이드 시퀀스의 고 역 oligo에 대 한 추가, 주문 하기 전에 "aaac" 5' 끝에 3' 끝에 "c" 추가.</li>
	</ol>
</li>
	<li>처음에, 3-5 gRNAs 250-1000 bp 지역에 걸쳐 관심의 각 지역에 대 한 디자인. 다음과 같이 효율을 대상으로 gRNA를 평가:<ol>
<li>Active Cas9 플라스 미드로 복제 확인 gRNAs (3 단계 참조) 정도 293T 세포 (4 단계 참조)에 transfect,11.</li>
		<li>2-3 d에서 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 페니실린-스 (펜 strep)에 대 한 세포 성장 다음 수확 하 고 게놈 DNA12를 추출 합니다.</li>
		<li>연쇄 반응 (PCR)에 의해 대상된 영역을 증폭. 1.5 %agarose 젤에 제품을 실행 하 고 적절 한 밴드를 정화.</li>
		<li>T7 endonuclease 분석 결과 Guschin에 설명 된 대로 수행 외. 프로토콜13,14. 참고: 효율적인 가이드 대상 사이트에 DNA를 자르기 위하여 결정 된 그는.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 세포 배양
<ol><li>세포는 건강 하 고 적극적으로 나눈 상태에서를 유지 관리 합니다.<ol>
<li>K562s, 10 %FBS 1% 펜 strep 로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 1640 미디어에서 문화에 대 한<ol>
<li>K562s 유지 보수에 대 한 25 cm2 canted 목 플라스 크에서 성장 하 고 매일 mL 당 400000 셀에 셀 밀도 조정.</li>
			<li>K562s로 불리고 되었습니다가지고 후 CLOuD9 생성, 2 µ g/mL puromycin와 100 µ g/mL hygromycin 유지 보수 미디어를 추가 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>293Ts에 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 10 %FBS 1% 펜 strep 문화에 대 한<ol>
<li>293Ts 10 cm2 접시에서 성장 하 고 분할 때 confluent.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 플라스 미드 준비 및 gRNA 삽입15
참고: 플라스 미드 맵 부록에서 사용할 수 있으며 예제에서는 실험에 활용 하는 뇌관 보충 표 1에서 사용할 수 있습니다.
<ol><li>믹스 5 µ g lentiviral CRISPR 플라스 미드의 BsmBI, 알칼리 성 인산 가수분해 효소, 버퍼, x 10의 6 µ L 및 갓된 100 mM DTT의 0.6 µ L의 3 µ L의 3 µ L와. DdH2O 60 µ L을 총 볼륨을 가져오고 소화 하 고 dephosphorylate 플라스 미드를 30 분 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>젤 소화 플라스 미드 정화 하 고 elute ddH2o.</li>
	<li>T4 결 찰 버퍼, ddH2O, 6.5 µ L와 0.5 µ L 10의 1 µ L로 각각 100 µ M에 대응된 가이드의 믹스 1 µ L T4 PNK, 10 µ L 총 볼륨에 도달. 30 분, 5 분 동안 95 ° C 다음 37 ° C에서 품 어 다음 25 ° C에 5 ° C/min까지 진입로. 참고:이 가이드의 쌍을 anneal 것입니다.</li>
	<li>DdH2오 (단계 3.3)에서 단련된 가이드 1: 200으로 희석</li>
	<li>믹스 1 µ L 단계 3.2에서에서 소화 플라스 미드의 단계 3.4, 버퍼, ddH2O, 1 µ l 고의 리가, 0.5 µ L 5.5 µ L 총 반응 x 2의 2.5 µ L에서에서 희석된 합자 가이드의 0.5 µ L로. BsmBI 소화 플라스 미드에 가이드를 위하여 10 분 실 온에서 이것을 품 어.</li>
	<li>Stbl3 박테리아 단계 3.5에서에서 새로 합자 플라스 미드를 변환 하 고 모든 플라스 미드 준비 방법을 사용 하 여 증폭.</li>
</ol>4. lentivirus 생산
<ol><li>6 잘 잘 당 수 750000 293T 세포는 hemocytometer를 사용 하 여 접시 하 고 10 %FBS 1% 펜 strep DMEM에 그들을 씨앗. 한 우물을 사용 하 여 각 구문에 대 한.</li>
	<li>시드, 후 24 h 10% 신선한 항생제 무료 DMEM 미디어 변경 FBS.</li>
	<li>1 개의 관에서 11 µ L 지질에 기초를 둔 transfection 시 약의 반응11당 OptiMEM 매체의 150 µ L로 희석.</li>
	<li>별도 튜브에 단계 3.6, pMDLg/pRRE, pRSV 회전의 1 µ g의 OptiMEM 매체의 반응11당 150 µ L와 pMD2.G의 0.65 µ g의 0.35 µ g에서에서 CLOuD9 lentiviral 벡터 플라스 미드의 2 µ g을 희석.</li>
	<li>각 반응에 대 한 1:1 비율로 희석된 지질에 기초를 둔 transfection 시 약을 희석된 lentiviral 플라스 미드 혼합물을 추가 하 고 5 분11품 어.</li>
	<li>4.2 단계에서 항생제 무료 293T 세포의 각 우물에 4.5 단계에서 각 혼합된 단지의 전체 볼륨을 추가 합니다.</li>
	<li>48 h 후, 5 분에 대 한 300 x g에서 내려 신선한 튜브와 스핀에 pipetting으로 바이러스 성 생산 미디어를 수집 합니다. 원심, 후 잔류 세포 파편을 제거 하는 신선한 튜브는 상쾌한을 이동 합니다.</li>
	<li>대상 셀의 변환에 대 한 즉시 바이러스 생산 미디어를 사용 하거나 나중에 사용-80 ° C에서 동결.</li>
</ol>5. lentivirus 셀의 변환
<ol><li>CLOuD9 응용 프로그램에 대 한 80, 000 셀을 포함 하는 15 mL 원뿔 튜브에 관심 (보완 CLOuD9 플라스 미드의 구성)의 바이러스 성 각 구문의 250 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>각 미디어의 총 볼륨을가지고 항생제-무료 미디어와 함께 1 ml 원뿔 1-8 µ g/mL (polybrene 활용 셀 형식에 의해 허용의 최대 농도 실험적으로 결정 될 필요 합니다) 사이 최종 농도에 polybrene를 추가 하 고.</li>
	<li>실 온에서 30 분 동안 800 x g에서 셀 스핀 다음 바이러스 상쾌한을 제거 하지 않고 pipetting으로 resuspend. 전체 세포 현 탁 액 셀 문화 접시에 이동.</li>
	<li>24 시간 후 변환, 실 온에서 5 분에 대 한 300 x g에 아래로 회전 셀</li>
	<li>바이러스 성 상쾌한 발음 하 고 일반 세포 배양에 있는 세포를 resuspend.</li>
	<li>다음 날, 셀 문화 매체를 두배로 불리고 셀 선택에 puromycin (1 µ g/l 293T 세포)와 hygromycin (293T 세포에 대 한 25 µ g/mL)을 추가 합니다. 실험적 puromycin 및 hygromycin 실험을 시작 하기 전에 지정 된 셀 형식에 대 한 적절 한 농도 결정 합니다.</li>
	<li>모든 다운스트림 실험 하기 전에 적어도 3 d 선택 미디어에 세포를 유지 하 고 모든 실험의 기간에 대 한 선택 미디어에서 유지.</li>
</ol>6. 세포 이합체 화 및 밖으로 세척
<ol><li>1mm Abscisic 산 (ABA)을 추가 하거나 컨트롤 하는 CLOuD9 dimerize 세포 배양에 대 한 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)의 해당 볼륨 선택 하 고 셀을 불리고. ABA 영수증의 날짜의 6 개월 이내 사용 하 여, 감기, 유지 하 고 사용을 통해 빛에서 그것을 보호. 필요한 경우에 2 mM ABA를 활용할 수 있습니다.<ol>
<li>매일 신선한 ABA (또는 컨트롤에 대 한 DMSO) 실험의 기간에 대 한 제공을 미디어를 변경 합니다. 참고: 이합체 화의 길이에 제한이 아직 관찰 되었습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>이합체 화 미디어 ABA 포함 하 고 셀 버퍼링 충분 한 인산 염 분 세척 (PBS)를 두 번, 접시의 표면을 커버의 제거를 통해 리버스. 그 후, 셀 취소 dimerized 상태를 유지 하기 위해 ABA-무료 미디어에 문화.</li>
</ol>7. Immunoprecipitation와 공동-immunoprecipitations
참고: 확인 하십시오 모든 버퍼 신선 하 고 즉시 사용 하기 전에.
<ol><li>이합체 화 실험의 다음 완료 수집 및 셀 아래로 회전 다음 상쾌한 발음.</li>
	<li>Crosslink 및 셀 아래로 동결<ol>
<li>신선한 재료를 사용 하 여 실 온에서 PBS에서 1% 포름알데히드의 신선한 소재를 확인 합니다. 모든 2 백만 셀에 대 한 회전 하는 동안 정확 하 게 10 분 동안 실내 온도에 1% 포름알데히드의 1 mL와 함께 resuspend 부드럽게. 참고: 사용 하 여 10 mL의 최소 볼륨 가교에 대 한 미만 10 백만 셀.</li>
		<li>0.125 M, 회전 하는 동안 실 온에서 5 분 동안 부 화 뒤의 최종 농도에 글리신의 추가와 가교를 끄다.</li>
		<li>셀 아래로 회전 시키십시오 그리고 얼음 처럼 차가운 PBS 가진 1-2 x를 씻어. 다음 셀 펠 릿 스냅 액체 질소에서 냉동 고-80 ° C에 저장 하거나 즉시 사용할 수 있습니다. 참고: 열 포름알데히드 crosslinks을 반대로 합니다. 돌진, 스냅 동결 없이 셀-80 ° C에 직접 저장할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>항 체/구슬 켤레 준비 참고: 선택 된 항 체 (즉, 다른 세포의 용 해 버퍼 세포 세포의 용 해에 대 한 테스트 및 IP 수행)에 대 한 최적화 조건 가치가 있을 수 있습니다. 2 개의 일반적인 버퍼, Farnham 세포의 용 해 버퍼 및 수정 RIPA 버퍼, IP 효율과 쥡니다 효율에 큰 영향을 가질 수 있습니다. 모든 버퍼 구성 재료의 테이블에서에서 찾을 수 있습니다. 또한, 마음에 계속 그 chromatin 쥡니다 완료 하는 데 몇 시간이 걸릴 수 있습니다.<ol>
<li>짧게 따라 선택한 항 체에 대 한 vortexing에 의해 구슬 resuspend.</li>
		<li>1.5 mL 튜브에 실험에 대 한 구슬의 적절 한 금액을 전송. 시작 지점으로 구슬의 20 µ L를 사용 하 여 항 체의 모든 1 µ g에 대 한. 항 체를 아직 추가 하지 마십시오. 참고: 사용 하 여 10 µ g 항 체 구슬의 200 µ L로 총 시작 점으로 lysate의 1 밀리 그램에 대 한 항 체는이 암시 하는 것 보다 더 효율적인 알려져 하지 않는 한. 낮은 풍부한 단백질에 대 한이 비율은 조정 될 필요가 있습니다.</li>
		<li>Farnham 세포의 용 해 버퍼 사용 하 여, IP 희석 버퍼에 3 배를 세척 한다. RIPA 세포의 용 해 버퍼 사용 하 여, RIPA 세포의 용 해 버퍼에 3 배를 세척 한다.</li>
		<li>Resuspend 구슬 단계의 7.3.3 동일한 버퍼의 마지막 볼륨 (IP 희석 또는 RIPA 버퍼)를 > 1 x와 < 초기 볼륨 x 5. 즉 100 µ L 초기 비드 볼륨, 100 및 500 µ L 최종 물의 resuspension 볼륨 사이의 사용 합니다.</li>
		<li>적절 한 농도에서 씻어 구슬에 항 체를 추가 합니다. 좋은 하 또는 플래그 항 체 IP CLOuD9 구문에 대 한 사용 하 여 항 체 1:50 (µ g 단백질: µ g 단백질 lysate)와 8 + h와 4 ° C에서 회전 하면서 하룻밤 사이 품 어. 실 온에서 2-4 h 또는 품 어.</li>
		<li>구슬에서는 상쾌한을 제거 하 고 삭제.</li>
		<li>워시 워시 버퍼와 3 x 비즈.</li>
		<li>항 체 (IP 희석 또는 RIPA 버퍼)와 야간 보육에 대 한 활용 하는 버퍼의 최소 볼륨에서 resuspend. 단백질 lysate 결합 때까지 차가운 유지.</li>
	</ol></li>
	<li>Chromatin sonicate<ol>
<li>먼저 셀 알 약 10 분 동안 얼음에 버퍼를 붓기의 추가 함께 세포를 lyse, 침전을 방지 하기 위해 몇 분 마다 세포 터치. 참고: 일반적으로, 버퍼 붓기의 500 µ L 25 백만 셀에 추가 되 고 거기에서 조정 하지만 마십시오 하지 사용 미만 500 µ L 버퍼에 대 한 < 25 백만 셀.</li>
		<li>Dounce 수동으로 모두 시계 방향 및 시계 반대 방향으로, 각각 x 13.</li>
		<li>다음 1500 x g.에 5 분 동안 4 ° C에 아래로 회전 핵은 상쾌한을 완전히 발음 하 고 나머지 상쾌한, 제거를 반복 다음 셀 펠 릿 mg에 무게.</li>
		<li>핵 세포의 용 해 버퍼를 추가 하는 프로 테아 제 억제제 (Farnham 버퍼 또는 RIPA 버퍼, 특히, 하나를 선택).</li>
		<li>Resuspend 수송과 핵을 핵 세포의 용 해 버퍼의 10 배 금액을 추가 (예를 들어 추가 핵 세포의 용 해 버퍼의 1 mL 0.100 g 펠 릿). 짧게 소용돌이 얼음에 10 분 동안 lyse. 참고: 명심 쥡니다 튜브의 크기. 이상적인 볼륨은 종종 < 1 mL, 그래서 샘플 펠 릿은 아주 큰 경우 분할 될 필요가 있습니다.<ol>
<li>공동-IP, 짧게 하 물자를 solubilize 희석 버퍼의 2-3 볼륨 immunoprecipitation를 허용 하는 수준에 SDS를 끄다 핵 sonicate 다음 7.4.6 단계로 진행 합니다. 매우 민감한 항 체에 대 한 추가 SDS의 농도 줄이기 위해 더 희석 버퍼를 추가 합니다. 참고: 중지 쥡니다 lysate 지웁니다; 그것은 완전히 투명 한 불투명/반투명 흰색에서 변경 됩니다. 샘플을 가능한 차가운 유지 하 고 할 하지 통해 sonicate.</li>
			<li>칩, 철저 하 게 DNA 150-1000 bp DNA 파편을 얻을 수를 sonicate이 다음 7.4.6 단계로 진행 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>4 ° c.에서 10 분에 대 한 최대 속도에서 불용 성 물질을 스핀</li>
		<li>신선한 튜브에 수용 성 자료를 전송 합니다.</li>
		<li>공동 IP에 대 한 단백질의 농도 측정 하 고 풀 다운 단계 7.5에서에서 계속 합니다.</li>
		<li>칩에 대 한 제거의 10 µ L 약 수 lysate 고 추가 40 µ L IP 차입 버퍼와 6 µ 5 M L 56ul의 총에 NaCl. 95 ° C에서 15 분 동안 boil의 3m NaOAc pH 5, 5-10 µ L을 추가 하 고 PCR 정화 열에 정리. 260에서 흡 광도 측정 하 여 DNA의 농도 측정 nm 및 샘플에 걸쳐 표준화. 그런 다음 풀 다운 단계 7.5에서에서 진행 합니다. 참고: 추가 lysate 스냅-80 ° C에서 냉동 고 수는 나중에 사용 하지만 최상의 결과 얻으려면 신선한 lysate에서 얻을 수 있습니다. 만약 얼어, 할 하지 동결/동결 해제 lysate 더 여러 번.</li>
	</ol></li>
	<li>풀 다운<ol>
<li>신선한 튜브에 단백질 lysate의 적절 한 금액을 전송. Farnham 세포의 용 해 버퍼 사용 하는 경우 2.1 양의 IP 희석 버퍼 (위)에 희석.</li>
		<li>입력된 컨트롤에 대 한 상쾌한의 100 µ L를 따로 설정 하 고 날까지 4 ° C에서 저장 합니다.</li>
		<li>지금 샘플 단계 7.3.8에서에서 구슬/항 체 켤레를 추가 합니다.</li>
		<li>밤새 4 ° C에서 샘플을 회전 하 고 1.5 mL 튜브에 액체 움직임에 대 한 충분 한 볼륨 확인을 하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>워시와 Elute<ol>
<li>하룻밤 회전 후 구속력 분수는 상쾌한을 저장 합니다. 그런 다음 세척 IP 희석 버퍼에 3-5 x 비즈.</li>
		<li>억제제 없이 실 온에서 IP 차입 버퍼를 준비 합니다.</li>
		<li>새로운 튜브를 15 분 이전 차입에 대 한 67 ° C에 소용돌이에 동요 50 µ L 차입 버퍼와 복합 elute 고 반복 또 다른 50 µ L. 결합 그들 모두 총 100 µ L 차입에 대 한. 참고:이 차입 절차에서 너무 많은 배경이 있는 경우에, 열 수 있습니다 수 감소 또는 떨고/부 화 하는 동안 제거. 이 일반적으로 대상 단백질의 수확량 감소 하지만 백그라운드를 대폭 줄일지 않습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>Crosslinks 67 ° C에서 난방에 의해 역 > 4 h. 참고:이 공동 IPs에 대 한 엄격 하 게 필요 하지 않습니다 하지만 도움이 될 수 있습니다.<ol>
<li>공동 IP 사이 관심의 대상 전체 이합체 화 되도록 실행 있다 SDS 페이지 젤과 하 태그 또는 플래그 태그에 대 한 항 체를 가진 조사에 모두 1: 1, 000에 표시 된 대로. 다음 8 단계를 계속 합니다.</li>
		<li>칩-정량에 대 한 올바른 지역화 및 각 CRISPR dCas9 구성 요소를 대상으로 되도록 열에 차입 제품 깨끗 하 고 10 µ L. 수행 실시간 정량 중 합 효소 연쇄 반응 (정량) 순화 된 DNA의에 elute. 뇌관 제시 데이터에서 보충 표 1에서 사용할 수 있습니다. 다음 8 단계를 계속 합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>8. RNA 추출 및 정량 PCR
<ol><li>CLOuD9 유도 유전자 발현 변화 조사를 먼저 분리 하 고 제어 셀 펠 릿 및 dimerized 셀 펠 릿 총 RNA를 정화.</li>
	<li>반전 녹음 방송17 에 의해 순화 된 RNA에서 보완 DNA (cDNA)을 확인 하 고 정량 분석을 수행. 뇌관 보충 표 1에서 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>9. 염색체 구조 붙 잡음 분석 결과
<ol><li>CLOuD9에 의해 유도 된 게놈 loci의 주파수에서 변화를 관찰, 염색체 구조 붙 잡음 (3 C) 수행8분석 실험.</li>
	<li>실시간 양이 많은 PCR에 의해 3 개의 생물 복제의 각각에 대 한 중복의 두 세트에 3 C 결 찰 제품을 계량. Tubulin 로커 스에서 3 C 신호를 샘플을 정상화. 뇌관 보충 표 1에서 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

The most CLOuD9 chromatin 반복에서 중요 한 단계는: 1) 디자인 또는 올바른 gRNAs를 사용 하 여, ABA 또는 DMSO를 포함 하 여 CLOuD9 불리고 셀에 매일 2) 변화 미디어 3), ABA의 신선도 유지 하 고 4)의 정확 하 고 주의 깊은 평가 수행 염색 질 구조입니다.
CLOuD9의 한계는 주로 선택의 대상 지역에 가이드를 설계 하는 능력에 거주. 가이드 RNAs 대상 DNA 영역을 수 dimerized dCas9 구성 요소를 지역화 하는 중요 한 작업을 수행 하 고 그들의 특정 타겟 사이트를 기반으로하는 가이드의 효능. 적절 한 gRNA 구성 요소 없이 시스템 역 형성 수 없습니다 CLOuD9 유도 루프. 따라서, 관심의 각 지역에 대 한 여러 지침을 디자인 하 고 250-1000 bp의 지역을 통해 가이드를 확산, 여 적어도 하나의 성공적인 가이드 보장 될 것입니다. 가이드 위치 정확한 결과에 필수적인 이기도합니다. 배경 효과와 같은 전사의 여기저기를 방지 하기 위해 전사 인자 바인딩 사이트 또는 다른 중요 한 지역에 있는 가이드를 피하기 위해 중요 하다. 또한, CLOuD9 구조물의 정확한 위치 수 약간 대상 유전자의 녹음 방송에 영향을. 이 실험적인 목적을 위한 가장 강력한 쌍을 식별 하는 각 대상 지역에 대 한 가이드의 여러 쌍을 테스트의 중요성을 강조 한다. 또한, 대상 영역의 각 쌍에서 체코 구문 S. 구 균, gRNAs와 대상 해야 하 고 CSP 구성 한다 타겟이 될 gRNAs와 S. pyogenes 에 대 한 구체적 대상에 대 한 키를 누릅니다.
정확한 결과 정확한 이합체 화를 보장 하기 위해, 그것은 또한 세포 환경 CLOuD9 구문 변환 다음의 신선도 유지 하는 것이 중요. 매일 미디어 변화와 신선한 dimerizer (또는 제어)의 추가 하면 상호 보완적인 구조 근접에서 유지 하 고 변경 된 염색 질 구조를 보존. 또한, ABA 신선 하 고 제조업체의 프로토콜 (열 감기, 빛 으로부터 보호 유지, 6 개월 이내)에 따라 적절 하 게 저장 된 보장 본격적인 결과 얻기 위해 필수적 이다.
특히, 보다는 오히려 더 일반적으로 FRB와 FKBP 시스템 활용 CLOuD9 위한 ABA dimerizer ABI와 PYL 이합체 화 단백질 사용 되었다. FRB/FKBP 시스템에는 rapalog의 필요성 때문에 암 세포에 독성 CLOuD9의 적용을 제한 것 이다. 대체 ABI/PYL 시스템이이 한계를 효과적으로 사용 될 더 넓게 utilizable CLOuD9 피할.
샨 다, 우리 CLOuD9, 독특하고 강력한 기술 강제로 수 있는 역 사이 장거리 표적 게놈 loci 연락처를 만들 개발 했습니다. Chromatin 루프 유도을 통해 또한 CLOuD9 적절 한 세포에서 유전자 발현을 수정에 활용 될 수 있습니다 설명 합니다. 기술의 적응성 반복 영역 또는 반복 메커니즘의 사전 지식 없이 어떤 두 게놈 loci 사이 상호 작용의 제한 없는 연구에 대 한 수 있습니다. 또한, CLOuD9의 독특한 시연된 반전 기능 추가 반복 메커니즘의 질병 및 개발 시험이 있습니다. Chromatin 반복의 목표에 효과 명확 하 게 입증 되어 있다, 그러나 있다 아직 데이터 대상에 루프에 오프 대상 반복 하 고 후속 영향의 효과에 대 한 통찰력을 제공.
우리의 데이터는 몇 가지 응용 프로그램에만이 도구를 보여 줍니다 하지만 chromatin 배치는 지표 유전자 발현의 주요 기본 아이디어를 의미. 우리의 기술은 연구 하 고 있는 유전자, 유전자의 녹음 방송에 있는 접는 chromatin의 역할의 전반적인 이해력 향상 chromatin 구조의 뉘앙스를 공개 사용할 수 있습니다. 연구 및 암, 유전 질환, 선 천 성 장애, 어떤 뚜렷한 chromatin에서 어셈블리는 의심할 여 지 없이 진 식20, 변경의 치료 방법을 끌 수 있습니다 transcriptional 역학의 예민의 더 나은 이해 21,,2223. CLOuD9 기술을 활용 하 여 후속 작업 정렬 및 chromatin 도메인 및 개발 및 질병에 안정적인 유전자 발현을 유지 하기 위해 접는 운전 방법의 역학에 대 한 내용을 더 켜 집니다.

Chromatin 핵 게놈의 특정 조직에 접는 관계로 진 식1,2와 밀접 하 게 관련 된 것으로 표시 되었습니다 최근 몇 년 동안에 상당한 관심을 얻고 있다. 유전자 활동의 염색 질 구조 사이 정확한 관계 불분명 한 동안, 가설 되는 동적 3 차원 chromatin 조직 결과로 염색체 연락처 사이 상호 작용 제공을 유전자의 규제 기능3. 실제로, 이러한 효과 인간의 globin 유전자 소재 시, 어디 로커 스 제어 영역 (LCR) 활동을 규제 globin 유전자의 발달 특정 방식으로 만들어 두 지역4사이 chromatin 루프에서 잘 입증 되었습니다. 그러나, 둘 다이 고 다른 지역, 그것 아니다 분명 chromatin 루프 인지는 원인 유전자 발현에 변경의 결과.
지금까지,이 현상을 공부에 도전 미해결에 남아 있었다. 예를 들어 유도 chromatin 루프에서 다른 시도 선형 DNA 순서 또는 반복5,6, 촉진 하는 특정 요소에 대 한 배경 지식 풍부 하 게 요구 하는 복잡 한 절차를 수정 관련 7,8. 또한, 이전 작업은 그 chromatin 루프 드라이브 유전자 발현 특정 하 고 제한 된 컨텍스트7,에 제안 하는 동안8, 수준 있는 chromatin에서 반복 영향 전사 세계적으로 불투명 하다. 장거리 반복 유전자 발현에 미치는 영향에 대 한 관심은 최근 몇 년 동안에 지속적으로 성장 하고있다, 비록 chromatin 연락처 변경 유전자 활동을 유지 하는 설정에 대 한 의문점이 계속 됩니다.
우리가 설계 하는 기술을 광범위 하 게 적용 가능한 모든 게놈 loci9의 대상에 대 한 수 있도록 nuclease 결핍 클러스터 정기적으로 interspaced 짧은 구조 반복 (CRISPR)-CRISPR-관련 단백질 (dCas9), 9를 사용 합니다. 이 기술은 선형 DNA 시퀀스의 수정에 관련 된 복잡 한 문제를 제거 하 고 특정 반복 구성의 중요 한 사전 지식 없이 액세스할 수 있습니다. 특히,이 도구는 보편적이 고 광범위 하 게 다양 한 질병, 암 등 뿐만 아니라 개발에서 인식 하는 chromatin 루프에 적용. CLOuD9의 파워는 역 효과적으로 유전자 발현을 조절 하는 루프의 구조를 변경 하 여 보여 줍니다.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640&nbsp; media</td><td>Life Technologies</td><td>11875-119</td><td>K562 세포 배양</td></tr><tr><td>DMEM media</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td>1X, 293T 세포 배양</td></tr><tr><td>lentiCRISPR v2</td><td>Addgene plasmid</td><td>#52961</td><td>CLOuD9 플라스미드 개발용</td></tr><tr><td>pRSV-Rev</td><td>Addgene plasmid</td><td>#12253</td><td>렌티바이러스 생산</td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene plasmid</td><td>#12259</td><td>For 렌티바이러스 생산</td></tr><tr><td>pMDLg/pRRE</td><td>Addgene plasmid</td><td>#12251</td><td>For lentivirus production</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668-019</td><td>For lentivirus production</td></tr><tr><td>anti-HA antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>3724</td><td>For immunoprecipitation</td></tr><tr><td>anti-Flag antibody</td><td>Sigma</td><td>F1804</td><td>For 면역침전</td></tr><tr><td>DNeasy 혈액 및 조직 키트</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td>DNA 추출용</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Life Technologies</td><td>15596-018</td><td>RNA 추출용</td></tr><tr><td>RNeasy Kit</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td>RNA 추출용</td></tr><tr><td>Superscript VILO</td><td>Life Technologies</td><td>11754-050</td><td>cDNA용&nbsp;</td></tr><tr><td>SYBR Green I MasterMix</td><td>Roche</td><td>4707516001</td><td>qPCR 분석용</td></tr><tr><td>Light Cycler 480II</td><td>Roche</td><td></td><td>qPCR 분석용</td></tr><tr><td>Anti-H3K4me3 항체</td><td>AbCam</td><td>ab8580</td><td>ChIP-qPCR</td></tr><tr><td>anti-RNA Pol-II 항체</td><td>Active Motif</td><td>61083</td><td>ChIP-qPCR EDTA</td></tr><tr><td>유리 프로테아제 억제제</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td>단백질용 추출</td></tr><tr><td>4-12 % Tris Glycine gel</td><td>Biorad</td><td></td><td>Any size, 웨스턴 블롯</td></tr><tr><td>안티 래빗 HRP 항체</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2030</td><td>웨스턴 블롯</td></tr><tr><td>안티 마우스 HRP 항체</td><td>세포 신호</td><td>7076S</td><td>웨스턴 블롯</td></tr><tr><td>K562 및 H3K293 ChIP-Seq 데이터</td><td>인코딩</td><td>ENCSR000AKU</td><td>ChIP-seq</td></tr><tr><td>분석 K562 및 H3K293 ChIP-Seq 데이터</td><td>Encode</td><td>ENCSR000APE</td><td>ChIP-seq 분석용</td></tr><tr><td>K562 및 H3K293 ChIP-Seq 데이터</td><td>인코딩</td><td>ENCSR000FCJ</td><td>ChIP-seq 분석용</td></tr><tr><td>K562 및 H3K293 ChIP-Seq 데이터</td><td>GEO</td><td>GSM1479215</td><td>ChIP-seq 분석용</td></tr><tr><td>Dynabeads 단백질 A 면역침전</td>용 <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10001D</td><td>면역침전용</td></tr><tr><td>Dynabeads 단백질 G Immunoprecipitation</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10004D</td><td>면역침전</td></tr><tr><td>RNA Clean & RNA 정제를 위한 Concentrator-5</td><td>Zymo Research</td><td>R1015</td><td></td></tr><tr><td>피어스 16% 포름알데히드 메탄올이 없는</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td><td>가교용</td></tr><tr><td>PX458 플라스미드</td><td>Addgene</td><td>48138</td><td>gRNA 클로닝을 위한 활성 Cas9 플라스미드를 제안했지만 모든 활성 Cas9 플라스미드는</td></tr><tr><td>QIAquick PCR 정제</td>를 수행할 것입니다. PCR <td>정제</td><td></td><td></td>를 위한 Qiagen 28104</tr><tr><td>FastDigest BsmBI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FD0454</td><td>가이드 RNA 클로닝용</td></tr><tr><td>FastAP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EF0651</td><td>가이드 RNA</td></tr><tr><td>10X 클로</td>닝용 <td>Thermo Fisher Scientific Buffer Thermo Fisher Scientific</td><td>B64</td><td>가이드 RNA 클로닝용</td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>클로닝 가이드 RNA용</td></tr><tr><td>10X T4 Ligation Buffer</td><td>NEB</td><td>B0202S</td><td>클로닝 가이드 RNA용</td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td>클로닝 가이드 RNA</td></tr><tr><td>2X Quick Ligase Buffer</td><td>NEB</td><td>B2200S</td><td>클로닝 가이드 RNA용</td></tr><tr><td>Quick Ligase</td><td>NEB</td><td>M2200S</td><td>클로닝 가이드 RNA용</td></tr><tr><td>Buffers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Farnham lysis buffer</td><td></td><td></td><td>1% Tris-Cl pH 8.0, 1% SDS, 1% 프로테아제 억제제 수용액(non-EDTA) 및 물 내 1mM EDTA</td></tr><tr><td>변형 RIPA 완충액</td><td></td><td></td><td>1% NP40/Igepal, 0.5% 나트륨 데옥시콜레이트, 0.1% SDS, 1mM EDTA 및 1% 프로테아제 억제제 수용액(비EDTA) PBS pH 7.8 또는 7.4</td></tr><tr><td>IP 희석 완충액</td><td></td><td></td><td>0.01% SDS, 1.1% Triton-X 100, 1.2mM EDTA, 16.7 mM Tris-HCl pH 8.0, 167 mM NaCl, 0.1x 프로테아제 억제제</td></tr><tr><td>세척 버퍼</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris pH 9, 100 mM LiCl, 1% NP-40 및 1% 나트륨 데옥시콜레이트</td></tr><tr><td>팽창 버퍼</td><td></td><td></td><td>0.1 M Tris pH 7.5, 10 mM 칼륨 아세테이트, 15 mM 마그네슘 아세테이트, 1% NP-40</td></tr><tr><td>희석 버퍼</td><td></td><td></td><td>0.01% SDS, 1.1% Triton X-100, 1.2 mM EDTA, 16.7 mM Tris pH 8 및 167 mM NaCl</td></tr><tr><td>IP 용출 버퍼</td><td></td><td></td><td>1% SDS, 10% NaHCO3 &nbsp;</td></tr></tbody></table>

crispr 중재 chromatin 루프 구조 개편

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

최근 연구는 명확 하 게 상호 작용 놀이 또는 유전자 발현에 변경의 결과 대 한 책임 인지 반복 하지만 유전자 발현의 규칙에 있는 중요 한 역할은 여전히 반복 하는 장거리, 3 차원 chromatin을 나타났습니다. 알 수 없는. 최근 까지는, 세포 기능과 유전자 활동의 규칙에 미치는 chromatin 반복 상대적으로 모호한 되었으며 이러한 구조를 조작 하는 기존 방법에 제한 금지 이러한 상호 작용의 심층 탐사. 이 불확실성을 해결 하려면 우리는 선택적이 고 가역 chromatin 루프 다시 조직 하는 방법 설계 CRISPR-dCas9 (CLOuD9)를 사용 하 여. CLOuD9 시스템의 동력 CLOuD9 구문 대상 로컬 chromatin 구조를 조절 하는 게놈 loci의 성공적인 현지화에 의해 증명 되었습니다. 중요 한 것은, 유도 연락처과 내 인 성 염색 질 구조를 복원 하는 능력 또한 확인 되었습니다. 이 방법으로 유전자 발현의 세포 유전자 발현을 조절 하는 능력을 설정 하 고 밑줄 만드는 안정적인 데 노 보 chromatin 루프 유전자를 현저 하 게 영향을 미치는이 기술의 응용 프로그램에 대 한 위대한 잠재력 암과 개발의 컨텍스트에서 식입니다.

Chromatin 반복; 유전자 규칙에 있는 중요 한 역 그러나, chromatin 루프의 선택적이 고 가역 수정 허용 하는 아무 기술 발전 되었습니다. 여기 우리가 chromatin 루프 개편에 대 한 강력한 시스템 설명 loci를 대상으로 선택적으로 고 역에서 유전자 발현 조절에 CRISPR-dCas9 (CLOuD9)을 사용 하 여.

CRISPR 중재 Chromatin 루프 구조 개편

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

이 방법은 염색질 구조가 유전자 발현에 어떻게 영향을 미치는지 그리고 크로마틴 조직이 전사 역학을 통제하는 방법을 정확하게 보여주는 유전자 발현과 관련된 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있었습니다. 우리는 장거리 크로마틴 루핑을 생성할 수 있도록 염색체 아키텍처를 제어할 수 있기를 원했기 때문에 이 기술을 개발했습니다. 동시에 내인성 염색체 구조를 복원하기 위해 크로마틴 컨텍스트를 반전시키는 능력이 있습니다.이 방법은 사용편의성과 폭넓은 적용성을 위해 설계되었습니다. 우리는 시스템을 보다 광범위하게 사용할 수 있도록 하기 위해 비독성 이질제와 dcas9의 직교 종을 이용했습니다. 우리는 유전자 발현이 염색체 건축을 낳는지 또는 염색체 구조가 유전자 발현의 변경으로 이끌어 내는지의 오랜 닭과 계란 질문에 대답할 수 있기를 원했기 때문에 이 방법을 개발했습니다.CRISPR-guide RNA 서열의 설계 및 세포 배양의 유지 보수는 텍스트 프로토콜에 설명된다. 플라스미드 맵과 활용된 프라이머가 거기에 나열되어 있습니다. 렌티바이러스 CRISPR 플라스미드 5마이크로그램과 BsmB1 3마이크로리터의 알칼리성 포스파타제 10x 소화 버퍼 6마이크로리터, DTT의 100밀리미터 100밀리리터를 혼합하여 플라스미드 제제를 시작합니다.총 부피 60 마이크로리터의 이중 증류수를 가져와 서 30분간 37°C의 혼합물을 배양하여 플라스미드를 소화하고 인계합니다. 그런 다음, 젤은 루프 플라스미드와 이중 증류수에서 소화된 플라스미드를 정화합니다. 다음으로, 가이드 RNA 쌍에 대한 안과 반응을 준비한다.각 가이드 RNA의 마이크로리터 1개를 10배 T4 리딩 버퍼 6.5 마이크로리터의 이중 증류수 6.5 마이크로리터와 T4 PNK의 0.5 마이크로리터를 결합하여 총 반응량 10마이크로리터를 지원합니다. 가이드 RNA쌍은 표적 서열에 37°C에서 혼합물을 배양한 다음 5분 동안 섭씨 95도에서 배양한 다음 분당 섭씨 5도까지 점차 온도를 25도로 낮춘다. 다음으로, 이중 증류수에 1~200개의 양안가이드 RNA를 희석시켰다.이제 두 가지 결찰 반응을 준비합니다. 소화된 플라스미드의 마이크로리터 1개를 희석된 perivaneal 가이드 RNAse 2.5 마이크로리터와 혼합하여 이중 증류수 1마이크로리터와 리그아제 0.5 마이크로리터를 버퍼링합니다. BsmB1 소화 플라스미드 가이드를 리게이트하기 위해 실온에서 10 분 동안 반응을 배양하십시오.그런 다음 새로 계회된 플라스미드를 안정된 3개의 박테리아로 변환하고 플라스미드 제제 방법을 사용하여 박테리아를 증폭시킨다. 6웰 플레이트에서, 잘 당, 씨앗 750, 000 2n3 DMEM에서 10%의 FBS 및 1%펜 스트렙. 각 구조에 대해 잘 사용하고 24 시간 동안 세포를 배양하십시오.다음 날, 10%의 FBS로 중간을 신선한 항생제 자유 DMEM으로 변경합니다. 도금 된 세포의 각 웰에 대한 배지를 변경 한 직후 렌티 바이러스 생산 혼합물의 튜브를 준비한다. 각 반응에 따라 각 반응에 대해 Opti-MEM 배지의 150 마이크로리터로 지질 염기 형 질산 염시약 11 마이크로리터를 희석시.그런 다음 별도의 튜브에서 DNA를 준비합니다. CLOud9 렌티바이러스 벡터 플라스미드의 두 마이크로그램을 다른 렌티바이러스 포장 성분의 2마이크로그램과 결합합니다. Opti-MEM 배지의 150 마이크로리터에 이 혼합물을 희석시.그런 다음 희석 된 지방 계 의 형질 전환 시약에 희석 된 렌티바이러스 플라스미드 혼합물의 동일한 볼륨을 결합하고 실온에서 5 분 동안 혼합물을 배양합니다. 그런 다음 각 셀웰에 준비된 혼합물의 튜브 를 추가하고 인큐베이션을 계속합니다. 48시간 후, 플레이트 우물에서 바이러스 성 생산 매체를 원물으로 옮기고 5분 동안 300g으로 회전합니다.그런 다음 상체를 신선한 튜브로 옮기고 펠릿 이물질을 버린다. 지금, 즉시 대상 세포를 변환하거나 향후 사용을 위해 섭씨 80도에서 동결 바이러스 성 생산 매체를 사용합니다. 관심의 각 바이러스 성 구조의 250 마이크로 리터를 추가로 시작,이 경우, 보완 CLOud9 플라스미드의 구성된다 50 밀리리터 원추형 튜브 80, 000 세포를 포함하는 세포.그런 다음 충분한 폴리브레인을 추가하여 밀리리터당 1~8마이크로그램의 용액을 제공합니다. 그런 다음 항생제없는 매체를 사용하여 각 튜브의 총 부피를 1 밀리리터로 조정합니다. 이제 바이러스 입자와 세포 사이의 접촉을 증가시키기 위해 실온에서 30 분 동안 800g에서 세포를 회전시킵니다.그런 다음 파이펫팅을 통해 상부체에서 셀을 다시 일시 중단합니다. 다음으로, 세포의 현탁액을 배양 판에 적재하고 24시간 동안 배양합니다. 다음 날, 세포를 수집합니다.원심 분리는 실온에서 5 분 동안 300g으로 분리하고 정상 매체에서 다시 중단하십시오. 다음 날, 이중 변환 된 세포를 선택 하는 매체에 puromycin및 hygromycin를 추가 합니다. 항생제의 적당한 농도는 각 세포 모형을 위해 사전에 결정되어야 합니다.이어서, 다운스트림 응용 프로그램을 진행하기 전에 선택 매체에서 세포를 적어도 3일 동안 배양하고 세포 및 선택 매체를 계속 유지한다. 선택된 CLOud9를 분화하기 위해 선택된 세포와 변형된 세포는 배양 접시에 1밀리몰라 ABA를 추가합니다. 컨트롤의 경우 DMSO를 추가한 다음 실험 기간 동안 ABA 또는 DMSO로 셀을 유지관리합니다.이산화를 되돌리려면, 플레이트 표면을 두 번 덮을 충분한 PBS로 세포를 씻으부리라. 그 후, ABA가 없는 배지의 배양 세포는 이를 비이질되지 않은 상태로 유지한다. CLOud9 시스템의 적절한 사용은 세포 배양 매체에 ABA의 첨가 또는 제거를 통해 보완적인 CSA 및 CSP CLOud9 구조의 가역적 접촉을 유도한다.CSA 및 CSP 구조는 표준 CRISPR 가이드 RNAse를 사용하여 적절한 게놈 영역으로 국한됩니다. 각 CLOud9 성분의 표적화에서 정확한 국소화를 보장하기 위해 정량적 PCR이 그 뒤를 이은 크로마티닌 면역 침전을 활용했다. 또한 ABA와 결합하여 리간드의 존재와 리간드가 없는 경우의 가역성을 검증했다.ABA 이산화 후, 베타 글로빈과 LCR 사이의 더 큰 접촉은 염색체 확인 캡처에 의해 측정되었다. 그러나 CSA 또는 CSP 구조만 포함하는 컨트롤에서는 이 관찰되지 않았습니다. LCR 베타 글로빈 상호 작용을 만드는 것은 내인성 LCR 글로빈 접촉을 완전히 제거하지 못했습니다.원래 연락처에만 추가되었습니다. 베타 글로빈 LCR 접촉에서 증가는 표적 LCR 또는 베타 글로빈 프로모터 영역 내의 정확한 영역에 관계없이 72시간의 이산화를 통해 관찰되었다. 마지막으로, 시스템의 가역성은 ABA를 제거한 후 염색체 확인 캡처로 확인되었다.이로 인해 내인성 확인이 완전히 갱신되었습니다. 이 절차를 시도하는 동안 미디어를 변경하고 매일 신선한 이산화 된 CLOud9 변환 된 세포를 추가하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 렌티바이러스로 일하는 것은 매우 위험할 수 있으며 BSL 2에서 사용되는 모든 예방 조치는 이 절차를 수행할 때 항상 취해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

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타겟 DNA epigenome 나타냅니다 편집 강력한 치료 접근. 이 프로토콜에 설명 합니다 생산, 정화, 그리고 모든-에-하나의 lentiviral 벡터 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC)에서 epigenome 편집 응용 프로그램에 대 한 CRISPR-dCas9-DNMT3A transgene 은닉의 농도-신경 파생.

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게놈은 핵 공간에서 염색체 형성 포획 기술을 통해 드러나게 할 수 있는 다른 구조물로 조직됩니다. 핵 내 Hi-C 방법은 드로소필라 세포주에서 크로마티닌 상호작용의 게놈 전체 컬렉션을 제공하며, 이는 제한 단편 수준에서 메가베이스 해상도로 탐색할 수 있는 접촉 맵을 생성합니다.

드로소필라 세포의 인핵 하이-C

고처리량 단일 분자 이미징 기술인 DNA 커튼은 다양한 단백질-DNA 상호 작용의 실시간 시각화를 위한 플랫폼을 제공합니다. 본 프로토콜은 DNA 커튼 기술을 활용하여 Schizosaccharomyces pombe bromodomain-containing AAA+ ATPase인 Abo1의 생물학적 역할과 분자 메커니즘을 조사합니다.

DNA 커튼 기법에 의한 히스톤 조립의 분자 메커니즘 해독

이 프로토콜은 플라스미드 DNA 형질주입 및 mRNA 핵 박션을 사용하여 인간 세포주에서 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 기반 후성유전체 편집 방법을 설명합니다.

Plasmid DNA Transfection 및 mRNA Nucleofection Delivery를 사용한 인간 세포의 CRISPR 에피게놈 편집

Chromatin 바인딩 단백질의 순차적 소금 추출 큰 단백질 복합물의 바인딩 속성을 결정 하기 위한 유용한 도구입니다. 개별 하위 단위 또는 단백질 복잡 한 대량 chromatin의 전반적인 선호도에 도메인의 역할을 평가 하기 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다.

바인딩 속성 수정 복합물 Chromatin의 대량 Chromatin의 분석에 대 한 순차적 소금 기사

DNA- 단백질 상호 작용은 여러 생물학적 과정에 필수적입니다. 세포 기능을 평가하는 동안 DNA- 단백질 상호 작용의 분석은 유전자 조절을 이해하는 데 없어서는 안될 필수 요소입니다. Chromatin immunoprecipitation (ChIP)은 생체 내에서 그러한 상호 작용을 분석하는 강력한 도구 입니다.

Chromatin Immunoprecipitation을 이용한 c-KIT 리간드 프로모터 분석

이 작품은 성숙 마우스 T 세포 라인을 사용하여 염색질 immunoprecipitation (ChIP)에 대한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 특정 프로모터 사이트 또는 게놈 전체에서 특정 히스톤 마크의 분포를 조사하는 데 적합합니다.

마우스 T- 세포주에서 Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

학습하세요 CRISPR-dCas9 기반 CLOuD9 시스템을 활용한 염색질 루프 재구성 기법으로 유전자 발현을 선택적이고 가역적으로 조절하는 방법입니다. 이 기술은 염색질 구조와 전사 역학의 관계를 규명하는 데 활용됩니다.

CRISPR 중재 Chromatin 루프 구조 개편

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