Name: 교정 및 DNA 복구 분석 결과 단일 뉴클레오티드 확장 및 TOF MALDI 질량 분석 분석을 사용 하 여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-19T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: 배우세요 MALDI-TOF 질량분석을 이용한 DNA 중합효소 교정 및 DNA 복구 분석 방법입니다. 단일 뉴클레오티드 확장 전략으로 9개 뉴클레오티드 이하의 복구 패치를 신속하고 특이적으로 분석할 수 있습니다.

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우리 감사 NCFPB 통합 핵심 시설 기능 유전체학 (타이페이, 대만)와 그들의 기술 지원에 대 한 NRPB Pharmacogenomics 연구소 (타이페이, 대만). 이 작품에서 대만 건강 재단 (L-I.L.) 사역의 과학 및 기술, 타이 페이, 대만, ROC [가장 105-2320-B-002-047] 웨이 야 오 주석, 연구 보조금에 의해 지원 되었다 [가장 105-2628-B-002-051-MY3] 강이 수, 및 [ MOST-105-2320-B-002-051-MY3] 회담에 린에 대 한.

1. 뇌관/서식 파일 준비
<ol><li>프라이 머/시퀀싱 또는 PCR 뇌관 디자인 60%와 40% 사이 균형된 G + C 함량 된 서식 파일을 디자인 합니다. 18-21의 뇌관을 사용 하 여 적절 한 열 처리 및 더 나은 MS 신호에 대 한 nt.</li>
	<li>용융 온도 이상 7 이중 지역에 대 한 최소 50 ° C를 설정 하 여 서식 파일을 디자인 뇌관와 템플릿 간의 신호 분리 5'-오버행의 nt. 참고: 예를 들어 기판 P21/T28 표 1에 대 한 21-nt 뇌관은 짝을 28-nt 서식 파일. 옵션: nuclease 저항 phosphorothioate 채권 대체 서식 파일의 3' 끝에 마지막 4 phosphodiester 채권 등 다른 핵 산의 사용 서식 파일 ( 의 일반적인 3' 끝 저하에 의해 가능한 방해를 방지할 수 있습니다. 예를 들어, 표 1에서 T28S4), 비록 서식 파일 준비에 대 한 약간의 비용이 추가 됩니다.</li>
	<li>더 이상 정화 없이 표준 desalted oligonucleotides를 사용 하 여이 연구에 대 한 만족 이다. 주식으로 pmol 100 µ H2O/L의 농도에서 oligonucleotide 뇌관/서식 파일을 사용 하 고-20 ° c.에 그것을 저장합니다 oligonucleotides 독특한 피크 신호 및 좋은 신호 대 잡음 비 MALDI TOF MS (4-7 단계) 실행 하 여 품질 및 뇌관 및 서식 파일의 순도 확인 합니다.</li>
	<li>교정 및 농도 정규화 (그림 2)에 대 한 반응에 관련 시퀀스의 동등 어 금 니 뇌관의 상대 MALDI TOF MS 신호 강도 (7 단계)를 결정 합니다.</li>
</ol>2. 반응 교정
참고: 동일한 교정 반응 조건 및 프로토콜 A의 DNA 복구에 적용 됩니다-난, G-I, C-, 및 T-나.
<ol><li>예를 들어 표 1 에서 교정에 대 한 기판 P21/T28의 불일치를 T-G를 사용 하 여, 희석 뇌관 P21 및 템플릿을 T28 µ L pmol 12.5/H2O; 그런 다음 멸 균된 microcentrifuge 1.5 mL 튜브 희석된 뇌관의 12 µ L와 12 µ L 희석된 서식 파일의 전송. 참고: 템플릿/뇌관 믹스의 금액은 2 반응;에 대 한 충분 한 따라는 시 약의 볼륨을 증가 비례 여러 반응에 대 한.</li>
	<li>튜브를 단단히 닫습니다. 대상된 65 ° C 물 목욕, 37 ° C 물 욕조에 30 분 뒤에 30 분 동안 품 어 그리고 마지막으로 적절 한 어 닐 링을 보장 하기 위해 얼음에.</li>
	<li>멸 균된 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 뇌관의 8 µ L을 추가 하 고 템플릿 믹스 (50 pmol), 교정 반응 버퍼, 4 ddNTPs 믹스 (각 4 dNTPs의 2 m m), 및 H2O 18 µ L.까지 4 µ L x 10의 2 µ L를 섞어 튜브 영화. 참고: 1 x 교정 반응 버퍼에 50 mM NaCl, 10 m m MgCl2, 1 m m dithiothreitol, 및 10 mM Tris HCl (25 ° C에서 pH 7.9)가 포함 되어 있습니다. 10x 반응 버퍼 교정의 상용 소스에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오. 각 ddNTP는 반응에서의 최종 농도 0.1 m m 이다.</li>
	<li>원하는 농도에 반응 버퍼 교정 x 얼음 1에 DNA 중 합 효소를 희석 [예를 들어, microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 반응 버퍼 및 상업적인 소스에서 5 U Klenow 중 합 효소의 1 µ L 교정 x 1의 4 µ L을 추가 (테이블의 Materials)]. 모든 시간에 얼음에 희석된 효소를 저장 합니다. 참고: 희석된 DNA 중 합 효소의 양 만으로는 2 반응; 비례에 따라 효소의 볼륨을 증가 여러 반응에 대 한. Klenow 중 합 효소의 2.0 단위를 포함 하는 2.0 µ L의 볼륨의 T-G 터미널 일치 P21/T28 5 분에 50 pmol의 절반 이상을 교정 수 있습니다.</li>
	<li>2.3 단계에서 원하는 반응 온도 (예를 들어, 일반적으로 37 ° C Klenow 중 합 효소 및 T4 DNA 중 합 효소에 대 한 25 ° C) 기판 믹스와 함께 microcentrifuge 튜브를 prewarm. Prewarmed 기판 혼합물에 단계 2.4에서에서 2.0 µ L 희석된 DNA 중 합 효소의 전송 그리고 그 내용을 혼합 튜브 영화.</li>
	<li>반응의 구성 요소를 회전 하는 주위 온도에 3200 x g에서 몇 초 동안 효소와 기질 튜브 원심. 즉시 전송 난방 블록 또는 단계 2.5에서 원하는 외피 온도에 물 욕조에 반응.</li>
	<li>
반응 종료
	<ol>
<li>버퍼링 된 페 놀의 동등한 볼륨을 추가 하 고 몇 초 동안 그것을 vortexing에 의해 혼합 5 분 주위 온도에 3200 x g에서 microcentrifuge에서 원심.<ol>
<li>수성 단계 깨끗 한 microcentrifuge 튜브에 전송 하 고 클로 프롬의 동일한 볼륨을 추가, 몇 초 동안 원심 분리기에 깨끗 한 microfuge 관을 3 분에 대 한 주위 온도에 3200 x g에서 microfuge에 수성 단계 전송 vortexing에 의해 혼합 cubate; 5 분 동안 95 ° C에서 다음 얼음에 그것을 장소. 주의: 페 놀과 클로 프롬은 유해 화학 물질입니다. 처리 및 폐기물 처리 제도 규정을 따라야 한다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>또는 사용 하는 프로토콜을 냉각 하는 산. 이 위해 6 분 동안 얼음에 반응을 중지 후 1 M diethanolamine (마약)을 반응 혼합물의 pH를 중화 하 고 5 분; 95 ° C에서 그것을 품 어의 0.64 µ L을 추가 1 M HCl의 2 µ L를 추가 다음 얼음에 그것을 장소.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 수 지 뿐만 아니라 소금 오염 제거
<ol><li>상용 담 수 지 국자를 사용 하 여 키트 ( 재료의 표참조), 384-보조 개, 6 mg 수 지 시료 접시의 보조 개를 충당 하기 위해 충분 한 수 지.</li>
	<li>수 지 모든 보조 개에 걸쳐 균등 (6 mg/보조 개) 접시의 위쪽에 된다고 하 여. 어떤 과잉 수 지를 복구 하 고 병에 합니다.</li>
	<li>384-잘 접시 microfuge 관에서 2.7 단계에서 최종 반응 제품을 전송. 16 µ L H2O 각 잘에서 최종 반응 제품을 희석 하 고 접시 인감 모든 거품을 제거 하는 그것을 원심의 분배.</li>
	<li>물개를 제거, 수 지 가득 보조 개 접시를 거꾸로 반응 제품 384-잘 접시.</li>
	<li>우물-보조 번호판 샌드위치를 뒤집어 고 주의깊게 384-잘 접시에 수 지 (384-잘 접시 수 지 가득 보조 개 접시에 금속 말뚝에 대 한 플러시 되었는지 수).</li>
	<li>위에 보조 플레이트를 제거, 반응 제품의 혼합물을 포함 하는 384-잘 접시 인감 및 수 지, 잠시 모든 거품을 제거 하 고 그 내용을 담 대 한 실내 온도에 적어도 15 분 동안 회전에 3200 x g에서 원심.</li>
	<li>수 지 정리 후 원심 우물의 바닥에 수 지를 압축 하려면 5 분 동안 3200 x g에서 384-잘 접시.</li>
</ol>4. 전송 반응 제품 매트릭스 칩을
<ol><li>Nanoliter 디스펜서에 샘플 접시를 설정 (nanodispenser, 테이블의 자료를 참조).</li>
	<li>넣어 매트릭스 칩 ( 테이블의 자료참조)와 해당 트레이에 섹션 3.7에서에서 384-잘 접시.</li>
	<li>칩; 반응 제품 자리를 nanodispenser 운영 시작 하는 nanodispenser의 터치 스크린에 실행 버튼을 눌러.</li>
	<li>확인 채도 정보를 칩에 전체 목격된 볼륨을 보장 하기 위해 화면에 포함 된 샘플 명소의 자동화 된 캡처된 이미지 주위 5-10 nL. 볼륨이 충분 하지 않으면 샘플 안보 반복 합니다.</li>
</ol>5. 설치 질량 분석에 분석 결과 정보
<ol><li>.Xls 형식 가져오기에 대 한 예상된 신호 정보를 포함 하는 파일을 준비 합니다. 예를 들어 2, 3, 4 단계에서 P21/T28의 교정 반응에 대 한 "P21_T28.xls" (표 2)의 설정을 사용 합니다.</li>
	<li>만들고 응용 프로그램에서 정의 하는 새로운 분석 결과 ( 재료의 표참조)으로 디자이너 형식에서 가져오기 분석 결과 그룹 을 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 (예를 들어, "P21_T28.xls" 단계 5.1에서에서).xls 파일 선택.</li>
	<li>나무의 상단을 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 파일 이름을 여는 대상 분석 결과 판 트리를 통해 고객: 프로젝트: 플레이트 옵션 화면의 왼쪽에 설정 (예를 들어, "CTT20171201" 분석 결과 코드와 날짜 나타냅니다).</li>
	<li>384-잘 접시 유형을 선택 하 고 눌러 확인; 빈 접시를 나타납니다.</li>
	<li>스크린의 왼쪽에 (예를 들어, P21_T28)에 적절 한 분석 결과 선택 합니다.</li>
	<li>잘 강조 하 고 추가 플렉스를 선택 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 여 칩 샘플 위치를 발견 하는 각 샘플에 대 한 (예, P21_T28) 선택 된 분석 결과 할당 합니다.</li>
	<li>(예를 들어, 표 3의 1201.xlsx) 아니 헤더와.xlsx 형식에서 칩에 모든 테스트 작업 목록을 준비 합니다. 작업 목록 옵션을 통해 추가 새 샘플 프로젝트 를 가져옵니다.</li>
	<li>P21_T28 분석 결과의 각 위치에 (예를 들어, 1201.xlsx에서) 작업 목록에 테스트를 할당 하 고 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 여 선택 합니다.</li>
</ol>6. MALDI TOF MS 가동
<ol><li>응용 프로그램을 사용 하 여 칩을 질량 분석기를 연결 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>화면 오른쪽에서 기본 설정을 선택 합니다.</li>
	<li>분석 결과 이름 단계의 5.3 (예, CTT20171201), 칩, 칩의 ID와 설정을 저장.</li>
	<li>MS 제어 프로그램을 시작 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>In/Out 버튼 누르고 스카우트 접시를 꺼내. 스카우트 접시에 4.4 단계에서 발견된 칩 놓고 질량 분석기를 입력 발견된 칩에 대 한 In/Out 버튼을 누르십시오.</li>
	<li>응용 프로그램의 인식 버튼을 클릭 ( 재료의 표참조) 질량 분석을 시작 하 고 데이터를.</li>
</ol>7. 데이터 분석
<ol><li>데이터 분석을 위한 프로그램 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>왼쪽된 상단에 데이터베이스 트리를 단계 6.3에서에서 칩 ID를 선택 합니다. 스크린의 오른쪽에 데이터 파일을 엽니다.</li>
	<li>질량 스펙트럼을 표시 하려면 스펙트럼 아이콘을 클릭 합니다. 특정 범위의 m/z를 자르려면, 사용자 지정 대화 상자를 선택 하 고 새 창에서 클릭 x 축 에 원하는 위와 더 낮은 제한을 설정 하 고 스펙트럼의 지정된 된 범위를 표시 하려면 확인 을 누릅니다을 마우스 오른쪽 단추로.</li>
	<li>수출을 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 여 유지 하는 기록에 대 한 스펙트럼을 내보냅니다. 참고: 컴퓨터 화면에 데이터 검사에 대 한 합리적인 크기는 1600 폭/1200 단위의 규모를 사용 하 여.<ol>
<li>JPEG 파일 형식을 선택 대상에 클릭 합니다, 그리고 찾아보기 디스크 (예를 들어, 플래시 디스크 e:), 파일 이름을 입력 합니다 (예를 들어, 1201-1.jpg), 선택한 내보내기클릭.</li>
	</ol>
</li>
	<li>데이터 정량에 대 한 커서를 사용 하 고 피크 피크 높이 왼쪽 상단에 표시 클릭 합니다.<ol>
<li>또는 내보낸된 JPEG 파일을 인쇄 하 고 수동으로 통치자와 피크 높이 측정.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Su, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerase+I+proofreading+exonuclease+activity+is+required+for+endonuclease+V+repair+pathway+both+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">DNA polymerase I proofreading exonuclease activity is required for endonuclease V repair pathway both in vitro and in vivo.</a> DNA Repair. 64, 59-67 (2018).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

이 연구는 선택한 상업 계기에 의해 분석 단계별 교정 활동 분석 결과 설명 ( 테이블의 자료를 참조) MALDI TOF MS를 사용 하 여. 주요 장점 포함 뇌관 및 템플릿 레이블 무료로 쉽게 수행 하는 실험 설계에서 더 큰 유연성을 허용 합니다. 스트림-석 회 완전 한 테스트를 교정 하는 30의 처리 등 수동으로 교정 반응을 수행 하기 위한 3 h 4 h 고 MALDI TOF MS 분석 위에서 언급 한 프로토콜을 사용 하 여 그들의 정리를 완료 하려면 1 시간 걸립니다. 이 방법의 주요 단점 분석 결과에 필요한 기판의 금액입니다. 강한 신호 및 일관 된 결과 얻으려면, 우리 20 µ L 반응; 50 pmol DNA 기판의 사용 따라서, DNA의 크기는 방사선 DNA 실험8,,910보다 훨씬 높다. 볼륨 및 샘플 크기를 줄이고 MS ...

DNA 복제 시 DNA polymerases의 교정 기능 자손1,2,3,4,로 전송 하는 유전 정보의 높은 충실도 보장 하기 위해 필수적입니다. 5,,67. 중 합 효소 exonucleases 교정의 기여를 평가 하기 위해 수 있는 유전적 안정성을 보호 하는 메커니즘을 명확히 것.
방사성 표지와 젤 기반 분석 autoradiograms 또는 형광 이미징8,,910 의 densitometric 분석을 함께 전통적으로 DNA의 교정 활동을 탐지 하는 데 사용 되었습니다. polymerases입니다. 기능을 하는 동안 이러한 분석 실험, 비싼, 힘들고 높은 처리량 포맷 하지 의무가 있습니다. 또한, radioisotopes 폐기물 처리 등 안전 문제를 겪고 있습니다. 또는, 교정 활동 fluorometric 기술에 의해 분석 되어 있다. 예를 들어 2-aminopurine (2-AP) 생체 외에서 중 합 효소 분석 실험 생산 형광 신호11,12교정 동안 확장 제품에 통합할 수 있습니다. 2 AP thymine와 시 토 신 쌍 수 이후 불행 하 게도, 이러한 접근 낮은 특이성에서 고통. 더 최근의 접근 프로브를 포함 중요 한 G-quadruplex-기반 발광 스위치에는 중 합 효소에 대 한 중 합 효소의 일부를 극복 하는 분석 결과 교정에 대 한 단독으로 표시 된 형광 프로브로 서 3'-5' exonuclease 분석 결과13 는 상기 단점14. 이러한 fluorometric 방법에 대 한 열정 DNA 기판의 특정 라벨에 대 한 필요 때문에 점감 된다.
반면, DNA 분석을 위한 TOF MALDI MS 뇌관 연장 반응 레이블이 없는 4 ddNTPs와 지정된 로커 스15,,1617 에 동 질 다 상 식별 하 사용 될 수 있는 정밀한 분석 결과에서 고용은 고 돌연변이 탐지에 대 한 임상 응용에 널리 채택 되었습니다 및 암 진단18. 이러한 기본 원칙을 사용 하 여, 우리는 높은 해상도, 높은 특이성 및 MALDI TOF 양 사용 중 의 높은 처리량 잠재력을 악용 하는 활동을 교정 하는 DNA 중 합 효소의 생체 외에서 결정에 대 한 레이블 없는 분석 결과 만든 대장균 DNA 중 합 효소 나 Klenow 모델 효소, dideoxyribonucleotide 된 (ddNTPs)으로 조각 기판 제품을 단일 뉴클레오티드 확장 통해 MALDI TOF MS (그림 1) 후 교정의 "스냅숏" 걸릴 수 있습니다.
마찬가지로,이 방법은 또한이 어디 포함 3' 어 디 병 변 복구 나 폴을 복종 된다 뇌관 시험 어떤 모방도 긁어 V 수리 중간체 DNA 수리 분석 결과 대 한 개발 되었다. 완전히 이해 하는 동안 엔 V도 수리 통로 교정 exonuclease 활동 병 변의 절단19,20대 나는 폴을 알려진 유일한 복구 시스템입니다. 표시 사용 하 여 MALDI TOF MS, 우리는 명확 하 게 정의 된 수리 패치 어디 디 폴에 의해 excised 수 마지막 2에서 발생 하는 경우 나 올바른 보충된 뉴클레오티드를 추가 하기 전에 뇌관의 nt.
교정 및 DNA 복구의 연구를 위해이 방법은 빠르고 덜 이전 방법 보다는 힘이 드는 이며 메커니즘 및 기능으로 추가 정보를 제공 합니다.

<table><tbody><tr><td>올리고뉴클레오티드</td><td>Mission Biotech (대만)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>포스포로티오에이트 변형 올리고뉴클레오티드</td><td>Integrated DNA Technologies (대만)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA 중합효소 I, 대형 (Klenow) 단편</td><td>New England Biolabs, MA</td><td>M0210L</td><td></td></tr><tr><td>Klenow 단편 (3'&rarr; 5' 엑소-)</td><td>New England Biolabs, MA</td><td>M0212L</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 2.1 (10X)</td><td>New England Biolabs, MA</td><td>B7202S</td><td></td></tr><tr><td>2', 3' ddATP</td><td>Trilink Biotechnologies, CA</td><td>N4001</td><td></td></tr><tr><td>2', 3' ddGTP</td><td>Trilink Biotechnologies, CA</td><td>N4002</td><td></td></tr><tr><td>2', 3' ddTTP</td><td>Trilink Biotechnologies, CA</td><td>N4004</td><td></td></tr><tr><td>2', 3' ddCTP</td><td>Trilink Biotechnologies, CA</td><td>N4005</td><td></td></tr><tr><td>dATP, dGTP, dCTP, dTTP 세트</td><td>Clubio, 대만</td><td>CB-R0315</td><td></td></tr><tr><td>SpectroCHIP 어레이</td><td>Agena Bioscience, CA</td><td>#01509</td><td></td></tr><tr><td>MassARRAY</td><td>Agena Bioscience, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Typer 4.0 소프트웨어</td><td>Agena Bioscience, CA</td><td>#10145</td><td></td></tr><tr><td>클린 레진 툴 키트</td><td>아제나 바이오사이언스, CA</td><td>#08040</td><td></td></tr></tbody></table>

교정 및 dna 복구 분석 결과 단일 뉴클레오티드 확장 및 tof maldi 질량 분석 분석을 사용 하 여

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

게놈의 충실 한 복제의 유지 보존 유전 정보에 대 한 최고 이다. 높은 충실도 복제, 평가 비 라는 간단한 개발 했습니다 하 고 매트릭스 보조 레이저 탈 착 이온화 시간의 비행 (TOF MALDI)와 함께 사용 하 여 라디오 동위-방법 질량 분석 (MS) 교정 연구에 대 한 분석. 여기, DNA 중 합 효소 [예를 들면, 대장균 DNA 중 합 효소의 Klenow 파편 (KF) 나 (폴 나)이 연구에서] 모든 4 개의 dideoxyribonucleotide 된 존재 일치 뇌관-템플릿 이중 처리 하는 데 사용 됩니다. 일치 하지 않는 입문서 다음 교정/확장 하 고 MALDI TOF MS를 받게. 제품은 단일 염기 변이 내려 뇌관의 질량 변화에 의해 구별 된다. 중요 한 것은, 한 교정 또한 확인할 수 있습니다 내부 단일 불일치에 대 한 다른 효율성에도 불구 하 고. 3' 끝에서 2-4-뉴클레오티드 (nt)에 있는 불일치 효율적으로 했다, 폴에 의해 교정 그리고 5에서 불일치 뇌관 종점에서 nt만 부분 수정. 아니 교정 뇌관 3' 끝에서 6-9 nt에 있는 내부 불일치에 대 한 발생 했습니다. 이 메서드는 또한 DNA 수리 분석 실험 (예를 들어, 엔 V 복구 경로 대 한 기판의 기본 병 변 수리 평가)에 적용할 수 있습니다. 뇌관 어 deoxyinosine (디) 병 변 3'를 포함 하는 폴에 의해 해결 될 수 나. 실제로, penultimate T-I, G-나, 그리고 A-나 기판 했다 그들의 마지막 2 디 포함 된 뉴클레오티드 excised 폴에 의해 나는 올바른 ddN 5'-monophosphate (ddNMP)를 추가 하기 전에 어 C 동안-나 불일치는 폴에 의해 용납 했다 나 뇌관 없이 확장 될 수 있도록 수리, 감도 및 해상도 MS의 DNA 복구를 측정 하는 분석 결과 보여주는.

서식 파일 및 뇌관:
제시 하는 절차를 사용 하 여 여기, 어 금 니 합성 oligonucleotide 서식 파일이 고 상업적인 소스에서 얻은 관련 시퀀스의 뇌관 그들의 순수성 및 (그림 3A; 참고 지정된 질량을 일치 하는 신호 품질에 대 한 확인 그리고 낮은 배경) 뿐만 아니라 피크 강도와 실정이 질량 (그림 2A) 사이의 관계에 대 한로. 피크 높이 및 측정 했다 MS 데이터 정규화에 대 한 (그림 2B)를 계산 합니다.
반응 조건 및 질량 스펙트럼...

교정 하는 DNA 중 합 효소와 DNA 수리 분석 결과 대 한 비 표시, 라디오 동위-방법 고해상도 TOF MALDI 질량 분석 및 단일 뉴클레오티드 확장 전략을 사용 하 여 개발 되었다. 분석 결과 매우 특정, 간단 하, 빠른, 고 교정에 대 한 수행 하 여 복구 패치 9-뉴클레오티드 보다 짧은 입증 했다.

교정 및 DNA 복구 분석 결과 단일 뉴클레오티드 확장 및 TOF MALDI 질량 분석 분석을 사용 하 여

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

이 방법은 교정 방법 및 분석과 같은 DNA 폴리머 충실도 및 DNA 복구 분야의 주요 질문에 답하고 DNA 복구 패치를 정의하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 매우 구체적이고 간단하며 빠르고 수행하기 쉽다는 것입니다. 일반적으로, 이 방법에 새로운 개인은 DNA 복제에서 아직도 그들 때문에 고군분투할 것이고 수선 분야는 질량 분석 기계 사용 및 자료 해석에 익숙하지 않을지도 모른다.가장 중요한 것은 돌연변이 및 대리와 같은 임상 응용 분야를 위해 상업적으로 개발된 질량 분석법이 DNA 교정 및 복구 연구에 어떻게 편리하게 적용될 수 있는지 보여줄 수 있기 때문에 시각적 시연이 매우 중요하다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 것은 제 연구실의 Rong-Syuan 대학원생과 Kuei-Ching 대학원생입니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 프라이머 및 템플릿 준비로 이 절차를 시작합니다.예를 들어, 교정을 위해 기판 P21과 T28의 TG 불일치를 사용합니다. P21 프라이머와 T28 템플릿을 물로 마이크로리터당 12.5피코몰로 희석합니다. 그런 다음 12마이크로리터의 희석된 프라이머와 12마이크로리터의 희석된 템플릿을 1.5밀리리터의 멸균 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다.튜브를 단단히 닫은 후 섭씨 65도의 뚜껑이 있는 수조에서 30분 동안 튜브를 배양합니다. 그런 다음 섭씨 37도의 수조에서 30분 동안 배양합니다. 그리고 마지막으로 튜브를 얼음 위에 올려 적절한 어닐링을 보장합니다.1.5ml 멸균 마이크로 원심분리기 튜브에 8마이크로리터의 프라이머 및 템플릿 혼합물, 2마이크로리터의 10x 교정 반응 완충액, 4마이크로리터의 4ddNTP 혼합물 및 최대 18마이크로리터의 물을 추가합니다. 튜브를 튕겨 섞습니다. DNA 중합효소를 얼음처럼 차가운 1x 교정 반응 완충액에서 원하는 농도로 희석합니다.희석된 효소는 항상 얼음에 보관하십시오. 기질 혼합물이 있는 마이크로 원심분리기 튜브를 원하는 반응 온도로 예열합니다. 그런 다음 희석된 DNA 중합효소 2마이크로리터를 예열된 기질 혼합물에 옮기고 튜브를 튕겨 내용물을 혼합합니다.주변 온도에서 중력의 3200배에서 몇 초 동안 효소와 기질이 있는 튜브를 원심분리하여 반응 성분을 스핀다운합니다. 즉시 반응을 원하는 배양 온도에서 가열 블록 또는 수조로 옮깁니다. 반응을 종료하려면 동일한 부피의 완충된 페놀을 추가하고 몇 초 동안 와류로 반응물을 혼합합니다.그런 다음 주변 온도에서 중력의 3200배인 마이크로 원심분리기에서 5분 동안 반응을 원심분리합니다. 수성상을 깨끗한 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 동일한 부피의 클로로포름을 첨가합니다. 몇 초 동안 볼텍싱하여 혼합한 후 상온에서 중력의 3200배로 3분 동안 마이크로 원심분리기에서 샘플을 원심분리합니다.수성상을 깨끗한 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 섭씨 95도에서 5분 동안 반응을 배양한 후 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 다음으로, 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 384웰 플레이트에서 염 오염을 제거하기 위해 수지 첨가를 수행합니다.나노리터 디스펜서에 있는 샘플 플레이트를 설정합니다. 매트릭스 칩과 준비된 384웰 플레이트를 해당 트레이에 놓습니다. 나노 디스펜서를 작동하여 칩에 대한 반응 생성물을 찾아냅니다.나노 디스펜서의 터치 스크린에 있는 실행 버튼을 눌러 시작합니다. 화면에서 채도 정보가 포함된 샘플 스폿의 자동 캡처 이미지를 확인하여 칩의 전체 스폿 부피가 약 5-10나노리터인지 확인하십시오. 볼륨이 충분하지 않은 경우 샘플 스포팅을 반복합니다.가져올 예상 신호 정보가 포함된 Excel 형식의 파일을 준비합니다. 응용 프로그램에서 디자이너 형식의 import assay 그룹을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 새 assay를 생성 및 정의하고 Excel 파일을 선택합니다. 트리 상단을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 파일 이름을 지정하여 화면 왼쪽의 고객 프로젝트 플레이트 옵션 트리를 통해 대상 분석 플레이트를 설정합니다.384웰 플레이트 유형을 선택하고 OK를 누릅니다. 빈 접시가 나타납니다. 화면 왼쪽에서 적절한 분석을 선택합니다. 웰을 강조 표시하여 칩의 각 점박이 샘플 위치에 대해 선택한 분석을 할당하고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 Add plex를 선택합니다.다음으로, 헤더가 없는 Excel 형식의 칩에 있는 모든 테스트의 작업 목록을 준비합니다. 새 샘플 프로젝트 추가 옵션을 통해 작업 목록을 가져옵니다. P21T28 분석의 각 위치에 테스트 및 작업 목록을 할당하고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 선택합니다.응용 프로그램을 사용하여 질량 분석기를 칩에 연결합니다. 화면 오른쪽에서 기본 설정을 선택합니다. 칩 모서리에 있는 분석 이름과 칩 ID를 입력합니다.설정을 저장하고 MS 제어 프로그램을 시작합니다. in/out 버튼을 누르고 스카우트 플레이트를 꺼냅니다. 점박이 칩을 스카우트 플레이트에 놓고 점박이 칩의 입력/출력 버튼을 눌러 질량 분석기에 들어갑니다.응용 프로그램의 acquire 버튼을 클릭하여 질량 분석기를 시작하고 데이터를 수집합니다. 데이터 분석을 위해 프로그램을 엽니다. 왼쪽 상단 모서리에 있는 데이터베이스 트리를 탐색하고 칩 ID를 선택합니다.화면 오른쪽에서 데이터 파일을 엽니다.스펙트럼 아이콘을 클릭하여 질량 스펙트럼을 표시합니다. 전하에 대한 특정 질량 범위를 자르려면 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 사용자 정의 대화 상자를 선택합니다. 새 창에서 x축을 클릭하고 원하는 상한과 하한을 설정하고 확인을 눌러 지정된 스펙트럼 범위를 표시합니다.export를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 기록 보관을 위해 스펙트럼을 내보냅니다. JPEG 파일 형식을 선택하고, 대상을 클릭하고, 디스크 찾아보기를 선택하고, 파일 이름을 입력한 다음 내보내기를 클릭합니다. 데이터 정량화를 위해 커서를 사용하고 피크를 클릭하면 왼쪽 상단 모서리에 피크 높이가 표시됩니다.MALDI-TOF MS에서는 올리고뉴클레오티드 질량의 피크 강도 사이에 반비례 관계가 있습니다. 17 내지 24개의 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드를 MS 분석을 실시하였다. 상대적인 신호 강도를 계산하여 교정 또는 수리 분석의 정량화에 사용할 수 있었습니다.템플릿 신호와 프라이머 신호는 모두 질량 스펙트럼에서 찾을 수 있습니다. 크기 차이로 인해 템플릿과 비특이적 부분 분해 산물의 신호는 일치하지 않는 프라이머 및 교정된 제품과 잘 분리되었습니다. 여기에 표시된 것은 5분 TG.At 3개의 프라임 단자에 대한 교정이며, 수정된 제품은 절제 제품의 경우 23%와 17%였습니다.이 차이는 20분 시점에서 69% 대 14%로 계속 증가했습니다. MS의 고분해능은 32의 질량 과충전 차이로 서브 스트레이트 신호와 제품 신호를 명확하게 분리합니다. 또한 쉽게 해결할 수 있는 것은 펜 ultimate TG 교정을 위한 두 가지 형태의 절제 제품이었습니다.1개의 뉴클레오티드 절제 중간체 및 2개의 뉴클레오티드 절제 산물. 내부 불일치에 대한 교정은 교정 효율성에서 뚜렷한 경향을 보여주었습니다. 큰 교정된 제품 말하기에 의해 입증된 바와 같이, 하위 직선이 3개의 프라임 말단에서 마지막, 끝에서 두 번째, 세 번째 및 네 번째 뉴클레오티드에서 불일치가 있을 때 다른 위치에서의 불일치와 비교하여 효율성이 증가하는 것이 관찰되었습니다.이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 4시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차에 따라 고분자 교정 heapiter 스크리닝과 같은 다른 응용 프로그램을 수행하여 제약 연구를 위한 신약을 발견하고 발명할 수 있습니다. 이 기술은 또한 DNA 복제 및 복구 분야의 연구자들이 그놈의 의학에 대한 더 많은 통찰력을 얻고 모든 살아있는 유기체에 대한 충실한 복제에 대한 통찰력을 얻을 수 있는 길을 열어줍니다.이 동영상을 시청한 후에는 MADI-TOF 질량 분석 분석을 사용하여 DNA 교정 및 복구 분석을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 스페노 클로로포름으로 작업하는 것은 위험할 수 있으며 절차를 수행하는 동안 항상 개인 보호 장비 착용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오. 텍스트의 대체 프로토콜은 더 안전한 대체물로 간주될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

우리는 DNA glycosylase 및 세포 핵 lysates의 에이피 endonuclease 활동의 양적, 실시간 측정을위한 방법을 설명합니다. 분석은 운동 분석 의무의 DNA 복구 활동의 속도를 얻을 조직과 종양의 lysates 또는 정화 단백질과 DNA를 복구 활동의 부량에 대한 적응이다.

병변 특정 분자 비콘을 활용 세포 Lysates의 기본 절단 복구 활동의 양적, 실시간 분석

여기에서는 뉴클레오티드 절제 복구 시스템을 예로 들어 단일 분자 AFM 이미징을 통한 다양한 DNA 병변 인식 접근 방식에 대한 연구를 시연합니다. DNA 및 단백질 시료 준비 절차와 AFM 실험을 위한 실험 및 분석 세부 사항에 대해 설명합니다.

핵 포스 현미경 검사에 의한 DNA 절편 검사에서의 DNA 병변 인식 연구

여기에서는 유전 독성 스트레스에 노출 된 현탁 세포 배양 물에서 ATM과 p53 사이의 직접적인 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하고 시각화하기 위해 현장에서의 근접 연결 분석 (PLA)이 어떻게 사용될 수 있는지 보여줍니다.

Proximity Ligation Assay를 이용한 현탁 세포 배양에서의 DNA 손상 유발 단백질 복합체의 검출 및 가시화

이 프로토콜의 목표는 플라스 미드 DNA에 정의 된 DNA-단백질 crosslinks의 수리 계량. Lesioned 플라스 미드는 받는 사람 포유류 세포 선 및 여러 시간 포인트 후 transfection에 수확 하는 저 분자 무게에 페. DNA 복구 속도 스트랜드 특정 뇌관 연장 정량 뒤를 사용 하 여 정량.

간단 하 고 빠른, 양적 분석 결과에 플라스 미드 DNA-단백질 Crosslinks의 측정 수리에 포유류 세포로 페

우라실-DNA 글리코실라제 활성을 분석하기 위한 비표지, 비-방사성-동위원소 방법은 직접 아푸린산/아피리미딘 부위 함유 생성물 분석을 위해 MALDI-TOF 질량 분광법을 사용하여 개발되었다. 이 분석은 DNA 글리코실라제 측정에 매우 간단하고, 구체적이며, 빠르고, 사용하기 쉬운 것으로 판명되었습니다.

매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 비행 시간 질량 분광법 분석에 의한 우라실-DNA 글리코실라제 분석

여기서 우리는 병변 유도 후 DNA를 복제하는 데있어 단일 가닥 DNA 갭을 조사하기 위해 DNA 섬유 분석의 두 가지 변형을 설명합니다. S1 섬유 분석은 ssDNA 특이적 S1 엔도뉴클레아제를 사용하여 복제 후 갭을 검출할 수 있게 하며, 갭 채우기 분석은 갭 복구의 시각화 및 정량화를 가능하게 합니다.

DNA 섬유 분석을 이용한 인간 세포에서의 복제 후 갭 축적 및 복구 검출

MALDI-TOF는 산화된 RNA와 엑소리보뉴클레아제 Xrn-1 사이의 반응성으로부터 수득된 단편을 특성화하는데 사용되었다. 본 프로토콜은 RNA 및/또는 DNA를 포함하는 다른 공정에 적용될 수 있는 방법론을 기술한다.

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GFP 기반 리포터 시스템을 사용한 HEK-293T 세포의 비상동성 말단 접합 및 상동 재조합 효율 분석

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고처리량 및 정량적 발광 기반 리포터 분석을 사용한 DNA 이중 가닥 파손 복구 활성 평가

배우세요 MALDI-TOF 질량분석을 이용한 DNA 중합효소 교정 및 DNA 복구 분석 방법입니다. 단일 뉴클레오티드 확장 전략으로 9개 뉴클레오티드 이하의 복구 패치를 신속하고 특이적으로 분석할 수 있습니다.

교정 및 DNA 복구 분석 결과 단일 뉴클레오티드 확장 및 TOF MALDI 질량 분석 분석을 사용 하 여

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