Name: 깊은 피부 주입으로는 모델 조직학 분석 Candida albicans 피부 감염의 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: 학습하세요 Candida albicans 피부 감염에서 면역 세포 활성화와 조직학 분석 방법을. 이 기술은 피부 구조를 보존하며 면역 세포 위치를 정확히 파악하여 감염 면역 반응을 연구하는 데 필수적입니다.

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FG 라 검색 술 Cancro (IG 2016Id.18842) 당 예술 슈퍼컵, Cariplo 재단 (그랜트 2014-0655), 그리고 피코 가정과 라 검색 Biomedica (FRRB) 당에 의해 지원 됩니다. 어제는 NIH 그랜트 1R01AI121066-01A1, 1R01DK115217, HDDC P30 DK034854 그랜트, 하버드 의료 학교 밀 튼 발견 CCFA 수석 연구 상 (412708), 엘 레 노어, 마일 해안 지원 50 주년 친목 프로그램, 및 Cariplo 재단 ( 2014-0859).

모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에서 승인 되었고 어린이 동물 자원의 부의 감독 아래 운영 병원 (아치) 보스턴 아동 병원에서 또는 이탈리아에 의해 승인 되었다 보건 기관 동물 관리 위원회 밀라노-Bicocca의 대학에서 수행 하는 고.
1. C. albicans 준비
<ol><li>문화 C. albicans, 스트레인 CAF3-113, 25 ° c.에 uridine (50 mg/L) 보충 풍부한 매체 (효 모 추출 물 펩 포도 당 (YEPD), 1% (w/v) 효 모 추출 물, Bacto 펩, 포도 당 2% (w/v)의 2% (w/v))를 포함 하는 튜브에 이러한 조건에서 C. albicans 는 효 모로 자 랍니다. 참고: 다른 C. albicans 변종 사용할 수 있습니다, 같은 임상 분리 C. albicans 스트레인 SC531413. 이후 우리는 최근 궤 양성 과정은 타고 난 면역 계통14, 이론적으로 세포 벽 구성 요소와 구조를 유지 하는 모든 C. albicans 스트레인의 활성화에 의해 유도 된 증명 하고있다 뿐만 아니라 hyphal 계획을 시작 하는 기능을 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>셀 카운터 분석기를 사용 하 여 세포 농도 계산 하 여 문화를 모니터링 합니다.</li>
	<li>약 8 x 106 셀/mL의 농도 도달 하면 문화를 수확. 또는, OD600을 측정 하는 분 광 광도 계를 사용 합니다. 참고: 일반적으로, OD600 의 값 = 1 ml/3 x 107 세포, 효 모 농도에 해당 하지만 적정 권장.</li>
	<li>HEPES (50 m m, pH 7.5)를 사용 하 여 버퍼 에이전트로 YEPD uridine 매체에 문화를 resuspend 하 고 균의 형성을 유발 하는 37 ° C에서 문화를 품 어. 100 배 확대에 현미경 hyphal 형성을 확인 하십시오. 37 ° C에서 배양 후 hyphal 형성은 보이는 5 h 그러나, 사용 하 여 셀을 16 h 37 ° C에 외피 후 hyphal 비율 총 문화의 거의 95%에 도달 하면.</li>
	<li>더 풍요롭게 hyphal 농도에서 준비, 5 분을 위한 3300 x g에서 문화 원심 분리기 aliquots 삭제는 상쾌한 고을 1 x 108 균/mL의 농도에서 살 균 PBS에 펠 릿을 resuspend.</li>
</ol>2. 깊은 피부 주입
<ol><li>24 시간 사전 감염 절차 케 타 민 (80-100 mg/kg) 및 xylazine (10 mg/kg)의 복 주사와 쥐를 anesthetize 하 고 전기 클리퍼를 사용 하 여 마우스의 측면을 면도. 참고: 후 마 취를 포함 하는 모든 프로시저를 놓습니다 난방 램프 아래 쥐 그들은 효율적으로 복구 될 때까지.</li>
	<li>24 h 쉐이 빙 과정 어떤 염증 방지를 위한 마우스를 놓습니다.</li>
	<li>면도 수술 후 24 h anesthetize 케 타 민 (80-100 mg/kg) 및 xylazine (10 mg/kg)의 복 주사와 쥐.</li>
	<li>쥐 취 깊이 되도록 발 반사를 확인 하십시오. 단단히 발을 곤란 하 게 하 여 발 반사를 평가 합니다. 마 취를 달성 하는 경우 동물 통증을 느끼지 않습니다 하 고 이동 하지 않습니다.</li>
	<li>C. albicans 균 50 µ L/주입, 해당 5 x 106 균/주입 하의 마지막 볼륨에 30 G x 8 m m 바늘으로 0.3 mL 인슐린 주사기를 사용 하 여 깊은 더 마에 주사.<ol>
<li>면도 측면의 피부를 당겨 긴장 된 손가락 두 개를 사용 하 여 깊은 더 마에서 직접 볼륨을 주입 합니다. 향하도록 하는 바늘의 경사와 10-15 °의 각도와 바늘을 삽입 합니다.</li>
		<li>이 각도와 약 300-500 µ m의 깊이와 병원 체를 주입 됩니다. 주사는 잘 수행 되도록 확인 주입 된 볼륨은 범프 형성 흡수 몇 분 주사 후. 참고: 범프 형성 후 주사 약 1 c m2의 있을 것입니다. 이것은 분자 또는 조직학 분석을 위해 지정 된 시간 지점에서 제거 될 것 이다 지역입니다.</li>
		<li>범프는 사출 형성 후 흡수, 몇 분 동안 지속 되 고 있기 때문에, 시간 점이 24 시간 보다는 더 적은 (권장)의 마커 펜으로 감염의 영역을 표시 합니다. 24 시간 이상의 시간 포인트, 위 궤 양 또는 낭종은 명확 하 게 볼 수 있기 때문에이 단계, 필요 하지 않습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 샘플 수집 및 조직학 얼룩을 위한 준비
<ol><li>제도적 절차에 따라 마우스를 안락사</li>
	<li>수술 용 집게를 사용 하 여 이전 마커 펜으로 표시 된 삽입 된 사이트의 테두리에서 피부를 당겨. 수술가 위를 사용 하 여 표시 된 라인을 따라 피부를 절단 하 여 감염 된 사이트를 삭제할. 참고: 라운드 팁이 위를 사용 하 여 복 막에서 피부를 분리 하는 주의 해야 합니다.</li>
	<li>일회용 기본 몰드 향하도록 피부의 내부 측면으로 최적의 절삭 온도 (10 월) 화합물, 가득한 피부에 젖어. 화합물 흰색 될 때까지 액체 질소에 샘플을 동결. 이 샘플을 손상 것으로 완전히 고정 하기 전에 샘플을 커버 하는 액체 질소 하 게 하지 마십시오 . 참고: 주의! 3.3 단계 동안 액체 질소에서 보호를 위해 얼굴 방패를 착용.</li>
	<li>샘플 슬라이드 준비를 위해 즉시 사용 하지 않는 경우 빠르게-80 ° c.에 저장 참고: 샘플을 저장할 수 있습니다-80 ° C에 무기한.</li>
</ol>4입니다. 슬라이드의 준비
<ol><li>샘플 샘플의 센터에서 출발 하는 조직학에 대 한 슬라이스를 준비 하는 반으로 잘라.</li>
	<li>잘라 5 µ m는 cryostat와 두꺼운 조각. 참고: 피부 샘플는 cryostat의 온도 하지 보다 클 수-25 ° c. 더 높은 온도 H-10 월의 부분적인 녹는 원인과 따라서 샘플 것 유지 되지 않을 올바른 위치에 절단 절차 동안.</li>
	<li>충전 된 현미경 슬라이드를 사용 하 여 슬라이스를 수집.</li>
	<li>준비 후 곧 수집 된 분할 영역을 사용 하지 않는 경우-20 ° c.에서 그들을 저장합니다 이 시점에서, 조각은 저장할 수 있습니다-20 ° C에서 무기한.</li>
</ol>5. 되며 & 오신 얼룩
<ol><li>5 분 동안 수돗물을 실행에 슬라이드 4 분 세척에 대 한 길의 hematoxylin에 침수에 의해 슬라이드를 얼룩.</li>
	<li>1 분에 오신 Y 솔루션에 집중 하 여 슬라이드 실행 5 분 린스에 대 한 수돗물 사용 하 여 슬라이드에 슬라이드 세척 얼룩 프로토콜을 계속 하기 전에 증류수.</li>
	<li>순차적으로 에탄올 솔루션 (50%, 70%, 80%, 95%, 100%)의 농도 증가에 침수에 의해 탈수. 15에 대 한 슬라이드를 담가 각 에탄올 솔루션에서 s.</li>
	<li>조직학 개간 에이전트에 침수에 의해 적어도 2 분 동안 슬라이드를 선택을 취소 합니다.</li>
	<li>장착 매체와 커버 전표를 사용 하 여 슬라이드를 탑재 합니다.</li>
	<li>40 X 확대 현미경 슬라이드 스캐너와 슬라이드의 이미지를 취득 합니다.</li>
</ol>6. 정기 산 Schiff (PA) 얼룩
<ol><li>1 분 동안 수돗물을 실행에 슬라이드 1 분 세척에 대 한 실 온에서 ≥99.5% 아세톤과 슬라이드를 수정 합니다.</li>
	<li>얼룩 슬라이드 주기 산 솔루션 (1 g/dL)에 침수에 의해 5 분 세척에 대 한 증류수 3 변경에서 슬라이드.</li>
	<li>5 분 동안 수돗물을 실행에 슬라이드에 Schiff의 시 약 15 분 세척에 대 한 침수로 슬라이드를 얼룩.</li>
	<li>5 분 씻어 30 수돗물 실행에 슬라이드에 슬라이드 길의 hematoxylin에 침수에 의해 얼룩 s.</li>
	<li>100% 에탄올의 3 변화에 집중 하 여 슬라이드를 탈수. 15에 대 한 슬라이드를 담가 s 각 시간.</li>
	<li>조직학 개간 에이전트에 침수에 의해 적어도 2 분 동안 슬라이드를 선택을 취소 합니다.</li>
	<li>장착 매체와 커버 전표를 사용 하 여 슬라이드를 탑재 합니다.</li>
	<li>현미경 슬라이드 스캐너와 슬라이드의 이미지를 취득 합니다.</li>
</ol>7. 샘플 수집 및 RNA 추출에 대 한 준비
<ol><li>제도적 절차에 따라 마우스를 안락사 3.2 단계에서 피부 샘플을 제거 합니다.</li>
	<li>산 guanidinium 안산 클로 페 놀 프롬-추출 시 약의 1 mL 2 mL 스냅 캡 튜브에 샘플을 담가. 참고: 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다 여기 하 고 샘플-80 ° c.에 저장 될 수 있다</li>
	<li>약 0.2 c m2 외과 집게를 사용 하 여 조각으로 샘플을 잘라. 참고: 주의! RNA 분리 시 약의 대부분은 독성 및 돌연변이. 증기 두건에서 수행 되어야 7.3 및 7.4 단계 해야 합니다 .</li>
	<li>또는 20 분에 대 한 20 진동/s의 속도로 비드 밀와 함께 샘플을 부 술, 기계적 포터를 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>샘플의 효과적인 균질 피부 그대로의 존재를 찾아 확인 합니다. 샘플은 완전 하 게 균질 하지 경우이 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>원심에서 16000 x g 1 분 유지에 대 한 샘플 RNA 추출 supernatants 고 펠 릿을 삭제. 이 단계는 머리와 추출 열을 차단할 수 있는 파편을 제거 하기 위해 수행 됩니다.</li>
	<li>RNA 추출 RNA 정화 열14를 사용 하 여 계속 합니다.</li>
	<li>분 광 광도 계를 사용 하 여 RNA 정화 및 농도 평가. RNA 추출 cDNA 준비를 위해 즉시 사용 하지 않는 경우-80 ° c.에 샘플 저장</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

여기 우리는 C. albicans 감염 깊은 더 마에 곰 팡이 입구를 따라 시작 된 염증 과정을 공부 하는 방법을 설명 합니다.
피부 농 양 형성 C. albicans 감염15시 상대적으로 드문 경우 이지만, 직접 깊은 더 마에에서 곰 팡이의 주입 수 선 구동 농 양 형성의 연구 뿐만 아니라 특정 면역의 분석 곰 팡이 확산을 포함에 참여 하는 셀입니다. 여기에 설명 된 방법으로 그것은 기계적 손상이 나 상처에 어떤 선 동적인 응답을 피하 면 서 곰 팡이 확산을 제어 하는 중요 한 면역 세포의 채용 뿐 아니라 면역 세포, 사이 상호 작용을 공부 하 형성입니다. 실제로, 상피 구조를 그대로 유지 가능성은 마모와 같은 기계적 자극에 의해 발생 하는 염증 성 환경 개발을 피하기 위해 중요 하다. 199416폴 리 Matzinger에 의해 처음으로 이론로 손상 신호 수 있...

인체는 미생물의 매우 높은 숫자를으로 덮여 있다. 피부 표면1평방 센티미터 당 거의 1 백만 박테리아의 서식 지입니다. 그러나,이 숫자 colonizes 피부 미생물의 전체 다양성을 반영 하지 않습니다. 박테리아, 뿐만 아니라 인간의 신체는 모두는 점 막과 피부 레벨2에서 살아남을 수 한 C. albicans를 포함 하 여 많은 곰 팡이 종에 의해 식민지 이다.
최근 몇 년 동안, 균 감염으로 진단 하는 사람의 비율이 엄청나게 증가 했다. 이것은 주로 immunocompromised 명, 즉, HIV 양성 환자와 환자 화학 요법 또는 면역 억제 약을 통해 이식3후 간 높은 수 있습니다. 미국에서 수행 하는 감시 연구, Wisplinghoff 그 외 여러분 병원내 혈 류 감염의 9.5 %Candida 종4에 의해 발생 했다 보여주었다. 증가 발생 곰 팡이 감염, 그리고 특히 칸디 다 종의 혈 류 감염 시 발견의 높은 비율 때문에, 때문에 매우은이 병원 체는 면역 시스템의 제어를 탈출 하는 어떻게 이해 중요 한.
C. albicans 동종이 형 균 류 효 모, blastospores, pseudohyphae,5환경 조건 따라 균 등 다른 형태학 형태로 성장 하는. Hyphal 형태의 C. albicans 높은 침해 용량을 보여줍니다 하 고 상피6을 관통 하는 기능이 있다.
C. albicans 감염 여러 가지 실험 방법을 사용 하 여 연구 되었습니다. 감염의 가장 일반적인 모델은 C. albicans 효 모7의 정 맥 주입. 그러나,이 모델 받지 않는다 고려 사항으로 모든 프로세스는 일이 혈 류로 확산 하는 곰 팡이 관리 하기 전에. 또 다른 모델은 상피를 침입 하는 C. albicans 의 기능을 활용 합니다. 이 방법, 일컬어 모래 종이 모델8, Gaspari 외. 19989에 의해 개발 되었다 그리고 C. albicans를 적용 하기 전에 따라서 지층 corneum 를 제거 피부를 침식을 모래 종이 사용 하 여 구성 됩니다. 이 절차에 따라서이 병원 체의 침입 능력의 분석을 사용 하는 상피 세포를 침투 하는 곰 팡이 수 있습니다. 마지막으로, 위장10 및 호흡기 책자11 를 위한 감염의 다른 모델 다른 연구에 사용 되었습니다.
(모래 종이 모델)로 상처의 형성 등 면역 세포 모집 활성화,12치유 과정 촉진 하기 위하여 여러 경로의 활성화를 하면 됩니다. 이 중 하나 변경 하거나 결과 혼동 하는 병원 체에 대해 특별히 elicited 면역 응답 마스크 수 있습니다.
여기 피부 감염을 초기 상처 형성을 방지 하는 방법 및 기저 선 동적인 환경 유도 설명 합니다. 그대로 상피 구조를 유지 하려면 우리는 직접 깊은 derma에 hyphal 형태로 C. albicans 주사. 염증의 금액 제한 및 제한 단일 주입 가벼운 염증 유도 수 있습니다, 비록 모래 종이 모델에서 열린 상처의 형성에 비해. 우리가 여기에 설명 하는 방법 곰 팡이 감염을 피하 면 서 기계적 손상으로 인 한 과도 하 고 기존의 염증 성 환경 확산 면역 반응의 연구를 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Euroclone</td><td>ECB4053L</td><td>37°C에서 따뜻합니다. C bath 사용 전</td></tr><tr><td>H-OCT 화합물</td><td>히스토 라인 실험실</td><td>R0030</td><td></td></tr><tr><td>Gill's Hematoxilyn</td><td>histo-line laboratories</td><td>09-178-2</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y solution, alcoholic</td><td>histo-line laboratories</td><td>09-209-05</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 앱솔루트</td><td>scharlau</td><td>ET00232500</td><td></td></tr><tr><td>Citro-HISTOCLEAR</td><td>histo-line 실험실</td><td>R0050</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt, 장착 매체</td><td>바이오 옵티카</td><td></td><td></td></tr><tr><td>아세톤</td><td>시그마 알드리치</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>PAS 염색 시스템</td><td>시그마 알드리치</td><td>395B-1KT</td><td></td></tr><tr><td>박토 펩톤</td><td>BD</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>박토 효모 추출물</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>D (+) - 분자 생물학</td> <td>용 포도당 무수Applichem PanReac</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>우리딘</td><td>Merck Millipore</td><td>8451</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Applichem PanReac</td><td>A1070,0500</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock 튜브 2 mL</td><td>eppendorf</td><td>30121597</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol 시약</td><td>Life Technologies</td><td>15596018</td><td>독성, 부식성 및 돌연변이 유발 물질. 필요한 모든 예방 조치를 사용하십시오</td></tr><tr><td>Rneasy Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>액체 질소</td><td></td><td></td><td>보안경을 착용</td></tr>하십시오<tr><td>Instrument</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coulter 카운터 입자 수</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5415 R</td><td>eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MC 3000 Microtome Cryostat</td><td>histo-line laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TissueLiser</td><td>QIAGEN</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>strong>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.3 ml 인슐린 주사기와 30G x 8mm 바늘&nbsp;</td><td>BD</td><td>324826</td><td></td></tr><tr><td>외과 겸자</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>외과 가위</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>기초 형 처분할 수 있는</td><td>histo-line 실험실</td><td>2781</td><td></td></tr><tr><td>양전하를 띤 생물 현미경 활주</td><td>bio-optica</td><td>09-2000</td><td></td></tr><tr><td>덮개는 미끄러집니다 24 x 50 mm</td><td>thermo 과학</td><td>적인 11911998</td><td></td></tr></tbody></table>

깊은 피부 주입으로는 모델 조직학 분석 candida albicans 피부 감염의

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

피부는 신체의 매우 확장 된 기관이 고,이 큰 표면 때문에 미생물을 지속적으로 노출 되. 피부 손상을 쉽게 혈 류로 병원 균의 보급에 차례 차례로 귀 착될 수 있다, 진 피에 감염 될 수 있습니다. 어떻게 면역 체계 싸움 감염 초기 단계와 어떻게 호스트 병원 체를 제거할 수 있습니다 이해 미래 치료 개입에 대 한 설정 하는 중요 한 단계입니다. 우리가 Candida albicans 감염 병원 체 면역 반응 elicited C. albicans에 의해로 서 상피 장벽을 통과 하는 때를 포함 하 여, 감염 동안 일찍 발생 하는 프로세스를 시각화 수 있는 모델을 설명 하는 여기 내 습. 우리는 피부 뿐 아니라 존재 및 병원 체의 지역화에 침투 하는 면역 세포를 표시 하는 조직학 분석을 수행 하기 위해이 감염 모델을 사용. 샘플 수집 후 감염 RNA 추출 처리 될 수 있습니다.

깊은 더 마에서 직접 병원 체의 주사를 통해 조직 구조 형태는 그대로 (그림 1A)를 남아 있습니다.
피부 구조 무결성의 유지 관리는 면역 세포의 탐지 및 감염의 사이트에 그들의 지 방화를 허용 한다. 그림 1B 에서 표시 하는 높은 배율이 보여준다 농 양 감염의 사이트에 그것의 감 금으로 병원 체의 확산을 포함 하는 polymorphonuclear 백혈구 (PMCs)의 주로 구성 되어있다. PMCs, 호 중구, 등 모집 조직14내 곰 팡이의 확산 따라서 피하 농 양 형성을 허용 한다. 높은 배율 (그림 1 c, D) 농 양의 주변 ...

여기는 Candida albicans 피부 주입 후 피부 샘플의 조직학 및 분자 분석을 허용 하는 프로토콜에 설명 합니다. 이 프로토콜 피부의 구조적 무결성을 유지 하 고 병원 체 분포 및 조직 상주 또는 새로 채용 면역 세포의 지역화에 대 한 수 있습니다.

깊은 피부 주입으로는 모델 조직학 분석 Candida albicans 피부 감염의

The skin is an extremely extended organ of the body and, due to this large surface, it is continuously exposed to microorganisms. Skin damage can easily ...

이 절차의 전반적인 목표는 피부 구조를 보존하고 특정 면역 및 비면역 세포의 국소화를 보존하기 위해 칸디다 알비칸스(Candida albicans)를 주입하여 피부 감염 시 면역 체계의 활성화를 관찰하는 것입니다. 이 방법은 피부 감염 중에 모집된 면역 세포의 특성과 국소화 및 관련된 주요 매개체와 같은 면역학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 곰팡이 주입 후 피부의 구조적 구조를 유지하여 각 면역 세포 유형의 국소화를 이해할 수 있다는 것입니다.절차의 일부를 시연하는 것은 Marina Vai 교수 연구실의 박사 과정 학생인 Giulia Stamerra입니다. 먼저 C.Albicanss 균주를 리터당 50mg의 우리딘이 보충된 풍부한 배지가 포함된 튜브에 접종하고 섭씨 25도에서 배양합니다. 이러한 조건에서 C.albicans는 효모로 자랍니다.세포 계수기 분석기 또는 분광 광도계를 사용하여 세포 농도를 측정하여 배양을 모니터링합니다. 배양액이 10의 8배에서 밀리리터당 6번째 세포에 도달하면 샘플을 수확합니다. Hepes가 포함된 YEPD-uridine 배지를 완충제로 사용하여 세포를 다시 현탁시키고 섭씨 37도에서 배양하여 균사 형성을 유도합니다.배양 5시간 후 균사가 보여야 할 때 100X 배율로 현미경으로 균사 형성을 확인합니다. 총 16시간 동안 세포를 배양하면 배양액의 95%가 균사를 형성하게 됩니다. 균사의 농도를 더욱 풍부하게 하기 위해, 배양액의 분취액을 3, 300배 g에서 5분 동안 원심분리합니다.상층액을 버리고 멸균 PBS를 사용하여 펠릿을 10의 1배에서 밀리리터당 8번째 균사로 다시 현탁시킵니다. 텍스트 프로토콜에 따라 면도한 쥐를 마취한 후 발 반사를 확인하여 동물이 깊이 진정되었는지 확인합니다. C.albicans 균사를 진피 깊숙한 곳에 주입하려면 두 손가락을 사용하여 면도한 옆구리의 피부를 팽팽하게 당긴 다음 0.3ml 인슐린 주사기에 부착된 30게이지 8mm 바늘을 바늘의 경사가 위를 향하도록 10-15도 각도로 삽입하고 6번째 균사에 5 곱하기 10에 해당하는 50마이크로리터의 최종 부피를 주입합니다.주사 각도가 15도 이상이면 병원체가 진피에 너무 깊숙이 주입되어 복막이 손상될 위험이 있으며 무엇보다도 피부 수준에서 감염을 구체적으로 연구할 기회를 잃게 됩니다. 이 각도에서 병원체는 약 300-500 미크론의 깊이로 주입됩니다. 주입이 잘 수행되었는지 확인하려면 주입된 부피가 몇 분 후에 흡수되는 범프를 형성하는지 확인하십시오.24시간 미만의 시점에서는 주사로 형성된 돌기가 몇 분 동안 지속되므로 마커 펜을 사용하여 감염 영역을 표시합니다. 24시간 이후의 시점에서는 궤양이나 낭종이 명확하게 보이기 때문에 이 단계가 필요하지 않습니다. 제도적 지침에 따라 생쥐를 안락사시킨 후, 수술용 겸자로 마커 펜으로 표시된 주입 부위의 경계에서 피부를 당긴 다음 수술용 가위를 사용하여 표시된 선을 따라 피부를 절단하여 감염된 부위를 절제합니다.O.C.T.compound로 채워진 일회용 베이스 몰드에 내부가 위를 향하도록 피부를 담그십시오. 혼합물이 하얗게 될 때까지 샘플을 액체 질소에 동결합니다. 액체 질소가 s를 덮지 않도록 하십시오.amp완전히 얼기 전에 s를 손상시킵니다.amp르.슬라이드를 준비하려면 샘플의 중앙에서 시작하여 샘플을 반으로 잘라 조직학을 위해 슬라이스를 준비한 다음 저온 유지 장치를 사용하여 5미크론 두께의 슬라이스를 자릅니다. 양전하를 띤 현미경 슬라이드를 사용하여 슬라이스를 수집합니다. H&E 염색을 수행하려면 슬라이드를 Gill의 헤마톡실린에 4분 동안 담근 다음 흐르는 수돗물에 5분 동안 세척합니다.슬라이드를 eosin-Y 용액에 1분 동안 담그고 흐르는 수돗물에 슬라이드를 5분 동안 씻은 다음 증류수를 사용하여 슬라이드를 헹굽니다. 다음으로, 샘플을 에탄올 시리즈에 각각 15초 동안 담가 탈수합니다. 슬라이드를 투명하게 하려면 최소 2분 동안 조직학적 투명화제에 옮긴 다음 장착 매체와 커버 슬립을 사용하여 샘플을 장착합니다.40X 배율의 현미경 슬라이드 스캐너를 사용하여 슬라이드를 이미지화합니다. 실온 아세톤을 사용하여 1분 동안 슬라이드를 고정한 다음 흐르는 수돗물을 사용하여 1분 동안 슬라이드를 세척하여 Period Acid Solution 또는 PAS 염색을 수행합니다. 슬라이드를 PAS에 5분 동안 담근 다음 증류수를 세 번 갈아타서 샘플을 세척합니다.그런 다음 슬라이드를 Schiff의 시약에 15분 동안 담근 다음 흐르는 수돗물을 사용하여 5분 동안 슬라이드를 세척합니다. 샘플을 Gill의 헤마톡실린에 5분 동안 담가 염색한 다음 흐르는 수돗물에 슬라이드를 30초 동안 세척합니다. 100% 에탄올을 각각 15초 동안 세 번 갈아서 샘플을 탈수한 다음 슬라이드를 조직학적 투명화제에 담그십시오.장착 매체와 커버 슬립을 사용하여 투명화된 샘플을 장착한 다음 현미경 슬라이드 스캐너를 사용하여 샘플을 이미지화합니다. 이 비디오의 앞부분에서 설명한 것처럼 마우스를 안락사시키고 피부 샘플을 제거한 후 산 구아니디늄 티오시아네이트 페놀 클로로포름 추출을 위한 1ml의 시약과 함께 샘플을 2밀리리터 스냅 캡 튜브에 담그십시오. 수술용 겸자를 사용하여 조직을 0.2제곱센티미터 조각으로 자릅니다.비드 밀을 사용하여 20분 동안 초당 20회 진동으로 샘플을 부수십시오. 손상되지 않은 피부 조각이 여전히 존재하는 경우 샘플이 완전히 균질화될 때까지 스매싱을 반복합니다. 16, 1 분 동안 000 번 g에서 샘플을 원심 분리하십시오.RNA 추출을 위해 상등액을 보관하고 펠릿을 버리십시오. 이 단계는 추출 과정을 방해할 수 있는 머리카락과 부스러기를 제거하기 위해 수행됩니다. 정제 컬럼으로 RNA를 추출한 후 분광 광도계를 사용하여 RNA 농도와 순도를 측정합니다.피부의 구조적 무결성을 유지하면 감염 부위에서 면역 세포와 면역 세포의 국소화를 감지할 수 있습니다. 이 높은 배율은 농양이 주로 감염 부위에 국한되어 병원체의 확산을 억제하는 PMC로 구성되어 있음을 나타냅니다. 농양의 주변 지역도 PMC가 풍부합니다.이 그림에서 곰팡이에 자주색-자홍색을 부여하는 PAS 염색은 병원체가 과립구 동원에 의해 형성된 농양 내부에 갇혀 있음을 분명히 보여줍니다. C.albicans는 더 높은 배율에서 명확하게 볼 수 있으며 괴사 및 면역 세포로 둘러싸인 것으로 보입니다. 감염 과정이 시작될 때 면역 세포 동원은 농양의 형성으로 이어집니다.감염 후 48시간에서 72시간 후, 병원체 배출 후 치유 단계로 인해 피부 구조의 파괴와 흉터의 형성이 시각화되었습니다. 여기에서 볼 수 있듯이 야생형 마우스는 시간이 지남에 따라 증가하는 궤양 과정을 보입니다. 특정 치료 또는 유전적 결핍에 따라 궤양의 형성이 감소하거나 제거될 수 있습니다.어떤 경우에는 궤양 대신 여기에서 볼 수 있듯이 낭종이 형성됩니다. 이 감염 절차에 따라 특정 세포 내 경로의 활성화와 같은 추가 질문에 답하기 위해 단백질 추출과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 상피의 구조를 방해하지 않고 미생물 감염 시 면역 체계의 관여를 연구하기 위해 피부에 C.Albicans를 주사하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.RNA 추출을 위한 시약으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 흄 후드 사용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 피하 조직에서 칸디다 알비칸스의 생물막 형성을 연구하기 위한 생체 내 마우스 모델의 개발을 보여줍니다. 이 실험은 생물막 발달을 위해 동물의 등 부위에 칸디다균에 감염된 장치를 이식하는 것을 포함합니다.

칸디다 알비칸스 In Vivo 마우스 모델의 생물막 형성

점막 수준에서의 병원체와 면역 방어의 생체 내 시공간 상호 작용은 기존 척추동물 숙주에서 쉽게 이미지화되지 않습니다. 여기에 제시된 방법은 어린 제브라피쉬의 부레를 감염 부위로 사용하여 살아있는 척추동물의 점막 칸디다증을 연구할 수 있는 다목적 플랫폼을 설명합니다.

Swimbladder 주입에 의해 애벌레 Zebrafish의 점막 칸디다증 모델링

마우스 피하 모델에서 칸디다 알비칸스 생물막 발달의 실험적 절차를 제시합니다. 진균 생물막은 군집 형성 단위의 수를 결정하고 생성되는 빛의 양이 생존 가능한 세포의 수와 일치하는 비침습적 생물 발광 이미징에 의해 정량화되었습니다.

생물 발광 영상에 이어 마우스 피하 모델의 의학 관련 외국 기관에 칸디다 알비 칸스 (Candida albicans)에 바이오 필름 ​​개발

갤러리아 mellonella 전파 칸디 다에 대 한 무척 추 동물 모델 역할을 합니다. 여기, 우리는 감염 세부 프로토콜 및 모델의 효과 대 한 지원 데이터를 제공.

갤러리아 mellonella Waxworm 감염 모델 전파 칸디 다에 대 한

이 프로토콜의 목적은 포유류 위장관에서 칸디다 알비칸스 세포 모양 및 국소화를 시각화하는 것입니다.

시투 혼성화에서 형광을 사용하여 뮤린 위장에서 칸디다 알비칸스의 시각화

이 원고는 비침습적 공초점 현미경을 사용하여 포유류 숙주에서 활성 감염 동안 형태 형성 표현형에 대해 중간 크기의 칸 디다 알비칸스 돌연변이 라이브러리를 스크리닝하는 방법을 설명합니다.

포유류 숙주에서 활성 감염 중 칸디다 알비칸스 돌연변이 균주에서 형태형성 표현형을 스크리닝하기 위한 생체 내 이미징 사용

위험한 병원체에 의한 보철 관절 주위 감염(PJI)은 임상 정형외과에서 흔합니다. 기존의 동물 모델로는 PJI의 실제 상황을 정확하게 시뮬레이션할 수 없습니다. 여기에서 우리는 PJI에 대한 새로운 치료제를 연구하고 개발하기 위해 Candida albicans 생물막 관련 PJI 마우스 모델을 구축했습니다.

마우스의 보철 관절 Candida albicans 감염 모델

우리는 카테터에 생물막이 형성되고 C.albicans와 숙주 간의 상호 작용이 임상 CRI와 잘 상관되는 C.albicans 관련 카테터 관련 감염(CRI)의 마우스 모델을 확립합니다. 이 모델은 C.albicans 생물막 관련 CRI에 대한 치료법을 스크리닝하여 임상 혁신을 위한 토대를 마련하는 데 도움이 됩니다.

마우스의 카테터 관련 칸디다 알비칸스 감염 모델

이 프로토콜은 구강 칸디다증의 쥐 모델에서 항균 광역학 요법(aPDT)의 적용을 설명합니다. aPDT는 커큐미노이드와 청색 LED 조명의 수용성 혼합물을 사용하여 수행되었습니다.

구강 칸디다증의 쥐 모델에 대한 커큐미노이드 매개 항균 광역학 요법

본 프로토콜은 임플란트 관련 감염을 조사하기 위해 피하 등쪽 이식을 사용하는 마우스 모델을 설명하며, 이를 통해 병태생리학적 메커니즘을 포괄적으로 조사할 수 있고 표적 치료 전략으로 진단 기준 개발을 지원할 수 있습니다.

마우스의 임플란트 관련 감염에 대한 동물 모델

학습하세요 Candida albicans 피부 감염에서 면역 세포 활성화와 조직학 분석 방법을. 이 기술은 피부 구조를 보존하며 면역 세포 위치를 정확히 파악하여 감염 면역 반응을 연구하는 데 필수적입니다.

깊은 피부 주입으로는 모델 조직학 분석 Candida albicans 피부 감염의

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