Name: 하위 형식 관련 광학 활동 전위 녹음 인간의 유도 만능 줄기 세포 유래 심 실 Cardiomyocytes (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: 학습하세요 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심실 심근세포에서 광학적 활동 전위 녹음 방법을. 렌티바이러스 매개 유전자 인코딩 전압 센서를 이용하여 심장 전기생리학 연구의 처리량을 극대화하고 하위 형식 특이적 기록을 가능하게 합니다.

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이 작품은 독일 연구 재단 (Si 1747/1-1), 다른 Kröner-Fresenius-재단, 그리고 도이치 재단에 Herzforschung에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

1. 이미징 iPSC 파생 Cardiomyocytes의 준비
참고: iPSC 문화와 심장 차별화 방법12,,1314 전에 게시 된 고 여기 자세하게에서 논의 하지 않습니다. 수동 서, 자석 세포 별거, 또는 젖 산 선택 iPSC-CMs의 정화 것이 좋습니다, 분화 프로토콜 사용에 따라. 다음 프로토콜에 대 한 지역, 생성 된 구타에서 microdissected explants 단층 차별화 프로토콜13를 사용 하 여, 심장 감 별 법의 15 날에 촬영 되었고 설명한 fibronectin 코팅 판에 30 날까지 교양 10전에.
<ol><li>받아 셀 인큐베이터에서 배양 배지 및 수동으로 microcentrifuge 튜브 200 µ L 피 펫을 사용 하 여 심장 explants를 수집 합니다. 침전, 후 세포 배양 표면에 뜨는 발음 하 고 부드럽게 행 크와 2 x의 균형 explants 소금 세척 솔루션 (HBSS).</li>
	<li>IPSC CMs 콜라 유형 II를 추가 하 여 해리 (HBSS에 430 U/mL)와 30 분 동안 37 ° C에서 그들을 품 어.</li>
	<li>나머지 큰 세포의 침전 묶습니다 후 상쾌한 천연된 단일 iPSC-CMs가 포함 된 수집 하 고 높은 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 농도 (DMEM-F12, 20 %FBS, 2 mM 포함 된 신선한 CM 유지 보수 매체 추가 L-glutamine, 1: 100 MEM 비필수 아미노산, 스-100 U/mL 페니실린, 그리고 0.1 m m β-mercaptoethanol).</li>
	<li>큰 세포 덩어리 남아 있으면 분리를 반복 합니다. 수집 iPSC CMs 원심 분리에 의해 단일 하 고 낮은 FBS 농도 포함 하는 CM 중간에 resuspend (2 %FBS).</li>
	<li>다시 fibronectin (2 µ g/c m2)로 코팅 되는 3.5 c m 유리 하단 셀 문화 microdish 단일 셀의 후속 이미징 수 있도록 밀도 단일 iPSC CMs 씨앗. 높은 처리량 실험에 참여 하기 전에 시드 밀도 최적화 합니다. 일반적으로, 3.5 c m 접시 당 5-10 심장 explants는 충분 한; 그러나,이 무 겁 게 explant 크기와 순도에 따라 달라 집니다.</li>
	<li>2%를 포함 하는 CM 유지 보수 매체에 그들의 분리 후 단일 iPSC CMs 문화 FBS 적어도 48 h에 대 한 충분 한 복구를 보장 하기 위해. 참고: 다음 단계에 iPSC CMs 인코딩 GEVI VSFP-CR MLC2v 증강10 의 통제 실의 특정 GEVI 식 달성 하기 lentivirus와 불리고 있다. 또는, 꾸벅꾸벅 졸 기 또는 심 방-같은 셀에 특히 GEVI을 표현 하기 위해 수 있도록 lentiviral 구문 또는 편 표현 PGK 발기인 은닉 난다 구문 사용된10될 수 있습니다. Lentiviral 플라스 미드 요청 시 사용할 수 있습니다. 주의: lentiviral 입자를 사용할 경우 작업 환경에는 잠재적으로 전염성이 에이전트 작업에 대 한 안전 지침을 준수 하 고 필요한 안전 조치를 취할 적절 한 biosafety 수준 확인 하십시오.</li>
	<li>감염 매체 lentivirus10을 혼합 하 여 준비-포함 하는15, CMs 유지 보수 매체와 전에 설명한 대로 HEK293 세포에서 생산 되어 표면에 뜨는, 세포 배양 (단계 1.3 참조) 1:1 비율에서.</li>
	<li>감염 효율을 향상 시키기 위해 8 µ g/mL의 최종 농도에 hexadimethrine 브 로마 이드를 추가 합니다. 참고: 높은 감염에의 한 효율성의 ultracentrifugation 통해 lentivirus iPSC CMs 이전 농도의 일반적으로 필요 하지 않습니다.</li>
	<li>단일 iPSC CMs에서 CM 유지 보수 매체를 발음 하 고 감염 매체 1.7, 1.8 단계 동안 준비 합니다. 37 ° c.에 12 h에 대 한 감염 매체에 감염 된 단일 iPSC-CMs 문화 다음, 매체를 발음 하 고 CM 유지 보수 매체 다시 바꿉니다. 참고: 형광 신호는 GEVI에서 감염 후 48 h에 나타납니다. 막 잠재적인 녹음의 이미징이 좋습니다, 초기에 감염 후 72 h 적절 한 신호 강도 보장 하기 위해. 단일 감염된 iPSC CMs 적어도 3 주 동안 경작 하 고 순차적으로 몇 군데 수 있습니다. 광범위 한 photobleaching 이미징 세션 동안 발생 하는 경우 시간이 지남에 따라 형광 신호를 복구 합니다.</li>
	<li>이미징, 전에 Tyrode의 솔루션 캘리포니아2 + 보충 하 여 세포 배양 매체 교환 (135 m m NaCl, 5.4 m KCl m, 1 mM MgCl2, 10 m m 포도 당, 1.8 m m CaCl2및 10 mM HEPES; pH 7.35).</li>
</ol>2. 광 막 잠재적인 녹음
<ol><li>장소 이미지 분배기, 적절 한 필터 집합 및 카메라 (예를 들어, sCMOS 카메라) 높은 고속 이미징 능력을 갖춘 거꾸로 epifluorescence 현미경의 스테이지 iPSC CMs 포함 된 이미징 챔버 감도입니다. 참고: 예를 들어 480/40 nm 대역 통과 여기 필터 사용 현미경, dichroic 거울 500 nm 롱 패스와 결합 하 고 568 nm 긴 패스 dichroic 거울 520/28 결합 및 이미지 스플리터에 630/75 nm 대역 통과 배출 필터. 단일 셀 이미징에 대 한 높은 확대, 높은 수 가늠 구멍 기름 침수 목표 최상의 신호 대 잡음 비율을 제공합니다.</li>
	<li>전기 성 하는 것이 필요한 경우 영상 실에서 서 성 전극을 설치 하 고 자극 발생기에 연결. 참고: 우리는 3.5 c m 유리 하단 셀 문화 요리에 포함 된 두 개의 백 금 전극을 장착 하 서 성 삽입을 사용 합니다. 전극 사이 위치한 세포 몇 군데 있었다. 전형적인 서 성 매개 변수 5 ms의 직사각형 펄스 지속 시간, 진폭 10 V/cm 전극 거리의 있는.입니다.</li>
	<li>필요에 따라 온수 현미경 단계를 사용 하 여 장기 이미징 경우 이미징, 또는 심지어 현미경 인큐베이션 챔버 설정 동안 iPSC-CMs의 안정적인 온도 보장 하기 위해.</li>
	<li>초점 셀을 가져오고 보기 필드의 중앙에는 GEVI을 표현 하는 셀을 배치. 참고: 이것은 가장 편리 하 게 녹색 형광 단백질 (GFP) 또는 형광 성 단백질 (RFP) 필터는 GEVI를 표현 하는 셀을 식별 하기 위해 설정 하는 빨간색을 사용 하 여 현미경의 접 안 렌즈를 사용 하 여 이루어집니다.</li>
	<li>내보낸된 빛 이미지 스플리터 라우팅됩니다 광학 경로 설정 합니다. 현미경에서 이미지 분배기에 필터와 결합 한 필터 큐브 전환 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>카메라를 제어 하는 소프트웨어에 고속 이미징 (예를 들어, 프레임 당 10 ms 노출 시간으로 초당 100 프레임)가 가능한 수집 설정을 설정 합니다. 참고: 일반적으로,이 카메라 픽셀의 binning 포함 (예를 들어, 8 x 8 픽셀 카메라 칩의 시간 경과 영화에서 한 픽셀을 생성 하 범주화 됩니다).</li>
	<li>제조업체의 지시에 따라 이미지 스플리터를 설정 합니다. 두 이미지를 대표 하는 두 개의 서로 다른 방출 파장 밴드 해야 서로 인접 한 한을 차지 하는 것은 각 이미지의 절반. 참고:이 단계는 수만 1 x 이미징 각 세션의 시작 부분에서 수행.</li>
	<li>확인 하 고, 필요한 경우, 카메라에 의해 생산 하는 이미지의 초점을 조정.</li>
	<li>조명 빛의 밝기를 조정 하는 픽셀의 어떤 채도 피할 수 있다; 이 가장 쉽게 포화 픽셀 독특한 색상으로 표시 됩니다 색상 팔레트를 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 참고: 영상 전에 이러한 모든 준비 하는 동안 제한 빛 (즉, 않습니다 떠나지는 빛에 연장 기간)에 필요한 금액을 여기에는 샘플의 노출은 GEVI의 photobleaching을 피하기 위해.</li>
	<li>시계열의 인수를 설정 (예를 들어, 50의 시리즈 동안 초당 100 프레임에서 5000 이미지 s). 측정에 영향을 미치는 길 잃은 빛을 피하기 위해 (를 포함 하 여 컴퓨터 모니터) 방에 빛을 희미 한. 이미징 소프트웨어에 의해 구동 가벼운 셔터를 제어할 수 없으면 그냥 인수를 시작 하기 전에 그것을 엽니다.</li>
	<li>이미지 시리즈의 수집을 시작 합니다. 전기 성 원하는 경우 이미징 소프트웨어에 의해 자동으로 시작 하지 않는 한 적절 한 시간 지점에 서 성 시퀀스를 시작 합니다. 약리 에이전트의 응용 프로그램을 원하는 경우이 작업을 수행 하거나 수동으로 (예를 들어, 버퍼, 900 µ L을 포함 하 고 부드럽게 피펫으로 혼합 녹음 실로 10 배 최종 농도에 에이전트의 pipetting 100 µ L에 의해) 또는 사용 하 여 한 일정 흐름 관류 시스템입니다.</li>
	<li>인수 완료 되 면, 필요한 경우 여기 광 셔터를 닫습니다. 하드 드라이브를 녹음을 저장 합니다.</li>
	<li>그대로 녹음 설정 (즉, 노출 시간, 프레임 속도, 및 빛의 강도)를 떠나, 수행 (2.11 단계)로 배경 형광의 녹음 되지 셀을 포함 하는 coverslip의 지역 또는 어떤 다른 coverslip 더 셀 시드 되었습니다. 참고: 연속 측정을 수집 설정을 변경 하지 않고 수행, 하나의 배경 형광 녹음 모든이 측정에 필요한입니다.</li>
	<li>원하는 경우 동일한 coverslip에 있는 다른 iPSC CMs에 추가 실험 (2.4-2.13 단계)를 수행 합니다. 약물이 적용 된 경우에 coverslip에 모든 CMs 영향 될 다는 것을 유의 하십시오.</li>
</ol>3입니다. 분석
> 참고: 이미징 소프트웨어에 따라 이용 한다 (일반적으로 독점 소프트웨어 패키지는 카메라 또는 전체 형광 이미징 시스템의 제조업체에서 제공), 그것 수 있습니다 또는 부분적으로 인수 이미지의 분석을 수행 이 소프트웨어 패키지에서 완전히. 그러나, 여기의 이미지 분석을 수행할 수 있는 워크플로가 오픈 소스 소프트웨어 (즉, 이미지 분석 플랫폼 ImageJ)16,17, 피지 등 R 패키지 배포를 사용 하 여 편리 하 게 설치할 수 있는 통계 컴퓨팅18 설명 합니다. 간단히, 관심 (ROIs) 대표 하는 셀 또는 배경 영역 그려집니다 ImageJ, 그리고 시간이 지남에 이러한 ROIs에 평균 형광, 다음, 더 분석할 R에 또는, 양자 택일로, 스프레드시트 소프트웨어와 파일을 내보내집니다.
<ol><li>이미징 소프트웨어에 저장 하거나 ImageJ로 읽을 수 있는 형식 (예를 들어, TIF) 획득된 한 이미지 시계열 (셀을 포함 하는 기록 및 해당 배경 녹음)를 내보낼. ImageJ 이미징 시스템 제조 업체의 다른 브랜드에서 독점적인 파일 포맷을 읽을 수 사용 루틴을 제공 하는 BioFormats 플러그인 (https://imagej.net/Bio-Formats), 또는 사용. 참고: 다음 단계 영상으로 녹음을 통해 동일 하다는 것을 가정 합니다. 만약이 경우가 아니라면, 이미징 소프트웨어에서 타이밍 정보를 내보내고 추가 분석에 포함 필요할 수 있습니다.</li>
	<li>ImageJ는 셀을 포함 하는 TIF 스택을 엽니다.</li>
	<li>자유형 선택 도구를 사용 하 여 빨강 채널에 형광 cardiomyocyte 통해 ROI를 그릴. 계약 하는 동안 투자 수익에서 셀 이동 하지 않는 투자 수익 큰 충분히 인지 확인 합니다.</li>
	<li>투자 수익 관리자 플러그인 오픈 ('분석 | 도구 | 투자 수익 관리자 ') ROI1로이 투자 수익을 추가 하려면 '추가 [t]' 버튼을 누릅니다.</li>
	<li>녹색 채널에 동일한 셀을 통해 투자 수익을 끌어서 ROI2로이 투자 수익을 추가.</li>
	<li>에서 ' 분석 | 설정 측정의 메뉴, '회색 값을 의미'제외한 모든 옵션의 선택을 취소 합니다. 참고: 이것은 단지 1 x ImageJ 세션에서 할 수 있다.</li>
	<li>투자 수익 매니저에는 를 눌러 ' 더 | 다중 측정 ' 버튼. '모든 분할 영역 측정' 과 '슬라이스 당 행' 옵션을 선택 하 고 '확인'을 누릅니다. 창이 열립니다 (분할 영역 번호와 빨간색에서 및 녹색 채널에 셀을 각각 나타내는 두 ROIs에 평균 형광) 세 개의 행으로 스프레드시트를 포함 하.</li>
	<li>를 사용 하 여 ' 파일 | 다른 이름으로 저장 ' 는 쉼표로 구분 된 값 (CSV) 파일에 스프레드시트를 저장 하려면.</li>
	<li>투자 수익 관리자 창을 닫지 않고 이미지 스택 창 및 스프레드시트 창을 닫습니다. 배경 측정을 포함 하는 TIF 스택을 엽니다.</li>
	<li>투자 수익 매니저에는 를 눌러 ' 더 | 다중 측정' 버튼. '모든 분할 영역 측정' 과 '슬라이스 당 행' 옵션을 선택 하 고 '확인'을 누릅니다.</li>
	<li>를 사용 하 여 ' 파일 | 다른 이름으로 저장 ' 다른 CSV 파일에 배경 데이터와 스프레드시트를 저장 하려면. 참고: 다음 계산 스프레드시트 소프트웨어와 함께 할 수 있습니다. 우리는 R 소프트웨어18을 사용합니다. 파일 "cell.csv" 및 "background.csv"에서 셀 및 배경 데이터 계산, 고 막 잠재적인 신호 시간 과정을 읽는 간단한 예제 스크립트 추가 코드 파일 1로 제공 됩니다.</li>
	<li>배경 녹음에서 빨간색에서 및 녹색 채널에 평균 강도 계산 합니다. 각각이 배경 배경 수정 RFP를 계산 하는 빨간색과 녹색 채널에 셀을 나타내는 신호에서 신호와 GFP 신호를 뺍니다.</li>
	<li>막 잠재력에 대 한 대리 모, RFP/GFP 비율을 계산 합니다. 참고:이 비율은 치수입니다. 또는, 그것은 초기 값 (즉, ΔR/R0) 정규화 될 수 있습니다. 중요 한 것은,이 비율의 절대 값 보다는 시간적 변화에 유용한 정보가 포함 되어 있습니다. GFP와 RFP의 고르지 못한 photobleaching, 때문에이 비율에서 초기 드리프트 발생할 수 있습니다. 필요한 경우 베이스 라인 드리프트 기준 곡선을 구성 하 고 RFP/GFP 비율10에서 빼서 수정할 수 있습니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

여기 설명 하는 방법을 인간의 Ipsc에서 생성 하는 CMs의 특정 하위 (즉, 같은 심 실 세포)에서 Ap의 광학 기록 수 있습니다. 인간의 iPSC-CMs는 거 대 한 다양 한 생물학과 의료 문제를 해결 하기 위해 새로운 도구 이며 다른 CM 하위 형식에 차별화 실험적인 다양성의 중요 한 소스. 특정 발기인 요소를 사용 하 여는 GEVI의 식 CMs에 관심, 하위를 나타내는 있는 광학 이미지 다음에 구체적으로 달성 된다.
단일 iPSC-CMs에서 APs의 성공적인 인수 분리 후 reseeding 밀도에 따라 달라 집니다. 셀 너무 밀도가 다시 시드해야는, 그것은 고립 된 하나의 iPSC-CMs는 전기 syncytium에 속하지 않는 찾을 수 있습니다. 그러나, 너무 낮은 시드 밀도 부정적인 세포의 생존에 영향을. 따라서, 다른 시드 밀도의 체계적인 테스트 것이 좋습니다, 특히 높은 처리량 영상에 의존 하는 실험에 참여 하기 전에.
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유도 만능 줄기 세포 (Ipsc)에서 파생 된 Cardiomyocytes (CMs)는 불리 한 심장 약물 효과1,2 에 대 한 분자 메커니즘의 심장 질환, 비 발한 요법을 조사 하 고 화면을 해 부하는 신흥 도구 3. 바로 처음부터, channelopathies 같은 arrhythmogenic 질병이 연구4의 중요 한 초점 되었습니다. 따라서, 부정맥 또는 활동 전위 (AP) 형태학 변화 같은 CMs의 전기 고기를 조사 하는 방법이이 기술의 마음에 있습니다.
IPSC CMs의 응용 프로그램에서 중요 한 고려 사항이입니다 셀의 균질 성 인구 현재 심장 차별화 프로토콜 발생 하지 않습니다. 대신, 그들은 오히려 셀 닮은 공동 노드, 심 방, 심 실 CMs 성숙5,6,,78의 서로 다른 수준에서의 혼합물. 이 관련 소스 수 실험 가변성의 AP 기간 (APD) 같은 매개 변수를 조사 하는 경우에 특히는 본질적으로 다릅니다 CM 하위 (예를 들어, APD는 짧은 심 실 CMs에 보다 심 방). 이 문제를 해결 하기 위해 기존의 접근 방법과 패치 클램프 메서드를 사용 하 여 단일 iPSC-CMs를 조사 하 고 각 셀에 꾸벅꾸벅 졸 기를 분류 하는-, 심 방-, 또는 심 실 같은, 그것의 AP 형태9에 따라. 모든 후속 분석 관심의 CM 하위 나타내는 셀에 다음 제한 될 수 있습니다. 이 전략의 주요 결점은 그것의 한정 된 처리량과 확장성의 부족. 또한, 패치 클램프 전기 생리학의 침략 적인 본질 순차적으로 확장 된 기간 동안 동일한 셀의 이미지를 허용 하지 않습니다.
여기, 우리는 방법10 광학 iPSC CMs의 특정 하위에 Ap의 이미지를 개발에 실험 정보를 제공 합니다. 이 하위가 문제를 극복 하 고 극적으로 iPSC-CMs 유전 이체를 운반 하거나 약물에 노출 된 에이전트의 급속 한 형질을 허용 하는 기존의 방법에 비해 처리량을 증가 시킵니다.
하위 형식 관련 광학 이미징 접근 방법의 개요
도발은와 세포 막의 repolarization 형광 속성 변경, 유전자 인코딩 전압 표시기 (GEVI), CMs의 막 잠재력의 변화를 광학 이미지에 사용 됩니다. 여기에 적용 하는 GEVI은 전압 감지 형광 단백질 VSFP CR11, 전압 감지 막 횡단 도메인 융합 그린 (클로버)와 레드 (mRuby2) 형광 성 단백질 (그림 1A)의 쌍을 이루어져 있는. 두 fluorophores의 근접 때문에 녹색 형광 단백질의 여기 여기 에너지는 빨간색 형광 단백질을 통해 포스터 공명 에너지 전달 (무서 워)에 전송 되 고의 결과. 따라서, 녹색 형광 단백질의 여기 모두 녹색과 적색 형광 단백질 (그림 1A, 상단 패널)에서 방출에 발생합니다. 셀 depolarizes, 전압 센서의 구조 재편 무서 워 효율성 두 가지 형광 단백질의 재교육으로 변환 하는 발생 합니다. 따라서, 여기 에너지의 더 많은 전송 됩니다 녹색에서 빨간색 형광 단백질 (그림 1A, 하단 패널). 그 결과, depolarized 셀에 녹색 형광 방출 주차, 이며 휴식 막 잠재적인 (그림 1B)에 셀에 빨간색 형광 방출은 보다 밝은.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58134/58134fig1.jpg"> 그림 1: VSFP cr.와 막의 광학 영상 VSFP CR 표시 전압에 민감한 형광 단백질의 행동을 묘사 하는 (A) A 회로도 세포 막의 도발은 시 전압 감지 막 횡단 도메인 구조 재편 (GFP) 녹색과 빨간색 (RFP) 형광 단백질, intramolecular 포스터의 효율성 증가의 재교육으로 변환 공명 에너지 전달 (무서 워) 휴식 막 잠재력 (위 패널)에서 셀에 및 depolarized 셀 (하단 패널)에 GFP의 구동 시 VSFP의 (B) 방출 스펙트럼 묘사 된다. 도발은 시 스펙트럼 변화 명확성을 위해 과장 이다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58134/58134fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
막 잠재력의 변동 미러링 무서 워 효율에서 변화는 빨간색과 녹색 형광 방출 분리 하 고 그들의 2 개의 인접 한 지역에 프로젝트는 이미지 스플리터 장착 형광 현미경을 사용 하 여 몇 군데 sCMOS 카메라 (그림 2)의 칩 했다. 이 설정으로 2 개의 다른 파장 악대에서 형광 방출 기록 될 수 동시에, 빨강-녹색 형광 막 잠재적인 시간 경과 시리즈의 모든 이미지에 맞게 비율의 계산을 허용 하.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58134/58134fig2.jpg"> 그림 2: 이미징 시스템의 구성. 이미징 시스템의 주요 구성 요소는 높은 시간 해상도에서 막 잠재적인 변화를 미러링 전압에 민감한 형광 단백질의 스펙트럼 변화를 묘사 하는 이미지를 사용. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58134/58134fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
VSFP-CR CMs의 식 lentiviral 변환 함으로써 이루어집니다. 관심의 CM 하위 식을 직접 lentivirus는 특히 심 실 같은 iPSC-CMs10전사를 드라이브 하는 발기인 요소 ( MLC2v enhancer)를 포함 합니다. 심 방 같은, 꾸벅꾸벅 졸 기 같은와 같은 심 실 세포의 혼합물을 나타내는 iPSC-CMs는이 lentivirus 함께 불리고, VSFP CR 심 실 같은 셀에만 표시 됩니다. 광학 활동 전위 이미징이 형광 센서에 따라, 이후 기록 된 활동 전위는 독점적으로 관심 (그림 3)의 CM 하위 유형을 나타냅니다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58134/58134fig3.jpg"> 그림 3: 하위 형식 관련 막 잠재적인 이미징 발기인 구동 VSFP 식. (한)이이 회로도 cardiomyocyte 하위 형식 관련 광학 활동 전위 기록 달성 하는 방법을 보여 줍니다. (b) iPSC-CMs 심 실 전용 MLC2v-증강의 통제는 VSFP에 감염 표시 됩니다. 전압 센서의 식 GFP 채널 (왼쪽된 패널)에서 심 실 같은 CMs에만 관찰 된다. 오버레이 이미지 (오른쪽 패널) 및 위상 대비 (중간 패널)도 제공 됩니다. 흰색 점선 셀 경계를 표시합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58134/58134fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>&szlig;-메르캅토에탄올</td><td>Invitrogen</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12 Medium</td><td>Invitrogen</td><td>21331046</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td><td>Invitrogen</td><td>16141079</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids</td><td>Invitrogen</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax-I Supplement</td><td>Invitrogen</td><td>35050061</td><td>alternative L-Glutamine</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>인비트로겐</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>피브로넥틴 소 혈장</td><td>시그마-알드리치</td><td>F1141&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 유형 II</td><td>Worthington Biochem</td><td>LS004174</td><td></td></tr><tr><td>헥사 디메 트린 브로마이드 (폴리 브렌</td>) <td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268</td><td>강화 렌 티바이러스 감염</td></tr><tr><td>3.5cm 유리 바닥 마이크로 접시</td><td>MatTek Corporation, Ashland, MA, USA</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>현미경 스탠드</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td><td>DMI6000B</td><td></td></tr><tr><td>현미경 대물렌즈</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td><td>HCX PL APO 63X/1.4-0.6 Oil</td><td></td></tr><tr><td>sCMOS camera</td><td>Andor Technology, Belfast, UK</td><td>Zyla V</td><td></td></tr><tr><td>현미경 필터 큐브: 여기 필터</td><td>Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA</td><td>ET480/40X</td><td>bandpass 480/40</td></tr><tr><td>microscope filter cube: dichroic mirror</td><td>Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA</td><td>T505lpxr</td><td>longpass 505 nm</td></tr><tr><td>이미지 스플리터</td><td>&nbsp; 케언 리서치, 영국 파버샴</td><td>OptoSplit II</td><td></td></tr><tr><td>이미지 스플리터 필터 큐브: 이색성 거울</td><td>AHF Analysentechnik GmbH, T&uuml; bigen, 독일</td><td>568LPXR</td><td>롱패스 568 nm</td></tr><tr><td>이미지 스플리터 필터 큐브: 방출 필터 1 (GFP 방출)</td><td>AHF Analysentechnik GmbH, T&uuml; bigen, 독일</td><td>520/28 BrightLine HC</td><td>대역통과 520/28 nm</td></tr><tr><td>이미지 스플리터 필터 큐브: 방출 필터 2 (RFP 방출)</td><td>AHF Analysentechnik GmbH, T&uuml; bigen, 독일</td><td>630/75 ET 대역 통과</td><td>대역 통과 630/75 nm</td></tr><tr><td>페이싱 삽입</td><td>Warner Instruments, Hamden, 코네티컷, 미국</td><td>RC-37FS</td><td></td></tr></tbody></table>

하위 형식 관련 광학 활동 전위 녹음 인간의 유도 만능 줄기 세포 유래 심 실 cardiomyocytes

Subtype-specific Optical Action Potential Recordings in Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Ventricular Cardiomyocytes

Cardiomyocytes 인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSC-CMs)에서 생성 된 심혈 관 연구에 새로운 도구입니다. 셀의 균질 성 인구 되 고, 보다는 오히려 현재 분화 프로토콜에 의해 생성 된 iPSC CMs 대표 심 실 세포의 혼합-, 심 방-, 및 phenotypic 분석을 복잡 하 게 꾸벅꾸벅 졸 기 같은 고기. 여기, 특히 심 실 같은 iPSC-CMs에서에서 광학 기록 활동 전위 하는 방법을 제시 합니다. 이는 유전자 인코딩 전압 표시기가 심 실 특정 발기인 요소의 제어 구조와 lentiviral 변환에 의해 달성 된다. IPSC-CMs는이 구문으로 불리고 때 하위 특정 광 막 잠재적인 녹음 시간 경과 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 사용 전압 센서 심 실 같은 셀에 독점적으로 표현 된다.

그림 4a에서 대표 단일 iPSC CM RFP (왼쪽)와 GFP (오른쪽) 채널에서 이미징 분석 하는 동안 그린 투자 수익을 표시 하얀 점선으로 그려져 있습니다. RFP 채널에서 신호 (그림 4b, 상단 패널) 각 활동 전위 동안 형광 강도 주기적 증가 보여줍니다. 소개에 설명 된 대로 이것은 잠재적인 막 (그림 1)에 있는 변화에 기인한 증가 무서 워. Concordantly, GFP 신호는 형광 강도 (그림 4b, 중간 패널)에서 정기적인 감소를 보여 줍니다. RFP/GFP 비율 (그림 4b, 하단 패널)는 APD50 및 APD90 측정 등 다운스트림 분석에 사용 ...

여기 우리는 특히 심 실 같은 유도 만능 줄기 세포 유래 cardiomyocytes에에서 광학 이미지 활동 전위, 하는 방법을 제시. 메서드를 사용 하면 전압에 민감한 형광 단백질의 발기인 기반 식을 기반으로 합니다.

하위 형식 관련 광학 활동 전위 녹음 인간의 유도 만능 줄기 세포 유래 심 실 Cardiomyocytes

Cardiomyocytes generated from human induced pluripotent stem cells (iPSC-CMs) are an emerging tool in cardiovascular research. Rather than being a ...

유도 만능 줄기 또는 IPS 세포에서 생성된 심근세포는 점점 심장 전기 생리학 분야에서 다양한 생물학적 질문에 대답하기 위해 사용된다. 이 기술의 주요 장점은 심실 특정 프로모터 요소를 사용하여 심근 세포와 같은 심실의 특수 작업 잠재적 기록뿐만 아니라 처리량의 극적인 증가를 허용한다는 것입니다. 렌티바이러스 트랜스듀션을 통해 유전자로 인코딩된 전압 센서의 도입은 인간 유도만능 줄기 세포-유래 심근세포 작용 잠재력을 광학적으로 이미징할 수 있게 해줍니다.렌즈피바이러스함유 세포배양상과 심근세포 유지보수 배지를 1대 1비율로 혼합하여 시작한다. 감염 효율을 향상시키기 위해 밀리리터 당 8 마이크로 그램의 최종 농도에서 헥사디메헤린 브로마이드를 추가하십시오. 그리고 IPS 세포 유래 심근세포 배양 접시에서 심근세포 유지 배지를 감염 배지로 대체한다.감염된 심근낭을 섭씨 37도에서 12시간 동안 배양하고, 감염 배지를 신선한 심근세포 유지 보수 매체로 대체한다. 이미징 전에 세포 배양 배지를 티로드의 용액으로 교환하여 칼슘으로 보충합니다. 그런 다음 심근세포는 화상 스플리터를 장착한 반전된 형광 현미경의 단계에 화상 진찰실에 놓습니다.전기 적 속도 조정이 필요한 경우 이미징 챔버에 속도 전극을 설치하고 전극을 자극 발생기에 연결합니다. 세포를 초점으로 가져오고, 시야의 중앙에 유전으로 인코딩된 전압 표시기를 표현하는 세포를 찾습니다. 방출된 빛이 영상 스플리터로 라우팅되도록 광학 경로를 설정하고 현미경의 필터 큐브를 이미지 스플리터의 필터와 결합하도록 전환합니다.카메라를 제어하는 소프트웨어에서 고속 이미징이 가능하도록 획득 설정을 설정하고 제조업체의 지침에 따라 이미지 스플리터를 설정합니다. 두 개의 서로 다른 방출 파장 밴드를 나타내는 두 이미지는 서로 인접해야 하며, 각각 이미지의 절반을 차지합니다. 필요에 따라 카메라에서 생성한 이미지의 초점을 확인하고 조정합니다.그리고 픽셀 채도를 피할 수 있도록 조명 광의 밝기를 조정합니다. 타임 시리즈의 획득을 설정하고, 측정에 영향을 미치는 길잃은 빛을 피하기 위해 방에 빛을 어둡게. 그런 다음 흥분 라이트 셔터를 열고 이미지 시리즈의 수집을 시작하여 실험적으로 적절하다면 적절한 시점에서 전기 적 속도를 시작합니다.획득이 완료되면 필요에 따라 여기 라이트 셔터를 닫고 기록을 하드 드라이브에 저장합니다. 그런 다음 기록 설정을 변경하지 않고 셀없이 커버 슬립 영역을 통해 배경을 기록합니다. 광학 멤브레인 전위 기록의 분석을 위해, ImageJ에서 세포를 포함하는 티프 스택을 열고, 자유 손 선택 도구를 사용하여 형광 심근세포에 대한 관심 영역을 그릴 수 있으며, 적색 채널에서는, 영역이 수축하는 동안 영역이 영역밖으로 이동하지 않을 정도로 충분히 크다는 것을 주의한다.다음으로 분석, 도구, 관심 영역 관리자를 선택하고 T 추가를 선택하여 이 지역을 관심 영역 1로 추가합니다. 관심 영역을 녹색 채널의 동일한 셀 위에 드래그하고 이 영역을 관심 영역 2로 추가합니다. 측정 분석 및 설정 메뉴에서 평균 회색 값을 제외한 모든 옵션을 선택 취소합니다.관심 영역 관리자에서 더 많은 및 다중 측정값을 클릭하여 슬라이스 옵션당 모든 조각과 행 1개를 측정하고 확인을 클릭합니다. 세 개의 행이 있는 스프레드시트가 포함된 창이 열립니다. 파일 및 저장 As를 사용하여 스프레드시트를 쉼표 분리된 값 파일에 저장합니다. 관심 영역 관리자 창을 닫지 않고 이미지 스택및 스프레드시트 창으로 창을 닫고 백그라운드 측정이 포함된 티프 스택을 엽니다.관심 영역 관리자에서 더 많은 측정값과 다중 측정값을 클릭하여 슬라이스 옵션당 모든 조각 및 행 1개를 측정하고 확인을 클릭합니다. 그런 다음 배경 데이터를 별도의 csv 파일에 저장합니다. 여기서, 대표적인 단일 IPS 세포 유래 심근세포는 RFP 및 GFP 채널에서 이미징 분석 중에 그려진 관심 영역을 표시하는 백색 점선으로 묘사된다. RFP 채널의 신호는 멤브레인 전위의 변화로 인한 강제 또는 공명 에너지 전달증가로 인한 각 작업 전위 동안 형광 강도의 주기적인 증가를 보여줍니다.GFP 신호는 형광 강도의 주기적인 감소를 나타낸다. RFP/GFP 비율은 동작 잠재력 지속시간 50 및 90 측정과 같은 다운스트림 분석에 사용되는 생물학적 신호입니다. 예를 들어,이 방법을 사용하여 0.5 Hertz에 배치 된 IPS 세포 유래 심근 세포와 같은 30 일 된 심실, 평균 작용 전위 지속 시간 50 의 439 밀리 초, 및 평균 작업 지속 전위 90 의 520 밀리 초.IPS 세포 유래 심근세포의 전기 자극은 5비트마다 자극률을 증가시키고, 구타율이 증가함에 따라 작용 잠재력의 점진적 단축을 입증하였다. 더욱이, 자발적으로 구타IPS 세포 유래 심근세포의 치료 isoproternol, 비 선택적 베타 아드레노 수용체 작용제, 구타 속도의 신속한 증가로 이어졌다, 그 아고니스트의 증가 용량으로 더 증가 될 수있다. 이 방법은 고전적인 전기 생리학적 측정에 비해 우수한 처리량을 제공하지만 형광 전압 센서의 본질적인 운동 특성에 의해 제한된 시간적 분해능을 포함하여 그 한계를 알고 있어야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

심장 질환의 세포 기준으로 현재의 지식은 주로 동물 모델에 대한 연구에 의존한다. 여기에서 우리는 기술과 인간의 심실의 심근의 작은 수술 샘플에서 하나의 실행 가능한 심근을 얻기 위해 새로운 방법을 확인합니다. 인간 심실 근세포은 전기 생리학 연구와 약물 검사를 위해 사용될 수있다.

신선한 수술 샘플에서 분리 및 인간의 심실 심근 기능 특성

인간의 다 능성 줄기 세포 (hPSC-CM)에서 유래 된 심근 세포의 전기 생리 학적 특성은 심장병 모델링 및 약물 반응 결정에 중요합니다. 이 프로토콜은 다중 전극 배열에서 hPSC-CM을 해리 및 플레이트하고 필드 전위를 측정하며 QT 및 RR 간격을 분석하는 데 필요한 정보를 제공합니다.

다중 전극 배열 (MEAs)을 이용한 인간 다 능성 줄기 세포 유래 심근 세포 (hPSC-CMs)의 전기 생리 학적 분석

여기, 우리는 생쥐에서 생존 가능한 심실 슬라이스의 준비와 날카로운 전극 활동 전위 녹음에 대한 그들의 사용을 설명합니다. 이러한 다세포 제제는 생체 내 에서 생리 학적 및 약리학 적 연구 에 유용한 모델이되는 조직 구조와 같은 생체 내 보존성을 제공합니다.

전기 생리학 연구를위한 마우스 짧은 축 심실 조각

본 문서는 멀티웰 MEA 플레이트상에서 배양된 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근세포(hiPSC-CM) 네트워크의 개발을 위한 프로토콜 세트를 함유하고 있으며, 작용 전위 측정을 위해 세포막을 가역적으로 전기화한다. 높은 처리량 기록은 며칠 동안 반복적으로 동일한 셀 사이트에서 얻어진다.

재발 동작 전위 기록을 위한 멀티웰 마이크로 전극 어레이의 인간 iPSC 유래 심근구 네트워크

우리는 뮤린 근세포를 분리하는 방법론과 동시 디지털 세포 기하학 측정을 통해 형광 광도계를 사용하여 sarcomere 단축 추적과 동시에 전압 또는 칼슘 흔적을 얻는 방법을 제시합니다.

고립 된 뮤린 심실 근세포의 광학 이미징

여기서는 고속 모듈식 광혈약 시스템을 사용하여 유도된 다능줄기 세포 유래 심근세포로부터의 작용 잠재력의 광학 획득 및 특성화를 설명합니다.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에서 단세포 광학 작용 잠재적 측정

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포 (hiPSC-CM)는 약물 유도 심장 독성 스크리닝 및 질병 모델링을위한 유망한 시험관 내 모델로 부상했습니다. 여기에서는 hiPSC-CM의 수축성과 전기 생리학을 측정하기위한 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에 대한 미세 전극 어레이 및 패치 클램프 기록의 기술적 응용

레이저 천공과 미세 전극 어레이(MEA)의 조합은 배양된 일차 및 줄기 세포 유래 심근 세포의 활동 전위와 유사한 기록을 가능하게 합니다. 파형 모양은 표준 기록보다 테스트 화합물의 작용 모드에 대한 우수한 통찰력을 제공합니다. 패치 클램프와 MEA 판독값을 연결하여 향후 심장 안전 연구를 더욱 최적화합니다.

안전성 약리학의 예측 가능성을 높이기 위해 미세 전극 어레이에서 심근 세포의 레이저 유도 활동 전위와 유사한 측정

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포(hiPSC-CM)는 전임상 심장 독성 스크리닝을 위해 동물을 사용하는 것에 대한 대안을 제공합니다. 전임상 독성 스크리닝에서 hiPSC-CM의 광범위한 채택에 대한 한계는 세포의 미성숙하고 태아와 유사한 표현형입니다. hiPSC-CM의 견고하고 신속한 성숙을 위한 프로토콜이 여기에 제시되어 있습니다.

성숙한 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포 단층을 사용한 고처리량 심장 독성 스크리닝

여기서, 광학 기반 플랫폼을 사용하여 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에서 수축성 및 칼슘 측정을 수행하는 확립된 방법이 설명되어 있습니다. 이 플랫폼을 통해 연구자들은 돌연변이의 효과와 다양한 자극에 대한 반응을 빠르고 재현 가능한 방식으로 연구할 수 있습니다.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에서 칼슘 및 수축성 매개변수의 실시간 측정

빛을 사용하여 심장 세포와 조직을 제어하면 비접촉 자극이 가능하여 세포의 자연 상태와 기능을 보존할 수 있으므로 기본 연구와 치료 응용 분야 모두에 유용한 접근 방식이 됩니다.

비유전적 광학 자극을 통한 Ca2+ 전파를 연구하기 위한 심장 미세생리학적 시스템

학습하세요 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심실 심근세포에서 광학적 활동 전위 녹음 방법을. 렌티바이러스 매개 유전자 인코딩 전압 센서를 이용하여 심장 전기생리학 연구의 처리량을 극대화하고 하위 형식 특이적 기록을 가능하게 합니다.

하위 형식 관련 광학 활동 전위 녹음 인간의 유도 만능 줄기 세포 유래 심 실 Cardiomyocytes

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