Name: 정위 적 입양 전송 Orthotopic 인간 세포종 님 Xenografts Murine 모델에서 세포 독성 면역 세포의 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: 배우세요 교모세포종 치료를 위한 세포독성 면역세포의 정위적 이입 전송 방법을 면역결핍 NSG 마우스 모델에서. 이 프로토콜은 뇌종양 내 면역세포 주사의 생존성과 항종양 효능을 입증합니다.

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저자는 낭 뜨에서 대학 병원 동물 시설 (UTE) 낭트의 축산 관리, 셀룰러 및 tissular 이미징, 낭트 대학 (MicroPICell)의 핵심 시설을 이미징에 대 한 그리고 Cytometry 시설 (Cytocell)의 직원을 감사 합니다. 대 한 그들의 전문 기술 지원. 이 작품은 INSERM, CNRS, 대학교 드 낭트, 인 국가 뒤 암 (잉카 #PLBio2014-155), 국가 리그 죄수 르 암 (AO 국제 2017), 그리고 유럽 컨소시엄 시대 Net Transcan2에 의해 투자 되었다 (Immunoglio). 팀은 Fondation 부 라 검색 Medicale (DEQ20170839118)에 의해 자금이 다. 이 작품은 LabEX IGO의 맥락에서 실현 하 고 IHU Cesti 프로그램에서 지 원하는는 국가 연구 기관 Investissements d'Avenir 통해 프로그램 ANR-11-LABX-0016-01 ANR-10-IBHU-005, 각각. IHU-Cesti 프로젝트도 낭트 메트로폴와 드 라 루아르 지역에 의해 지원 됩니다. 저자는 원고 수정에 도움을 제공 하는 Chirine Rafia 감사 합니다.

다음 절차와 관련 된 동물 과목 (계약 #00186.02; 지역 윤리 위원회는 드 라 루아르 [프랑스]의) 기관 지침에 따라 수행 되었다. 인간의 PBMCs 정보 건강 한 기증자 (Etablissement 프랑스어 뒤 상 낭트, 프랑스)에서 수집 된 혈액에서 분리 했다. 모든 단계는 무 균 조건 하에서 수행 됩니다.
1. 특정 세포 독성 효과 기 T 세포의 확장
<ol><li>준비 하 고 35 Gy에서 피더 세포를 비추는. 2 x 105 -4 x 105 effector 세포 자극에 대 한 세 가지, 건강 한 기증자 로부터 10 x 106 PBMCs 및 1 x 106 BLCLs을 준비 합니다.</li>
	<li>피더 세포와 RPMI 10% 열 비활성화 FCS, 2 mM L-글루타민, 페니실린 (100 IU/mL), 고 스 (0.1 µ g/mL) 및 300 IU/mL 재조합 일리노이-2와 보충의 15 mL에 이펙터 셀 resuspend.</li>
	<li>1 µ g/mL의 최종 농도에 PHA-L을 추가 하 고 신중 하 게 혼합, 96-잘 U 바닥 접시에 잘 당 세포 현 탁 액의 150 µ L를 배포.</li>
	<li>37 ° C에서 그리고 5% CO2 습도 분위기에서 품 어.</li>
	<li>큰 셀 묶습니다 문화 우물에서 때까지 접시를 매일 확인 (~ 7 일).</li>
	<li>1 x 106 셀/mL 신선한 문화 매체에서 문화 플라스 크로 셀을 전송 합니다.</li>
	<li>(주 2)를 계산 하 여 총 셀 수를 결정 하 고 신선한 문화 매체에 1 x 106 셀/mL에서 그들을 유지 합니다. 참고: 이펙터 면역 세포 휴식 상태 (초기 증폭 자극 후 보통 3 주)에서 치료 관리에 대 한 준비 되어야 합니다. 순도 이러한 효과 기 세포의 반응성 vivo에서 한 주사 (예를 들면, 생체 외에서 분석으로) 전에 검사 되어야 한다.</li>
</ol>2. 수술 Effector 세포 준비
<ol><li>이펙터 세포 수를 확인 한 후 원심 분리 (300 x g 5 분)에 의해 50 mL 튜브에 효과 기 세포를 수집 합니다. 참고: 모든 손실에 대 한 보상 (예를 들어, 50 x 106) 세포의 과잉 준비.</li>
	<li>조심 스럽게는 상쾌한을 제거 하 고 살 균 PBS와 300 x g 에 5 분 동안 원심 분리기 세척을 수행의 15 mL에 셀 resuspend.</li>
	<li>신중 하 고 완전히 제거는 상쾌한 하 고 메 마른 PBS의 1 mL에 다음 셀 펠 릿을 resuspend.</li>
	<li>5 분에 대 한 300 x g 에서 원심 분리에 대 한 1.5 mL microtube resuspended 셀을 전송 합니다.</li>
	<li>신중 하 고 완전히 천천히 pipetting 여는 상쾌한을 제거 합니다.</li>
	<li>마우스 마다 살 균 PBS의 8 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend. 참고:이 중요 한 단계입니다.</li>
	<li>micropipette를 사용 하 여 셀 서 스 펜 션의 볼륨을 측정 합니다. 필요한 경우 살 균 PBS (복용량 당 PBS의 15 µ L에서 20 x 106 셀)을 추가 하 고 신중 하 게 혼합.</li>
	<li>마우스 당 최종 볼륨 15과 20 μ (명령적 < 20 µ L) 사이 micropipette를 사용 하 여 확인 합니다.</li>
	<li>정위 적 주입까지 얼음에 셀을 계속. 참고: 이상의 3 h timepoints은 테스트 하지.</li>
</ol>3. 정위 적 주입
<ol><li>
장비 설정
	<ol>
<li>조립 하 고 intracranial 주사 (예를 들어, 주사기 크기, 원하는 볼륨 및 사출 속도)의 정확성을 보장 하는 제조업체의 지침에 따라 작은 동물 정위 적 프레임 보정. 참고: 느린 주입 속도 (즉, 2-3 µ L/min) 좋습니다.</li>
		<li>감염에서 미생물 안전 캐비닛 (MSC) 악기의 불 임을 유지 하 고 쥐를 보호 하기 위해 아래 자료를 설치 합니다. 참고: 장소 "등온선 진영" 37 ° c.에 물 목욕 이 시스템 수술 시 쥐의 저체온증을 제한 한다. 패드는 포스트 절차적 케어에 필요한 난방 지속적인 온도 모니터링 하는 동안 사용 해야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
수술 동물 준비
	<ol>
<li>케 타 민 (10mg/mL) 및 xylazine (0.1 mg/mL) 마우스의 몸 무게의 10 µ L/g의 복 주사와 마우스 anesthetize</li>
		<li>완전 한 마 취 및 진통 동물의 발가락 핀치 테스트를 수행 합니다. 참고: 모든 운동 비 깊은 진통의 표시 이며, 몇 분 작업을 반복 하기 전에 필요한 경우.</li>
		<li>일단 마우스 제대로 마 취가 위를 사용 하 여 (두 귀, 코까지) 사이 수술 사이트에서 모피를 제거.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
수술 세포 준비
	<ol>
<li>신중 하 게 resuspend는 피 펫 셀 (여러 번) 셀 응집을 방지 하기 위해 각 주입 전에.</li>
		<li>신중 하 게 거품의 열망을 피하기 위해 22-G microsyringe에 필요한 셀 서 스 펜 션 볼륨 (15-20 µ L)를 그립니다. 참고:이 셀 로드 단계는 microsyringe에는 주입 된 볼륨에 분산을 최소화 하는 것이 중요입니다. 셀 응집을 방지 하 고 이펙터 셀 관리는 일대에는 짝수를 위해 절차 사이 각 개별 주입에 대 한 셀을 다시 로드 합니다.</li>
		<li>그런 다음, 적응된 주사기 펌프에 주사기를 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
절차적 케어
	<ol>
<li>Povidone-요오드 5% 솔루션 적어도 3에에서 젖은 면봉으로 수술 부위의 소독 x.</li>
		<li>어떤은 각 막의 건조를 방지 하기 위해 마우스의 눈에서 윤 활 안과 연 고를 배치 합니다.</li>
		<li>위치는 따뜻한 등온선 블록에 정위 적 프레임에 마 취 마우스 수술 하는 동안 마우스의 온도 유지 하 고 사망률을 제한 하는 살 균 플라스틱 포장으로 커버. 참고: 마우스의 코 그리고 치아 해야 적절 하 게 배치 절차 중 적절 한 호흡기 흐름을 보장 하기 위해 치아 바 위에.</li>
		<li>일단 치아 바 위에 마우스를 위치 귀 바 머리를 고정 하는 마우스의 귀 아래 단단히 조입니다. 참고: 고 막 손상 하지 또는 호흡 타협 다는 것을 주의 하십시오.</li>
		<li>후부는 두개골을 폭로 앞쪽에서 두개골의 상단 부분을 따라 살 균가 위는 1-2 cm 중간 화살 피부 절 개를 확인 합니다.</li>
		<li>화살과 코로나 봉합 (Bregma) ( 그림 1참조) 주입 전에 정위 적 지역화에 대 한 랜드마크로 서 역할을 교차로 식별 합니다.</li>
		<li>이 이때 위의 microsyringe를 놓습니다.</li>
		<li>Microsyringe 오른쪽 측면 2 m m와 0.5 m m는 Bregma의 앞쪽을 이동 합니다.</li>
		<li>microdrill를 사용 하 여 미리 결정 된 좌표에 살 균 드릴 비트와 함께 두개골에 작은 구멍을 확인 합니다. 두뇌의 어떤 외상 성 상해를 피하기 위하여 표면 유지 주의 해야 합니다. 참고:이 프로토콜에 면역 세포는 설립된 종양 (종양 세포 주입 후 1 주일) 내 주입 했다. 피부 되어야 재개 (흉터) 및 사출 (구멍은 일반적으로 주사 후 2 주까지 여전히 존재) 종양 세포 이식에 사용 되는 같은 좌표에서 수행 됩니다. 좌표는 뇌 실질13,14에서 종양과 effector 세포를 주입에 대 한 선정 됐다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
면역 효과 기 세포의 주입
	<ol>
<li>조심 스럽게 드릴된 된 구멍에는 microsyringe를 삽입 하 고, 경질에서 아래로 3mm 고 효과 기 세포를 주입 하기 전에 2.5 m m의 최종 깊이를 다음 뒤로 0.5 m m 바늘을 앞으로 천천히 이동.</li>
		<li>2-3 µ L/분 effector 세포 주입을 실행 하 고 주입 시간 따라 마우스를 모니터링.</li>
		<li>주입이 완료 되 면만 1 m m의 바늘을 철회 하 고 천천히 주입 사이트에서 어떤 누설을 방지 하기 위해 microsyringe을 완전히 철수 하기 전에 추가 분 자리에는 microsyringe를 유지. 참고: 정위 적 장치에서 동물의 제거 다음 즉시 곧 실험에 대 한 주입 장비 청소.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
수술 치료 및 마우스의 후속
	<ol>
<li>정위 적 프레임에서 동물을 제거 하 고 즉시 povidone-요오드 5% 솔루션 절 개 사이트에 적용 하 고 적절 한 수술 치료와 피부를 닫습니다.</li>
		<li>상처에 직접 2 %lidocaine 젤을 적용 하 고 0.15 µ g/g buprenorphine의 사후 절차 진통에 대 한 피하 주입에 의해 관리.</li>
		<li>적절 한 마우스 체온을 유지 하 고 어떤 저체온증을 피하기 위해 장소 다시 마 취 마우스 난방 패드 위에 그것의 감 금 소를 37 ° C로 설정 합니다. 참고: 별도 주거 필요는 없습니다.</li>
		<li>그것은 완전히 마 취에서 회복 될 때까지 마우스를 모니터 하 고 주택 룸에 그것을 전송. 참고: 날짜,이 프로토콜은 잘 지원 몇 외 합병증 발생 (주입 된 쥐의 < 5%)으로.</li>
		<li>매일 쥐를 모니터링 하 고 어떤 감소 건강 징후 (예를 들어, 돌출된 자세, 감소 이동성, 의식, 또는 중요 한 몸 무게 감량 [≥ 15%]) 관찰 하는 때 그들을 안락사.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

입양 전송 선정 네이티브 또는 조작된 면역 효과 기 세포 효율적으로 제한 비 변형 세포15에 대 한 reactivities의 infiltrative 뇌 암 같은 종양을 치료 하는 유망한 접근 방식을 나타냅니다. 16,,1718. 그러나, 중앙 신경 조직, 두뇌를 구성 하는 혈액-뇌 장벽의 존재와 고아 한 림프 배수 시스템19,20의 부족 때문에 특히 특정 면역 상태. 이러한 생리 적 기능 조직 인신 매매에 영향을 하 고 면역 세포의 조직 주사를 손상 수 있습니다. 극복 하기 위해 이러한 hindrances, intraparenchymal 주사 antitumor 셀 배달 되는 대신 로컬로, 약리 화...

GBM (누가 학년 4 astrocytoma), 성인에서 가장 자주 하 고 공격적인 주 뇌 암 이다. 수술과 라디오 화학 요법을 결합 하는 적극적인 치료에도 불구 하 고 GBM는 매우 빈약한 예 지 (14.6 개월 및 2 년 사망률 > 73%의 메디아 생존)1와 관련 남아 있습니다. 이 몇 가지 효율적인 치료 발전2지난 10 년 동안 검증 된 증거. 더 효과적인 치료 전략3,,45의 디자인에 대 한 후보자, 중 immunotherapies6 현재 탐험 추적 하 고 매우 침략과 라디오/항 암 치료-방지 종양 제거 셀, 신속 하 고 치명적인 종양 재발7에 그들의 주요 기여에 대 한 의심. 다양 한 잠재적인 면역 목표 식별 및 제안 immunotherapies, 자연 관련 된 또는 수정 된 αβ 또는 GBM 특정 종양 항 원 등 스트레스 유발 분자8,9, ϒδ T 림프 톨 했다 10. 선택한 GBM 반응 면역 세포 이펙터 관리 가능성 잔여 악성의 사이트에 직접 효과 기 림프 톨의 높은 금액을 제공 하는 독특한 기회를 나타냅니다. 이 전략을 지원 하기 위해 우리가 최근에 나타났습니다 orthotopic 기본 인간의 GBM xenografts를 충실 하 게 수행 하는 immunodeficient 마우스에 따라 모델 GBM 환자9,11에서 뇌 종양의 개발을 정리. 또한, 이러한 모델 adoptively 전송된 수용자 인간 Vϒ9Vδ2T 림프 톨의 강한 antitumor 효율을 보여 주기 위해 사용 되었다.
이 프로토콜 GBM, 수용자 T 림프 톨의 입양 이동에 따라 같은 뇌종양의 정위 적 immunotherapies를 달성 하기 위한 중요 한 실험 단계를 설명 합니다. 문서 쇼: (i) 인간 림프 톨 Vϒ9Vδ2T; 같은 치료 수용자 면역 효과 기 T 세포의 증폭 (ii) 분사;에 대 한 이러한 이펙터 T 림프 톨의 준비 (뇌 종양 근처에서 정위 적 관리를 위한 절차 iii). 이 문서는 또한 정위 적 주입 후 이러한 셀룰러 이펙터의 동작에 대 한 통찰력을 제공합니다.
여기에 제시 된 치료 방법은 20 x 106 effector 세포 당 복용량의 각 뇌 종양 베어링 immunodeficient 마우스에 대 한 주입을 기반으로 합니다. 초기 생체 외에서 확장 단계는 면역 세포의 대량 생산 해야 합니다. 따라서, 일반적인 셀 확장 phytohemagglutinin (PHA-L)를 사용 하 여 수행 됩니다 및 수용자 피더 세포 반구: 건강 한 기증자와 엡 스타인 바 바이러스 EBV 변형 B lymphoblastoid 셀에서 주변 혈액 단 세포 (PBMCs) 라인 (BLCLs), 포함 하는 EBV 문화 비단 B95-8 셀 라인 1 µ g/mL cyclosporin A의 존재에서 표면에 뜨는 생체 외에서 감염에 의해 PBMCs에서 파생 된
GBM 반응 이펙터 면역 세포는 비교 하 고 분석 실험 체 외에 9에서 선택. 이러한 효과 기 세포 활성화 되 고 증폭 된 표준 프로토콜을 사용 하 여 (예를 들어, 인간의 Vγ9Vδ2 T 림프 톨9 또는 인간 항 헤 르 페 스 바이러스 αβ T 림프 톨12) 그들의 성격에 따라 정기적으로 > 80%의 최소 순도와 cytometric 분석에 의해 확인. 아래 상세한 셀 확장 프로시저는 다양 한 인간 림프 톨 부분 집합에 적용 됩니다.

<table><tbody><tr><td>3명의 건강한 기증자의</td> <td>PBMC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3명의 다른 기증자의</td><td>BLCL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute 매체(RPMI)</td><td>Gibco</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Dutscher</td><td>S1810-500</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>IL-2</td><td>Novartis</td><td>proleukin</td><td></td></tr><tr><td>PHA-L</td><td>시그마</td><td>L4144</td><td></td></tr><tr><td>입체 프레임</td><td>Stoelting Co.</td><td>51600</td><td></td></tr><tr><td>입체성 프레임용 마우스 어댑테이터&nbsp; &nbsp;</td><td>Stoelting Co.</td><td>51624</td><td></td></tr><tr><td>마이크로주사기 펌프 인젝터&nbsp;</td><td>WPI</td><td>UMP3-4</td><td></td></tr><tr><td>NanoFil 주사기</td><td>WPI</td><td>NF34BV-2</td><td></td></tr><tr><td>NSG 마우스</td><td>Charles River</td><td>NSGSSFE07S</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Merial</td><td>Imalg&egrave; ne 1000</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>바이엘</td><td>Rompur 2 %</td><td></td></tr> <tr><td>가위</td><td>WPI</td><td>201758</td><td></td></tr><tr><td>집게</td><td>WPI</td><td>501215</td><td></td></tr><tr><td>OmniDrill 115 / 230V</td><td>WPI</td><td>503598</td><td></td></tr><tr><td>Vicryl 4-0</td><td>Ethicon</td><td>VCP397H</td><td></td></tr><tr><td>Xylocaine</td><td>Astrazeneca</td><td>3634461</td><td></td></tr></tbody></table>

정위 적 입양 전송 orthotopic 인간 세포종 님 xenografts murine 모델에서 세포 독성 면역 세포의

Stereotactic Adoptive Transfer of Cytotoxic Immune Cells in Murine Models of Orthotopic Human Glioblastoma Multiforme Xenografts

세포종 님 (GBM), 성인에서 가장 자주 하 고 공격적인 주 뇌 암은 일반적으로 빈약한 예 지와 연결 하 고 지난 10 년간 부족 한 효율적인 치료 제안 되었습니다. 새로운 치료 전략을 디자인 하기 위한 유망한 후보자 중 세포 immunotherapies는 높게 침략 적 제거 하 표적이 되었습니다 및 항 암 치료-radioresistant 종양 세포, 가능성이이 암의 신속 하 고 치명적인 재발 있습니다. 따라서, 종양 주변 인간 Vϒ9Vδ2 T 림프 톨 같은 수용자 GBM 반응 면역 세포 이펙터의 administration(s) 것이 효율적 제공 하는 독특한 기회 나타내고 고도로 집중에 직접 치료제를 뇌 악성 사이트입니다. 여기, 선물이 orthotopic 인간의 기본 뇌 종양을 들고 immunodeficient 마우스에 준비 및 수용자 인간 림프 톨의 stereotaxic 관리에 대 한 프로토콜. 이 연구는 타당성과 intrabrain 종양 침대에서 수용자 인간 림프 톨의 정위 적 주사에 의존 하는 이러한 세포 immunotherapies의 antitumor 효능에 대 한 전 임상 증거의 개념을 제공 합니다.

이 연구는 종양 침대 내에서 직접 수행 하는 정위 적 주사에 따라 종양을 들고 쥐의 뇌 내 세포 면역 효과 기 세포의 입양 전송의 전략을 설명 합니다.
큰 사출 량과 관련 된 뇌 손상의 모든 위험을 최소화 하려면 effector 세포 현 탁 액 (20 x 106 셀 PBS의 15-20 µ L에) 집중 될 필요가 있다. 이 셀 농도 단계 효과 기 세포의 생존에 영향을 미칠 수 여부를 확인 하려면이 셀 설명된 프로토콜에 따라 준비 하 고는 microsyringe에 로드 된 했다. 효과 기 세포는 microsyringe에 그들을 로드 후 즉시, 또는 10 분을 수집 했다. 셀은 propidium 요오드 화물 (PI)은 세포를 라이브 permeant cytometry 다른 timepoints (0, 24, 그리고 72 시간)에 의해 분석 된 형광 DN...

여기, 선물이 orthotopic 인간의 기본 뇌 종양을 들고 immunodeficient 마우스에 준비 및 수용자 인간 림프 톨의 stereotaxic 관리에 대 한 프로토콜. 이 연구는 타당성과 세포 immunotherapies intrabrain 전달의 antitumor 효능에 대 한-의 증거-개념을 제공합니다.

정위 적 입양 전송 Orthotopic 인간 세포종 님 Xenografts Murine 모델에서 세포 독성 면역 세포의

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce ...

다형 교모세포종은 성인에서 가장 빈번하고 공격적인 원발성 뇌종양으로 남아 있습니다. 수술 후 방사선 및 화학 요법을 통한 적극적인 치료에도 불구하고 다형성 교모세포종은 예후가 매우 좋지 않고 생존 기간 중앙값이 15개월 미만인 것과 관련이 있습니다. 지난 10년 동안 치료법의 발전이 거의 이루어지지 않았기 때문에 현재 세포 면역 요법은 빠른 종양 재발에 관여할 가능성이 있는 고도로 침습적이고 내성이 있는 교모세포종 세포를 제거하기 위해 연구되고 있습니다.종양 인근에서 선택된 GBM 반응성 세포독성 면역 인자를 투여하는 것은 잔류 악성 종양 부위에 직접 농축 세포 면역 요법을 제공할 수 있는 독특한 기회가 될 수 있습니다. 우리 그룹은 최근 orthotopic primary human GBM xenograft를 가진 면역 결핍 NSG 마우스가 GBM을 환자에서 더 많이 발달시키는 것으로 요약한다는 것을 보여주었습니다. 이러한 교모세포종 모델은 종양내 주사에 대한 세포독성 면역 효과기의 효능을 평가하는 데 사용되었습니다.이 프로토콜은 먼저 GBM 반응성 면역 효과기 세포의 분리 및 증폭을 기반으로 하는 치료 과정을 설명합니다. 둘째, 두개간 주사를 위한 이러한 효과기 세포의 증식입니다. 셋째, 쥐의 뇌 내 종양 부위에 대한 정위 주입입니다.정소주사 후 면역 효과기의 거동도 조사했습니다. PHA 태아 자극 3주 후, 플라스크 바닥에 세포 덩어리를 형성하는 효과기 세포는 휴지 상태로 돌아가 사용할 준비가 되었습니다. effector cell count를 확인한 후 115ml tube에 세포를 재현탁 및 채취하고 원심분리합니다.상층액을 조심스럽게 완전히 제거하십시오. 그리고 멸균 PBS와 원심분리기에 세포를 재현탁시켜 세척합니다. 상등액을 조심스럽게 완전히 제거하십시오.그런 다음 1ml의 멸균 PBS에 세포를 재현탁합니다. 원심분리를 위해 마이크로튜브에 세포를 전달합니다. 다시 말하지만, 천천히 피펫팅하여 상층액을 조심스럽게 완전히 제거합니다.다음 단계는 매우 중요하며, 멸균 PBS의 최종 부피의 절반에서 세포를 재현탁하고 부드럽고 조심스럽게 균질화합니다. 마이크로피펫으로 최종 부피를 확인하고, 마우스당 최종 부피는 2,000만 개의 세포에 대해 15-20마이크로리터여야 합니다. 마우스당 20마이크로리터를 초과하지 않는지 확인하십시오.주입할 때까지 세포를 얼음 위에 두십시오. 동물이 발가락 꼬집기로 적절하게 마취되었는지 확인한 다음 수술 부위, 양쪽 귀 사이, 코까지 털을 제거합니다. 세포가 뭉치는 것을 방지하기 위해 세포를 천천히 재현탁시키고 기포가 발생하지 않도록 각별히 주의하면서 세포 현탁액을 주사기에 로드합니다.그런 다음 주사기를 개조된 주사기 펌프에 넣습니다. 수술 부위를 소금과 포비돈 요오드 5% 용액으로 소독하고 쥐의 눈에 윤활 안과 연고를 발라 각막의 건조를 방지합니다. 그런 다음 마취된 마우스를 따뜻한 블록의 정위 프레임에 놓습니다.마우스의 코와 이빨을 치아 막대 위에 적절하게 배치합니다. 머리를 고정하기 위해 마우스 귀의 이어바를 단단히 조입니다. 고막이 손상되지 않도록 주의하고, 호흡을 방해하지 않도록 주의하고, 머리가 잘 움직이지 않도록 하십시오.두개골 윗부분을 따라 멸균 가위로 정중선 시상 피부를 절개하여 두개골을 노출시킵니다. 정위 국소화를 위한 랜드마크 역할을 할 시상 구조와 관상 구조의 교차점을 식별하고 이 지점 위에 주사기를 놓습니다. 미리 결정된 좌표에서 주사기를 움직입니다.오른쪽 측면 2mm, 전방 0.5mm 마이크로드릴을 사용하여 멸균 드릴 비트로 두개골에 작은 구멍을 뚫습니다. 뇌 손상을 방지하기 위해 피상적인 상태를 유지하도록 주의하십시오. 천공된 구멍에 주사기를 조심스럽게 삽입합니다.경막에서 바늘을 3mm 아래로 천천히 앞으로 이동한 다음 0.5mm 뒤로 0.5mm 이동하여 2.5mm 세포 주입의 최종 깊이로 이동합니다. 분당 2μL 또는 3μl의 속도로 세포 주입을 실행하고 주입 시간 내내 마우스를 모니터링합니다. 주입이 완료되면 바늘을 1mm 정도만 빼고 주사기를 1분 더 제자리에 두었다가 주입 부위에서 누출을 방지하기 위해 주사기를 천천히 완전히 빼냅니다.정위 프레임에서 동물을 조심스럽게 제거하십시오. 적절한 외과용 봉합사로 피부를 봉합하고 2% 리도카인 젤을 상처에 직접 바릅니다. 마취된 마우스를 섭씨 37도로 설정된 가열 패드 위의 해당 케이지로 옮겨 마취에서 완전히 회복될 때까지 적절한 마우스 체온을 유지합니다.현탁액이 매우 농축되어 있기 때문에 세포 생존율과 반응성을 확인했습니다. 효과기 세포는 생체 내 주입을 모방하기 위해 주사기에 적재되었습니다. 세포를 즉시 또는 10분 후에 수집하여 프로피듐 요오드화물 염색을 위해 유세포 분석으로 분석했습니다.보시다시피, 준비와 로딩은 24시간 시점에 effector cell의 생존력에 영향을 미치지 않았습니다. 교모세포종 종양 세포에 대한 반응성도 준비되지 않은 세포 또는 효과기를 사용하여 확인하고 3시간 동안 눈에 유지했습니다. 반응성은 활성화 마커 CD107A의 양성 염색에 의해 모니터링됩니다.이러한 결과는 효과기 세포의 반응성이 제제에 의해 영향을 받지 않았음을 보여줍니다. effector 세포를 주입한 지 7일 후, 종양 구조를 확인할 수 있도록 쥐의 뇌를 채취하여 절단하고 혈관 착색을 위해 염색했습니다. 그런 다음 항인간 CD3 염색을 통해 effector 세포의 국소화를 허용했습니다.흥미롭게도, 효과기 세포는 종양 주변과 종양 코어에서 발견되었지만, 반대쪽 반구에서도 발견되었습니다. 주입 후 48시간 후 마우스 뇌에서 분리된 인간 effector T 세포는 뇌 세포의 2%를 나타냅니다. 그들은 PHA, 공급기 및 IL2 자극이 있는 곳에서도 여전히 증식할 수 있었으며, 증폭 후 순도는 99%였습니다.이 프로토콜 덕분에, 휴면 중인 인간 효과기 세포는 입체주사 후 며칠 동안 쥐의 뇌 실질로 생존하고 순찰할 수 있습니다. 결론적으로, 정위 주사에 의한 인간 효과기 세포의 채택 이식은 건강한 세포에 대한 해로운 영향이 제한된 침윤성 악성 뇌종양을 효율적으로 치료할 수 있는 유망한 접근 방식을 나타냅니다. 이러한 투여 경로는 인간 세포가 종양 부위에 밀접하게 전달되어 조직과 유기체 내에서 희석되는 것을 제한한다는 이점을 이용합니다.여기에서는 효과기 세포에 해로운 영향 없이, 그리고 중요하게는 생쥐에 대한 눈에 띄는 해로운 영향 없이 뇌종양 내에서 많은 양의 면역 세포를 전달하는 절차에 대해 설명했습니다. 더욱이, 쥐의 뇌에 국소적으로 주입된 면역 세포는 생존할 수 있을 뿐만 아니라 생체 밖에서 활성화 및 증폭되는 능력을 유지할 수 있을 뿐만 아니라 주변 뇌 조직에 퍼진 종양 세포를 제거할 수 있습니다. 총체적으로, 이러한 특징은 교모세포종 종양을 특징짓는 강력한 침윤성 종양 세포를 제거하는 데 필수적입니다.이 프로토콜은 뇌종양 마우스 모델에서 입양 이식 절차를 확립할 수 있는 새로운 기회를 열어줍니다. 임상 CD를 고려하기 전에 반드시 해야 할 단계입니다.

stereotactic-adoptive-transfer-cytotoxic-immune-cells-murine-models

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

우리는 누드 마우스 및 이후 일련의 뇌에 인간 glioblastoma multiforme의 세포의 정확한, stereotactic 주입을위한 통합 방법을...

Stereotactic Intracranial 주입 및<em&gt; 생체에</emGlioblastoma의 Multiforme의 마우스 모델 시스템에서 종양 Xenografts의&gt; 발광 생물 이미징

이 비디오는 인간 뇌종양을 운반하는 쥐 모델에 인간 효과기 T 림프구를 투여하는 입체 주사 기술을 보여줍니다. 종양이 있는 마취된 마우스를 정위 프레임에 배치하고 두개골의 주입 위치에 버 구멍을 만들면 종양 부위에 effector T 림프구를 주입합니다.

Effector T 림프구를 인간 뇌종양을 운반하는 마우스에 전달

악성 글리오마스는 뚜렷한 임상 및 분자 특징을 가진 고도로 침입된 신경교 신생물의 이질적인 그룹을 구성합니다. 1 차 성 치열 교정 이종이식은 전임상 동물 모델에서 악성 신경종 아류형의 조직 병리학 및 분자 특징을 재구성합니다.

1차 성우 성안 성액 제노이식은 침투 성장을 재구성하고 탈수소 효소 I 돌연변이를 이소염시분해합니다.

플록스, 조건부 발암성 대립유전자로 조작되고 바이러스 Cre 매개 재조합을 통해 형질전환된 마우스에서 채취한 표현형 야생형 성상세포와 신경 줄기세포는 syngeneic, immune-competent littermate의 뇌에 형질전환된 세포의 orthotopic 주입에 의해 in vitro 및 in vivo에서 성상세포종 발병기전을 모델링하는 데 사용할 수 있습니다.

모델링 성상 세포종 병인 체외와 생체 대뇌 피질의 성상이나 조건, 유전자 조작 쥐에서 신경 줄기 세포를 사용하여

뇌는 잘 시험관이나 자궁외 분석으로 표시되지 않은 자질을 가진 유일한 사이트입니다. 위치 재현성과 성장 특성 정위 마우스 모델을 확실 정위 고정기구 및 저압 주사기 펌프를 사용하여 두개 내 주사로 생성 될 수있다.

만들기 해부학 적으로 정확하고 인간의 두뇌 종양의 재현 두개 내 이종 이식

화학요법 및 방사선 표준 치료의 림프구 정지 및 면역 조절 효과를 활용하여 T 세포 면역 요법의 항종양 효능을 향상시킬 수 있습니다. EGFRvIII 특이적 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포를 생성하고 교모세포종 표준 치료의 맥락에서 투여하는 방법을 설명합니다.

배려의 아교 모세포종 표준의 맥락에서 입양 치료에 대한 자동차 T 세포의 생성

종양을 추구 치료 중간 엽 줄기 세포 (MSCs) 침략 세포종에 대 한 치료로 서 약속을 보여줍니다. 최적의 이식 건설 기계에 종양 절제술 구멍으로 MSCs의 납품을 포함 한다. 여기, MSC 세포종의 치료를 공부 하기 전 임상 기술을 포함 하 여 제공 됩니다: 이미지 기반 종양 절제술; 주입 장비의 MSC 시드; 그리고 수술 후 치료 추적입니다.

세포종과 치료 줄기 세포 시드 장비의 Intracranial 주입의 이미지 기반 절제

여기에서 우리는 유전자 조작 마우스 모델 종양에서 파생된 세포의 두개내 주입에 의해 확립된 GBM에 대한 전임상 동소 마우스 모델을 설명합니다. 이 모델은 인간 GBM의 질병 특징을 표시합니다. 중개 연구를 위해 마우스 뇌종양은 생체 내 MRI 및 조직병리학에 의해 추적됩니다.

다형성 교모세포종의 번역 동소 모델

정형소 소아 뇌종양 모델의 개발에는 암세포를 정밀하게 이식하기 위해 입체 장치를 사용하는 세심한 정밀도가 필요합니다. 여기에 제시된 방법론은 뇌종양 세포를 준비하고, 두개내 주사를 수행하고, 뇌종양 생착을 평가하기 위한 수술 후 모니터링 시스템을 구현하는 것과 관련된 단계를 간략하게 설명합니다.

Stereotaxic Device를 이용한 뇌종양에 대한 Orthotopic Patient-derived Xenograft Models 구축

교모세포종은 파괴적인 형태의 원발성 뇌암이며, 레이저 간질성 열 요법은 수술이 불가능한 교모세포종에 대한 기존 외과적 절제술의 유망한 대안으로 부상하고 있습니다. 이 프로토콜은 치료 효과 또는 보조 및 조합 치료를 연구하는 데 사용할 수 있는 최적화된 전임상 마우스 모델을 설명합니다.

교모세포종의 레이저 간질성 열처리 치료를 위한 면역 역량 있는 쥐 모델

이 프로토콜의 목표는 연구자들에게 두개내 이식에 대한 고재현 기술을 제공하는 것입니다.

쥐에서 교모세포종 환자 유래 이종이식 세포주의 입체정위 두개내 이식

배우세요 교모세포종 치료를 위한 세포독성 면역세포의 정위적 이입 전송 방법을 면역결핍 NSG 마우스 모델에서. 이 프로토콜은 뇌종양 내 면역세포 주사의 생존성과 항종양 효능을 입증합니다.

정위 적 입양 전송 Orthotopic 인간 세포종 님 Xenografts Murine 모델에서 세포 독성 면역 세포의

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