Name: 정 맥 및 양수 내 Utero Murine 모델에 이식 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: 배우세요 정맥 및 양수 내 자궁 내 이식 기법으로 마우스 태아에 세포와 바이러스 벡터를 도입하는 방법. 이 면역관용 환경에서 발생생물학 및 유전자 치료 연구를 수행할 수 있습니다.

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실험 프로토콜 기관 동물 관리 및 사용 위원회 필라델피아의 아동 병원에 의해 승인 되었다.
1입니다. 사출 펫의 창조
<ol><li>수직 micropipette 끌어당기는 사람을 사용 하 여 100 µ L microcapillary 피 펫 (그림 1A -1c)을 당겨. 테이퍼 끝입니다 > 1 ㎝ 길이 micropipette 끌어당기는 보정. 참고: 처음, 끌어당기는의 설정은 조정 해야 최적의 길이. 높은 열 설정 팁, 더 이상 만들고 높은 풀 설정 팁의 직경을 좁은 만들 것입니다.</li>
	<li>≥ 1 ㎝ 길이 테이퍼 끝을 잘라. 그 바늘의 끝에 내부 직경 70 µ m, 100 µ m 사이 이며 테이퍼 끝의 길이에 반비례 하는 것을 확인 하십시오. 참고: 내부 직경은 또한 micropipette 끌어당기는의 교정에 따라 다릅니다. 수직 micropipette 끌어당기는 사람 또는 선호 micropipette 끌어당기는 종류의 제조업체에서 지침을 참조 하십시오.</li>
	<li>바늘 올바른 내부 직경은 확인 한 후 다이아몬드 휠 (그림 2A -2 C) 선명 micropipette beveller를 사용 하 여 팁을 연마 하 여 15-20도 빗면을 만듭니다. 부드럽게 하거나 팁을 크래킹의 기회를 감소 하, 너무 많은 압력 없이 바퀴에 팁을 확인 하십시오. 참고: 그림 붓 바늘 팁에 어떤 파편 든 지 멀리 닦기 위하여 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>현미경 아래 팁을 평가 하 고 팁이 칩 또는 균열 없이 라운드 합니다. 70 µ m, 100 µ m (그림 2D -2 H) 사이 되도록 내부 직경을 다시 평가 합니다.</li>
	<li>그들 사이의 볼륨의 5 µ L을 지정 하는 바늘의 나머지 부분에 선을 그릴 (예를 들어, 1.3 m m 내부 직경 바늘 있어야 3.77 m m 증가에서 그린 라인).</li>
	<li>압력솥 바늘 이전에 수술에 사용 하 고 멸 균 장갑과 그들을 처리.</li>
</ol>2. utero에서 주사
<ol><li>준비 필요한 계측 압력가 마로 소독 하 여 그들 미리. Microinjector 바늘 홀더, 수술 바늘 드라이버, 한 쌍 Adson 집게, 곡선된 정규 조직 위, 1 mL 인슐린 주사기, 몇 면 끝 도포, 전송 피 펫, 50 mL 원뿔 튜브의 한 쌍의 필수 악기를 포함 한 고 4-0 polyglactin 910 봉합의 팩입니다.</li>
	<li>무 균 기술을 사용 하 여, 바늘 홀더에 바늘을 부착 하 고는 microinjector에 그것을 연결. 참고: 사용 하는 압축 된 질소의 설정은 뒤: 4-6 psi를 주입, 0 psi를 균형. 무엇은 주입 되 고, 특히, injectate의 점도 물론 micropipette의 크기에 따라 주입 시간 0.3-사이 다 1.5 s.</li>
	<li>인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 살 균 1의 5-10 µ L을 다음 밖으로 그것을 선택을 취소 하 여 모든 가능한 파편의 바늘 팁을 청소 합니다. 이 2-3 배를 반복 합니다.</li>
	<li>그들의 인체 깎기로 면도 하 여 수술에 대 한 임신 2-6 개월 여성 쥐를 준비 합니다. 수는 젖꼭지를 손상 하지 않도록 주의 하십시오. 구강 진통제 (예를 들어, 1.5 m g/mL meloxicam 구두 현 탁 액의 마우스 당 100 µ L)를 관리 합니다.</li>
	<li>원하는 볼륨에 원하는 자료 (셀/벡터/약)와 바늘을 작성을 시작 합니다. 바늘을 작성 하는 동안 바늘 팁을 깰 조심 해야. 참고: 태아 당 주입의 볼륨 특정 실험 설계에 따라 다릅니다. 20 µ L 작품 잘 주입 많은 수의 셀 (즉, vitelline 정 맥으로 107 셀까지. 예를 들어, 우리는 1 x 107 전체 골 수 세포 C57BL/6TgN(act-EGFP) OsbY01에서 격리를 전달 ["B6 녹색 형광 단백질 (GFP)"] 생쥐를 통해 임신 하루 14 Balb/c 태아로 vitelline 정 맥. 바이러스 성 벡터 주사, PBS와 1:1 희석된 벡터의 10 µ L의 단일 주사를 잘 작동합니다.</li>
	<li>사출 시간을 보정 하기 위해 다음 단계를 수행 합니다.<ol>
<li>밀어넣기 모드 단추 주입 보정 화면을 microinjector에 3 배. 10의 간격을 추가 하 여 주입 시간을 조정 하거나 100 ms와 푸시 모드 버튼 2 배.</li>
		<li>균형 버튼 하 고 한 번 발 페달을 밀어. 이제 다시 페달을 밀어 하 고 얼마나 많은 볼륨 푸시 당 바늘에서 비운 평가. 원하는 볼륨 페달 푸시 당 5-20 µ L의 보정 하지, 2.6.1과 2.6.2 단계를 반복 합니다. 참고: 일반적으로, 그것은 한 번에 제공 하는 반 총 대상 볼륨을 각 푸시를 보정 좋은입니다. 30 µ L의 총 볼륨도 40 µ L를 주입 수 있지만 우리가 일반적으로 가지 마세요 정 맥 또는 양수 내 태아 당 20 µ L 이상.</li>
	</ol></li>
	<li>원하는 수준까지 바늘을 입력 합니다.</li>
	<li>1 L/min에 산소 유량 계 및 isoflurane 기화 기 3%로 조정 하 여 마우스에 마 취를 제공 시작 합니다.</li>
	<li>마우스 페달 반사의 부재에 대 한 확인 하 여 마 취 여부를 확인 합니다. 부정사 위치에 난방 패드를 마우스를 전송 합니다.</li>
	<li>각 막 건조를 피하기 위해 윤활제 아이 젤을 적용 합니다. 패드에 위와 더 낮은 사지를 찍고 여 장소에서 마우스를 보안 합니다.</li>
	<li>뒤에 알코올 액체 스크럽으로 복 부를 준비 하 고 (예를 들어, 0.25 %bupivacaine 100 µ L) 로컬 마 취를 피하 주사 (그림 3A).</li>
	<li>가 위, 낮은 테두리는 더 치; 1 ㎝ 보다 가까이 1-2 cm 피부 절 개를 하 게 아래 근 막이 매우 얇은 하 고 반투명.</li>
	<li>주변 지역 보다 더 투명 하 게 하는 근 막의 중간을 식별 합니다. 수는 midline의 양쪽에는 상 복 부 혈관을 다치게 하지 않도록 주의 하십시오. 상 복 부 혈관 부상을 얻을, 출혈을 멈추게 하 면 끝 도포와 압력을 개최.</li>
	<li>창 자, 방광, 또는 태아 등 내부 장기의 잡는 없이 근 막 꼬집어 Adson 집게를 사용 하 여. 가 위, 장기의 손상 되지 않도록 주의 되 고 근을 엽니다. 일단 안전 하 게 복 부에 확장 fascial 절 개. 피부 절 개 보다 더 이상 그것을 만들.</li>
	<li>따라서 노출 벗 자 궁 복 부의 위쪽 부분에 내장을 이동 면 끝 도포를 사용 합니다. 절 개, 신중 하 게 식별 하는 모든 태아 (그림 3B) 계산 되도록 오른쪽과 왼쪽 난소에서 자 궁을 제공 합니다.</li>
	<li>에 배치 하 왼쪽된 자 궁 복 부에 다시 오른쪽 자 궁만 노출 됩니다. 이 자 궁의 건조를 방지 하 고 따뜻한 비 주입 태아를 유지 합니다.</li>
	<li>엄지 및 집게 손가락의 운영자의 비 지배적인 손 (그림 3C) 사이 가장 측면 태아/양수 sac를 개최. 항상 하지는 태아에 어떠한 손상으로 부드러운 됩니다.</li>
	<li>(10 배 확대 이상적입니다) 해 부 현미경 놓고 태아가 보기에 초점을 조정 합니다. 더 나은 시각화에 대 한 조명을 조정 합니다.</li>
	<li>주입 됩니다 부품 파악 (vitelline 정 맥, amnion). 정 맥 주사, 시각화 vitelline 혈관과 문 합 그들의 처음. 양수 내 주사, 보기에 오른쪽으로 태아를 방향을 정하십시오.</li>
	<li>아래 설명 된 대로 바늘 대상 공간에 도달 합니다.<ol>
<li>정 맥 주입, 다음과 같이 할.<ol>
<li>주입 되는 vitelline 정 맥; 바늘의 팁에 평행 되도록 자 궁을 회전 주사의 두 정 맥 문 합으로 만들 수 있어야 합니다 유의 하십시오.</li>
			<li>5 ° 각도에서 자 궁에 바늘을 자 궁 벽을 관통. 이제는 끝 자 궁 벽과 양수 골목 사이, vitelline 정 맥 위에 직접 팁을 놓습니다.</li>
			<li>거의 탄젠트 각도에 날고 바늘 정 맥 경사 pierces; 혈관으로 이동 될 때까지 이것은 바늘 팁 (그림 3D)에서 혈액의 플래시에 의해 분명 하다입니다. 참고: 바늘 하지 정 맥을 통해 첫 번째 글라이드와 함께 정 맥을 뚫 수 있습니다 대로 몇 가지 시도 걸릴 수 있습니다 액세스 하는 정 맥.</li>
		</ol>
</li>
		<li>양수 내 주입, 다음과 같이 할.<ol>
<li>Amniotic sac를 피어스 용기 없는 위치를 찾습니다.</li>
			<li>자 궁 벽에 수직으로 바늘을 가리키고 자 궁, 노 른 자 삭 그리고 amniotic sac 통해 피어스. 조심 하지 어떤 태아 조직을 통해 피어스 합니다. 바늘이 바늘 amniotic sac에 인지 확인 하는 대로 사지 사이 통과 했다 다는 것을 확인 하십시오. 주사와 함께 진행 됩니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>발 페달을 추진 하 여 자료 원하는 (보통 10-20 µ L)의 적절 한 볼륨을 주입. 참고: 인젝터를 통해 바늘 팁의 시각화를 유지 해야 하기 때문에 항상, 두 번째 사람이 현미경 하 주입된 양을 계량 인젝터 얼마나 볼륨 삽입 왼쪽 바늘에 읽어야 합니다. 인젝터와 조 수 사이 주입 전에 토론은 어떤 혼란 및 지연을 방지 하기 위해 중요 합니다. 이 지연된 제거는 바늘의 바늘 및 부정확 한 배치에 결과에 정 맥 혈액의 역류를 허락할 것 때문에 정 맥 주사에 대 한 특히 중요 하다.</li>
	<li>일단 원하는 볼륨 배달 됩니다 바늘 주사 사이트에서 철수. 일부에서 출혈이 있을 수 있으므로 배 사이트 정 맥 주사와 펑크, 압력에 대 한 10-15는 출혈을 멈추게 하는 바늘의 측면.</li>
	<li>다음 태아를 진행 합니다. 바로 자 궁 경적의 모든 태아 주입 되어 때까지 계속 합니다.</li>
	<li>복 부에서 왼쪽된 자 궁 경적을 제거 하 고 복 막 구멍 안으로 바로 자 궁 경적을 바꿉니다. 참고: 때때로, 바늘은 injectant와 리필을 해야 합니다.</li>
	<li>일단 모든 태아 주입 되어, (그림 3E) 복 부에 자 궁을 교체 합니다. 자 궁 또는 장 volvulus를 피하기 위해 되었는지 확인 합니다.</li>
	<li>처분할 수 있는 이동 피 펫 감수성이 손실을 대체 하 복 부에 약 2 mL 1 x PBS의 장소.</li>
	<li>근 막과 연속 레이어 (그림 3 층 -3g) 폐쇄 하는 동안 기본 장기 부상 방지를 4-0 polyglactin 910 봉합을 사용 하 여 복 부를 닫습니다.</li>
	<li>테이프를 제거 하 고 새 장 열 램프 아래에 마우스를 전송. 수 열 램프 마우스에 너무 가까이 배치 하지 않도록 주의 하십시오. 케이지는 침구, 음식, 그리고 물 다는 것을 확인 하십시오. 참고: 온도 조절 장치로 통제 따뜻한 챔버 사용할 수도 있습니다. 그것은 직 립 하 고 걷는 때 마우스 깨어입니다.</li>
	<li>마우스를 매일 관찰 하 고 필요에 따라 진통제를 주고. 참고: 우리가 일상적으로 meloxicam 수술 후 일 1과 2, 그리고 3 일에 경우 줄 마우스 통증의 흔적을 보여줍니다.</li>
	<li>동일한 사출 소재 일괄 처리 수술을 하 고, 살 균 PBS와 주사 바늘을 청소 합니다. 다른 재료와 함께 주입, 바늘은 sharps 용기에 폐기 하 고 새 바늘을 사용 하 여. 참고: 댐 모유를 통해 새끼를 injectant 및 항 체 면역 반응을 거치 하는 경우에 출생 후 즉시 대리 댐과 새끼를 육성 것이 좋습니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

이식 utero에서 임신 초기에 진단 될 수 있는 많은 선 천 성 질환에 대 한 잠재적인 치료 이다. IUT는 murine 모델 연구를 태아 환경을 탐구 하 또는 다른 치료와 함께 실험을 수 있습니다. 주입 되 고 타겟이 되 고에 따라 정 맥 또는 양수 내 utero에 이식 원하는 공간으로는 injectant의 안정적인 납품을 제공할 수 있습니다.
특정 장기를 대상으로, 그것은 주입 기술 뿐 아니라 태아의 적절 한 embryological 나이 선택 하는 것이 중요입니다. E14에서 세포의 정 맥 주입은 혈액 틈새 타겟팅 E16에서 양수 내 주입 폐 타겟팅에 이상적입니다 하는 동안 이러한 사용할 수 있는 유일한 옵션 하지 않습니다. 예를 들어 양수 내 주사 수행할 수 있습니다 태아에 대 한 일찍 E8 초음파 안내8. 조직 배달 가능한 E14 전에 E9-E1011에...

태아 검사 및 진단의 최근 발전 태아 선 천 성 장애는 적절 한 산 후 치료 옵션 없고 중요 한 병 적 상태와 사망률의 수에 대 한 치료의 가능성을 빛을 가져왔다. 특히, utero에서 조 혈 줄기 세포 이식 (IUHCT) 및 유전자 치료/게놈 편집가지고 혈액, 면역, 그리고 유전자 치료 선 천 성 태아의 정상적인 발달 속성의 활용 가능성 출생 후 HSC 이식 및 유전자 치료/게놈 편집1,2를 할 수 있는 것 보다 더 효율적으로 장애. 특히, 태아의 작은 크기로 인해 기증자 셀 또는 바이러스 성 벡터 복용량 수 극대화 할 받는 사람의 무게 당. 또한, 태아의 면역학 미 숙 기증자 HSCs 없이 myeloablative 및 면역 조절 주사 하 산 후 이식 프로토콜에 필요한 수 있습니다. 마찬가지로, 치료 transgene 또는 게놈 편집 기술 바이러스 성 벡터는 transgene 제품 또는 바이러스 성 벡터에 대 한 제한 면역 응답 없이 주입 수 있습니다. 마지막으로, 접근성 및 태아 줄기/뿌리 세포의 증식 특성 줄 보다 효율적인 변환 대상 조상 세포의 게놈 편집 (homology 감독 수리)의 자전거 필요로 하는 특정 모드의 가능성 효율적으로 발생 하는 셀. Murine 모델 줄기 세포 생물학과 면역학 큰 전 임상 동물 모델에서 실험 이전에 중요 한 질문을 해결 하는 통찰력과 저렴 한 수단으로 제공 하 고, 따라서, IUHCT 및 utero에서 기본 모델 역임 했다 유전자 치료 탐험된1,2,3되었습니다.
많은 변수는 IUHCT 및 utero에서 유전자 치료/게놈 편집 murine 크고 동물 모델에서의 성공에 중요 한 역할을, 비록 주요 변수 HSCs 또는 바이러스 성 벡터의 납품의 방법입니다. 태아 간, IUHCT의 때에 조 혈 기관에에서 발생 하는 1 차 통과 효과 함께 기증자 HSCs의 큰 복용량의 납품 engraftment 마우스 및 큰 동물 모델4 macrochimeric 수준의 달성에 도움이 될 표시 되었습니다. ,5. 이것 달성을 통해 통해 개 모델에서 내 심장 주입 및 기증자 세포를 통해 마우스 모델에서 vitelline 정 맥 주사 했다. 주입의 경로 또한 개발 하는 동안 다른 장기의 조상 세포를 타겟팅에서 근본적인 역할을 하고있다. 예를 들어 한 정 맥 주사 를 통해 vitelline 정 맥 효율적으로 transduce cardiomyocytes와 늦은 임신 주입6,7다음 hepatocytes에 표시 되었습니다. 또는, 바이러스 성 벡터의 양수 내 주사 주입8시간에 배아 접는/개발에 따라 물리적으로 노출 되는 장기를 대상으로 수 있습니다. 이 최고의 활용 운동의 정상적인 태아 "호흡", 바이러스 성 벡터에는 양수를 호흡기 노출 임신에서 양수 내 주입을 통해 호흡기 상피의 대상으로 궁 행 유체9. IUT, 정 맥을 통해 vitelline 정 맥의 이러한 두 가지 모드와 양수 내, 우리의 실험실에서 여러 과거와 지속적인 실험에 대 한 기초가 되었습니다. 이 프로토콜에서 우리가 자세히 murine 모델에 정 맥 및 양수 내 IUT를 수행 하기 위한 방법을 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>장갑</td><td>Cardinal Health</td><td>2D73DP65</td><td></td></tr><tr><td>Adson 포셉스 w/ 이빨</td><td>Fine Science Tools</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>Adson 포셉스 w/o 이빨</td><td>Fine Science Tools</td><td>11006-12</td><td></td></tr><tr><td>곡선 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>14075-11</td><td></td></tr><tr><td>무거운 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>14002-13</td><td></td></tr><tr><td>니들 드라이버</td><td>Fine Science Tools</td><td>12005-15</td><td></td></tr><tr><td>Vicryl 2.0</td><td>Ethicon</td><td>JB945</td><td></td></tr><tr><td>전사 피펫</td><td>Medline</td><td>GSI135010</td><td></td></tr><tr><td>Cotton Tipped Applicators</td><td>Medline</td><td>MDS202000</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 원뿔형 튜브</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>테이프</td><td>3M</td><td>1527-1</td><td></td></tr><tr><td>눈 윤활제</td><td>Major LubriFresh</td><td>0904-6488</td><td></td></tr><tr><td>히팅 패드</td><td>K& H</td><td>3060</td><td></td></tr><tr><td>실체 현미경</td><td>Leica</td><td>MZ16</td><td></td></tr><tr><td>인젝터</td><td>Narishige</td><td>HI01PK01</td><td></td></tr><tr><td>유리 모세관</td><td>Kimble</td><td>71900-100</td><td></td></tr><tr><td>수직 마이크로 피펫 풀러</td><td>셔터 기기</td><td>P-30</td><td></td></tr><tr><td>미세 전극 베벨러</td><td>셔터 기기</td><td>BV-10</td><td></td></tr><tr><td>IM-300 공압 마이크로인젝터</td><td>Narishige</td><td>IM-300</td><td></td></tr><tr><td>인슐린 주사기&nbsp;</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>305935</tr><tr><td>필터</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-244</td><td></td></tr><tr><td>Compac5 마취 기계</td><td>VetEquip Compac5</td><td>901812&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal Critical Care</td><td>NDC 66794-017-25</td><td></td></tr><tr><td>N2 가스</td><td>Airgas</td><td>NI 125</td><td></td></tr><tr><td>O2 가스</td><td>Airgas</td><td>OX 125</td><td></td></tr><tr><td>Ad-GFP 바이러스 벡터</td><td>Penn Vector Core</td><td>H5'.040.CMV.eGFP</td><td></td></tr></tbody></table>

정 맥 및 양수 내 utero murine 모델에 이식

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

이식 (IUT) utero에서 의 치료는 임신 초기에 줄기 세포, 바이러스 성 벡터, 또는 다른 물질을 소개 하는 데 사용할 수 있는 독특하고 다양 한 모드입니다. 치료 목적 IUT 뒤에 근거는 태아, 태아 면역학 미 숙, 접근성 및 태아 줄기 또는 조상 세포 및 질병을 치료 하는 잠재력의 증식 특성 또는 증상의 작은 크기에 따라 이전에 출생. 필요 없이 낫 세포 질병 등 선 천 성 혈액 질환을 치료 하는 한 IUT 태아, 조 혈 줄기 세포 (HSC) 을 통해 전달의 이러한 정상적인 발달 속성의 활용 myeloablative 또는 출생 후 HSC 이식에 필요한 면역 조절. 마찬가지로, 개발 하는 동안 여러 장기에 조상 세포의 접근성은 잠재적으로 줄기/시 조 세포 유전자 치료 또는 게놈 편집과 바이러스 성 벡터의 IUT 다음의 보다 효율적인 타겟팅에 대 한 수 있습니다. 또한, IUT 포함 하 여, 정상적인 발달 과정을 연구 하는 데 사용 수 있지만, 면 역학적 관용의 개발에 국한 되지 않습니다. Murine 모델 잠재력과 전 임상 큰 동물 연구와 최종 임상 응용 프로그램 전에 IUT의 한계를 이해 하는 데 귀중 한 하 고 저렴 한 방법을 제공 합니다. 여기, 우리는 정 맥 및 양수 내 경로 통해 murine 태아의 한 IUT 수행을 위한 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜은 명료 하 게 하는 필요 조건 및 조 혈 줄기 세포 이식 utero에서 , 관용 유도, 그리고 유전자 치료 utero에서 뒤에 메커니즘을 성공적으로 사용 되었습니다.

생존과 engraftment IUHCT 실험에 대 한 성공의 중요 한 조치는. 실험의 특정 끝점에 따라 태아는 IUHCT를 받은 수 있습니다 분석 prenatally 제왕 절 개 또는 postnatally. 평균, 정 맥 주사 후 생존 율은 75-100%에서 범위. 양수 내 주사 후 생존 율은 약 85-100%에서 정 맥 주사 보다 더 공정한 경향이 있습니다.
우리 실험실에서이 기술에 숙달을 달성 하기 위해 훈련 과정 약 8-12 개월 걸립니다. 재현할 수 패션에이 주사를 수행 하기 위해 필요한 능력의 인수를 평가, 연수생은 IUT 다음 짧은 시간 점에서 태아 생존 및 기증자 세포 engraftment를 위해 모니터링 된다. 이것은 다음과 같은 품질 관리 실험에 의해 증명 됩니다. 특히, 1 x 107 전체 골 수 세포는 격리 C57BL/6Tg...

우리는 murine 모델에 주입의 정 맥 및 양수 내 노선을 통해는 utero에 이식 (IUT)을 수행 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다. 독특한 면역 관용 태아 환경에 셀, 바이러스 성 벡터, 및 다른 물질을 소개 하는 것이 프로토콜을 사용할 수 있습니다.

정 맥 및 양수 내 Utero Murine 모델에 이식

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances ...

이 방법은 배아학, 유전자 치료 및 줄기 세포 이식에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 장점은 뮤린 태아에 대한 다른 실험 요법의 효과를 분석 할 수 있다는 것입니다. 이 절차를 보여주는 것은 우리의 실험실에 있는 닥터 니콜라스 안, 바바라 쿤스, 의사 및 연구 동료가 될 것입니다.시술을 시작하기 전에, 수술 바늘 팁안팎으로 멸균 PBS의 5~10마이크로리터를 2~3회 떨어뜨려 가능한 잔해를 치웁힙시다. 다음으로 적절한 실험용 부피 및 농도에 대한 관심의 시약으로 바늘을 채웁니다. 그리고 마이크로 인젝터에서 모드 버튼을 세 번 눌러 주사 교정 화면으로 진행합니다.10밀리초 또는 100밀리초의 간격을 추가하여 주입 시간을 조정하고 모드 버튼을 두 번 더 누릅니다. 밸런스 버튼을 누르고 발 페달을 한 번 누릅니다. 그런 다음 페달을 다시 누르고 푸시당 바늘에서 비워지는 용액의 양을 평가합니다.마이크로 인젝터가 적절한 실험 용 부피에 보정되면 주사를 위한 올바른 수준으로 바늘을 채웁니다. 모든 바늘이 청소되었을 때, 임신 2 ~ 6 개월 된 여성 마우스의 발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인합니다. 복부를 면도하고 젖꼭지를 손상시키지 않도록 주의하고 동물을 척추 위치에있는 가열 패드로 옮기.동물의 눈에 연고를 바르고 테이프로 가열 패드에 팔다리를 고정하십시오. 그리고 노출된 피부를 소독합니다. 그런 다음 0.25%의 부피바카인 100마이크로리터와 같은 국소 마취제를 피하한다.다음으로, 하부 테두리가 내성에 1센티미터 이상 이될 정도로 1~2센티미터의 피부 절개를 하고, 근막의 중간선을 식별하여 주변 상복부 혈관을 손상시키지 않도록 주의한다. Adson 집게를 사용하여 기본 장기 나 태아를 잡지 않고 근막을 꼬집어 가위로 조직을 엽니다. 일단 안전하게 복강 내에서, 피부 절개의 길이에 매실 절개를 확장하고, 목팁 어플리케이터를 사용하여 내장을 복부의 상부로 이동하여 중력 자궁을 노출시합니다.절개를 통해 자궁을 추출하여 모든 태아가 계산되도록 오른쪽 과 왼쪽 난소를 주의 깊게 식별합니다. 왼쪽 자궁을 복부에 다시 넣고 오른쪽 자궁만 노출되도록 하여 주입되지 않은 태아를 따뜻하게 유지합니다. 그리고 엄지손가락과 엄지손가락 사이의 가장 측면 양수 낭을 부드럽게 잡습니다.해부 현미경을 동물 위에 배치하고 필요에 따라 태아의 더 나은 시각화를 위해 초점과 조명을 조정합니다. 정맥 주사의 경우 자

intravenous-intra-amniotic-utero-transplantation-murine

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

E16 랫 태아의 Utero의 심실 주입 및 Electroporation에

E15 마우스 태아의 Utero의 심실 주입 및 Electroporation에

마우스에 utero 서바이벌 수술 개발하는 동안 유전자 발현의 분자 조작 수 있습니다. 여기 우리는 배아 하루 마우스 뇌 (E) 9.5에 r​​etroviral 벡터의 주사를 안내 고주파 초음파 이미징의 사용을 설명합니다.

마우스 Forebrain에 초음파 유도 Microinjection Utero에서 E9.5에서

의 마우스 모델 Utero에 이식

체세포 줄기 세포의 확장을 제어하는​​ 것은 자신의 연구와 치료에 사용 hampering 결정하는 주요 요인입니다. 여기 시간적 마우스 뇌에서 생성 된 뉴런의 수를 증가하는 데 사용할 수있는 개발 및 성인기 동안 신경 줄기 세포 확장을 제어 할 수있는 시스템을 설명합니다.

의 배아와 성인 신경 줄기 세포의 확장<em&gt; 자궁에</em&gt; Electroporation 또는 바이러스 성 Stereotaxic 주입

자궁 - 난관 배아 입금 자궁 전송을 수행 할 때 발생할 수있는 배아 유출을 방지하는 장벽으로 자궁 - 난관 접합부를 사용한다. 과 vasectomized 남성은 배아 전송 pseudopregnant받는 사람을 얻기 위해 필요합니다. 두 가지 기술을 설명합니다.

마우스 모델에서 자궁 - 난관 배아 전송 및 정관

소아 질환의 동물 모델은 초기 발병과 적극적인 질병의 진행을 경험할 수 있습니다. 임상 어린 마우스 모델에 관련된 치료 전달 기술적 어려울 수있다. 이 프로토콜은 생후 두 생후 일 이내 신생 쥐 비 침습적 정맥 주입 방법을 설명한다.

신생아 마우스의 정맥 주사

우리는 살아있는 유기체의 합병증 없이 모계 염증에 태아 노출을 시뮬레이션하기 위하여 chorioamnionitis의 모형을 개발했습니다 자손의 창자 발달에 FEMI의 효력을 검토합니다. 이것은 chorioamnionitis 다음 장 상해의 발달을 위한 기계론적인 원인의 연구를 허용합니다.

신생아 장 발달에 급성 chorioamnionitis의 효력을 연구하기 위하여 모성 염증에 태아 노출의 Murine 모형

이 프로토콜에서는 E7.5의 마우스 양수에 렌티 바이러스를 주입하여 생존 또는 배아 발달에 미치는 해로운 영향을 최소화하면서 전체 신경판을 균일하게 형질 도입하는 방법을 설명합니다.

배아 일 7.5에서 자궁 내 나노 주사 (NEPTUNE)에 의한 뮤린 신경 판 표적화

이 연구에서는 제브라피시 유충에 대해 EBD(Evans Blue Dye) 분석을 수행하는 간단한 방법을 설명합니다.  이 기술은 골격근 무결성의 특성화와 근이영양증의 제브라피시 모델을 묘사하기 위한 강력한 도구이며 새로운 치료법 개발을 위한 귀중한 방법입니다.

에반스 블루 염료와 Zebrafish의 애벌레 골격 근육 무결성 분석

배우세요 정맥 및 양수 내 자궁 내 이식 기법으로 마우스 태아에 세포와 바이러스 벡터를 도입하는 방법. 이 면역관용 환경에서 발생생물학 및 유전자 치료 연구를 수행할 수 있습니다.

정 맥 및 양수 내 Utero Murine 모델에 이식

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