Name: 만성 림프모구 백혈병에서 면역 글로불린 유전자 순서 분석: 시퀀스 해석 환자 자료에서 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: 배우세요 만성 림프모구 백혈병에서 면역 글로불린 유전자 순서 분석 방법을. PCR 증폭과 IMG TV Quest 도구를 활용하여 환자 예후 정확도를 높이고 치료 결정을 지원하는 이 기술을 익히세요.

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우리는 그들의 헌신과 열정 CLL에 immunogenetics 공부에 대 한 우리의 연구 그룹, IgCLL 그룹, 에릭의 현재와 과거 회원을 감사 합니다. 우리 또한 모든 멤버 IMGT/CLL-DB 이니셔티브의 및, 특히, 마리-Paule Lefranc 교수와 박사 베로 Giudicelli, 응용 d'Immunogenetique Moleculaire, LIGM, 대학의 믿을 협업을 인정 하 고 싶습니다. 몽펠리에 II, 몽펠리에, 프랑스, 및 IMGT, 국제 ImMunoGeneTics 정보 시스템, 그들의 거 대 한에 대 한 지원과 도움이 IG 유전자 순서 분석. 이 작품은 TRANSCAN-179 소설 JTC 2016;에서 교부 금에 의해 부분적으로 지원 라 검색 술 Cancro AIRC (탐정 부여 #20246 및 특별 한 프로그램 분자 임상 종양학-5 밀레 #9965 당) 당 예술 슈퍼컵, 밀라노, 이탈리아; Progetti 디 Rilevante 가끔 나 (인화) # 2015ZMRFEA, MIUR, 로마, 이탈리아; 스웨덴 암 협회, 스웨덴 연구 위원회, 크누트와 앨리스 발 렌 버그, 카롤 린스 카 Institutet, 웁살라 대학, 웁살라 대학 병원 재단과 라이온의 암 연구 재단, 웁살라; 오 디 세우 스 프로그램, "작업에 대 한는 전략 개발에는 연구 및 기술 분야", "경쟁력, 기업가 정신 및 혁신" 운영 프로그램에 의해 자금에서 구현 (NSRF 2014-2020) 및 그리스에 의해 공동 자금 그리고 유럽 연합 (유럽 지역 개발 기금)

연구 프로토콜 산 라파엘 레 과학 연구소, 밀라노, 이탈리아의 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.
1. 소재 선택
<ol><li>
시작 물자의 선택 참고: CLL의 대부분의 경우 종양 세포 수는 진단에 높은 (> 80-90%). 따라서, 셀 정렬 또는 농축 leukemic 세포의 일반적으로 필요 하지 않습니다.<ol>
<li>말 초 혈액 (PB)를 사용 하 여, IG 유전자 순서 분석을 위해 선택의 가장 일반적인 재료 사이 10-20 mL 혈액 볼륨을 사용 합니다.</li>
		<li>또는 낮은 CLL 세포 부담으로 경우, 셀 정렬 PB 샘플 또는 골 (BM) 또는 림프 노드 (LN) 같은 다른 조직에서 자료의 사용.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
샘플링 시간
	<ol>
<li>샘플링 시간은 중요 하지 않습니다 IG SHM 상태는 안정적인 초과; 즉, 피하 샘플링 특정 기간에서와 같은 직후 또는 치료 동안 CLL 세포의 낮은 수 분석을 복잡 하 게 하 고 신뢰할 수 없는 결과가 발생할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
자료를 수집 및 저장 참고: 수집 및 저장 시작 물자에 따라 다릅니다 강하게 소재 선택.<ol>
<li>PB 또는 BM 샘플에 대 한 PCR 증폭 과정;의 저해를 방지 하기 위해 EDTA 또는 CPT (시트르산-트리 스-pyridossalphosphate) 컬렉션 튜브 사용 또는 헤 파 린 튜브를 사용 하 여.</li>
		<li>LN 샘플에 대 한 컬렉션 옵션은 어느 셀 정지, 포 르 말린 고정 파라핀 포함 (FFPE) 조직 드문 경우에에서, 또는 신선한 냉동된 조직 생 검.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 밀도 그라데이션 분리
참고: 경우 PB 또는 BM 가장 빈번한 시나리오 선택의 시작 물자 단 세포 격리 밀도 그라데이션 분리를 사용 하 여 것이 좋습니다.
<ol><li>EDTA의 200 µ L 추가 (0.5 M EDTA / pH 8.0) 50 mL 살 균 컬렉션 튜브를. 20 mL의 PB와 RPMI의 15 mL를 추가 합니다. Pipetting으로 믹스 (2-3 시간 충분 하다).</li>
	<li>새로운 50 mL 수집 튜브를 밀도 그라데이션 매체의 15 mL를 추가 합니다. 참고: PB 볼륨 20 mL 미만의 경우, RPMI (이전 단계) 및 밀도 그라데이션 볼륨 해야 수정 따라.</li>
	<li>그라디언트를 방해 하지 않습니다 있도록 천천히 단계 2.1에서에서 솔루션에 레이어. 원심 800 x g에 20 분 동안 원심 브레이크 해제.</li>
	<li>단 셀 링 위 플라즈마/혈소판 레이어 및 살 균 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 밀도 그라데이션 중간 레이어 사이 형성 했다 수집 다음 살 균 15 mL 컬렉션 튜브를 전송.</li>
	<li>RPMI 12 mL의 최종 볼륨을 추가 하 고 섞으십시오. 8 분 동안 750 x g에서 원심. 폐기는 상쾌한.</li>
	<li>Resuspend RPMI의 10 mL를 사용 하 여 셀 펠 릿 고 2.5 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>1 mL의 PBS (DPBS, 아무 칼슘 아니 마그네슘)에 셀 펠 릿을 디졸브. 샘플의 20 µ L 1시 10분의 80 µ L를 혼합 하 여 Neubauer 플레이트를 사용 하 여 셀 수를 수행 터키어의 솔루션.</li>
	<li>샘플의 다운스트림 처리 같은 날에 대 한 예약 되지 않은 경우 8 분 동안 750 x g에서 샘플을 원심. 삭제는 상쾌한 고-80o c.에 셀 펠 릿 저장</li>
</ol>3. 핵 산 추출
<ol><li>SHM 상태의 IG 유전자의 분석에 대 한 기판에 결정 합니다. 반전 녹음 방송 단계;에 대 한 필요가 없습니다으로 게놈 DNA (gDNA) 가장 인기 있는 선택은 또는, RNA/보완 DNA (cDNA) 사용 하면, 적어도 transcriptional 수준에서 생산, 기능성 clonotypic IG 재배치 "선호" 대상.</li>
	<li>CDNA의 합성 및 gDNA 또는 총 RNA 추출에 적합 한 수많은 상용 키트 중 하나를 사용 하 여 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>DNA 또는 RNA를 사용 하 여 중요 한 핵 산의 정량화 시스템의 무결성을 평가 합니다. 예: retinoic 산 성 수용 체 알파 (RARa), 알려진된 하우스키핑 유전자의 PCR 증폭에 의해 추출 된 gDNA/cDNA의 양과 품질 평가 FFPE 자료 분석을 위해 사용 하는 경우 베타-걸, 등.</li>
</ol>4. 증폭 및 IGHV-IGHD-IGHJ 유전자 재배열의 연속
<ol><li>
IGH PCR 뇌관 선택
	<ol>
<li>가급적 이면, IGHV 하위 특정 5' 뇌관 및 IGHJ 유전자 특정 3' 뇌관25,에서26멀티플렉스 PCR을 수행 합니다. 결과 최적의 단일 IGHV 하위 특정 뇌관을 사용 하 여 별도 PCR 믹스를 준비.</li>
		<li>5' 중 하나에 있는 지도자 지역 anneal 뇌관을 사용 하 여 즉시 업스트림 IG 재배치 또는 IGHV 유전자의 코딩 영역 (예: 프레임 워크 1, FR1) 내.<ol>
<li>전체 뜯어 IGHV-IGHD-IGHJ 유전자 순서, 차례 차례로 SHM 레벨의 정확한 추정 하면의 확대를 위한 허용 지도자 뇌관을 사용 합니다. 따라서, IGHV 지도자 뇌관 에릭에 의해 IG 유전자 시퀀스 분석27에 대 한 그들의 업데이트 지침에 권장 됩니다.</li>
			<li>지도자 뇌관 clonotypic IG 재배치를 증폭 하는 실패 하는 경우에 IGHV FR1 뇌관을 사용 합니다. 그러나, 프레임 워크 뇌관 전체 clonotypic IG 유전자 재배열, SHM의 레벨의 부정확 한 결정으로 이어질 수 있는 증폭 하지 않습니다. 이 시나리오, IGHV FR1 뇌관의 사용 수 있습니다 가까운 생식 유전자 진정한 % 정체성과 대 평가 하는 임상 보고서에 명확 하 게 상태에 대 한.</li>
		</ol>
</li>
		<li>3' 끝, IGHJ 유전자, IGHJ 유전자 특정 뇌관 또는 기판에 따라 isotype-특정 뇌관의 다중 세트를 대상으로 하는 합의 뇌관을 사용 합니다. 그림 1 다양 한 뇌관 어 닐 링의 위치를 묘사 하는 반면 뇌관 순서 표 1에 제공 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
IGHV-IGHD-IGHJ 유전자 재배열의 PCR 증폭
	<ol>
<li>사용 하 여 각 하위 그룹 primer(s)의 아데닌 수량 편견된 확대 뇌관 믹스를 준비 합니다.<ol>
<li>예를 들어 지도자 뇌관을 사용 하 여, 2 개의 다른 뇌관 IGHV1 하위 그룹에 속하는 재배열을 증폭에 사용 됩니다. 따라서, IGHV4L, IGHV4 하위 재배열에 대 한 유일한 뇌관은에 비해 절반이 2 뇌관 (IGHV1L 및 IGHV1bL)의 수량을 사용 합니다.</li>
			<li>IGHJ1-2와 IGHJ4-5 뇌관의 경우 반대 접근을 적용 합니다. 이 프라이 머 두 개의 서로 다른 IGHJ 유전자 하위를 대상으로 두 배 수량에 비해 IGHJ3와 IGHJ6 뇌관.</li>
			<li>표 1 를 사용 하 여 관련 뇌관 믹스를 준비할 때 정확한 뇌관 수량을 결정 하.</li>
		</ol>
</li>
		<li>표 2에 나열 된에 약을 믹스 PCR PCR 튜브에 모든 PCR 시 약 결합, 추가 Taq 중 합 효소의 0.5 µ L 100 gDNA 또는 cDNA의 2 µ L의 ng (cDNA은 RNA의 1 µ g으로 준비 되어야 한다). 참고: 교정 활동와 Taq 효소 증폭 에러율 매우 낮은 이며 따라서 미치지 SHM의 수준으로 필수적입니다.</li>
		<li>표 3에 대 한 자세한 열 PCR 프로토콜을 실행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Clonality 평가 참고: 중요 한 다음 단계 PCR 제품의 clonality 패턴 평가 포함 한다. CLL 환자에서 clonality를 평가할 때 가장 일반적인 찾기는 단일, 단일 클로 널 피크/밴드 이다.<ol>
<li>Clonality 평가28,29에 대 한 높은 감도, 조각 또는 heteroduplex 분석 같은 방법을 사용 합니다.</li>
		<li>파편 분석<ol>
<li>멀티플렉스 PCRs 5' 표시 된 IGHV 지도자 또는 FR1 하위 특정 PCR 뇌관;를 사용 하 여 수행 이 모 세관 전기 이동 법으로 분리 될 수 있다 PCR 제품을 얻을 것입니다, 그리고 그로 인하여 허용 IGH PCR의 clonality 평가 제품 기반 지역 결정 그들의 IGHV complementarity 3 (CDR3) 길이.</li>
			<li>사용 하 여 뇌관, 시 약 및 열 조건 동일 그 이전에 언급 한 (참조 표 1-3). 사용자 지정 5´-뇌관 표시 붙일 oligos 5' 끝에 염료의 선택으로 표시 됩니다. 기자 염료의 예로 6-식구 들, 16 진수, NED 또는 TET 있습니다. 따라서, 2 개의 반응 반응 당 3 다른 염료의 사용에 따라 필요한입니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>1을 사용 하 여 (이 비율 귀착되는 최적의 해상도) 6% (6%) polyacrylamide 젤에 PCR 제품의 크기를 평가 실행 버퍼 x TBE. 80에서 실행 V 45 분. 참고: PCR 제품 단일 클로 널 샘플 polyclonal 배경에서 분리 될 수 있다 DNA 크기 마커 적절 하 게 구분할 수 있도록 충분 한 시간 동안 젤에 마이그레이션할 수 있습니다 하는 것이 좋습니다. 크기와 젤의 두께 등의 요인에 영향을 마이그레이션 단일 설정 (전압 및 시간) 말했다, 그것은 너무 마이그레이션 샘플의 위험을 최소화 좋은 출발점은 45 분 동안 80 V 전압을 설정 하는 최적의 결과 보장 수 없습니다. 신속 하 고 '실행'에서 젤.</li>
		<li>IGHV 리더 뇌관을 사용 하는 경우 약 500 기본적인 쌍 및 350 기본 쌍의 PCR 제품을 위한 IGHV FR1 뇌관 믹스를 사용 하 여 확인 합니다. 참고: 드문 경우에, CLL 경우 발견 되었습니다, 단일 클로 널 제품 하 고도 희귀 한 경우, 경우 oligoclonal 패턴을 전시 수 있습니다. Intercalating 에이전트 Ethidium 평범한 사람 (EtBr) 또는 위험 하 고 더 민감한 상용 DNA 얼룩 덜 UV 여기 또는 라이트 블루를 사용 하 여 아크릴 아 미드 젤에 DNA의 시각화에 대 한 사용할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
PCR 제품 정화 참고: PCR 제품 뇌관 뿐만 아니라 CLL 샘플 내의 정상 B 세포에서 발생 하는 이합체 차선 시퀀싱을 이어질 수 있습니다 어떤 polyclonal 배경을 제거 하 정화 됩니다. 비법 인된 dNTPs와 뇌관 PCR 청소 업, 효소 치료를, 예를 들어, Sap (새우 알칼리 성 인산 가수분해 효소) 등을 제거 하는 메서드를 사용 하 여 / 엑 소 (Exonuclease 나), 또는 열 기반 정화.<ol>
<li>3% 낮은 녹는 agarose 젤에 PCR 제품의 전체 볼륨을 로드 합니다.</li>
		<li>PCR 제품 젤에 그들은 배경에서 분리 될 때까지 실행을 허용 합니다.</li>
		<li>날카로운, 저명한 PCR 밴드를 소비 세, 정화 하 고 elute. 두 재배열 검색 되 면 두 밴드 excised 해야 하 고 별도로 시퀀스.</li>
		<li>Sap/엑 소 정리를 수행 하려면 사용할; 특정 볼륨에 대 한 제조업체의 지침에 따라 그러나 전형적인 반응 1 µ L를 포함할 수 있습니다 Sap, 0. 5 µ L 엑 소 및 2 µ L 5 배 부 화 당 5-10 µ L PCR 반응 버퍼. 부드럽게 vortexing에 의해 각 샘플을 혼합 하 고 30 분 동안 37 ° C에서 PCR 블록에 품 어. 15 분 동안 85 ° C에가 열 하 여 효소 비활성화.</li>
		<li>제품의 순도 평가 하기 위해 3 %agarose 젤에 PCR 제품의 소량을 로드 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 생어 시퀀싱
그러나 참고: 여러 시퀀싱 전략 존재,, 정확한 접근, 직접 두 가닥의 시퀀싱에 신뢰할 수 있는 결과 보장 하기 위해 필수입니다.
<ol><li>
일반 시퀀싱 프로토콜
	<ol>
<li>증폭 수행 단일 뇌관을 사용 하 여, 있는 적절 한 IGHV-IGHJ-또는 일정 지역 특정 뇌관을 사용 하 여 연속 진행. 이 이렇게 놓여있는지 다중화 레이블이 뇌관 사용 되 고 PCR 제품 조각 분석 (시퀀싱 뇌관 없습니다 표시 되어야 합니다)를 사용 하 여 평가 했다 경우에 또한 채택 수 있습니다.</li>
		<li>멀티플렉스 뇌관 사용 되 고 clonality 젤에 평가 했다, 사용 다운스트림 뇌관 시퀀싱 예 IGHJ 뇌관 합의의 첫 번째 단계에서 순서 5'-GTGACCAGGGTNCCTTGGCCCCAG-3 되와 함께 '. 또는, 채널 뇌관 cDNA 기판으로 사용 하는 경우 사용할 수 있습니다. 다음, 두 번째 연속 단계에 대 한 하위 그룹 전용 IGHV 지도자 또는 FR1 뇌관을 사용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
예를 들어 연속 프로토콜 참고: 여러 시퀀싱 프로토콜 존재와 예제 프로토콜 아래 상세한.<ol>
<li>33 희석 사용 하 여, 예를 들어, 메 마른 물 11.5 µ L의 전체 볼륨에 PCR 제품의 ng. PCR 제품을 5 분 동안 95 ° C에가 열에 의해 변성. 즉시 보조 구조의 형성을 방지 하기 위해 10 분 동안 얼음에 놓습니다.</li>
		<li>(해당 5 pmol 하) 하는 0.5 µ L 뇌관의 함께 각 튜브를 마스터 믹스의 8 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>컨트롤, 마스터 믹스의 8 µ L, 0.5 µ L pUC18 컨트롤 템플릿, 2 µ L (-) 47 시퀀싱 뇌관 및 9.5 µ L 살 균 물 튜브 준비. 각 관에서 마지막 총 볼륨 20 µ L 이어야 한다.</li>
		<li>연속 반응에 대 한 열 순환 조건을 사용 하 여 표 4에 설명으로.</li>
		<li>나트륨 아세테이트 3 M (pH 5.2), 2 µ L의 2 µ L를 혼합 하 여 중지 솔루션 준비 EDTA 100 m m (pH 8.0) 및 글 리 코겐의 1 µ L (농도 20 mg/mL), 5 µ L 각 샘플에 추가. 새로운 microcentrifuge 튜브에 제품을 전송.</li>
		<li>100% 에탄올 (-20 ° C)의 60 µ L을 추가 하 고 부드럽게 혼합. 15 분 (4 ° C)에 대 한 14000 rpm에서 원심. 폐기는 상쾌한.</li>
		<li>70% 에탄올 (-20 ° C)의 100 µ L을 추가 하 고 부드럽게 혼합. 원심 14000 rpm에서 10 분 (4 ° C). 폐기는 상쾌한. 한 번 반복 합니다.</li>
		<li>실 온에서 90 분 동안 펠 릿을 건조. 40 µ L의 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) 솔루션 각 샘플을 추가 합니다.</li>
		<li>시퀀싱 접시에 샘플을 전송, 스트립 모자 또는 테이프 물개 커버 고 컴퓨터에 로드 하 고, 수행 생어 시퀀싱. 시퀀싱 플레이트는 일반적으로 96-글쎄, v-하단, 풀 치마 PCR 판 시퀀서와 호환입니다. 플레이트 바코드 자체 수행 되어야 하는 시퀀싱 인지에 따라, 상업 회사에 또는 학술 시퀀싱 센터/플랫폼에 있을 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>시퀀싱, 후 ' 바느질 함께 '는 완전 한 IGHV 유전자 재배열 즉, 합의 시퀀스를 개별 시퀀싱 단계에서 생성 된 2 읽습니다.</li>
</ol>6. 시퀀스 분석
참고: 다음 섹션 집중 분석할 때 IMGT/V-퀘스트 도구30 에서 얻은 출력 재배열 IG 시퀀스 및 IMGT/JunctionAnalysis31, 둘 다는 특히 임상 보고 및 연구 관련 연구입니다. IMGT/V-퀘스트는 사용자를 비교 하는 맞춤 도구 제출 IMGT 참조 디렉터리와 IG 시퀀스 설정30. 도구 출력 되는 사용자 특정 매개 변수를 정의할 수 있습니다 여러 섹션을 포함 합니다.
<ol><li>종, 예를 들어, 호모 사피엔스 (인간), 그리고 수용 체 유형 또는 로커 스 (예: 고등학교, IGK 또는 IGL)를 지정 합니다.</li>
	<li>시퀀스를 분석, FASTA 형식에서 및 헤더를 포함 하 여 (실행 당 최대 50 시퀀스의 배치)에서 텍스트 영역으로 붙여넣습니다. 또는, FASTA 시퀀스를 포함 하는 로컬 파일 경로 입력 하는 옵션이 제공 됩니다.</li>
	<li>결과 대 한 다음 3 디스플레이 옵션 중 하나를 선택 합니다.<ol>
<li>상세 보기: 개별적으로 각 시퀀스에 대 한 결과 얻기 위해이 옵션을 선택 하십시오.</li>
		<li>보기 종합: IGHV 유전자와 대립 유전자 이름이 나 시퀀스 입력된 순서는 요약 테이블을 편집 하려면이 옵션을 선택 하십시오. 이 옵션은 또한, 어떤 전송된 일괄 처리에 할당 된 동일한 IGHV 유전자와 대립 유전자 시퀀스의 맞춤을 제공 합니다.</li>
		<li>Excel 파일: 모든 단일 파일에 통합 하는 스프레드시트 파일 출력 제공 하려면이 옵션을 선택 하십시오. 그러나 모든 보기 옵션 기본 및 고급 매개 변수에서 선택의 큰 선택이 있다 CLL IG 시퀀스 분석에 가장 관련 요인 ' 대표 결과 ' 섹션에서 아래에서 토론 된다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 체포/AssignSubsets 도구
<ol><li>BcR IG stereotypy CLL (자세한 내용은 아래 '대표 결과' 섹션에서 제공)에서 조사, 체포/AssignSubsets 도구32IGHV-IGHD-IGHJ FASTA 시퀀스를 제출. 도구 주요 CLL에 대 한 할당 진부 하위 집합을 보고 합니다. 자세한 내용은 하위 할당 도구는 체포/AssignSubset 웹사이트32 및 서비스 탭 아래 에릭 웹사이트에 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>

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<li>Ntoufa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cell+anergy+modulated+by+TLR1%2F2+and+the+miR-17+approximately+92+cluster+underlies+the+indolent+clinical+course+of+chronic+lymphocytic+leukemia+stereotyped+subset+%234%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">B cell anergy modulated by TLR1/2 and the miR-17 approximately 92 cluster underlies the indolent clinical course of chronic lymphocytic leukemia stereotyped subset #4.</a> Journal of Immunology. 196 (10), 4410-4417 (2016).</li>
<li>Mansouri, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+loss+of+IkappaBepsilon+leads+to+NF-kappaB+deregulation+in+aggressive+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Functional loss of IkappaBepsilon leads to NF-kappaB deregulation in aggressive chronic lymphocytic leukemia.</a> The Journal of Experimental Medicine. 212 (6), 833-843 (2015).</li>
<li>Navrkalova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATM+mutations+in+major+stereotyped+subsets+of+chronic+lymphocytic+leukemia%3A+enrichment+in+subset+%232+is+associated+with+markedly+short+telomeres%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">ATM mutations in major stereotyped subsets of chronic lymphocytic leukemia: enrichment in subset #2 is associated with markedly short telomeres.</a> Haematologica. 101 (9), e369-e373 (2016).</li>
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<li>Rossi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+prediction+of+durable+remission+after+first-line+fludarabine-cyclophosphamide-rituximab+in+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Molecular prediction of durable remission after first-line fludarabine-cyclophosphamide-rituximab in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 126 (16), 1921-1924 (2015).</li>
<li>Thompson, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fludarabine%2C+cyclophosphamide%2C+and+rituximab+treatment+achieves+long-term+disease-free+survival+in+IGHV-mutated+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Fludarabine, cyclophosphamide, and rituximab treatment achieves long-term disease-free survival in IGHV-mutated chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 127 (3), 303-309 (2016).</li>
<li>Hallek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+diagnosis%2C+indications+for+treatment%2C+response+assessment+and+supportive+management+of+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Guidelines for diagnosis, indications for treatment, response assessment and supportive management of chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. , (2018).</li>
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</ol>

저자는 공개 관련 충돌의 관심 있다.

CLL에 IG 유전자의 연구는 질병 pathobiology로 더 나은 이해를 제공 뿐만 아니라 환자 위험 계층을 개선 하기 위한 중요 한 되었습니다. 그것은 그러므로 파라마운트 IG 유전자 순서 분석의 다단계 절차 및 후속 해석 순서 데이터의 표준화 된 방식으로 수행 됩니다. 적합 하 고 충분 한 환자 자료의 가용성 및 샘플링의 타이밍 하지 PB와 높은 CLL 종양 세포 수와 어떤 샘플 테스트를 수행할 수 있습니다 이후 IG 유전자 mutational 분석을 수행 하는 기능에 영향을 한다. 그라데이션 분리 방법을 사용 하 여 단 혈의 분리는 정기적으로 진단 실험실에서 수행 하 고 항상 주의 해야 그라데이션; 포함 된 튜브에 혈액/RPMI 솔루션을 추가할 때 이 작업에서 그라디언트를 방해 하지 않도록 하 고 세포의 손실을 방지 하는 느린, 부드러운 방식으로 수행 되어야 한다.
다음 셀 분리, 핵 산 추출 됩니다. 그러나 모두 cDNA 및 gDNA SHM clonotypic 고등학교 재배치의 분석을 위해 적당 하다,, 어느 자료의 사용에 대 한 장단점이 있다. 실험실 워크플로 진행 빨리 때 gDNA를 사용 하 여 이후 아무 반전 녹음 방송 PCR 확대 이전에 수행할 수 있다. 즉, 차례로, 추가 실습 실험실 작업, 즉, 정화 또는 다중 PCR 제품의 젤 절단으로 이어질 수 있는 생산적이 고 비생산적인 재배열의 증폭 PCR 위한 기판 발생할 수 있으므로 gDNA를 사용 하 여 그리고 모든 재배열의 개별 연속입니다. 비교할 때 gDNA cDNA 접근, 후자에 대 한 반전 녹음 방송 단계 수행 되어야 합니다 PCR 확대와 함께 진행 하기 전에. 그러나, 대부분의 경우,이 경우에서 생산성 IG 재배열 될 증폭 되며 이후 시퀀스. 따라서만 단일 PCR 제품 정화 됩니다 고 시퀀싱, 해석 결과 더 간단 하지만.
증폭의 효율은 크게 gDNA/cDNA, 민감한 정량화 방법 및 활용 하는 뇌관을 사용 하 여 평가 한다의 품질에 따라 달라 집니다. 사용 하는 뇌관은 SHM 수준의 정확한 결정만 뜯어 IGHV 유전자의 전체 순서를 증폭 하 여 달성 될 수 있다 때문에 전체 분석 절차에 중요 한. 전체 길이 재배치 지도자 뇌관27의 사용에 대 한 에릭에 의해 최근 권고를 정당화 하는 그로 인하여 5' IGHV 지도자 프라이 머 사용 하는 경우에 평가 수 있습니다. 불완전 한 IGHV-IGHD-IGHJ 유전자 재배열의 확대로 이어지는 다른 프라이 머를 사용 하 여 IGHV 유전자 mutational 분석에 적합 하지 않습니다 그리고 그러므로 대하여 강하게 조언. 유일한 예외는 IGHV 지도자 뇌관을 사용 하는 경우 반복적으로 부정적인 결과 생산 하는 경우에 관련 된 및 새로운 환자 자료의 분석은 하지 가능한 또는 또한 않는 결과 생성 하지. 다른 환자 샘플 및 자료 (gDNA/cDNA) 및 다양 한 프라이 머의 사용 설정 PCR 제품을 생산 하기 위해 여전히 실패, 때문일 수 종양 세포 부담 너무 낮게 또는 그 lymphocytosis CLL 클론 때문만 아니다 (어떤 경우에 immunophenotype 이어야 한다 다시 평가)입니다. 분석에 사용 되는 뇌관 항상 임상 보고서에 언급 해야 합니다.
CLL 같은 IGHV-IGHD-IGHJ 유전자 재배열을 베어링 단일 클론 B 세포의 축적에서 결과로 경우 clonality의 대부분에 대 한 평가 공개 한다 독특한 단일 클로 널 피크, 즉, 단일 클론. 드문 경우에, 이중 재배열 또는 심지어 oligoclonal 패턴 수 있습니다 관찰35. 이러한 경우에 젤 전기 이동 법 clonality 평가 위한 기본 기법 이며 조각 분석 같은 더 민감한 방법을 적용 한다. Clonality 확인 되었습니다 시퀀싱 전에 마지막 단계는 시퀀스의 높은 품질을 얻을 수 있습니다 있도록 PCR 제품의 정화에 관한. 마지막으로, IMGT/V-퀘스트 도구 에릭에 의해 IG 시퀀스 분석에 대 한 권장 리소스입니다. IMGT 데이터베이스는 지속적으로 업데이 트 하 고 일관성 및 잘 주석된 방식으로 결과 보고,이 도구는 표준화 된 분석을 보장 하 고 다른 임상 이나 교육 시설 사이 비교 분석을 용이 하 게.
CLL에 immunogenetic 분석은 예견 하 고, 특히, 예측 의미, 주요 CLL에 대 한 할당을 포함 하 여 IGHV-IGHD-IGHJ 유전자 재배열의 강력한 분석 하위 집합 진부, 이상입니다만 바람직한 하지만 주요 중요성의. 이것은 새로운 치료제와 IG 유전자 분석 치료 결정5,,2122,23,36,37 안내 하는 잠재력의이 시대에 특히 분명 하다 ,38로 공식적으로 CLL24국제 워크숍에서 NCI 후원 지침의 최근 업데이트로 표시. SHM 상태는 clonotypic의의 결정 CLL 환자에서 IGHV 유전자 재배열로 특히, 엄격한 표준 보증은 사소한 문제 이며 여러 단계 프로세스를 포함 한다. 중요 한 것은, 특정 실험 단계 뇌관, 수확량 뛰어난 결과 특정 옵션 및 접근의 가장 주목할 만한 선택 준수 하, 다른 기술적인 측면은 어느 정도 유연성, 소재 선택 등의 의무가 또는 사실은 그들은 미묘한 차이가 있으면, 최종 결과 관해서는 이어질 clonality, 평가 하기 위한 방법입니다.
지난 10 년간, 에릭 CLL 진단 및 prognostication에 관련 된 다양 한 방법의 통일 및 표준화 노력 했다. 이것은 게시 된 권장 사항 및 immunogenetic 분석27,34, 수많은 조직된 교육 워크샵 및 이벤트, IG 네트워크에 전문적인 온라인 포럼의 설립에 대 한 지침에 반영 토론 하 고 CLL에 IG 유전자 시퀀스 해석에 지침을 제공 합니다. 이러한 작업을 통해 에릭의 전반적인 목표는 최적의 임상 관리 및 환자 치료입니다. 강렬한 노력에도 불구 하 고이 작업까지 완료, 그리고 실제로 면역 프로 파일링 겨냥 소설 높은 처리량 시퀀싱의 발전 때문에 더 복잡 한 되고있다. 그럼에도 불구 하 고, 과제 지속, 비록 CLL에 IG 유전자 분석의 강력한 표준화에 대 한 집중적인 노력 계속 되며 현재 에릭 내에서 지속적인 활동의 초점.

만성 림프모구 백혈병 (CLL), 서방 국가에서 성인 백혈병의 가장 일반적인 형태는 성숙한 종양 약 B 세포1의 클론 확장 특징 이다. 임상 관점에서 적극적인 질병 발생, 매우 일찍 진단 후, 치료를 필요로 하 고 자주 돌아가는 또는 치료에 내 화 되 고 몇몇 환자와 질병 과정은 매우 변수. 이것은 나태 한 질병으로 제시, 결코 치료를 필요로 하 고 건강 한 나이 일치 하는 개인2와 유사한 수명을 환자 (~ 30%)의 상당한 비율에 스 탁 대조에서. 이 임상이 성분 분자 이상은 CLL 환자는 궁극적으로 병 인3이 질병 진행을 드라이브에서 발견의 다양성에서 반영 된다.
그러나 정확한 CLL 진단을 일반적으로 간단 합니다,, 상기 임상이 CLL 환자의 효과적인 관리를 방해할 수 있습니다 수립과 전조 및 예측 마커에 지원할 수에 대 한 필요성을 밑줄 치료 의사 결정2. 다 수의 연구는 소설 임상 및 생물 학적 마커 제안된4되의 풍부에 culminating CLL의 prognostication를 수정 하려고 했습니다. Clonotypic 면역 글로불린 무거운 변수 (IGHV) 유전자의 mutational 상태가입니다 CLL에 가장 강력한 전조 마커 중 주로 인해 사실은 시간 이상과 질병 진행 되는 동안, (i) 그것은 안정적으로 유지 하 고 (ii) 독립적입니다. 임상 및 생물 학적 매개 변수5. 그 불구, 아주 몇 가지 경우 마커, IGHV mutational 상태를 포함 하 여 현재 적용 됩니다 임상 일과에서 진단의 때에.
1999 년, 2 독립적인 연구 없이 환자 또는 최소한의 신체적인 hypermutation (SHM) 부하 (unmutated CLL, U-CLL)를 보고 하는 때까지 다시 CLL 날짜에 IG 유전자 시퀀싱의 임상 유틸리티에 초기 보고서는 들고 환자 보다는 더 나쁜 예 후를 높은 SHM 부담 (돌연변이 CLL, M-CLL)6,7. 좀 더 구체적으로, U-CLL 그룹 이루어져 있었다 clonotypic IGHV 유전자 몇몇 또는 SHM 은닉 하는 경우 따라서 가까운 생식 IGHV 유전자 (≥ 98%), 높은 백분율 정체성 반면 M CLL의 경우 높은 mutational 부하 구성 (%id는 가장 가까운 생식 IGHV 유전자 < 98%). 이러한 초기 연구 이후 그것은 지속적으로 입증 되었습니다 U CLL의 경우 짧은 시간에 우선 치료 (TTFT) 및 전반적인 생존 (OS) M CLL에 비해 표시.
돌이켜보면, 이러한 정액 연구 강조는 B 세포 수용 체 (BcR) IG CLL pathobiology에 따라서 성패의 중추적인 역할 광범위 한 연구는, 차례 차례로,의 더 포괄적인 감사 CLL microenvironmental 상호 작용으로 이 질병8,9의 생물 학적이. 더 최근의 연구 개별 사례 하위 집합 공유 (외견상) 동일한 BcR IG 유전자 시퀀스 때문에 클러스터 수 있습니다 공개 CLL에 immunogenetic 분석의 중요성에 대 한 추가 지원을 제공, 현상이 나 BcR IG stereotypy10 ,11,,1213. 개념 같은 진부한 하위 집합 하버 비슷한 clinicobiological 속성을 명확 하 게 다른 CLL 환자 다른 IG 유전자 시퀀스; 하지만 동일한 SHM 범주 내에서 그들을 분리에 할당 된 그 환자 지원 증거를 축적 그것은 실제로 알려졌다 CLL 환자 BcR IG stereotypy 추가에 따라 분류 U CLL 또는 M CLL 그룹14,,1516, 으로 CLL 환자의 대량 분리를 통해 생생한 17 , 18 , 19 , 20.
임상의 관점에서 그것은 주목할 만한 SHM 상태 clonotypic IGHV 유전자의 chemoimmunotherapy에 대 한 특정 응답 연관 시킬 것. 특히, M-CLL 환자에서 fludarabine/cyclophosphamide/rituximab (FCR)의 조합으로 치료, TP53 유전자 결함, 부족 한 의학적으로 맞는 CLL 환자에 대 한 금 치료 더 이상 크게 진행 무료 전시 생존 (PFS)와 같은 치료21,,2223받은 U CLL 환자에 비해 운영 체제. 따라서, SHM 상태의 식별 중요 해지고 있다 특히 예측 마커 CLL 환자 즉, 의 치료 관리에 도움 보다는 질병 즉, 임상 과정 평가 전조 표식입니다. 사실, CLL에 대 한 국제 워크샵에서 NCI 후원 지침 서의 최신 업데이트에 따라 재배열된 IGHV 유전자의 SHM 상태 되어야 모든 CLL 경우 모두 일반적인 연습에 있는 치료 개시 이전에 결정 하 고 임상 실험24. 또한, 비 발한 치료 대리인, 승인 최근 시험에서 약물의 증가 때문 SHM 상태 서 분자의 재생할 수 있습니다 훨씬 더 큰 역할 근처 미래5CLL 환자의 치료 관리.
이 보고서는 IG 유전자 순서 분석, 적절 한 재료를 선택 하 고 시퀀싱 결과의 임상 해석와 culminating으로 시작의 모든 측면을 자세히 설명 합니다. 단계 심층 평가 임상 시험에서 정확한 환자 층 리를 보장 하기 위해 신뢰할 수 있는 결과의 생산에 대 한 진단 루틴에서 중요 하다. 프로토콜 IG 유전자 순서 분석, 그 결과 다른 실험실 사이 비교는 보장의 조화에 도움이 제공 됩니다.

<table><tbody><tr><td>BD Vacutainer 플라스틱 혈액 수집 튜브 K2EDTA : 튜브 스토퍼</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>02-689-4</td><td>재료 저장</td></tr><tr><td>BD Vacutainer CPT 단핵 세포 준비 튜브 - 나트륨 헤파린</td><td>Becton Dickinson</td><td>362753</td><td>재료 저장</td></tr><tr><td>BD Vacutainer Heparin 혈액 수집 튜브 FAQ</td><td>Daigger Scientific</td><td>366480</td><td>재료 저장</td></tr><tr><td>UltraPure 0.5 M EDTA pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15575038</td><td>세포 처리</td></tr><tr><td>원심분리기 튜브 15 mL CS500</td><td>Corning</td><td>352096</td><td>세포 처리</td></tr><tr><td>원심분리기 튜브 PP 50 mL CS500</td><td>Corning</td><td>352070</td><td>세포 처리</td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640 (1X) 액체</td><td>Invitrogen</td><td>21875-091</td><td>세포 처리</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS, 6 x 100 mL</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>17-1440-02</td><td>세포 처리</td></tr><tr><td>혈청학적 피펫 5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>861,253,001</td><td>세포 처리</td></tr><tr><td>혈청학적 피펫 10 mL</td><td>Sarstedt</td><td>861,254,001</td><td>세포 처리</td></tr><tr><td>혈청학적 피펫 25 mL</td><td>Sarstedt</td><td>861,685,001</td><td>세포 처리</td></tr><tr><td>Dulbecco의 인산염 완충 식염수(D-PBS) (1X)</td><td>Invitrogen</td><td>14190250</td><td>세포 처리</td></tr><tr><td>Neubauer 플레이트</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>640010</td><td>세포 처리</td></tr><tr><td>Tuerk 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93770</td><td>세포 처리</td></tr><tr><td>PureLink 게놈 DNA 미니 키트</td><td>Invitrogen</td><td>K1820-01</td><td>DNA 추출</td></tr><tr><td>QIAamp RNA 혈액 미니 키트</td><td>Qiagen</td><td>52304</td><td>RNA 추출</td></tr><tr><td>AllPrep DNA/RNA 미니 키트</td><td>Qiagen</td><td>80204</td><td>DNA/RNA 추출</td></tr><tr><td>5X 첫 번째 가닥 완충액</td><td>Invitrogen</td><td>P/N Y02321</td><td>cDNA 합성</td></tr><tr><td>무작위 프라이머, 20 &마이크로; g</td><td>Promega</td><td>C1181</td><td>cDNA 합성</td></tr><tr><td>RNaseOUT& 무역; 재조합 리보뉴클레아제 억제제</td><td>Invitrogen</td><td>10777019</td><td>cDNA 합성</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Invitrogen</td><td>P/N Y00147</td><td>cDNA 합성</td></tr><tr><td>SuperScript II 역전사효소</td><td>Invitrogen</td><td>18064-014</td><td>cDNA 합성</td></tr><tr><td>10 mM dNTP Mix</td><td>Invitrogen</td><td>18427013</td><td>cDNA 합성, PCR</td></tr><tr><td>PCR 완충액</td><td>Invitrogen</td><td>O00065</td><td>PCR</td></tr><tr><td>MgCl2 (염화마그네슘) (25 mM)</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>AB0359</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Taq DNA 중합효소, 재조합</td><td>Invitrogen</td><td>10342-020</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Applied Biosystems 5&prime; 라벨링된 프라이머</td><td>ThermoFisher</td> <td>scientific-PCR</td><td>/Clonality assessment</td></tr><tr><td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td>PCR product quantification</td></tr><tr><td>UltraPure TBE Buffer, 10X</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>15581044</td><td>gel 전기영동</td></tr><tr><td>UltraPure Ethidium Bromide, 10 mg/mL</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>15585011</td><td>gel 전기영동</td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>S33102</td><td>gel 전기영동</td></tr><tr><td>10X BlueJuice Gel 로딩 버퍼</td><td>Invitrogen</td><td>16500100</td><td>gel 전기영동</td></tr><tr><td>DNA Ladder 1000 bp/1 kb ladder BLUE ready-to-use</td><td>Geneon</td><td>305-105</td><td>gel 전기영동</td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>16500500</td><td>gel 전기영동</td></tr><tr><td>아가로스 저겔화 온도</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414-250G</td><td>겔 전기영동</td></tr><tr><td>Novex TBE Gels, 10%, 10웰</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>EC6275BOX</td><td>gel 전기영동</td></tr><tr><td>ExoSAP-IT PCR 제품 클린업 시약</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>78201.1.mL</td><td>PCR 제품 클린업</td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>PCR 제품 세척</td></tr><tr><td>GenomeLab DTCS 퀵 스타트 키트</td><td>Beckman Coulter</td><td>608120</td><td>Sanger 염기서열</td></tr>분석 <tr><td>아세트산나트륨 용액(3M), pH 5.2</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>R1181</td><td>Sanger 염기서열분석</td></tr><tr><td>글리코겐, 분자생물학 등급</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>R0561</td><td>Sanger 염기서열</td></tr>분석 <tr><td>에탄올 절대</td><td>EMD Millipore</td><td>1024282500</td><td>Sanger 염기서열분석</td></tr><tr><td>SafeSeal 튜브 1.5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72,706</td><td>범용</td></tr><tr><td>Multiply-Pro 컵 0.2 mL, PP</td><td>Sarstedt</td><td>72,737,002</td><td>범용</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td></td><td></td><td>장비</td></tr><tr><td>PCR 기계</td><td></td><td></td><td>장비</td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>장비</td></tr></tbody></table>

만성 림프모구 백혈병에서 면역 글로불린 유전자 순서 분석: 시퀀스 해석 환자 자료에서

Immunoglobulin Gene Sequence Analysis In Chronic Lymphocytic Leukemia: From Patient Material To Sequence Interpretation

B 세포 성숙, 동안 면역 글로불린 (IG) 유전자 V (D) J 재결합의 복잡 한 과정 각 개별 B 세포 내에서 독특한 DNA 시퀀스에 신체적인 hypermutation (SHM) 제공 증가 함께 결합. 이후 B 세포 악성 결과 단일 셀의 클론 확장에서 IG 유전자 독특한 분자 서명 일반적인 개별 환자; 내 모든 악성 세포 대표 따라서, IG 유전자 재배열 클론 표식으로 사용할 수 있습니다. 중요 한 클론 식별자로 봉사 이외에 IG 유전자 시퀀스 이후 특정 발달 단계와 관련 하 고 따라서 종양 약 변환에 관련 된 B 세포의 역사를 반영 하는 '분자 타임 라인'으로 작동할 수 있다. 또한, 특정 악성 종양에 대 한 특히 만성 림프모구 백혈병 (CLL), IG 유전자 시퀀스 보유 전조 및 잠재적으로 예측 기능. 즉, IG 유전자 순서 분석에서 의미 있는 결론을 바탕 불가능할 경우 강력한 방법 및 도구 들의 분석에 도움이 사용할 수 없었습니다. 이 기사, CLL (에릭), 정보 기술 측면 및 필수 요구 사항을 안정적이 고 재현 IG 유전자 시퀀스 분석 CLL, 지금 권장 테스트를 보장 하기 위하여 필요한 유럽 연구 이니셔티브의 광범위 한 경험에 그리기 치료 전에 모든 CLL 환자에 대 한 좀 더 구체적으로, 다양 한 분석 단계 clonotypic IG 유전자 재배열의 신분증과 뉴클레오티드 순서의 결정에서 IG 유전자 시퀀스 데이터의 정확한 임상 해석에 이르기까지 설명 합니다.

여기, 우리 제시 내용은 기술적인 측면 및 만성 림프모구 백혈병 (CLL) 환자에서 강력한 IG 유전자 순서 분석을 위해 필수적인 요구 사항에 유럽 연구 이니셔티브의 축적 된 경험에 기반 하는 프로토콜 CLL (에릭)입니다.

During B cell maturation, the complex process of immunoglobulin (IG) gene V(D)J recombination coupled with somatic hypermutation (SHM) gives rise to a ...

이 방법은 환자의 정확한 예후와 같은 만성 림프구성 백혈병 분야에서 중요한 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 간단하고 빠르며 매우 정확하다는 것입니다. 이 기술의 의미는 정확한 예후가 나중에 질병의 치료 관리를 정의할 수 있기 때문에, 만성 림프구성 백혈병을 가진 환자를 가진 강력한 예후, 특히 위험한 인증으로 확장합니다.이 방법의 시각적 데모는 PCR 제품 선택 및 소화 시퀀스 분석 유형과 같이 정밀도와 경험이 모두 필요하기 때문에 배우기 가 어렵습니다. 이 절차를 시작하려면 EDTA 200 마이크로리터를 50 밀리리터 멸균 수집 튜브에 추가합니다. 말초 혈액 20 밀리리터와 15 밀리리터의 RPMI 배지를 튜브에 넣고 파이펫을 2~3회 위아래로 섞습니다.다음으로, 새로운 50 밀리리터 수집 튜브에 밀도 그라데이션 배지 15 밀리리터를 추가합니다. 말초 혈액 용액을 밀도 그라데이션 배지에 천천히 겹쳐서 그라데이션을 방해하지 않도록 합니다. 원심분리기는 20분 동안 800회 G로 원심분리기 브레이크를 해제합니다.그런 다음 멸균 파스퇴르 파이펫을 사용하여 상부 플라즈마 혈소판 층과 밀도 그라데이션 중간 층 사이에 형성된 단일 핵 세포 고리를 수집하고 새로운 멸균 15 밀리리터 수집 튜브로 옮김합니다. 최종 볼륨이 12 밀리리터이고 파이펫이 혼합하도록 위아래로 파이펫이 될 수 있도록 RPMI 매체를 추가합니다. 8분 동안 800배 G의 원심분리기.상체를 버리고 RPMI 배지의 10 밀리리터로 셀 펠릿을 다시 중단하십시오. 원심분리기는 8분 동안 750배 G로 다시 합니다. 그 후, 상체를 버리고 PBS의 1 밀리리터에 세포 펠릿을 용해.새로운 바우어 플레이트를 사용하여 20 마이크로리터의 샘플과 1~10개의 Turk 용액의 80마이크로리터를 혼합하여 세포 수를 형성합니다. 샘플의 다운스트림 처리가 당일 예약되지 않은 경우 샘플을 8분 동안 750회 G로 원심분리합니다. 상체를 버리고 셀 펠릿을 영하 80도에 보관하십시오.먼저, 각 하위그룹 프라이머의 평수량을 사용하여 프라이머 믹스를 준비하여 편견없는 증폭을 보장한다. 텍스트 프로토콜의 표 2에 나열된 PCR 시약을 혼합합니다. 혼합 PCR 시약을 포함하는 PCR 튜브에 TAP 폴리머라제 0.5 마이크로리터를 추가합니다.그런 다음 100 나노그램의 gDNA 또는 2개의 마이크로리터를 추가합니다. 텍스트 프로토콜의 표 3에 상세한 대로 열 PCR 프로토콜을 실행합니다. 그 후 IGHPFR1 프라이머 믹스를 사용할 때 IGHV 리터 프라이머 또는 350개의 기본 쌍을 사용할 때 약 500개의 기본 쌍의 PCR 제품을 확인하십시오.PCR 제품 정화를 시작하려면 PCR 제품의 총 부피를 3% 저용 아가로즈 젤에 적재합니다. PCR 제품이 배경과 분리될 때까지 젤에서 실행되도록 합니다. 날카로운 눈에 띄는 PCR 밴드를 소비한 다음 정화하고 용인합니다.두 개의 재배열이 감지되면 두 대역모두 별도로 절제되고 시퀀싱되어야 합니다. 엑소 수액 정리를 수행하려면 사용할 특정 볼륨에 대한 제조업체의 지침을 따르십시오. 각 샘플을 부드럽게 소용돌이쳐 30분 동안 PCR 블록에 섞고 배양합니다.효소를 섭씨 85도까지 15분간 가열하여 비활성화합니다. 그 후, 제품의 순도를 평가하기 위해 3% 아가로즈 젤에 소량의 PCR 제품을 적재한다. 시퀀싱 전에 마지막 검사점은 단편 분석을 사용하여 샘플의 복제도를 결정하는 것입니다.시퀀스 분석을 시작하려면 적절한 소프트웨어를 시작합니다. 호모 사피엔스와 같은 종및 수용체 유형 또는 궤적을 지정한다. fasta 형식으로 분석할 시퀀스를 최대 50회 시퀀스를 일괄적으로 텍스트 영역에 포함시킵니다.그런 다음 결과에 대한 다음 세 가지 표시 옵션 중 하나를 선택합니다. 자세한 보기:각 시퀀스에 대한 결과를 개별적으로 얻으려면 이 옵션을 선택합니다. 합성 보기:IGHV 유전자및 allele 이름 또는 서열 입력 순서로 정렬된 요약 테이블을 컴파일하려면 이 옵션을 선택합니다.이 옵션은 또한 제출된 배치에서 동일한 IGHV 유전자 및 allele에 할당되고 마지막으로 Excel 파일에 할당되는 서열의 정렬을 제공합니다. 이 옵션을 선택하여 모든 출력 파일을 단일 파일에 통합된 스프레드시트로 제공합니다. IGHV 리터 프라이머만 사용하면 재배치된 IGHV의 전체 길이가 증폭되어 실제 HSM 부하가 결정될 수 있습니다.예상 PCR 제품은 약 500개의 기본 쌍입니다. IGHV 리터 프라이머가 CLONOTYPIC IG 재배열을 증폭할 수 없는 드문 경우는 IGHBFR1 프라이머가 사용될 수 있습니다. 예상 PCR 제품은 약 350개의 기본 쌍입니다.그런 다음 획득한 시퀀스는 IMG TV 퀘스트 도구를 사용하여 분석됩니다. 결과 테이블의 첫 번째 행에는 IG 재배열 시퀀스가 생산적이거나 비생산적일 수 있기 때문에 시퀀스의 기능이 표시됩니다. IGH 유전자 재배열은 VDJ 영역 내에 있는 코돈이 정지되는 중지 및/또는 삽입/삭제로 인해 재조정이 프레임이 없는 경우입니다.생산적이고 따라서 기능적인 재배열만 더 분석해야 한다는 점에 유의해야 합니다. 기본 IMG TV 퀘스트 매개 변수를 사용하는 경우 삽입 및 삭제가 자동으로 감지되지는 하지만 이러한 변경 내용을 수행할 수 있다는 강력한 징후가 도구에 의해 제공되며 결과 요약 테이블 아래에 경고 경고가 나타납니다. 이 절차를 시도할 때, 클론 결합이 다클론 배경에서 구별될 수 있도록 젤에 PCR 제품을 충분히 착륙시키는 것을 기억하는 것이 중요합니다.개발 후, 이 기술은 만성 림프구성 백혈병 면역 유전학 분야의 연구자들이 환자의 체증 상순 상태의 예후 적 영향을 탐구하는 길을 열었습니다. 에틸륨 브로마이드로 일하는 것은 매우 위험할 수 있으며 항상 후드 아래에서 작업하는 것과 같은 예방 조치는 이 절차를 수행하는 동안 항상 취해야 합니다.

immunoglobulin-gene-sequence-analysis-chronic-lymphocytic-leukemia

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

여기에서 우리는 커플이 프로테오믹스 기술, 즉 전기 영동 (2DE)와 질량 분석기 (MS) 2 차원, 차동 차 샘플 두 개 이상의 그룹 중 / 번역 후 변형 된 단백질을 발현 식별 할 수있는 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은, 실험과 함께 기능성, 예후 마커 / 치료 대상의 식별 및 특성을 허용한다.

단백질 기능에 2DE - 젤 지점에서 만성 림프 구성 백혈병에 HS1에서 배운 레슨

이 프로토콜은 딥 시퀀싱(deep-sequencing)을 통해 림프종의 재조합된 면역글로불린 중쇄 VDJ 영역을 조사하고 VDJ 재배열 및 체세포 과돌연변이 상태를 검색하여 개별 종양의 클론 구조를 설명하는 방법을 설명합니다. 쌍을 이룬 진단과 재발 샘플 사이의 클론 구조를 비교하면 림프종 재발 클론 진화 모드가 밝혀집니다.

VDJ-SEQ : B 세포 림프종의 클론 진화 패턴을 나타 내기 위해 재 배열 면역 글로불린 무거운 체인 유전자의 깊은 시퀀싱 분석

여기에서는 고전적인 Hodgkin lymphoma (CHL)의 Hodgkin Reed-Sternberg (HRS) 세포로부터 고품질, 전체 exome 데이터를 생산하도록 고안된 결합 된 유동 세포 계측법 세포 분류 및 저 입력, 차세대 라이브러리 구성 프로토콜을 설명합니다.

고전적인 Hodgkin 림프종의 Reed-Sternberg 세포의 흐름 정렬 및 Exome 시퀀싱

이 연구는 만성 림프 구성 백혈병 (CLL) 환자에서 차별적으로 메틸화 된 CpG가 풍부한 부위를 확인하기 위해 최적화 된 메틸 -CpG 결합 도메인 (MBD) 시퀀싱 프로토콜과 계산 파이프 라인을 설명합니다.

만성 림프 성 백혈병 환자에서 Methyl-CpG- 결합 도메인 포착 기반 방법을 이용한 포괄적 인 DNA 메틸화 분석

만성 림프모구 백혈병 (CLL)은 서방 세계에서 가장 흔한 백혈병이 이다. NFAT 녹음 방송 요인 개발 및 많은 세포 유형에 활성화의 중요 한 레 귤 레이 터는. 여기, 우리 NFAT2의 소설 대상 유전자를 식별 하기 위해 인간의 CLL 세포에 chromatin immunoprecipitation (칩)의 사용에 대 한 프로토콜을 제시.

만성 림프모구 백혈병에서 소설 NFAT2 대상 유전자를 식별 하는 Chromatin Immunoprecipitation 분석 결과

여기, 우리는 프로토콜 분석 및 구조 시각화 및 전체 항 체 레파토리의 헌법에 대 한 설명. 이 다음-세대 시퀀싱을 사용 하 여 항 체 RNA의 광대 한 시퀀스의 수집을 포함 한다.

마우스와 차세대 시퀀싱에 의해 인간의 항 체 레파토리의 식별

이 프로토콜은 1 차적인 만성 림프구성 백혈병 세포에서 핵 및 세포질 분획의 최적화 그리고 연속적인 효율적인 생성을 가능하게 합니다. 이 견본은 세포 자극 및 약 처리에 핵과 세포질 구획 사이에서 일어나는 단백질 인신 매매에 있는 단백질 현지화 그리고 변경을 결정하기 위하여 이용됩니다.

핵/세포질 단백질 인신 매매를 모니터링하기 위한 1차 만성 림프구성 백혈병 세포의 세포 분열

현재 프로토콜은 혈액 샘플 및 장 생검에서 DNA 절연을 위한 방법을 설명합니다, 차세대 시퀀싱을 위한 TCRβ 및 IGH PCR 라이브러리의 생성, NGS 실행의 성능 및 기본 데이터 분석.

차세대 시퀀싱을 이용한 T 및 B 세포 수용체 면역 레퍼토리 분석

종양 조직에서 높은-품질 게놈 DNA를 얻는 유전 변경 다음 세대 시퀀싱을 사용 하 여 분석 하기 위한 필수적인 첫 번째 단계입니다. 이 문서에서는, 우리는 종양 세포를 풍부 하 게 하 고 그대로 DNA 터치에서 인쇄물 세포학 표본 하는 간단 하 고 빠른 방법을 제시.

터치 인쇄물 세포학을 사용 하 여 병 적인 임상 표본에서 높은-품질 종양 DNA를 간단 하 고 빠른 방법

우리는 cytometry에 의해 동시 표현의 기본 급성 골수성 백혈병 세포에 백혈병 줄기 세포 마커를 감지 하는 프로토콜 개요. 우리 3 조상 인구와 성숙의 정도 증가 함께 상 상속 LSC 인구를 측정 하는 방법을 보여 줍니다. 우리는 이러한 인구에 해당 환자-파생-xenografts의 존재를 확인 했다.

Flow Cytometry 최대 백혈병 줄기 세포 주 급성 골수성 백혈병 및 환자-파생-xenografts, 진단에 따라 추정 하

배우세요 만성 림프모구 백혈병에서 면역 글로불린 유전자 순서 분석 방법을. PCR 증폭과 IMG TV Quest 도구를 활용하여 환자 예후 정확도를 높이고 치료 결정을 지원하는 이 기술을 익히세요.

만성 림프모구 백혈병에서 면역 글로불린 유전자 순서 분석: 시퀀스 해석 환자 자료에서

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