CRISPR 중재 Chromatin 루프 구조 개편

이 방법은 염색질 구조가 유전자 발현에 어떻게 영향을 미치는지 그리고 크로마틴 조직이 전사 역학을 통제하는 방법을 정확하게 보여주는 유전자 발현과 관련된 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있었습니다. 우리는 장거리 크로마틴 루핑을 생성할 수 있도록 염색체 아키텍처를 제어할 수 있기를 원했기 때문에 이 기술을 개발했습니다. 동시에 내인성 염색체 구조를 복원하기 위해 크로마틴 컨텍스트를 반전시키는 능력이 있습니다.

이 방법은 사용편의성과 폭넓은 적용성을 위해 설계되었습니다. 우리는 시스템을 보다 광범위하게 사용할 수 있도록 하기 위해 비독성 이질제와 dcas9의 직교 종을 이용했습니다. 우리는 유전자 발현이 염색체 건축을 낳는지 또는 염색체 구조가 유전자 발현의 변경으로 이끌어 내는지의 오랜 닭과 계란 질문에 대답할 수 있기를 원했기 때문에 이 방법을 개발했습니다.

CRISPR-guide RNA 서열의 설계 및 세포 배양의 유지 보수는 텍스트 프로토콜에 설명된다. 플라스미드 맵과 활용된 프라이머가 거기에 나열되어 있습니다. 렌티바이러스 CRISPR 플라스미드 5마이크로그램과 BsmB1 3마이크로리터의 알칼리성 포스파타제 10x 소화 버퍼 6마이크로리터, DTT의 100밀리미터 100밀리리터를 혼합하여 플라스미드 제제를 시작합니다.

총 부피 60 마이크로리터의 이중 증류수를 가져와 서 30분간 37°C의 혼합물을 배양하여 플라스미드를 소화하고 인계합니다. 그런 다음, 젤은 루프 플라스미드와 이중 증류수에서 소화된 플라스미드를 정화합니다. 다음으로, 가이드 RNA 쌍에 대한 안과 반응을 준비한다.

각 가이드 RNA의 마이크로리터 1개를 10배 T4 리딩 버퍼 6.5 마이크로리터의 이중 증류수 6.5 마이크로리터와 T4 PNK의 0.5 마이크로리터를 결합하여 총 반응량 10마이크로리터를 지원합니다. 가이드 RNA쌍은 표적 서열에 37°C에서 혼합물을 배양한 다음 5분 동안 섭씨 95도에서 배양한 다음 분당 섭씨 5도까지 점차 온도를 25도로 낮춘다. 다음으로, 이중 증류수에 1~200개의 양안가이드 RNA를 희석시켰다.

이제 두 가지 결찰 반응을 준비합니다. 소화된 플라스미드의 마이크로리터 1개를 희석된 perivaneal 가이드 RNAse 2.5 마이크로리터와 혼합하여 이중 증류수 1마이크로리터와 리그아제 0.5 마이크로리터를 버퍼링합니다. BsmB1 소화 플라스미드 가이드를 리게이트하기 위해 실온에서 10 분 동안 반응을 배양하십시오.

그런 다음 새로 계회된 플라스미드를 안정된 3개의 박테리아로 변환하고 플라스미드 제제 방법을 사용하여 박테리아를 증폭시킨다. 6웰 플레이트에서, 잘 당, 씨앗 750, 000 2n3 DMEM에서 10%의 FBS 및 1%펜 스트렙. 각 구조에 대해 잘 사용하고 24 시간 동안 세포를 배양하십시오.

다음 날, 10%의 FBS로 중간을 신선한 항생제 자유 DMEM으로 변경합니다. 도금 된 세포의 각 웰에 대한 배지를 변경 한 직후 렌티 바이러스 생산 혼합물의 튜브를 준비한다. 각 반응에 따라 각 반응에 대해 Opti-MEM 배지의 150 마이크로리터로 지질 염기 형 질산 염시약 11 마이크로리터를 희석시.

그런 다음 별도의 튜브에서 DNA를 준비합니다. CLOud9 렌티바이러스 벡터 플라스미드의 두 마이크로그램을 다른 렌티바이러스 포장 성분의 2마이크로그램과 결합합니다. Opti-MEM 배지의 150 마이크로리터에 이 혼합물을 희석시.

그런 다음 희석 된 지방 계 의 형질 전환 시약에 희석 된 렌티바이러스 플라스미드 혼합물의 동일한 볼륨을 결합하고 실온에서 5 분 동안 혼합물을 배양합니다. 그런 다음 각 셀웰에 준비된 혼합물의 튜브 를 추가하고 인큐베이션을 계속합니다. 48시간 후, 플레이트 우물에서 바이러스 성 생산 매체를 원물으로 옮기고 5분 동안 300g으로 회전합니다.

그런 다음 상체를 신선한 튜브로 옮기고 펠릿 이물질을 버린다. 지금, 즉시 대상 세포를 변환하거나 향후 사용을 위해 섭씨 80도에서 동결 바이러스 성 생산 매체를 사용합니다. 관심의 각 바이러스 성 구조의 250 마이크로 리터를 추가로 시작,이 경우, 보완 CLOud9 플라스미드의 구성된다 50 밀리리터 원추형 튜브 80, 000 세포를 포함하는 세포.

그런 다음 충분한 폴리브레인을 추가하여 밀리리터당 1~8마이크로그램의 용액을 제공합니다. 그런 다음 항생제없는 매체를 사용하여 각 튜브의 총 부피를 1 밀리리터로 조정합니다. 이제 바이러스 입자와 세포 사이의 접촉을 증가시키기 위해 실온에서 30 분 동안 800g에서 세포를 회전시킵니다.

그런 다음 파이펫팅을 통해 상부체에서 셀을 다시 일시 중단합니다. 다음으로, 세포의 현탁액을 배양 판에 적재하고 24시간 동안 배양합니다. 다음 날, 세포를 수집합니다.

원심 분리는 실온에서 5 분 동안 300g으로 분리하고 정상 매체에서 다시 중단하십시오. 다음 날, 이중 변환 된 세포를 선택 하는 매체에 puromycin및 hygromycin를 추가 합니다. 항생제의 적당한 농도는 각 세포 모형을 위해 사전에 결정되어야 합니다.

이어서, 다운스트림 응용 프로그램을 진행하기 전에 선택 매체에서 세포를 적어도 3일 동안 배양하고 세포 및 선택 매체를 계속 유지한다. 선택된 CLOud9를 분화하기 위해 선택된 세포와 변형된 세포는 배양 접시에 1밀리몰라 ABA를 추가합니다. 컨트롤의 경우 DMSO를 추가한 다음 실험 기간 동안 ABA 또는 DMSO로 셀을 유지관리합니다.

이산화를 되돌리려면, 플레이트 표면을 두 번 덮을 충분한 PBS로 세포를 씻으부리라. 그 후, ABA가 없는 배지의 배양 세포는 이를 비이질되지 않은 상태로 유지한다. CLOud9 시스템의 적절한 사용은 세포 배양 매체에 ABA의 첨가 또는 제거를 통해 보완적인 CSA 및 CSP CLOud9 구조의 가역적 접촉을 유도한다.

CSA 및 CSP 구조는 표준 CRISPR 가이드 RNAse를 사용하여 적절한 게놈 영역으로 국한됩니다. 각 CLOud9 성분의 표적화에서 정확한 국소화를 보장하기 위해 정량적 PCR이 그 뒤를 이은 크로마티닌 면역 침전을 활용했다. 또한 ABA와 결합하여 리간드의 존재와 리간드가 없는 경우의 가역성을 검증했다.

ABA 이산화 후, 베타 글로빈과 LCR 사이의 더 큰 접촉은 염색체 확인 캡처에 의해 측정되었다. 그러나 CSA 또는 CSP 구조만 포함하는 컨트롤에서는 이 관찰되지 않았습니다. LCR 베타 글로빈 상호 작용을 만드는 것은 내인성 LCR 글로빈 접촉을 완전히 제거하지 못했습니다.

원래 연락처에만 추가되었습니다. 베타 글로빈 LCR 접촉에서 증가는 표적 LCR 또는 베타 글로빈 프로모터 영역 내의 정확한 영역에 관계없이 72시간의 이산화를 통해 관찰되었다. 마지막으로, 시스템의 가역성은 ABA를 제거한 후 염색체 확인 캡처로 확인되었다.

이로 인해 내인성 확인이 완전히 갱신되었습니다. 이 절차를 시도하는 동안 미디어를 변경하고 매일 신선한 이산화 된 CLOud9 변환 된 세포를 추가하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 렌티바이러스로 일하는 것은 매우 위험할 수 있으며 BSL 2에서 사용되는 모든 예방 조치는 이 절차를 수행할 때 항상 취해야 합니다.