교정 및 DNA 복구 분석 결과 단일 뉴클레오티드 확장 및 TOF MALDI 질량 분석 분석을 사용 하 여

이 방법은 교정 방법 및 분석과 같은 DNA 폴리머 충실도 및 DNA 복구 분야의 주요 질문에 답하고 DNA 복구 패치를 정의하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 매우 구체적이고 간단하며 빠르고 수행하기 쉽다는 것입니다. 일반적으로, 이 방법에 새로운 개인은 DNA 복제에서 아직도 그들 때문에 고군분투할 것이고 수선 분야는 질량 분석 기계 사용 및 자료 해석에 익숙하지 않을지도 모른다.

가장 중요한 것은 돌연변이 및 대리와 같은 임상 응용 분야를 위해 상업적으로 개발된 질량 분석법이 DNA 교정 및 복구 연구에 어떻게 편리하게 적용될 수 있는지 보여줄 수 있기 때문에 시각적 시연이 매우 중요하다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 것은 제 연구실의 Rong-Syuan 대학원생과 Kuei-Ching 대학원생입니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 프라이머 및 템플릿 준비로 이 절차를 시작합니다.

예를 들어, 교정을 위해 기판 P21과 T28의 TG 불일치를 사용합니다. P21 프라이머와 T28 템플릿을 물로 마이크로리터당 12.5피코몰로 희석합니다. 그런 다음 12마이크로리터의 희석된 프라이머와 12마이크로리터의 희석된 템플릿을 1.5밀리리터의 멸균 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다.

튜브를 단단히 닫은 후 섭씨 65도의 뚜껑이 있는 수조에서 30분 동안 튜브를 배양합니다. 그런 다음 섭씨 37도의 수조에서 30분 동안 배양합니다. 그리고 마지막으로 튜브를 얼음 위에 올려 적절한 어닐링을 보장합니다.

1.5ml 멸균 마이크로 원심분리기 튜브에 8마이크로리터의 프라이머 및 템플릿 혼합물, 2마이크로리터의 10x 교정 반응 완충액, 4마이크로리터의 4ddNTP 혼합물 및 최대 18마이크로리터의 물을 추가합니다. 튜브를 튕겨 섞습니다. DNA 중합효소를 얼음처럼 차가운 1x 교정 반응 완충액에서 원하는 농도로 희석합니다.

희석된 효소는 항상 얼음에 보관하십시오. 기질 혼합물이 있는 마이크로 원심분리기 튜브를 원하는 반응 온도로 예열합니다. 그런 다음 희석된 DNA 중합효소 2마이크로리터를 예열된 기질 혼합물에 옮기고 튜브를 튕겨 내용물을 혼합합니다.

주변 온도에서 중력의 3200배에서 몇 초 동안 효소와 기질이 있는 튜브를 원심분리하여 반응 성분을 스핀다운합니다. 즉시 반응을 원하는 배양 온도에서 가열 블록 또는 수조로 옮깁니다. 반응을 종료하려면 동일한 부피의 완충된 페놀을 추가하고 몇 초 동안 와류로 반응물을 혼합합니다.

그런 다음 주변 온도에서 중력의 3200배인 마이크로 원심분리기에서 5분 동안 반응을 원심분리합니다. 수성상을 깨끗한 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 동일한 부피의 클로로포름을 첨가합니다. 몇 초 동안 볼텍싱하여 혼합한 후 상온에서 중력의 3200배로 3분 동안 마이크로 원심분리기에서 샘플을 원심분리합니다.

수성상을 깨끗한 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 섭씨 95도에서 5분 동안 반응을 배양한 후 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 다음으로, 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 384웰 플레이트에서 염 오염을 제거하기 위해 수지 첨가를 수행합니다.

나노리터 디스펜서에 있는 샘플 플레이트를 설정합니다. 매트릭스 칩과 준비된 384웰 플레이트를 해당 트레이에 놓습니다. 나노 디스펜서를 작동하여 칩에 대한 반응 생성물을 찾아냅니다.

나노 디스펜서의 터치 스크린에 있는 실행 버튼을 눌러 시작합니다. 화면에서 채도 정보가 포함된 샘플 스폿의 자동 캡처 이미지를 확인하여 칩의 전체 스폿 부피가 약 5-10나노리터인지 확인하십시오. 볼륨이 충분하지 않은 경우 샘플 스포팅을 반복합니다.

가져올 예상 신호 정보가 포함된 Excel 형식의 파일을 준비합니다. 응용 프로그램에서 디자이너 형식의 import assay 그룹을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 새 assay를 생성 및 정의하고 Excel 파일을 선택합니다. 트리 상단을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 파일 이름을 지정하여 화면 왼쪽의 고객 프로젝트 플레이트 옵션 트리를 통해 대상 분석 플레이트를 설정합니다.

384웰 플레이트 유형을 선택하고 OK를 누릅니다. 빈 접시가 나타납니다. 화면 왼쪽에서 적절한 분석을 선택합니다. 웰을 강조 표시하여 칩의 각 점박이 샘플 위치에 대해 선택한 분석을 할당하고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 Add plex를 선택합니다.

다음으로, 헤더가 없는 Excel 형식의 칩에 있는 모든 테스트의 작업 목록을 준비합니다. 새 샘플 프로젝트 추가 옵션을 통해 작업 목록을 가져옵니다. P21T28 분석의 각 위치에 테스트 및 작업 목록을 할당하고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 선택합니다.

응용 프로그램을 사용하여 질량 분석기를 칩에 연결합니다. 화면 오른쪽에서 기본 설정을 선택합니다. 칩 모서리에 있는 분석 이름과 칩 ID를 입력합니다.

설정을 저장하고 MS 제어 프로그램을 시작합니다. in/out 버튼을 누르고 스카우트 플레이트를 꺼냅니다. 점박이 칩을 스카우트 플레이트에 놓고 점박이 칩의 입력/출력 버튼을 눌러 질량 분석기에 들어갑니다.

응용 프로그램의 acquire 버튼을 클릭하여 질량 분석기를 시작하고 데이터를 수집합니다. 데이터 분석을 위해 프로그램을 엽니다. 왼쪽 상단 모서리에 있는 데이터베이스 트리를 탐색하고 칩 ID를 선택합니다.화면 오른쪽에서 데이터 파일을 엽니다.

스펙트럼 아이콘을 클릭하여 질량 스펙트럼을 표시합니다. 전하에 대한 특정 질량 범위를 자르려면 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 사용자 정의 대화 상자를 선택합니다. 새 창에서 x축을 클릭하고 원하는 상한과 하한을 설정하고 확인을 눌러 지정된 스펙트럼 범위를 표시합니다.

export를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 기록 보관을 위해 스펙트럼을 내보냅니다. JPEG 파일 형식을 선택하고, 대상을 클릭하고, 디스크 찾아보기를 선택하고, 파일 이름을 입력한 다음 내보내기를 클릭합니다. 데이터 정량화를 위해 커서를 사용하고 피크를 클릭하면 왼쪽 상단 모서리에 피크 높이가 표시됩니다.

MALDI-TOF MS에서는 올리고뉴클레오티드 질량의 피크 강도 사이에 반비례 관계가 있습니다. 17 내지 24개의 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드를 MS 분석을 실시하였다. 상대적인 신호 강도를 계산하여 교정 또는 수리 분석의 정량화에 사용할 수 있었습니다.

템플릿 신호와 프라이머 신호는 모두 질량 스펙트럼에서 찾을 수 있습니다. 크기 차이로 인해 템플릿과 비특이적 부분 분해 산물의 신호는 일치하지 않는 프라이머 및 교정된 제품과 잘 분리되었습니다. 여기에 표시된 것은 5분 TG.At 3개의 프라임 단자에 대한 교정이며, 수정된 제품은 절제 제품의 경우 23%와 17%였습니다.

이 차이는 20분 시점에서 69% 대 14%로 계속 증가했습니다. MS의 고분해능은 32의 질량 과충전 차이로 서브 스트레이트 신호와 제품 신호를 명확하게 분리합니다. 또한 쉽게 해결할 수 있는 것은 펜 ultimate TG 교정을 위한 두 가지 형태의 절제 제품이었습니다.

1개의 뉴클레오티드 절제 중간체 및 2개의 뉴클레오티드 절제 산물. 내부 불일치에 대한 교정은 교정 효율성에서 뚜렷한 경향을 보여주었습니다. 큰 교정된 제품 말하기에 의해 입증된 바와 같이, 하위 직선이 3개의 프라임 말단에서 마지막, 끝에서 두 번째, 세 번째 및 네 번째 뉴클레오티드에서 불일치가 있을 때 다른 위치에서의 불일치와 비교하여 효율성이 증가하는 것이 관찰되었습니다.

이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 4시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차에 따라 고분자 교정 heapiter 스크리닝과 같은 다른 응용 프로그램을 수행하여 제약 연구를 위한 신약을 발견하고 발명할 수 있습니다. 이 기술은 또한 DNA 복제 및 복구 분야의 연구자들이 그놈의 의학에 대한 더 많은 통찰력을 얻고 모든 살아있는 유기체에 대한 충실한 복제에 대한 통찰력을 얻을 수 있는 길을 열어줍니다.

이 동영상을 시청한 후에는 MADI-TOF 질량 분석 분석을 사용하여 DNA 교정 및 복구 분석을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 스페노 클로로포름으로 작업하는 것은 위험할 수 있으며 절차를 수행하는 동안 항상 개인 보호 장비 착용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오. 텍스트의 대체 프로토콜은 더 안전한 대체물로 간주될 수 있습니다.